KR20190039529A

KR20190039529A - 내염성 할로모나스 종에 의한 과다염성 환경으로부터의 포르메이트 촉매촉진

Info

Publication number: KR20190039529A
Application number: KR1020197004981A
Authority: KR
Inventors: 하이케 헤크로쓰; 크리스토프 헤르빅; 도냐 캄라바마네시; 폴 루쉬츠카
Original assignee: 코베스트로 도이칠란트 아게
Priority date: 2016-08-25
Filing date: 2017-08-24
Publication date: 2019-04-12
Also published as: US20190218126A1; WO2018037081A1; EP3504164A1; CN109562968A; JP2019528169A

Abstract

본 발명은 할로모나스(Halomonas) 종 균주 MA-C의 세포를 사용하여 과다염성 폐수의 포르메이트 함량을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 염소 및/또는 소듐 히드록시드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의해 추가로 포괄되는 것은 과다염성 폐수 및 할로모나스 종 균주 MA-C의 세포를 포함하는 조성물이다.

Description

내염성 할로모나스 종에 의한 과다염성 환경으로부터의 포르메이트 촉매촉진

본 발명은 할로모나스(Halomonas) 종 균주 MA-C의 세포를 사용하여 과다염성(hypersaline) 폐수의 포르메이트 함량을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 염소 및/또는 소듐 히드록시드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의해 추가로 포괄되는 것은 과다염성 폐수 및 할로모나스 종 균주 MA-C의 세포를 포함하는 조성물이다.

클로르알칼리 공정은 NaCl의 전기분해를 위한 산업 공정이다. 그것은 염소 및 소듐 히드록시드를 제조하는 데에 사용되는 기술이다. 과다염성 용액은 클로르알칼리 공정에 중요한 재료이다. 그러나, 매우 순수한 과다염성 용액이 요구된다. 따라서, 재순환된 과다염성 폐수를 클로르알칼리 공정에 사용하기는 어렵다. 예를 들어, 폴리우레탄 제조의 과다염성 폐수는 약 300-500 mg/l의 포르메이트를 함유하는데, 이것은 제거되어야 하며, 그렇지 않을 경우 염소가 CO₂로 오염되게 된다.

원치 않는 총 유기 탄소 (TOC)의 제거는 활성탄 상에서의 흡착에 의해 달성될 수 있다. 그러나, 활성탄에 흡착되지 않는 포르메이트의 경우에는 이것이 가능하지 않다.

포르메이트는 특정 미생물 세포에 의해, 예를 들면 포르메이트 데히드로게나제와 같은 효소의 형성에 의해 분해될 수 있다. 그러나, 미생물 세포는 보통 10%를 초과하는 염 농도를 갖는 폴리우레탄 염수와 같은 과다염성 용액에서는 성장하지 않는다.

이에 따라, 과다염성 폐수의 포르메이트 함량을 감소시키기 위한 수단 및 방법이 강하게 요구되고 있다.

WO 2013/124375호는 특정 호염성(halophilic) 및/또는 호염알칼리성(haloalkaliphilic) 미생물에 의한 총 유기 탄소의 감소에 대해 개시하고 있다.

펜다슈테(Pendashteh) 등은 단리된 호염성 미생물들의 조합에 의한 연속 회분식 반응기(sequencing batch reactor) 중 생성수의 생물학적 처리에 대해 개시하고 있다 (문헌 [Pendashteh, Fakhru'l Razi, Chuah, Radiah, Madaeni, and Zurina, Environ. Technol., vol. 31, (2010) pp 1229-1239]).

힌테레거(Hinteregger) 및 스트레이츄비에르(Streichsbier)는 염성 페놀계 폐수의 생물처리를 위한 중간 호염성 할로모나(Halomona) 균주에 대해 개시하고 있다 (문헌 [Hinteregger and Streichsbier, Biotechnol. Lett., vol. 19 (1997) pp 1099-1102]).

할로모나스 종 균주의 상세한 표현형 특성화는 마타 마르티네즈-카노바스(Mata Martinez-Canovas) 등에 의해 제공되어 있다 (문헌 [Mata Martinez-Canovas, Quesada, and Bejar, Syst. Appl. Microbiol., vol. 25 (2002) pp 360-375]).

울라드(Woolard) 및 어빈(Irvine)은 연속 회분식 반응기에서의 과다염성 폐수의 처리에 대해 개시하고 있다 (문헌 [Woolard and Irvine, Water Res., vol. 29 (1995) pp 1159-1168]).

아자치(Azachi) 등은 포름알데히드 저장 부지에서 수집된 토양으로부터의 내염성 그람-음성 유박테리움(eubacterium)의 단리에 대해 개시하고 있다 (문헌 [Azachi, Henis, Oren, Gurevich, and Sarig, Can. J. Microbiol., vol. 41 (1995): 548-553]). MA-C로 명명되고 할로모나스 종으로 식별된 균주 (DSM 7328)는 높은 염 농도에서 성장하였다. 유도성 NAD-의존성 포르메이트 데히드로게나제 활성이 검출되었다. 할로모나스 종 균주 MA-C의 추출물을 사용한 실험은 포르메이트 데히드로게나제가 45℃에서 그의 온도 최적조건을 나타낸다는 것을 보여주었다. 포르메이트 데히드로게나제의 활성은 염의 존재에 의해 강하게 억제되었다. 1.5% NaCl의 농도에서, 50% 억제가 관찰되었다.

본 발명이 기초로 하는 기술적인 문제점은 상기 언급된 필요성에 부합하는 방법의 제공으로 볼 수 있다. 상기 기술적 문제점은 청구범위 및 이하에서 특성화되는 실시양태들에 의해 해결된다.

유리하게도, 본 발명의 연구에서, 할로모나스 종 균주 MA-C가 10%를 초과하는 고농도 NaCl의 존재하에서도 폐수 중 포르메이트 함량의 효율적인 감소를 가능케 한다는 것이 밝혀졌다. 흥미롭게도, 할로모나스 종 균주 MA-C는 포르메이트 상에서 성장하지는 않았다. 따라서, 본 발명에 의한 포르메이트의 제거는 포르메이트 상에서의 MA-C 세포의 촉매촉진 작용을 통하여 이루어진다. 포르메이트의 촉매촉진 제거는 빠르고 효율적인데, 포르메이트 단독 상에서의 성장이 관찰되지 않은 것으로 볼 때 (도 2 참조), 상기 결과는 촉매촉진 반응에 의해 생성되는 대사물이 CO₂라는 것을 암시한다.

이에 따라, 본 발명은,

(i) 과다염성 폐수를 포함하는 조성물 A를 제공하는 단계, 및

(ii) 상기 조성물 A를 할로모나스 종 균주 MA-C의 세포와 혼합함으로써, 과다염성 폐수 및 할로모나스 종 균주 MA-C를 포함하는 조성물 B를 생성시키는 단계

를 포함하는, 과다염성 폐수의 포르메이트 함량을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명 방법의 단계 (i)에서는, 과다염성 폐수를 포함하는 조성물 A가 제공되어야 한다. 상기 조성물 A는 포르메이트를 포함하는 용액이다. 바람직하게는, 조성물 A는 25 mg/l를 초과하는 양, 특히 50 mg/l를 초과하는 양으로 포르메이트를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 조성물 A는 50 mg/l를 초과하나 2000 mg/l 미만인 양으로 포르메이트를 포함한다. 더욱 더 바람직하게는, 조성물 A는 100 mg/l를 초과하나 1000 mg/l 미만인 양으로 포르메이트를 포함한다. 가장 바람직하게는, 조성물 A는 100 mg/l를 초과하나 500 mg/l 미만인 양으로 포르메이트를 포함한다.

포르메이트 이외에도, 조성물 A는 높은 농도로 NaCl을 포함하게 된다. 바람직한 실시양태에서, 조성물 A는 조성물 A의 총 부피 기준 10% (w/v)를 초과하는 농도로 NaCl을 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 조성물 A는 조성물 A의 총 부피 기준 12.5% (w/v)를 초과하는 농도로 NaCl을 포함한다. 또한, 조성물 A가 조성물 A의 총 부피 기준 14% (w/v)를 초과하는 농도로 NaCl을 포함하는 것이 고려된다. 또한, 조성물 A는 조성물 A의 총 부피 기준 15% (w/v)를 초과하는 농도로 NaCl을 포함할 수도 있다.

본 발명이 기초로 하는 연구에서는 20.0% (w/v)의 NaCl 농도에서도 포르메이트 함량이 감소된 것으로 나타난 바 있기 때문에, 원칙적으로 조성물 A는 NaCl의 포화 농도까지의 농도로 NaCl을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 농도의 상위 한계는 원칙적으로는 NaCl의 포화 농도이다. 그러나, 조성물 A는 포화 농도 미만의 농도로 NaCl을 포함하는 것으로 상정된다. 바람직하게는, 조성물 A 중 NaCl 농도는 역시 조성물 A의 총 부피를 기준으로 22% (w/v) 미만, 더욱 바람직하게는 20% (w/v) 미만, 가장 바람직하게는 18% (w/v) 미만이다. 이에 따라, 예를 들면 NaCl의 농도는 10% (w/v)를 초과하나 20% (w/v) 미만, 또는 12.5% (w/v), 14% (w/v) 또는 15% (w/v)를 초과하나 20% (w/v) 미만일 수 있다.

과다염성 폐수는 바람직하게는 산업 폐수, 특히 염수이다. 상기에서 언급된 바와 같은 NaCl의 농도는 다양한 산업 폐수에서 발견될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 과다염성 폐수는 폴리우레탄의 예비-생성물로서의 메틸렌 디아민 제조로부터 유래한다. 이에 따라, 본 발명 방법의 단계 i)은 메틸렌 디아민 제조로부터의 과다염성 폐수의 단리를 포함할 수 있다. 과다염성 폐수는 예비 단계들에 적용되었을 수 있다. 일 실시양태에서, 과다염성 폐수는 활성탄을 사용한 정제 단계에 적용됨으로써 TOC 함량을 감소시킨 것이다. 또한, 폐수는 여과되었을 수 있다. 또한, 본 발명 방법의 단계 i) 전에 폐수의 NaCl 농도가 농축되는 것이 고려된다. NaCl을 포함하는 조성물의 바람직한 농축 방법은 본원의 다른 곳에서 기술한다.

상기에서 제시된 바와 같이, 조성물 A는 과다염성 폐수를 포함하게 된다. 바람직한 실시양태에서, 조성물 A는 본질적으로 과다염성 폐수로 이루어진다. 특히 바람직한 실시양태에서, 조성물 A는 과다염성 폐수로 이루어진다. 이와 같은 경우에서, "과다염성 폐수" (즉 처리되지 않은 과다염성 폐수)라는 용어와 "조성물 A"라는 용어는 호환가능하게 사용될 수 있다.

과다염성 폐수 및 그에 따른 조성물 A는 아닐린, 페놀레이트 및/또는 MDA (4,4'-메틸렌디아닐린)와 같은 추가의 유기 화합물들을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 조성물 A는 0.1 내지 20 mg/l, 특히 1 내지 10/mg/l의 아닐린 및/또는 0.1 mg/l 내지 10 mg/l, 특히 1 내지 5 mg/l의 MDA, 및/또는 2 내지 100 mg/l, 특히 5 내지 20 mg/l의 페놀레이트를 포함한다.

바람직하게는, 조성물 A는 50 mg/l 초과, 더욱 바람직하게는 60 mg/l 초과, 더욱 더 바람직하게는 60 mg/l 초과, 가장 바람직하게는 65 mg/l 초과의 총 유기 탄소 ("TOC") 함량을 갖는다. 또한, 조성물 A가 70 mg/l 초과, 특히 70 mg/l 초과의 TOC (총 유기 탄소) 함량을 갖는 것이 고려된다. 바람직하게는, 조성물 A는 1000 mg/l 이상까지의 총 유기 탄소 ("TOC") 함량을 가질 수 있다.

본 발명에 따라, 과다염성 폐수의 포르메이트 함량은 감소되어야 한다. 본원에서 사용될 때의 "감소시키는 것"이라는 용어는 과다염성 폐수 포르메이트 함량의 상당한 감소를 지칭하게 된다. 바람직하게는, 상기 용어는 조성물 A에 존재하는 총 포르메이트 함량 중 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 70%, 또는 특히 적어도 90% 또는 적어도 95%의 포르메이트 함량 감소를 나타낸다. 또한, 포르메이트 함량이 완전히 제거되는 것이 고려된다.

바람직하게는, 본 발명의 방법이 수행된 후, 처리된 폐수는 15 mg/l 미만, 더욱 바람직하게는 10 mg/l 미만, 가장 바람직하게는 5 mg/l 미만의 양으로 포르메이트를 포함한다.

본 발명의 방법을 수행하는 것에 의하면, TOC 함량 역시 (즉 포르메이트 함량에 더하여) 감소되게 된다. 바람직하게는, 처리된 폐수는 (특히 본원의 다른 곳에서 기술되는 바와 같은 세포의 분리 후에는) 40 mg/l 미만, 더욱 바람직하게는 30 mg/l 미만, 가장 바람직하게는 20 mg/l 미만의 TOC 함량을 갖는다.

바람직하게는, 포르메이트 함량은 할로모나스 종 균주 MA-C 세포의 존재에 의해, 구체적으로는 이산화탄소로의 포르메이트의 산화를 촉매촉진하는 포르메이트 데히드로게나제의 활성에 의해 감소된다. 포르메이트 데히드로게나제는 할로모나스 종 균주 MA-C의 세포에 의해 발현된다.

본 발명 방법의 단계 ii)에 따라, 단계 i)에서 제공된 바와 같은 조성물 A는 할로모나스 종 균주 MA-C (DSM 7328)의 세포와 혼합된다. 그에 의해, 조성물 A (및 그에 따른 과다염성 폐수) 및 할로모나스 종 균주 MA-C (즉 이와 같은 균주의 세포)를 포함하는 조성물 B가 생성된다.

할로모나스 종 균주 MA-C (DSM 7328)에 대해서는 관련 기술분야에 기술되어 있다. 상기 균주에 대해서는 예를 들면 모두 그 전체가 의거 참조로써 개재되는 문헌 [Azachi et al. (Can. J. Microbiol., vol. 41 (1995): 548-553)] 및 [Oren et al. (Biodegradation (1992), 3: 387-398)]에 기술되어 있다. 균주 MA-C는 에이. 오렌(A. Oren) 및 엠. 아자치(M. Azachi)에 의해 DSM 번호 7328하에 DSM (독일생물자원센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen), 독일 브라운슈바이크 소재)에 기탁되어 있다. "MA-C"는 균주 호칭이다. 상기 균주는 DSM의 공공 수집군으로 유지되고 있으며, 제한 없이 DSM에서 주문할 수 있다.

단계 ii)에서 조성물 A와 혼합될 수 있는 세포는 생존가능해야 하며, 다시 말하자면 살아있는 세포여야 한다. 따라서, 할로모나스 균주 MA-C의 효소 추출물과 같은 추출물을 사용하는 것은 고려되지 않는다. 세포가 생존가능한지 아닌지를 평가하는 방법은 잘 알려져 있는 방법에 의해 평가될 수 있다. 물론, 조성물 A와 혼합되어야 할 세포들 중 소정 백분율은 생존가능하지 않을 수 있다. 그러나, 이는 숙련 기술자에 의해 고려된다.

바람직하게는, 균주 MA-C 세포의 현탁액은 조성물 A와 혼합된다. 상기 세포는 바람직하게는 MA-C 균주 세포의 사전-배양으로부터 유래한다. 일 실시양태에서, 세포의 사전-배양은 포르메이트의 존재하에서 수행되었는데, 다시 말하자면 사전-배양용 배지가 포르메이트를 함유하게 된다는 것이다.

조성물 A와 혼합되어야 하는 균주 MA-C 세포의 양은 숙련 기술자에 의해 결정될 수 있다. 혼합되어야 하는 세포량은 포르메이트 함량의 충분한 감소를 가능케 해야 한다. 상기 양은 예를 들면 본 발명의 방법에 의해 처리되어야 할 조성물 A의 부피에 따라 달라진다. 일반적으로, 처리되어야 할 조성물 A의 부피가 더 클수록, 사용되어야 할 세포의 양은 더 많아지게 된다. 이는 숙련 기술자에 의해 고려될 것이다.

혼합은 적합한 용기 내에서 이루어질 수 있다. 일 실시양태에서, 혼합은 생물반응기에서 수행된다. 본원에서 사용될 때의 "생물반응기"라는 용어는 포르메이트 함량의 감소를 가능케 하도록 조건이 정밀하게 조절되는 시스템을 지칭한다. 일 실시양태에서, 상기 생물반응기는 교반 탱크 반응기이다. 바람직하게는, 생물반응기는 스테인리스강과 같은 비-부식성 재료로 구성된다. 조성물 B의 인큐베이션에 그것이 유용하다는 전제하에, 생물반응기는 임의 크기의 것일 수 있다. 바람직하게는, 생물반응기는 과다염성 폐수 포르메이트 함량의 대규모 감소를 가능케 한다. 이에 따라, 생물반응기는 적어도 1, 10, 100, 500, 1000, 2500 또는 5000 리터의 부피, 또는 임의의 중간 부피를 갖는 것으로 상정된다. 그러나, 5 내지 100 ml의 조성물 B를 사용하는 것과 같이 소규모로 본 발명의 방법을 수행하는 것도 고려된다.

조성물 B는 균주 MA-C의 세포에 의한 포르메이트 함량의 감소를 가능케 하는 배지 성분들을 추가로 포함할 수도 있다. 그와 같은 배지 성분에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들면 NH₄Cl, KH₂PO₄, Na₂SO₄, MgCl₂ (예컨대 MgCl₂*6H₂O), CaCl₂ (예컨대 CaCl₂*2H₂O) 및 KCl이 포함된다. 일 실시양태에서, 조성물 B는 (배지 성분으로서) 인 공급원, 질소 공급원, 황 공급원, 칼륨 공급원 및/또는 마그네슘 공급원을 포함한다. 조성물 B는 또한 철, 구리, 아연 및 코발트와 같은 미량 원소를 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 배지 성분은 조성물 A와 세포를 (단계 ii)에서 제시된 바와 같이) 혼합한 후에 조성물 B에 첨가된다.

적합한 배지 성분의 선택은 추가의 작업 없이 숙련 기술자에 의해 수행될 수 있다. 또한, 숙련 기술자라면, 추가의 작업 없이 배지 성분들의 적합한 농도를 결정할 수 있다.

예를 들면, 하기 배지 성분들의 경우에는 하기의 농도 범위 및 농도들이 적합한 것으로 간주된다. 그러나, 본 발명이 상기에서 언급된 배지 성분들 및 하기의 농도 범위로 제한되는 것은 아니다.

조성물 B 중 농도:

NH₄Cl: 0.5 내지 3 g/l, 예컨대 1.5 g/l

KH₂PO₄: 0.05 내지 0.5 g/l, 예컨대 0.15 g/l

MgCl₂*6H₂O: 0.5 내지 3 g/l, 예컨대 1.1 g/l

CaCl₂*2H₂O: 0.1 내지 2 g/l, 예컨대 0.55 g/l

KCl: 0.5 내지 3 g/l, 예컨대 1.66 g/l

Na₂SO₄: 0.5 내지 1 g/l. 예컨대 0.75g/l.

배지 성분들의 다른 바람직한 농도는 실시예 부문의 표 3에 상술되어 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 조성물 B는 적합한 기질, 즉 균주 MA-C의 성장을 가능케 하는 기질을 포함할 수 있다. 상기 기질은 바람직하게는 조성물 B에 첨가된다. 일 실시양태에서, 상기 기질은 유기 산 또는 당이다. 바람직하게는, 기질은 아세테이트, 글루코스, 수크로스, 락테이트, 말레이트, 숙시네이트, 시트레이트 및 글리세롤로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 기질은 아세테이트이다. 본 발명이 기초하는 연구에서는, 배지 중 아세테이트의 존재가 (다른 시험된 기질들과 비교하였을 때) 균주 MA-C의 최상의 성장을 가능케 하는 것으로 나타났다.

바람직하게는, 조성물 B는 인큐베이션이 연속 공정으로 수행되는 경우에 기질을 포함한다. 연속 방식에서 포르메이트 촉매촉진의 안정성을 달성하기 위해서는, 기질이 느린 속도로 바이오매스 성장을 가능케 해야 한다.

기질의 적합한 농도 또는 농도 범위는 추가의 작업 없이 숙련 기술자에 의해 결정될 수 있다. 포르메이트 함량의 감소 및 그에 따른 MA-C의 배양은 바람직하게는 탄소 제한하에서 수행된다. 이에 따라, 아세테이트와 같은 기질의 농도는 느린 속도로 바이오매스 성장을 가능케 하는 것으로 상정된다. 그에 따라 새로운 바이오매스가 생성되며, 그것은 연속 방식으로 이산화탄소로의 포르메이트의 산화를 촉매촉진한다. 바람직하게는, 기질은 세포에 의해 완전히 흡수되는 양으로 조성물 B에 첨가된다. 따라서, 기질의 첨가에 의해 TOC 함량이 증가되지는 않게 되는 것으로 상정된다.

예를 들면, 조성물 B에서의 기질, 특히 상기 언급된 기질의 농도는 0.5 g/l 내지 10 g/l, 특히 0.5 g/l 내지 5 g/l인 것으로 상정된다. 추가의 기질이 연속적으로 첨가되지 않는 경우 공정 동안 기질의 농도는 감소하게 되는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 일 실시양태에서, 추가의 배지 성분 및/또는 적합한 기질은 특히 조성물 A와 균주 MA-C의 세포를 혼합한 후에 조성물 B에 첨가된다. 예를 들면, 추가의 배지 성분 및/또는 적합한 기질은 조성물 B의 인큐베이션 개시시, 또는 조성물 B의 인큐베이션 동안 (예컨대 연속적으로 또는 펄스로서)의 것일 수 있다.

물론, 조성물 B에 포함되어 있는 세포에 의해 소정 속도로 기질이 대사될 것이기 때문에, 기질의 농도는 인큐베이션 동안 변화하게 된다. 따라서, 기질 농도는 일정하지 않을 수 있다. 그렇지만, 기질 함량의 감소를 상쇄하기 위하여, 인큐베이션 동안 추가의 기질이 첨가될 수 있다.

세포와 조성물 A를 혼합한 후, MA-C 세포에 의한 포르메이트 함량의 감소를 가능케 하기 위하여, 생성되는 조성물 B는 인큐베이션된다. 따라서, 본 발명의 방법은 바람직하게는 조성물 B를 인큐베이션하는 추가의 단계를 포함한다. 상기 인큐베이션은 적합한 조건하에서, 즉 MA-C 세포에 의한 포르메이트 함량의 감소를 가능케 하는 조건하에서 수행된다. 바람직하게는, 인큐베이션은 생물반응기에서 수행된다.

바람직하게는, 포르메이트 함량의 감소 (및 그에 따른 조성물 B의 인큐베이션)는 15℃ 내지 45℃의 온도, 더욱 바람직하게는 18℃ 내지 32℃의 온도, 더욱 바람직하게 20℃ 내지 30℃의 온도, 가장 바람직하게는 25℃ 내지 30℃의 온도, 특히 27℃ 내지 30℃의 온도에서 수행된다. 상기 감소는 일정한 온도에서 수행되는 것으로 상정된다. 그러나, 인큐베이션 동안 온도가 변화할 수 있는 것 역시 고려된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 조성물 B의 온도는 인큐베이션 동안 모니터링된다.

본 발명 방법의 바람직한 실시양태에서, 조성물 B는 (인큐베이션 동안) 교반된다. 바람직하게는, 조성물 B는 100 rpm 내지 700 rpm의 범위, 더욱 바람직하게는 100 rpm 내지 500 rpm의 범위, 가장 바람직하게는 200 rpm 내지 400 rpm의 범위로 교반된다.

인큐베이션은 호기성 조건하에서 수행된다. 바람직하게는, 호기성 조건은 연속적으로 조성물 B에 공기 또는 정제 산소를 첨가하는 것에 의해 유지된다.

바람직하게는, 조성물 B는 5.5 내지 8.5 범위, 더욱 바람직하게는 6.0 내지 8.0, 가장 바람직하게는 6.6 내지 7.4 범위의 pH 값을 갖는다. 이에 따라, 인큐베이션은 바람직하게는 그와 같은 pH 값에서 수행된다. 바람직한 실시양태에서, 조성물 B의 pH 값은 인큐베이션 동안 모니터링된다. pH 값은 배양 동안 일정하게 유지되는 것으로 상정된다. 이는 예를 들면 사용되는 공동-기질에 따라 HCl 또는 NaOH를 첨가하는 것에 의해 달성될 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, 상기 단계 ii)에서 제시된 바와 같은 혼합은 (조성물 A의 부피와 비교하였을 때) 생성되는 조성물 B의 부피를 크게 증가시키지는 않는 것으로 상정된다. 따라서, 조성물 B의 주 성분은 조성물 A가 될 수 있다. 이에 따라, 혼합이 조성물 A를 크게 희석하지는 않을 수 있다. 희석 계수는 바람직하게는 1.2 미만, 더욱 바람직하게는 1.1 미만, 가장 바람직하게는 1.05 미만이다. 또한, 희석 계수는 1.03 또는 1.02 미만인 것으로 상정된다. 본원에서 사용될 때의 "희석 계수"라는 용어는 바람직하게는 조성물 A의 부피에 대한 조성물 B 부피의 비를 지칭한다.

다른 말로 하면, 조성물 B는 조성물 B의 총 중량을 기준으로 적어도 80 중량%, 더욱 바람직하게는 적어도 90 중량%, 가장 바람직하게는 적어도 95 중량%의 조성물 A를 포함한다 (특히 그것으로 구성된다). 또한, 조성물 B는 조성물 B의 총 중량을 기준으로 적어도 97 중량% 또는 98 중량%의 조성물 A를 포함하는 것으로 상정된다.

희석 계수가 무시할만하기 때문에, 조성물 B는 조성물 A와 동일하거나 본질적으로 동일한 함량의 포르메이트 및 NaCl을 포함하는 것으로 상정된다.

따라서, 조성물 B는 25 mg/l을 초과하는 양으로, 특히 50 mg/l을 초과하는 양으로 포르메이트를 포함하는 것으로 상정된다. 더욱 바람직하게는, 조성물 B는 50 mg/l를 초과하나 2000 mg/l 미만인 양으로 포르메이트를 포함한다. 더욱 더 바람직하게는, 조성물 B는 100 mg/l를 초과하나 1000 mg/l 미만인 양으로 포르메이트를 포함한다. 가장 바람직하게는, 조성물 B는 100 mg/l를 초과하나 500 mg/l 미만인 양으로 포르메이트를 포함한다. 포르메이트 함량은 인큐베이션 동안 감소하게 된다는 것이 이해되어야 한다.

또한, 조성물 B는 조성물 B의 총 부피를 기준으로 10% (w/v)를 초과하는 농도의 NaCl 및 포르메이트를 포함하는 것으로 상정된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 조성물 B는 조성물 B의 총 부피 기준 12.5% (w/v)를 초과하는 농도로 NaCl을 포함한다. 또한, 조성물 B는 조성물 B의 총 부피 기준 14% (w/v)를 초과하는 농도로 NaCl을 포함하는 것으로 상정된다. 또한, 조성물 B는 조성물 B의 총 부피 기준 15% (w/v)를 초과하는 농도로 NaCl을 포함할 수 있다. 역시 바람직하게는, 조성물 B 중 NaCl 농도는 역시 조성물 B의 총 부피를 기준으로 22% (w/v) 미만, 더욱 바람직하게는 20% (w/v) 미만, 가장 바람직하게는 18% (w/v) 미만이다. 이에 따라, 예를 들면 NaCl의 농도는 10% (w/v)를 초과하나 20% (w/v) 미만, 또는 12.5% (w/v), 14% (w/v) 또는 15% (w/v)를 초과하나 20% (w/v) 미만일 수 있다.

상기에서 제시된 바와 같이, 조성물 B는 원칙적으로 조성물 A와 본질적으로 동일한 함량의 NaCl을 포함할 수 있다. 이에 따라, 조성물 A는 조성물 A의 총 부피 기준 10% (w/v)를 초과하는 농도로 NaCl을 포함하고, 조성물 B는 조성물 B의 총 부피 기준 10% (w/v)를 초과하는 농도로 NaCl을 포함하는 것으로 상정된다. 이에 따라, 조성물 A는 조성물 A의 총 부피 기준 12.5% (w/v)를 초과하는 농도로 NaCl을 포함하고, 조성물 B는 조성물 B의 총 부피 기준 12.5% (w/v)를 초과하는 농도로 NaCl을 포함하는 것으로 상정된다. 또한, 조성물 A 및 조성물 B 모두는 각각 조성물 A 및 B의 총 부피 기준 14% (w/v)를 초과하는 농도로 NaCl을 포함하는 것으로 상정된다. 또한, 조성물 A 및 조성물 B 모두는 각각 조성물 A 및 B의 총 부피 기준 15% (w/v)를 초과하는 농도로 NaCl을 포함할 수 있다. 역시 바람직하게는, 조성물 A 및 B 중 NaCl 농도는 역시 조성물 B의 총 부피를 기준으로 22% (w/v) 미만, 더욱 바람직하게는 20% (w/v) 미만, 가장 바람직하게는 18% (w/v) 미만이다. 이에 따라, 예를 들면 NaCl의 농도는 10% (w/v)를 초과하나 20% (w/v) 미만, 또는 12.5% (w/v), 14% (w/v) 또는 15% (w/v)를 초과하나 20% (w/v) 미만일 수 있다.

바이오매스, 즉 균주 MA-C 세포의 농도는 포르메이트 함량의 감소를 가능케 하는 임의의 농도일 수 있다. 다양한 바이오매스 범위가 시험되었다 (실시예 2 참조). 예를 들면, 바이오매스 농도는 0.2 내지 10 g/l 사이의 범위, 특히 0.5 내지 4.5 g/l 사이의 범위일 수 있다. 250 mg/l의 포르메이트를 위한 최적의 바이오매스 농도는 1.6 g/l이다. 이에 따라, 바이오매스 농도는 또한 1.3 내지 1.9 g/l 사이의 범위인 것으로 상정된다.

또한, 조성물 A에 대하여 본원에서 상기한 바와 같이, 조성물 B는 아닐린, 페놀레이트 및/또는 MDA를 포함할 수 있다. 또한, 조성물은 (인큐베이션 개시시에) 조성물 A에 대하여 본원에서 상기한 바와 같은 TOC 함량을 가질 수 있다.

상기에서 제시된 바와 같이, 본 발명의 방법은 바람직하게는 대규모로 수행된다. 따라서, 조성물 B는 바람직하게는 적어도 1, 10, 100, 500, 1000, 2500 또는 5000 리터의 부피, 또는 임의의 중간 부피를 갖는다. 그러나, 적어도 5 ml 또는 100 ml의 부피와 같은 더 작은 부피 역시 본 발명에 의해 고려된다 (예를 들면 시험용).

본 발명의 방법, 특히 본원에서 언급되는 바와 같은 인큐베이션은 바람직하게는 회분식, 유가식(fed-batch) 또는 연속 공정으로, 특히 회분식, 유가식, 또는 (바람직하게는 생물반응기에서의) 세포 보류를 사용하는 연속 공정으로 수행된다. 따라서, 조성물 B는 회분식, 유가식 또는 연속 조건하에서 인큐베이션된다. "회분식 공정"이라는 용어는 바람직하게는 기질 및 추가의 배지 성분, 조성물 A는 물론 세포 자체를 포함하여 세포를 인큐베이션하는 데에 궁극적으로 사용되게 되는 모든 성분이 인큐베이션 공정 개시시에 제공되는 세포의 인큐베이션 방법을 지칭한다. 회분식 공정은 바람직하게는 소정 시점에 중지되며, 처리된 과다염성 폐수가 단리된다. 본원에서 사용될 때의 "유가식 공정"이라는 용어는 배양 과정 개시 후 소정 시점에 추가의 배지 성분 및/또는 기질과 같은 추가의 성분들이 배양액에 제공되는 세포의 인큐베이션 공정을 지칭한다. 유가식 배양은 바람직하게는 소정 시점에 중지되며, 배지 중 세포 및/또는 성분들이 수확된 후, 처리된 과다염성 폐수가 단리된다.

특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 그에 따른 본원에서 언급되는 바와 같은 인큐베이션은 상기에서 언급된 바와 같은 (아세테이트와 같은) 기질을 사용하는 혼합 공급 시스템을 사용하여 연속 배양으로 수행된다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명은 방법은 또한 조성물 B로부터 할로모나스 종 균주 MA-C의 세포를 분리함으로써 조성물 C를 제공하는 단계를 포함한다. 조성물 B로부터의 세포의 분리는 조성물 B의 인큐베이션 후, 즉 포르메이트 함량의 감소 후에 수행되어야 한다.

생성되는 조성물 C (본원에서는 "처리된 폐수"로 지칭되기도 함)에는 할로모나스 종 균주 MA-C의 세포가 본질적으로 없어야 한다. 다른 말로 하면, 조성물 C는 세포를 포함하지 않아야 한다.

조성물 B로부터의 세포의 분리는 적절한 것으로 간주되는 모든 세포 보류 수단에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, 세포의 분리는 원심분리, 여과 또는 경사분리에 의해 달성될 수 있다. 바람직하게는, 세포는 여과에 의해 조성물 B로부터 분리된다.

또한, 세포는 비드 또는 고체 지지체상에 고정됨으로써 조성물 B로부터의 세포의 분리를 가능케 할 수 있다.

연속 공정이 수행되는 경우에는, 분리된 세포가 다시 폐수로 공급되는 것이 고려된다.

생물반응기에서 방법이 수행되는 경우에는, 생물반응기가 세포 보류를 위한 수단을 포함하는 것이 고려된다. 바람직하게는, 생물반응기는 여과에 의해 조성물 B로부터 세포를 분리하는 데에 적합한 멤브레인을 포함한다.

생성되는 조성물 C, 즉 처리된 폐수는 바람직하게는 15 mg/l 미만의 양으로 포르메이트를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 그것은 10 mg/l 미만, 가장 바람직하게는 5 mg/l 미만의 양으로 포르메이트를 포함한다. 이는 조성물 B에도 적용된다.

또한, 조성물 C는 바람직하게는 40 mg/l 미만, 더욱 바람직하게는 30 mg/l 미만, 가장 바람직하게는 20 mg/l 미만의 TOC 함량을 갖는다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 방법은 또한 조성물 C를 농축함으로써 조성물 C^*를 제공하는 것을 포함한다.

이와 같은 단계는 처리된 폐수의 NaCl 농도를 증가시키게 되는데, 다시 말하자면 NaCl이 조성물 중에서 상향-농축된다(up-concentrated). 바람직하게는, 농축된 조성물 C^*는 조성물 A의 총 부피 기준 20.0% (w/v)를 초과하는 농도, 특히 22% (w/v)를 초과하는 농도로 NaCl을 포함한다. 이러한 NaCl 농도는 클로르알칼리 공정의 공급 스트림에 사용되는 경우에 이상적인 농도이다.

본 발명에 있어서, 조성물 C의 상향-농축은 적절한 것으로 간주되는 임의의 방법에 의한 농축일 수 있다. 바람직한 방법은 역삼투, 한외여과 및 나노여과이다. 이들 방법에서는, 여과 멤브레인의 일측에 양의 삼투압이 존재한다. 또한, 상향-농축은 증발에 의해 달성될 수 있다.

상기에서 제시된 바와 같이, 조성물 A 및 B는 20% (w/v)를 초과하는 농도로 NaCl을 포함할 수 있다. 이러한 농도가 사용되는 경우에는, 처리된 폐수를 클로르알칼리 공정에 적용시킬 때 농축 단계가 원칙적으로 생략될 수 있다.

본원에서 상기에 제공된 정의 및 설명들은 필요한 변경을 가하여 본 발명의 하기 주제에, 특히 염소 및/또는 소듐 히드록시드의 제조를 위한 본 발명의 하기 방법, 본 발명의 조성물, 본 발명의 생물반응기 및 본 발명의 용도에 적용된다.

본 발명은 또한,

(a) 본 발명의 방법에 따른 조성물 C 또는 본 발명의 방법에 따른 조성물 C^*를 제공하는 단계, 및

(b) (a)에 따른 조성물을 소듐 클로라이드 전기분해에 적용함으로써, 염소 및 소듐 히드록시드를 생성시키는 단계

를 포함하는, 염소 및/또는 소듐 히드록시드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

소듐 클로라이드의 전기분해는 관련 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 전기분해는 소듐 클로라이드의 멤브레인 전지 전기분해, 특히 산소 소비 전극을 사용하는 멤브레인 전기분해, 소듐 클로라이드의 격막(diaphragm) 전지 전기분해 또는 소듐 클로라이드의 수은 전지 전기분해이다.

상기 언급된 방법의 단계 (a), 즉 본 발명의 방법에 따른 조성물 C 또는 본 발명의 방법에 따른 조성물 C^*의 제공은 바람직하게는 과다염성 용액의 포르메이트 함량을 감소시키기 위한 방법 단계들을 포함한다.

따라서, 단계 a)는 바람직하게는,

(i) 과다염성 폐수를 포함하는 조성물 A를 제공하는 단계, 및

(ii) 상기 조성물 A를 할로모나스 종 균주 MA-C의 세포와 혼합함으로써, 과다염성 폐수 및 할로모나스 종 균주 MA-C를 포함하는 조성물 B를 생성시키는 단계, 및

(iii) 조성물 B로부터 할로모나스 종 균주 MA-C의 세포를 분리함으로써, 조성물 C를 제공하는 단계

를 포함한다.

조성물 C^*가 사용되는 경우, 단계 a)는 바람직하게는 조성물 C를 농축함으로써 조성물 C^*를 제공하는 추가의 단계를 포함한다.

바람직하게는, 조성물 B는 혼합 단계 (ii) 후에 인큐베이션된다. 상기 인큐베이션은 적합한 조건하에서, 즉 MA-C 세포에 의한 포르메이트 함량의 감소를 가능케 하는 조건하에서 수행되어야 한다. 바람직하게는, 인큐베이션은 생물반응기에서 수행된다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법과 관련하여 본원에서 상기 정의된 바와 같은 조성물 B에 관한 것이다. 이에 따라, 본 발명은 과다염성 폐수 및 할로모나스 종 균주 MA-C 세포의 조성물 B에 관한 것으로써, 여기서 상기 조성물은 10% (w/v)를 초과하는 농도의 NaCl 및 포르메이트를 포함한다.

바람직한 포르메이트 함량 및 또한 바람직한 NaCl 농도에 대해서는 포르메이트 함량의 감소를 위한 본 발명의 방법과 관련하여 개시되어 있다. 더하여, 상기 조성물은 상기한 바와 같은 성분들 (예컨대 추가의 배지 성분 및/또는 적합한 기질, 페놀, 아닐린 등)을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 조성물 B 적어도 1 l를 포함하는 생물반응기에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 할로모나스 종 균주 MA-C 세포의, 과다염성 폐수를 포함하는 조성물 A의 포르메이트 함량을 감소시키기 위한 용도에 관한 것이다. 상기 조성물 A는 바람직하게는 조성물 A 총 부피 기준 10% (w/v)를 초과하는 농도의 NaCl 및 포르메이트를 포함한다.

마지막으로, 본 발명은 할로모나스 종 균주 MA-C 세포의, 조성물 B의 포르메이트 함량을 감소시키기 위한 용도에 관한 것이다.

상기 언급된 용도에 따라, 포르메이트 함량은 바람직하게는 본 발명의 방법과 관련하여 본원에서 상기한 바와 같이 감소된다. 정의 및 설명들은 부합하여 적용된다.

본 발명의 바람직한 실시양태

하기에서는, 본 발명의 바람직한 실시양태들을 기술한다. 정의 및 설명은 필요한 변경을 가하여 적용된다.

1. (i) 과다염성 폐수를 포함하는 조성물 A를 제공하는 단계, 및

를 포함하며, 여기서 조성물 A는 조성물 A의 총 부피 기준 10% (w/v)를 초과하는 농도로 NaCl을 포함하는 것인, 과다염성 폐수의 포르메이트 함량을 감소시키는 방법.

2. 조성물 A가 조성물 A의 총 부피 기준 12.5% (w/v)를 초과하는 농도로 NaCl을 포함하는, 실시양태 1의 방법.

3. 조성물 A가 조성물 A의 총 부피 기준 15% (w/v)를 초과하는 농도로 NaCl을 포함하는, 실시양태 1의 방법.

4. 조성물 A가 과다염성 폐수로 이루어진, 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나의 방법.

5. 조성물 A가 50 mg/l를 초과하는 TOC 함량을 갖는, 실시양태 1 내지 4 중 어느 하나의 방법.

6. 조성물 A가 50 mg/l를 초과하는 양으로 포르메이트를 포함하는, 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나의 방법.

7. 조성물 B가 6.0 내지 8.0 범위, 바람직하게는 6.6 내지 7.4 범위의 pH 값을 갖는, 실시양태 1 내지 6 중 어느 것의 방법.

8. 포르메이트 함량의 감소가 15℃ 내지 45℃의 온도, 바람직하게는 18℃ 내지 32℃의 온도에서 수행되는, 실시양태 1 내지 7 중 어느 하나의 방법.

9. 회분식, 유가식, 또는 특히 세포를 보류하게 되는 생물 반응기에서 연속 공정으로 수행되는, 실시양태 1 내지 8 중 어느 하나의 방법.

10. 단계 (i)이 메틸렌 디아민 제조로부터 과다염성 폐수를 단리하는 것을 포함하는, 실시양태 1 내지 9 중 어느 하나의 방법.

11. 조성물 B가 10% (w/v)를 초과하는 농도로 NaCl을 포함하는, 실시양태 1 내지 10 중 어느 하나의 방법.

12. 조성물 B가 15% (w/v)를 초과하는 농도로 NaCl을 포함하는, 실시양태 1 내지 10 중 어느 하나의 방법.

13. 조성물 B가 아세테이트, 글루코스, 수크로스, 락테이트, 말레이트, 숙시네이트, 시트레이트 및 글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 기질을 추가로 포함하며, 상기 기질은 조성물 B에 첨가되는, 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나의 방법.

14. 조성물 B가 적어도 1 l의 부피를 갖는, 실시양태 1 내지 13 중 어느 하나의 방법.

15. 조성물 B로부터 할로모나스 종 균주 MA-C의 세포를 분리함으로써, 조성물 C를 제공하는 것을 추가로 포함하는, 실시양태 1 내지 14 중 어느 하나의 방법.

16. 조성물 C가 30 mg/l 미만의 TOC 함량을 갖는, 실시양태 15 중 임의 것의 방법.

17. 조성물 C가 15 mg/l 미만의 양으로 포르메이트를 포함하는, 실시양태 15 및 16의 방법.

18. 조성물 C를 농축함으로써 조성물 C^*를 제공하는 것을 추가로 포함하는, 실시양태 15 내지 17 중 어느 하나의 방법.

19. (a) 실시양태 15 내지 17 중 어느 하나의 방법에 따른 조성물 C 또는 실시양태 18의 방법에 따른 조성물 C^*를 제공하는 단계, 및

(b) (a)에 따른 조성물을 소듐 클로라이드 전기분해에 적용함으로써, 염소 및/또는 소듐 히드록시드를 생성시키는 단계

를 포함하는, 염소 및 소듐 히드록시드를 제조하는 방법.

20. 10% (w/v)를 초과하는 농도의 NaCl 및 포르메이트를 포함하는, 과다염성 폐수 및 할로모나스 종 균주 MA-C 세포의 조성물 B.

21. 실시양태 20의 조성물 적어도 1 l를 포함하는 생물반응기.

22. 할로모나스 종 균주 MA-C 세포의, 과다염성 폐수를 포함하며 조성물 A 총 부피 기준 10% (w/v)를 초과하는 농도의 NaCl 및 포르메이트를 포함하는 조성물 A의 포르메이트 함량을 감소시키기 위한 용도.

본 명세서에서 인용되는 모든 참고문헌은 그의 전체적인 개시 내용 및 본 명세서에서 구체적으로 언급된 개시 내용과 관련하여 의거 참조로써 개재된다.

도 1. MA-C 세포의 촉매촉진 활성 및 혼합 공급 시스템을 사용하는 연속 방식의 포르메이트를 함유하는 폐수의 생물학적 처리를 나타냄.
도 2. 다양한 당 및 유기 산 상에서의 할로모나스 종 MA-C 세포의 바이오매스 증가를 나타냄. 그래프는 기질로서의 포르메이트 상에서는 바이오매스 증가가 없음을 보여줌.
도 3. 다양한 염 농도에서의 250 mg/l 포르메이트 상에서의 할로모나스 종 MA-C 세포의 촉매촉진 활성을 나타냄. 더 낮은 염 농도 (0 내지 7% w/v NaCl)에서 더 빠른 포르메이트 촉매촉진이 이루어지기는 하지만, 더 높은 염 농도 (15 내지 20% w/v NaCl)에서도 효율적인 포르메이트 촉매촉진이 관찰되었음.
도 4. 반응 카운터 플롯은 최적의 포르메이트 촉매촉진이 더 낮은 NaCl 농도 및 더 높은 최초 포르메이트 농도에서 이루어진다는 것을 보여줌.
도 5. 포르메이트 촉매촉진에 대한 MA-C 세포 바이오매스 농도의 효과를 나타냄. 250 mg/l의 포르메이트를 위한 최적의 바이오매스 농도는 1.6 g/l임.
도 6. 계수 플롯은 포르메이트 촉매촉진에 대한 두 가지 인자인 최초 포르메이트 농도 및 바이오매스 농도의 중요성을 보여줌.
도 7. 14% w/v NaCl 및 250 mg/l의 포르메이트를 함유하는 염수 상에서의 MA-C 세포를 사용한 유가식 배양을 나타냄. 바이오매스는 공정 28시간까지 감소되며, 포르메이트는 약간 촉매촉진됨. 공정 28시간에서 아세테이트 펄스 (3.5 g/l)는 바이오매스 성장을 촉진하여, 즉각적인 포르메이트 촉매촉진이 이루어짐. 공정 120시간에는 아세테이트가 완전히 이용됨.
도 8. 14% w/v NaCl, 250 mg/l의 포르메이트 및 3.5 g/l의 아세테이트를 함유하는 염수 상에서의 MA-C 세포를 사용한 회분식 공정을 나타냄. 바이오매스 증가는 아세테이트로부터 수득됨. 공정 190 및 235시간에서의 2회의 포르메이트 펄스 첨가는 바이오매스 성장으로 이어지지 않음. 배출가스 중 CO₂ 백분율은 반응기 내의 바이오매스가 첫 번째 포르메이트 펄스를 완전히 CO₂로 촉매촉진할 수 있다는 것으로 보여줌. 두 번째 포르메이트 펄스는 완전히 촉매촉진되지 않음.

하기 실시예로써 단순히 본 발명을 예시하기로 한다. 해당 실시예들은 어떠한 것도 본 발명의 영역을 제한하는 방식으로 해석되어서는 아니 된다.

[ 실시예 ]

실시예 1: 진탕 플라스크 실험에서의 포르메이트 촉매촉진

균주 및 배지

dsmz - 독일 생물자원센터(German collection of microorganisms and cell cultures)로부터 MA-C로 지칭되는 할로모나스 종 (DSM 7328) 야생형 균주를 구매하였다. 접종물 조제용 진탕-플라스크 배양물을 하기의 조성 (g/l)을 갖는 dsmz가 제안한 배지 no. 1428을 사용하여 실험실 인큐베이터 (인포스(Infors) 사, 스위스 소재)에서 120 rpm 및 30℃하에 성장시켰다: NaCl 100, MgCl₂.6H₂O 10, KCl 1.0, Na₂SO₄ 0.5, 효모 추출물 5.0, 트립톤 5.0; pH 7.0. 500 ml 에를렌마이어 플라스크 및 배지는 항상 멸균하였다.

분석사항

12시간 간격으로 600 nm에서 쉬마주(Shimadzu) UV/Vis 분광광도계를 사용하여 세포 성장 지표로서의 탁도를 측정하였다. 배양 상청액 중 잔류 포르메이트 농도는 HPLC를 사용하여 측정하였다. HPLC (써모-피셔(Thermo-Fisher) 사) 방법은 30℃에서 바이오-래드(Bio-Rad) 사의 아미넥스(Aminex) HPX-87H 컬럼을 사용하고, 0.5 ml/분의 유량을 갖는 MQ수 중 0.1% TFA의 등용매 용리액에 후속하는 210 nm에서의 UV 검출을 사용하여 수행하였다. 20 μl의 주입 부피에 의한 정량 한계는 포르메이트의 경우 5 mg/l이었다. 정량에 사용된 표준은 샘플과 동일한 염 매트릭스에서 제조하였다.

진탕 플라스크에서의 포르메이트 연구

포르메이트 흡수 연구를 위하여, 합성 규정 배지(defined medium)를 제조하였다. g/l로 나타낸 배지 조성은 하기와 같다: NaCl 100, MgCl₂.6H₂O 10, KCl 1.0, 및 Na₂SO₄ 0.5, 다양한 농도의 나트륨 포르메이트 (50 내지 2000 mg/l) 첨가. pH는 7.0으로 조정하였다. 3000 rpm에서의 5분 동안의 원심분리에 의해, 하기를 함유하는 복합 배지 상에서 성장하는 세포를 수확하였다: 효모 추출물 5.0, 트립톤 5.0, NaCl 100, MgCl₂.6H₂O 10, KCl 1.0 및 Na₂SO₄ 0.5. 세포를 세척하고, 탄소 공급원으로서 포르메이트만을 포함하는 100 ml의 규정 배지를 함유하는 진탕-플라스크에 용해시킨 후, 30℃에서 120 rpm으로 교반하면서 인큐베이션하였다. 0시간 OD₆₀₀을 측정하고, 0시간에서의 HPLC 분석용으로 1 ml의 샘플을 저장하였다. 포르메이트 상에서의 성장 및 잔류 포르메이트 농도를 모니터링하였다.

할로모나스 종 MA-C의 세포는 성장을 위한 공급원으로서 포르메이트를 사용하는 데에는 실패하였으나, 시간 경과에 따른 잔류 포르메이트 농도를 측정하기 위한 HPLC 분석은 합성 배지 및 실제 염수 모두에서 배양된 배지로부터 포르메이트가 완전히 제거되었음을 보여주었다. 기타 공정 파라미터들을 조절할 수 있도록 하기 위하여, 진탕 플라스크는 물론 생물반응기에서의 더 많은 실험으로써 포르메이트 상에서의 세포의 촉매촉진 작용을 더욱 상세하게 조사하였다.

실시예 2: 여러 기질 상에서의 할로모나스 종 MA-C

기질로서의 다양한 당 및 유기 산 상에서의 성장에 대하여 균주를 연구하였다. 25 mM의 농도로 하기 중 어느 하나를 함유하는 멸균 배지를 제조하였다: 글루코스, 수크로스, 아세테이트, 락테이트, 시트레이트, 말레이트, 숙시네이트, 푸마레이트 및 당 알콜 글리세롤. 100 ml의 멸균 배지를 500 ml 에를렌마이어 플라스크로 옮기고, 균일한 농도의 세포를 각 플라스크에 첨가한 후, 30℃에서 120 rpm으로 교반하면서 플라스크를 추가 인큐베이션하였다.

할로모나스 종 MA-C는 본 연구에서 사용된 모든 당 및 유기 산들을 성장을 위한 공급원으로 이용할 수 있다 (도 2). 푸마레이트 상에서는 성장이 관찰되지 않았으며, 배양 상청액 중 푸마레이트 농도가 그대로 유지되었다. 이에 따라, 할로모나스 종 MA-C의 촉매촉진 활성은 포르메이트에 대하여 특이적인 것으로 결론을 지었다.

실시예 3: 포르메이트 촉매촉진을 위한 최적 배양 조건

다양한 염 농도에서 포르메이트에 대한 MA-C 세포의 촉매촉진 활성을 연구하였는데, 더 낮은 염 농도에서 더 우수한 포르메이트 촉매촉진이 이루어지기는 하였지만, 모든 NaCl 농도 (0 내지 20) % w/v에서 효율적인 포르메이트 촉매촉진이 이루어지는 것으로 관찰되었다 (도 3 및 도 4).

최적의 조건, 및 포르메이트에 대한 MA-C 세포의 촉매촉진 활성에 있어서의 다른 공정 파라미터들의 영향을 찾기 위하여, 부분 인자 설계(fractional factorial design)의 실험을 수행함으로써, 3종 파라미터 (델타 바이오매스 농도, 잔류 포르메이트 농도 및 pH)에 대한 4종 인자 (온도, pH, 포르메이트 농도 및 바이오매스 농도)의 영향을 평가하였다. 본 실험에서 연구된 인자들을 각 범위와 함께 (표 1)에 제시하였다.

<표 1>

본 연구를 위하여, 통계 도구인 모데(Modde)에 의해 19회의 실험이 제안되었다. 실험들은 진탕 플라스크의 14% w/v NaCl을 함유하는 실제 염수 상에서 수행하였다. 바이오매스 농도, pH 변화 및 잔류 포르메이트 농도는 24시간 간격으로 측정하였다. 수득된 측정치는 모데에 의해 분석하였다.

델타 포르메이트용으로 유효한 모델을 수득하였다. 계수 플롯은 포르메이트 촉매촉진에 대한 최초 바이오매스 농도의 영향을 보여주었다 (도 5). 더 높은 바이오매스 농도에서 더 우수한 포르메이트 제거가 수득될 수 있었다. 온도는 포르메이트 촉매촉진에 대하여 영향을 미치지 않는 것으로 보이나, 세포 생존을 위하여 더 낮은 온도가 제안되었다. (6 내지 8) 범위가 연구된 경우에서, pH는 포르메이트 촉매촉진에 대하여 중요성을 가지지 않았다 (도 6).

실시예 4: 생물반응기에서의 배양

진탕 플라스크 실험의 한계로 인하여, 더 이상의 조사는 공정 파라미터 및 배양 조건이 조절되는 반응기에서 수행하였다. 이와 같은 경우에서의 실험은 과다염성 환경에서의 배양에 적합한 특수 부식 내성 생물반응기 장비에서 수행하였다.

하기의 세부사항들을 동반하여, 특수 비-부식성 레이버포스 피크(Laborfors PEEK) (인포스(Infors) AG 사, 스위스 소재) 반응기를 이용하였다:

보로실리케이트 유리 배양 용기: 1 L 부피

보로실리케이트 유리 배기 가스 냉각

특수 부식 내성 중합체 (피크) 생물반응기 상부 뚜껑

특수 부식 내성 중합체 (피크) 온도계 홀더

보로실리케이트 유리 샘플링 튜브 및 기체 유입구 튜브

특수 부식 내성 교반기

반응기 용기 상의 보로실리케이트 유리 자켓

온라인 분석사항:

배기 가스 CO₂

배기 가스 O₂

유리 pH 프로브

하스텔로이 클라크(Hastelloy Clark) pO₂ 및

공기용 열 질량 유동 조절기

생물반응기 내 14% w/v의 NaCl 및 250 mg/l의 포르메이트를 함유하는 실제 염수 상에서의 할로모나스 종 MA-C 배양의 실현가능성을 조사하기 위하여, 회분식 공정을 수행하였다. 하기 배지 성분들을 염수에 추가로 첨가하였다: KCl 1 g/l, MgCl₂.6H₂O 10 g/l, Na₂SO₄ 0.5 g/l, 및 (Fe, Cu, Mn 및 Zn)을 함유하는 미량 원소 용액 2.5 ml.

온도: 30℃

pH: 7.0 (pH 조절용으로는 0.5 M HCl을 사용하였음)

교반: 300 rpm

공기 유입구: 0.2 vvm (NL/분).

공정 3.5시간에, 대략 0.5 g/l의 바이오매스 농도까지 반응기를 접종하였다. 다양한 시간 간격으로 OD₆₀₀ 및 잔류 포르메이트 농도를 측정하였다. 바이오매스 농도는 감소를 나타내었으며, 포르메이트는 어느 정도까지 촉매촉진되었는데 (도 7), 이 역시 포르메이트에 대한 MA-C 세포의 촉매촉진 작용을 확인해주었다. 포르메이트 촉매촉진의 생성물은 CO₂로써, 배출가스 분석기에 의해 측정하였다. MA-C 세포는 포르메이트만을 촉매촉진할 수 있으며 이와 같은 경우의 기질에서는 바이오매스가 형성되지 않기 때문에, 바이오매스를 생성시키기 위하여 제2의 기질을 공급하였다. 이전의 실험들에서 아세테이트 상에서의 성장이 다른 단순 기질들에 비해 더 고속으로 이루어질 수 있다는 것을 보여주었기 때문에, 저렴한 기질로서의 아세테이트는 산업 공정에서의 적합한 대안이 된다. 그에 따라, 아세테이트를 공정의 제2 기질로 선택하였다. 포르메이트 감소가 느렸기 때문에, 공정 시간 28시간차에 반응기에 아세테이트 펄스 (3 g/l)를 공급하였다. 바이오매스는 증가하기 시작하였으며, 형성된 새로운 바이오매스는 36.7시간에 포르메이트를 완전히 촉매촉진하였다. 공정 120시간 후에는, 아세테이트의 완전한 제거도 관찰할 수 있었다 (도 7). 연속 방식에서의 아세테이트 흡수 및 포르메이트 분해를 촉진하기 위하여, 배지 최적화를 수행하였다.

실시예 5: 연속 방식에서의 최적의 포르메이트 촉매촉진을 위한 배지 최적화

배지 최적화 목적으로, 전체 인자 설계(full factorial design)의 실험을 수행하여, 3종 파라미터 (바이오매스 농도, 델타 포르메이트 및 델타 아세테이트)에 대한 5종 인자 (마그네슘, 칼륨, 황, 질소 및 인)의 영향을 평가하였다. 모든 실험은 진탕 플라스크에서 250 mg/l의 포르메이트 및 3.5 g/l의 아세테이트 및 접종물로서의 동일 농도의 MA-C 세포를 사용하여 수행하였다. 부분 인자 설계를 위하여 통계 도구인 모데에 의해 19회의 실험이 제안되었으며, 2회의 대조 실험도 매트릭스에 추가하였다. 24시간마다 바이오매스, 그리고 잔류 포르메이트 및 아세테이트의 농도를 측정하였다. 72시간 후 수득된 결과를 반응에 대하여 분석하였다. 계수 플롯은 다른 인자들과 비교하였을 때의 최종 바이오매스 농도에 대한 질소 및 칼륨의 상당한 효과를 보여주었다. 또한, 5회의 실험으로부터 수득된 데이터가 최고의 최종 바이오매스 농도, 그리고 완전한 아세테이트 및 포르메이트 흡수를 보이는 것으로 나타났다. 이와 같은 실험에 사용된 성분 및 범위를 (표 2)에 나타내었다.

<표 2>

최고의 바이오매스 농도, 그리고 완전한 아세테이트 및 포르메이트 흡수를 나타낸 실험은 하기의 배지 성분 농도 (g/l)를 가졌다 (표 3).

<표 3>

실험 6: 연속 방식에서의 할로모나스 종 MA-C 세포에 의한 포르메이트 촉매촉진

균주 할로모나스 종 MA-C가 생물반응기에서 성공적으로 배양될 수 있고 공동-기질로서 아세테이트를 사용하여 포르메이트가 완전히 촉매촉진됨에 따라, 혼합 공급 시스템을 사용한 연속 제한 공정을 확립하였다. 첫 번째 과제는 산업 규모의 용도로 적용가능할 수 있기에 충분하게 높으면서도 여전히 최대 비성장률에 비해서는 더 낮은 MA-C의 최적 희석률을 위한 선택사항들을 밝히는 것이었다. 하기의 희석률을 실험하였다:

0.008 1/h

0.011 1/h

0.015 1/h

0.02 1/h

세척 제거(wash out)가 발생하였는데, 이는 해당 희석률이 아세테이트 상에서의 세포의 최대 비성장률에 비해 더 크다는 것을 의미한다. 사실상, 회분식 실험에서 최대 성장률은 0.02 1/h에 가까운 것으로 측정되었다. 더 높은 희석률을 적용하고 세척 제거를 방지하기 위해서는, 세포 보류의 사용이 필요한 것으로 보인다.

실험 전에, 3.5 g/l의 아세테이트와 함께 모든 배지 성분들을 염수에 첨가하였다. pH는 0.5 M HCl의 첨가에 의해 7.0으로 일정하게 유지하였다. 연속 공정으로부터 정상 상태를 수득하기 위하여, 바이오매스 농도를 측정하기 위한 샘플을 공정으로부터 수득하였다. HPLC에 의해 포르메이트 및 아세테이트의 잔류 농도를 측정하였는데, 정상 상태에서 아세테이트 및 포르메이트의 완전한 제거를 나타내었다. 처리된 염수의 TOC 함량 분석을 외부에서 수행하였는데, TOC 함량은 약 15 ppm까지의 상당한 감소를 나타내었다. 아세테이트 및 포르메이트 양자에 대하여 기질 상에서의 속도 및 수율 (산소: Y_O2/S, 이산화탄소: Y_CO2 _/S, 바이오매스: Y_X _/S)을 계산하였다. 전체적인 탄소 균형은 0.918 Cmol/Cmol로 계산되었다.

Claims

(i) 과다염성 폐수 및 포르메이트를 포함하는 조성물 A를 제공하는 단계, 및
(ii) 상기 조성물 A를 할로모나스(Halomonas) 종 균주 MA-C의 세포와 혼합함으로써, 과다염성 폐수 및 할로모나스 종 균주 MA-C를 포함하는 조성물 B를 생성시키는 단계
를 포함하며, 여기서 조성물 A는 조성물 A의 총 부피 기준 10% (w/v)를 초과하는 농도로 NaCl을 포함하는 것인, 과다염성 폐수의 포르메이트 함량을 감소시키는 방법.
제1항에 있어서, 조성물 A가 조성물 A의 총 부피 기준 12.5% (w/v)를 초과하는 농도로 NaCl을 포함하거나, 또는 조성물 A가 조성물 A의 총 부피 기준 15% (w/v)를 초과하는 농도로 NaCl을 포함하는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 조성물 A가 과다염성 폐수로 이루어진 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 A가 50 mg/l를 초과하는 양으로 포르메이트를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 포르메이트 함량의 감소가 15℃ 내지 45℃의 온도, 바람직하게는 18℃ 내지 30℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i)이 메틸렌 디아민 제조로부터 과다염성 폐수를 단리하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 B가 10% (w/v)를 초과하는 농도로 NaCl을 포함하거나, 또는 조성물 B가 15% (w/v)를 초과하는 농도로 NaCl을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 B가 아세테이트, 글루코스, 수크로스, 락테이트, 말레이트, 숙시네이트, 시트레이트 및 글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 기질을 추가로 포함하며, 상기 기질은 조성물 B에 첨가되는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 B로부터 할로모나스 종 균주 MA-C의 세포를 분리함으로써, 조성물 C를 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제9항에 있어서, 조성물 C가 30 mg/l 미만의 TOC 함량을 갖고/거나, 조성물 C가 15 mg/l 미만의 양으로 포르메이트를 포함하는 것인 방법.
제9항 또는 제10항에 있어서, 조성물 C를 농축함으로써 조성물 C^*를 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
(a) 제9항 또는 제10항의 방법에 따른 조성물 C 또는 제11항의 방법에 따른 조성물 C^*를 제공하는 단계, 및
(b) (a)에 따른 조성물을 소듐 클로라이드 전기분해 공정에 적용함으로써, 염소 및 소듐 히드록시드를 생성시키는 단계
를 포함하는, 염소 및/또는 소듐 히드록시드를 제조하는 방법.
제12항에 있어서, 소듐 클로라이드 전기분해가, 소듐 클로라이드의 멤브레인 전지 전기분해, 특히 산소 소비 전극을 사용하는 멤브레인 전기분해, 소듐 클로라이드의 격막 전지 전기분해 및 소듐 클로라이드의 수은 전지 전기분해로부터 선택된 것인 방법.
10% (w/v)를 초과하는 농도의 NaCl 및 포르메이트를 포함하는, 과다염성 폐수 및 할로모나스 종 균주 MA-C 세포의 조성물 B, 및/또는 상기 조성물 적어도 1 l를 포함하는 생물반응기.
과다염성 폐수를 포함하며 조성물 A 총 부피 기준 10% (w/v)를 초과하는 농도의 NaCl 및 포르메이트를 포함하는 조성물 A의 포르메이트 함량을 감소시키기 위한, 할로모나스 종 균주 MA-C 세포의 용도.