JP2017118874A - 有機酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】効率よく有機酸を製造することのできる新たな方法の提供。【解決手段】糸状菌を用いて、培地中の炭素源から有機酸を製造する方法であって、炭素源を含み、かつ、溶存酸素濃度を８ｐｐｍ以上、３５ｐｐｍ以下に制御した液体培地にて糸状菌を培養し、有機酸を得る、有機酸の製造方法。【選択図】なし
Description
本発明は、有機酸、特にフマル酸の製造方法に関する。
フマル酸は、アルキド樹脂等のプラスチック原料、食品添加物、入浴剤、アスパラギン酸等の基礎化学品へ変換する中間原料等として利用されている。工業的にフマル酸はベンゼンやブタンを原料とした石油化学製品として製造されているが、近年、化石資源の枯渇及び地球温暖化等の環境側面から、再生可能な資源を用いてフマル酸を製造することが求められている。
再生可能な資源を用いたフマル酸の製造方法としては、例えば、糖類からリゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍｅｒ）等の糸状菌の培養によりフマル酸を生成させる方法が知られている。
糸状菌の培養においては、フマル酸は主に炭素源から生じたピルビン酸から始まる還元的ＴＣＡ回路において生成されると考えられている。一方で、ピルビン酸からエタノールを生成する経路も存在するため、糸状菌によるフマル酸の生成には副産物としてエタノールが生成するという問題がある。そのため、エタノールの副生成を抑制し、且つフマル酸への変換率を高めることはフマル酸製造の効率化に重要である。
従来、フマル酸の生成収率を向上するための技術としては、例えば、炭素源からなる培養媒体中にＲｈｉｚｏｐｕｓ属の菌カビを増殖させることによるフマル酸製造のための発酵工程において、培養媒体中に溶解した酸素の濃度を、細胞増殖段階において飽和の約８０〜１００％そして酸生産段階において飽和の約３０〜８０％に保持する方法が報告されている（特許文献１）。
糸状菌の培養においては、フマル酸は主に炭素源から生じたピルビン酸から始まる還元的ＴＣＡ回路において生成されると考えられている。一方で、ピルビン酸からエタノールを生成する経路も存在するため、糸状菌によるフマル酸の生成には副産物としてエタノールが生成するという問題がある。そのため、エタノールの副生成を抑制し、且つフマル酸への変換率を高めることはフマル酸製造の効率化に重要である。
従来、フマル酸の生成収率を向上するための技術としては、例えば、炭素源からなる培養媒体中にＲｈｉｚｏｐｕｓ属の菌カビを増殖させることによるフマル酸製造のための発酵工程において、培養媒体中に溶解した酸素の濃度を、細胞増殖段階において飽和の約８０〜１００％そして酸生産段階において飽和の約３０〜８０％に保持する方法が報告されている（特許文献１）。
しかしながら、本発明者が前記特許文献１に記載している培地中に溶解した酸素の濃度をフマル酸生産段階において飽和の約３０〜８０％、すなわち２．１〜５．７ｐｐｍの範囲に制御して糸状菌の培養工程を行ったところ、エタノールが多く生成し、十分なフマル酸の生成収率が得られない場合があることが判明した。
従って、本発明は、効率よく有機酸、特にフマル酸を製造することのできる新たな方法を提供することに関する。
従って、本発明は、効率よく有機酸、特にフマル酸を製造することのできる新たな方法を提供することに関する。
本発明者は、糸状菌による有機酸収率を向上させるべく検討した結果、糸状菌の培養時に炭素源を含む液体培地の溶存酸素濃度を増加させ、所定範囲内に制御することで、炭素源からのエタノールの副生成が抑えられ、且つ有機酸への変換率が高くなることを見出した。
すなわち、本発明は、糸状菌を用いて、培地中の炭素源から有機酸を製造する方法であって、炭素源を含み、かつ、溶存酸素濃度を８ｐｐｍ以上、３５ｐｐｍ以下に制御した液体培地にて糸状菌を培養し、有機酸を得る、有機酸の製造方法を提供するものである。
本発明によれば、炭素源から有機酸への変換率を向上させることができ、糸状菌を用いて高い収率で有機酸を製造することができる。
本発明の有機酸の製造方法は、炭素源を含み、かつ、溶存酸素濃度を８ｐｐｍ以上、３５ｐｐｍ以下に制御した液体培地にて糸状菌を培養し、有機酸を得る、ものである。
本発明において有機酸とは、糸状菌の培養の過程により炭素源から生産される有機酸であり、例えば、フマル酸、乳酸、イタコン酸、リンゴ酸、ピルビン酸等が挙げられる。なかでも、好ましくは、フマル酸、ピルビン酸、乳酸及びリンゴ酸から選ばれる少なくとも１種であり、更に好ましくはフマル酸、ピルビン酸であり、更に好ましくはフマル酸である。
（糸状菌）
本発明に用いられる糸状菌としては、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属に属する微生物等が挙げられる。例えば、リゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ）、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、ムコール・マンドシュリクス（Ｍｕｃｏｒ ｍａｎｄｓｈｕｒｉｃｕｓ）等が挙げられる。
なかでも、有機酸の高い生産性の観点から、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属菌が好ましく、リゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ Ｄｅｌｅｍｅｒ）、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）がより好ましい。
本発明に用いられる糸状菌としては、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属に属する微生物等が挙げられる。例えば、リゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ）、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、ムコール・マンドシュリクス（Ｍｕｃｏｒ ｍａｎｄｓｈｕｒｉｃｕｓ）等が挙げられる。
なかでも、有機酸の高い生産性の観点から、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属菌が好ましく、リゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ Ｄｅｌｅｍｅｒ）、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）がより好ましい。
本発明においては、糸状菌をペレット状、綿状、塊状、固定化糸状菌の形態で単独で用いても、混合物として用いてもよい。ここで、本明細書において「ペレット状」とは、液体培養により菌糸が自発的に形成した数百μｍ〜数ｍｍの大きさの菌糸塊をいう。また、「綿状」とは、菌糸が数十μｍの大きさでまばらに存在する糸状菌をいう。「塊状」とは、菌糸同士が凝集し、数十ｍｍ以上の大きさに成長した菌糸塊をいう。「固定化糸状菌」とは、担体に保持又は包埋された糸状菌をいう。
なかでも、有機酸の高い生産性の観点及び取扱い性の観点から、好ましくは糸状菌ペレット、固定化糸状菌であり、より好ましくは糸状菌ペレットである。
これらは、商業的に入手したものを使用してもよい。また、例えば、糸状菌ペレットや固定化糸状菌は、次の工程により調製したものを使用してもよい。
なかでも、有機酸の高い生産性の観点及び取扱い性の観点から、好ましくは糸状菌ペレット、固定化糸状菌であり、より好ましくは糸状菌ペレットである。
これらは、商業的に入手したものを使用してもよい。また、例えば、糸状菌ペレットや固定化糸状菌は、次の工程により調製したものを使用してもよい。
（糸状菌ペレットの調製工程）
糸状菌ペレットは、培養により調製することができる。
培養に用いる培地としては、糸状菌を生育可能な液体培地であれば、合成培地、天然培地及び天然成分を添加した半合成培地のいずれでもよい。培地には、後述するような炭素源、窒素源、無機塩等が含まれるのが一般的であるが、各成分組成は適宜選択可能である。
培養条件としては、培養温度が、糸状菌ペレットの生育の観点から、好ましくは２０℃以上、より好ましくは２５℃以上であり、また、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３０℃以下である。また、培地のｐＨ（２５℃）は、糸状菌ペレットの生育の観点から、好ましくは２以上、より好ましくは３以上であり、また、好ましくは７以下、より好ましくは６以下である。
培養方法は、公知の方法を採用することができる。例えば、糸状菌の胞子を液体培地に植菌後、胞子を発芽させて菌糸とし、その菌糸から菌体を形成させペレット化させる。この培養は、通常、好気的条件で行われる。
培養期間は、糸状菌の胞子を液体培地に植菌後、糸状菌ペレットの生育の観点から、好ましくは１日以上、より好ましくは３日以上であり、また、好ましくは７日以内、より好ましくは６日以内である。
培養に用いる培養槽は、従来公知のものを適宜採用することができる。具体的には、通気撹拌型培養槽、気泡塔型培養槽、流動床培養槽等が挙げられ、通気条件は、糸状菌ペレットの生育の観点から、好ましくは０．１ｖｖｍ以上、より好ましくは０．３ｖｖｍ以上であり、また、好ましくは４ｖｖｍ以下、より好ましくは２ｖｖｍ以下である。
培養後、糸状菌ペレットは、培養液と共に培養槽から抜き出して、ろ別、遠心分離等の簡便な操作により分離回収し有機酸を生成する培養工程に使用することができるが、培養槽に糸状菌ペレットを残し、同一培養槽で培養工程を行うことも可能である。
また、本工程は２以上の工程に更に分けて行うこともできる。
糸状菌ペレットは、培養により調製することができる。
培養に用いる培地としては、糸状菌を生育可能な液体培地であれば、合成培地、天然培地及び天然成分を添加した半合成培地のいずれでもよい。培地には、後述するような炭素源、窒素源、無機塩等が含まれるのが一般的であるが、各成分組成は適宜選択可能である。
培養条件としては、培養温度が、糸状菌ペレットの生育の観点から、好ましくは２０℃以上、より好ましくは２５℃以上であり、また、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３０℃以下である。また、培地のｐＨ（２５℃）は、糸状菌ペレットの生育の観点から、好ましくは２以上、より好ましくは３以上であり、また、好ましくは７以下、より好ましくは６以下である。
培養方法は、公知の方法を採用することができる。例えば、糸状菌の胞子を液体培地に植菌後、胞子を発芽させて菌糸とし、その菌糸から菌体を形成させペレット化させる。この培養は、通常、好気的条件で行われる。
培養期間は、糸状菌の胞子を液体培地に植菌後、糸状菌ペレットの生育の観点から、好ましくは１日以上、より好ましくは３日以上であり、また、好ましくは７日以内、より好ましくは６日以内である。
培養に用いる培養槽は、従来公知のものを適宜採用することができる。具体的には、通気撹拌型培養槽、気泡塔型培養槽、流動床培養槽等が挙げられ、通気条件は、糸状菌ペレットの生育の観点から、好ましくは０．１ｖｖｍ以上、より好ましくは０．３ｖｖｍ以上であり、また、好ましくは４ｖｖｍ以下、より好ましくは２ｖｖｍ以下である。
培養後、糸状菌ペレットは、培養液と共に培養槽から抜き出して、ろ別、遠心分離等の簡便な操作により分離回収し有機酸を生成する培養工程に使用することができるが、培養槽に糸状菌ペレットを残し、同一培養槽で培養工程を行うことも可能である。
また、本工程は２以上の工程に更に分けて行うこともできる。
（固定化糸状菌の調製工程）
固定化糸状菌は、培養により調製することができる。
培養方法は、公知の方法を採用することができる。例えば、糸状菌の胞子を糸状菌固定化担体の存在する液体培地に植菌後、胞子を発芽させて菌糸とし、担体内へ捕捉された菌糸から固定化糸状菌を調製する。固定化担体として、ウレタン系重合体、オレフィン系重合体、ジエン系重合体、縮合系重合体、シリコーン系重合体、又はフッ素系重合体等が利用可能である。
担体の形状としては、平板状、多層板状、波板状、四面体状、球状、紐状、網状、円柱状、格子状、円筒状等のいずれの形状のものでもよい。
尚、糸状菌の固定化に使用する培地及び培養槽としては前述の糸状菌ペレットと同様のものを使用することが可能であり、また培養条件についても前述の糸状菌ペレットと同様の条件を採用することができる。
更に、培養後、固形化糸状菌は、糸状菌ペレットと同様の操作により分離回収し有機酸を生成する培養工程に使用することができるが、培養槽に固定化糸状菌を残し、同一培養槽で培養工程を行うことも可能である。
また、本工程は２以上の工程に更に分けて行うこともできる。
固定化糸状菌は、培養により調製することができる。
培養方法は、公知の方法を採用することができる。例えば、糸状菌の胞子を糸状菌固定化担体の存在する液体培地に植菌後、胞子を発芽させて菌糸とし、担体内へ捕捉された菌糸から固定化糸状菌を調製する。固定化担体として、ウレタン系重合体、オレフィン系重合体、ジエン系重合体、縮合系重合体、シリコーン系重合体、又はフッ素系重合体等が利用可能である。
担体の形状としては、平板状、多層板状、波板状、四面体状、球状、紐状、網状、円柱状、格子状、円筒状等のいずれの形状のものでもよい。
尚、糸状菌の固定化に使用する培地及び培養槽としては前述の糸状菌ペレットと同様のものを使用することが可能であり、また培養条件についても前述の糸状菌ペレットと同様の条件を採用することができる。
更に、培養後、固形化糸状菌は、糸状菌ペレットと同様の操作により分離回収し有機酸を生成する培養工程に使用することができるが、培養槽に固定化糸状菌を残し、同一培養槽で培養工程を行うことも可能である。
また、本工程は２以上の工程に更に分けて行うこともできる。
（炭素源を含む液体培地）
本発明で有機酸の生成に用いられる液体培地は炭素源を含む。
液体培地は、合成培地、天然培地、或いは合成培地に天然成分を添加した半合成培地のいずれであってもよい。
炭素源としては、グリセリン、ソルビトール、糖類が挙げられ、有機酸の高い生産性の観点から、好ましくは糖類である。
糖類としては、グルコース、フルクトース、キシロース等の単糖類、スクロース、ラクトース、マルトース等の二糖類が挙げられる。糖類は無水物又は水和物であってもよい。なかでも、炭素源は、有機酸の高い生産性の観点から、グルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、ラクトース、マルトース、ソルビトールが好ましく、グルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、ラクトース、マルトースがより好ましく、グルコースが更に好ましい。
本発明で有機酸の生成に用いられる液体培地は炭素源を含む。
液体培地は、合成培地、天然培地、或いは合成培地に天然成分を添加した半合成培地のいずれであってもよい。
炭素源としては、グリセリン、ソルビトール、糖類が挙げられ、有機酸の高い生産性の観点から、好ましくは糖類である。
糖類としては、グルコース、フルクトース、キシロース等の単糖類、スクロース、ラクトース、マルトース等の二糖類が挙げられる。糖類は無水物又は水和物であってもよい。なかでも、炭素源は、有機酸の高い生産性の観点から、グルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、ラクトース、マルトース、ソルビトールが好ましく、グルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、ラクトース、マルトースがより好ましく、グルコースが更に好ましい。
液体培地中の炭素源の濃度は、有機酸の高い生産性の観点から、好ましくは１質量％以上、より好ましくは２質量％以上、更に好ましくは３質量％以上であって、また、好ましくは４０質量％以下、より好ましくは３０質量％以下、更に好ましくは２０質量％以下、更により好ましくは１５質量％以下である。
液体培地には、炭素源の他、窒素源、無機塩類、その他必要な栄養源が含まれていてもよい。また、使用する炭素源に培養に適切な濃度の上記栄養源が含まれている場合には、炭素源のみを用いることも可能である。
窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム等の含窒素化合物が挙げられる。
液体培地中の窒素濃度は、有機酸の高い生産性の観点から、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．００２質量％以上、更に好ましくは０．００４質量％以上であり、また、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０８質量％以下、更に好ましくは０．０６質量％以下である。
窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム等の含窒素化合物が挙げられる。
液体培地中の窒素濃度は、有機酸の高い生産性の観点から、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．００２質量％以上、更に好ましくは０．００４質量％以上であり、また、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０８質量％以下、更に好ましくは０．０６質量％以下である。
無機塩としては、硫酸塩、マグネシウム塩、亜鉛塩等が挙げられる。硫酸塩の例としては、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、硫酸カリウム、硫酸ナトリウム等が挙げられる。マグネシウム塩の例としては、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。亜鉛塩の例としては、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、塩化亜鉛等が挙げられる。
液体培地中の硫酸イオン濃度は、有機酸の高い生産性の観点から、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．００５質量％以上、更に好ましくは０．０１質量％以上であり、また、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０８質量％以下、更に好ましくは０．０４質量％以下である。
また、液体培地中のマグネシウムイオン濃度は、有機酸の高い生産性の観点から、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．００２質量％以上であり、また、好ましくは０．５質量％以下、より好ましくは０．２質量％以下、更に好ましくは０．１質量％以下である。
また、液体培地中の亜鉛イオン濃度は、有機酸の高い生産性の観点から、好ましくは０．００００１質量％以上、より好ましくは０．００００５質量％以上であり、また、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０１質量％以下、更に好ましくは０．００５質量％以下である。
液体培地中の硫酸イオン濃度は、有機酸の高い生産性の観点から、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．００５質量％以上、更に好ましくは０．０１質量％以上であり、また、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０８質量％以下、更に好ましくは０．０４質量％以下である。
また、液体培地中のマグネシウムイオン濃度は、有機酸の高い生産性の観点から、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．００２質量％以上であり、また、好ましくは０．５質量％以下、より好ましくは０．２質量％以下、更に好ましくは０．１質量％以下である。
また、液体培地中の亜鉛イオン濃度は、有機酸の高い生産性の観点から、好ましくは０．００００１質量％以上、より好ましくは０．００００５質量％以上であり、また、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０１質量％以下、更に好ましくは０．００５質量％以下である。
液体培地のｐＨ（３５℃）は、菌体の生育や、有機酸の高い生産性の観点から、好ましくは２以上、より好ましくは３以上であり、また、好ましくは７以下、より好ましくは６以下である。
液体培地のｐＨ（３５℃）は、好ましくは２〜７、より好ましくは３〜６である。ｐＨ制御は、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、炭酸カルシウム、アンモニア等の塩基、硫酸、塩酸等の酸を用いて行うことができる。
液体培地のｐＨ（３５℃）は、好ましくは２〜７、より好ましくは３〜６である。ｐＨ制御は、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、炭酸カルシウム、アンモニア等の塩基、硫酸、塩酸等の酸を用いて行うことができる。
（培養方法）
有機酸の生成は、上記液体培地で糸状菌を培養することにより行なわれる。培養の条件は、通常の培養条件に従えばよい。例えば、培養温度は、菌体の生育や、有機酸、特にフマル酸の高い生産性の観点から、好ましくは２０℃以上、より好ましくは３０℃以上であって、また、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３７℃以下である。
培養に用いる培養槽は、従来公知のものを適宜採用することができるが、有機酸、特にフマル酸の高い生産性の観点から、好ましくは、通気撹拌型培養槽、気泡塔型培養槽、及び流動床培養槽であり、回分式、半回分式及び連続式のいずれで行ってもよい。
培養期間は、適宜調整することができる。
有機酸の生成は、上記液体培地で糸状菌を培養することにより行なわれる。培養の条件は、通常の培養条件に従えばよい。例えば、培養温度は、菌体の生育や、有機酸、特にフマル酸の高い生産性の観点から、好ましくは２０℃以上、より好ましくは３０℃以上であって、また、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３７℃以下である。
培養に用いる培養槽は、従来公知のものを適宜採用することができるが、有機酸、特にフマル酸の高い生産性の観点から、好ましくは、通気撹拌型培養槽、気泡塔型培養槽、及び流動床培養槽であり、回分式、半回分式及び連続式のいずれで行ってもよい。
培養期間は、適宜調整することができる。
本発明において、有機酸、特にフマル酸の生成は、溶存酸素濃度が８ｐｐｍ以上、３５ｐｐｍ以下に制御された液体培地で行われる。
培養工程における液体培地中の溶存酸素濃度は、エタノールの副生を抑え、有機酸、特にフマル酸の収率を向上させる観点から、好ましくは８．５ｐｐｍ以上、より好ましくは９ｐｐｍ以上、更に好ましくは１２ｐｐｍ以上、更により好ましくは１５ｐｐｍ以上、更により好ましくは２８ｐｐｍ以上であり、また、好ましくは３４ｐｐｍ以下、更に好ましくは３３ｐｐｍ以下である。
液体培地中の溶存酸素濃度は、好ましくは８．５〜３４ｐｐｍ、より好ましくは９〜３３ｐｐｍ、更に好ましくは１２〜３３ｐｐｍ、更に好ましくは１５〜３３ｐｐｍ、更に好ましくは２８〜３３ｐｐｍである。
尚、液体培地中の溶存酸素濃度の制御は、好ましくは経時的に溶存酸素濃度をモニターしながら行われ、当該溶存酸素濃度は、後記実施例記載の方法によって測定することができる。
培養工程における液体培地中の溶存酸素濃度は、エタノールの副生を抑え、有機酸、特にフマル酸の収率を向上させる観点から、好ましくは８．５ｐｐｍ以上、より好ましくは９ｐｐｍ以上、更に好ましくは１２ｐｐｍ以上、更により好ましくは１５ｐｐｍ以上、更により好ましくは２８ｐｐｍ以上であり、また、好ましくは３４ｐｐｍ以下、更に好ましくは３３ｐｐｍ以下である。
液体培地中の溶存酸素濃度は、好ましくは８．５〜３４ｐｐｍ、より好ましくは９〜３３ｐｐｍ、更に好ましくは１２〜３３ｐｐｍ、更に好ましくは１５〜３３ｐｐｍ、更に好ましくは２８〜３３ｐｐｍである。
尚、液体培地中の溶存酸素濃度の制御は、好ましくは経時的に溶存酸素濃度をモニターしながら行われ、当該溶存酸素濃度は、後記実施例記載の方法によって測定することができる。
液体培地中の溶存酸素濃度は、通気酸素濃度、通気速度（通気量）、撹拌回転数、圧力等によって制御することができる。
本発明において、通気酸素濃度は、培地に供給される気体中の酸素濃度であり、溶存酸素濃度を８ｐｐｍ以上、３５ｐｐｍ以下に制御する観点から、２１％（体積比率、以下同じ）以上であり、好ましくは３５％以上、より好ましくは４０％以上である。上限としては、１００％とするのが好ましい。通気酸素濃度は培養挙動に合わせて変化させてもよい。酸素濃度が２１％以上の気体を得る方法としては、例えば、深冷分離法やＰＳＡ法（吸着法）、膜分離法等が挙げられる。
本発明において、通気酸素濃度は、培地に供給される気体中の酸素濃度であり、溶存酸素濃度を８ｐｐｍ以上、３５ｐｐｍ以下に制御する観点から、２１％（体積比率、以下同じ）以上であり、好ましくは３５％以上、より好ましくは４０％以上である。上限としては、１００％とするのが好ましい。通気酸素濃度は培養挙動に合わせて変化させてもよい。酸素濃度が２１％以上の気体を得る方法としては、例えば、深冷分離法やＰＳＡ法（吸着法）、膜分離法等が挙げられる。
通気速度（通気量）は、好ましくは０．１ｖｖｍ以上、より好ましくは０．２ｖｖｍ以上であって、また、好ましくは２ｖｖｍ以下、より好ましくは１ｖｖｍ以下である。
また、撹拌回転数は、培地に供給された気体を分散する条件が好ましく、スケールに合わせて適宜調整することが出来る。圧力は常圧から微加圧の条件が好ましく、加圧する場合は、０〜０．１ＭＰａの範囲が好ましい。
また、撹拌回転数は、培地に供給された気体を分散する条件が好ましく、スケールに合わせて適宜調整することが出来る。圧力は常圧から微加圧の条件が好ましく、加圧する場合は、０〜０．１ＭＰａの範囲が好ましい。
有機酸、特にフマル酸の生成においては、生成する有機酸によって培養液中のｐＨが低下するので中和剤を用いて中和しながら培養を進めるのが一般的である。
ｐＨ調整に用いる中和剤は、例えば、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の炭酸塩、アンモニウム化合物及びこれらの混合物が挙げられる。なかでも、有機酸、特にフマル酸の高い生産性の観点から、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、アンモニア水、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウムであり、より好ましくは水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムであり、更に好ましくは水酸化ナトリウムである。これらは単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
尚、生成した有機酸は、中和剤と塩を形成し、有機酸塩の形で存在していてもよい。
ｐＨ調整に用いる中和剤は、例えば、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の炭酸塩、アンモニウム化合物及びこれらの混合物が挙げられる。なかでも、有機酸、特にフマル酸の高い生産性の観点から、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、アンモニア水、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウムであり、より好ましくは水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムであり、更に好ましくは水酸化ナトリウムである。これらは単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
尚、生成した有機酸は、中和剤と塩を形成し、有機酸塩の形で存在していてもよい。
このような培養により、培地中に有機酸が蓄積する。
有機酸を含有する培養液は、培養終了後、適当な分離手段、例えば、遠心分離や精密濾過等の膜処理より培養物から微生物等の不溶物を除去することが好ましい。これらは培養槽内で行ってもよく、一度槽外に抜き出して行ってもよい。一方、培養液から分離された糸状菌は、有機酸生産に再利用することができる。
有機酸を含有する培養液は、培養終了後、適当な分離手段、例えば、遠心分離や精密濾過等の膜処理より培養物から微生物等の不溶物を除去することが好ましい。これらは培養槽内で行ってもよく、一度槽外に抜き出して行ってもよい。一方、培養液から分離された糸状菌は、有機酸生産に再利用することができる。
本発明によれば、炭素源からのエタノールの副生成が抑えられ、且つ有機酸への変換率を向上させることができる。具体的には、４０％以上、より好ましくは５０％以上の変換率でグルコースから有機酸を製造することができる。
ここで、有機酸変換率（％）とは、培養後に生成した有機酸濃度を、有機酸の培養生産おいて消費したグルコース濃度で割った値である。有機酸変換率の算出方法の詳細は実施例に記載した。
ここで、有機酸変換率（％）とは、培養後に生成した有機酸濃度を、有機酸の培養生産おいて消費したグルコース濃度で割った値である。有機酸変換率の算出方法の詳細は実施例に記載した。
得られた有機酸を含有する培養液は、必要に応じて濃縮した後、晶析法、イオン交換法、溶剤抽出法、あるいは有機酸をアルカリ土類金属塩として析出させた後析出物を酸分解する方法等により、培養液から有機酸を分離し回収することができる。
上述した実施形態に関し、本発明は更に以下の製造方法を開示する。
＜１＞糸状菌を用いて、培地中の炭素源から有機酸を製造する方法であって、炭素源を含み、かつ、溶存酸素濃度を８ｐｐｍ以上、３５ｐｐｍ以下に制御した液体培地にて糸状菌を培養し、有機酸を得る、有機酸の製造方法。
＜２＞糸状菌が、好ましくはリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、又はムコール（Ｍｕｃｏｒ）属に属する微生物であり、より好ましくはリゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ）、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、又はムコール・マンドシュリクス（Ｍｕｃｏｒ ｍａｎｄｓｈｕｒｉｃｕｓ）である＜１＞に記載の有機酸の製造方法。
＜３＞糸状菌が、好ましくはリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属菌であり、より好ましくはリゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ Ｄｅｌｅｍｅｒ）、又はリゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）である＜１＞に記載の有機酸の製造方法。
＜４＞糸状菌が、好ましくはペレット状、綿状、塊状、及び固定化糸状菌から選ばれる形態であり、より好ましくは糸状菌ペレット、及び固定化糸状菌から選ばれる形態であり、更に好ましくは糸状菌ペレットである＜１＞〜＜３＞のいずれか１に記載の有機酸の製造方法。
＜５＞炭素源が、好ましくはグリセリン、ソルビトール、及び糖類から選ばれる少なくとも１種であり、より好ましくは糖類であり、また、より好ましくはグルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、ラクトース、マルトース、及びソルビトールから選ばれる少なくとも１種であり、更に好ましくはグルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、ラクトース、及びマルトースから選ばれる少なくとも１種であり、更に好ましくはグルコースである＜１＞〜＜４＞のいずれか１に記載の有機酸の製造方法。
＜６＞液体培地中の炭素源の濃度が、好ましくは１質量％以上、より好ましくは２質量％以上、更に好ましくは３質量％以上であって、また、好ましくは４０質量％以下、より好ましくは３０質量％以下、更に好ましくは２０質量％以下、更により好ましくは１５質量％以下であり、また、好ましくは１〜４０質量％、より好ましくは２〜３０質量％、更に好ましくは３〜２０質量％、更に好ましくは３〜２０質量％である＜１＞〜＜５＞のいずれか１に記載の有機酸の製造方法。
＜７＞液体培地が、好ましくは窒素源及び無機塩類を更に含む＜１＞〜＜６＞のいずれか１に記載の有機酸の製造方法。
＜８＞窒素源が、好ましくは硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸カリウム、又は硝酸ナトリウムであり、無機塩が、好ましくは硫酸塩、マグネシウム塩、又は亜鉛塩であり、より好ましくは硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、硫酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、又は塩化亜鉛である＜１＞〜＜７＞のいずれか１に記載の有機酸の製造方法。
＜９＞液体培地中の窒素濃度が、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．００２質量％以上、更に好ましくは０．００４質量％以上であり、また、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０８質量％以下、更に好ましくは０．０６質量％以下であり、また、好ましくは０．００１〜０．１質量％、より好ましくは０．００２〜０．０８質量％、更に好ましくは０．００４〜０．０６質量％である＜７＞又は＜８＞に記載の有機酸の製造方法。
＜１０＞液体培地中の硫酸イオン濃度が、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．００５質量％以上、更に好ましくは０．０１質量％以上であり、また、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０８質量％以下、更に好ましくは０．０４質量％以下であり、好ましくは０．００１〜０．１質量％、より好ましくは０．００５〜０．０８質量％、更に好ましくは０．０１〜０．０４質量％である＜７＞又は＜８＞に記載の有機酸の製造方法。
＜１１＞液体培地中のマグネシウムイオン濃度が、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．００２質量％以上であり、また、好ましくは０．５質量％以下、より好ましくは０．２質量％以下、更に好ましくは０．１質量％以下であり、また、好ましくは０．００１〜０．５質量％、より好ましくは０．００２〜０．２質量％、更に好ましくは０．００２〜０．１質量％である＜７＞又は＜８＞に記載の有機酸の製造方法。
＜１２＞液体培地中の亜鉛イオン濃度が、好ましくは０．００００１質量％以上、より好ましくは０．００００５質量％以上であり、また、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０１質量％以下、更に好ましくは０．００５質量％以下であり、また、好ましくは０．００００１〜０．１質量％、より好ましくは０．００００５〜０．０１質量％、更に好ましくは０．００００５〜０．００５質量％である＜７＞又は＜８＞に記載の有機酸の製造方法。
＜１３＞液体培地のｐＨ（３５℃）が、好ましくは２以上、より好ましくは３以上であり、また、好ましくは７以下、より好ましくは６以下であり、また、好ましくは２〜７、より好ましくは３〜６である＜１＞〜＜１２＞のいずれか１に記載の有機酸の製造方法。
＜１４＞培養温度が、好ましくは２０℃以上、より好ましくは３０℃以上であって、また、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３７℃以下であり、また、好ましくは２０〜４０℃、より好ましくは３０〜３７℃である＜１＞〜＜１３＞のいずれか１に記載の有機酸の製造方法。
＜１５＞液体培地中の溶存酸素濃度が、好ましくは８．５ｐｐｍ以上、より好ましくは９ｐｐｍ以上、更に好ましくは１２ｐｐｍ以上、更により好ましくは１５ｐｐｍ以上、更により好ましくは２８ｐｐｍ以上であり、また、好ましくは３４ｐｐｍ以下、更に好ましくは３３ｐｐｍ以下であり、また、好ましくは８．５〜３４ｐｐｍ、より好ましくは９〜３３ｐｐｍ、更に好ましくは１２〜３３ｐｐｍ、更に好ましくは１５〜３３ｐｐｍ、更に好ましくは２８〜３３ｐｐｍである＜１＞〜＜１４＞のいずれか１に記載の有機酸の製造方法。
＜１６＞液体培地中の溶存酸素濃度を、好ましくは通気酸素濃度、通気速度（通気量）、撹拌回転数、又は圧力によって制御する＜１＞〜＜１５＞のいずれか１に記載の有機酸の製造方法。
＜１７＞通気酸素濃度が、好ましくは２１％（体積比率、以下同じ）以上、より好ましくは３５％以上、より好ましくは４０％以上であり、また、好ましくは１００％以下であり、また、好ましくは２１〜１００％、より好ましくは３５〜１００％、更に好ましくは４０〜１００％である＜１６＞に記載の有機酸の製造方法。
＜１８＞通気速度（通気量）が、好ましくは０．１ｖｖｍ以上、より好ましくは０．２ｖｖｍ以上であって、また、好ましくは２ｖｖｍ以下、より好ましくは１ｖｖｍ以下であり、また、好ましくは０．１〜２ｖｖｍ、より好ましくは０．２〜１ｖｖｍである＜１６＞又は＜１７＞に記載の有機酸の製造方法。
＜１９＞圧力が、好ましくは常圧から微加圧の条件であり、加圧する場合は、好ましくは０〜０．１ＭＰａの範囲である＜１６＞〜＜１８＞のいずれか１に記載の有機酸の製造方法。
＜２０＞好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上の変換率でグルコースから有機酸を製造する＜１＞〜＜１９＞のいずれか１に記載の有機酸の製造方法。
＜２１＞有機酸が、好ましくはフマル酸、乳酸、イタコン酸、リンゴ酸、及びピルビン酸から選ばれる少なくとも１種であり、より好ましくはフマル酸、ピルビン酸、乳酸及びリンゴ酸から選ばれる少なくとも１種であり、更に好ましくはフマル酸、及びピルビン酸から選ばれる少なくとも１種であり、更に好ましくはフマル酸である＜１＞〜＜２０＞のいずれか１に記載の有機酸の製造方法。
＜３＞糸状菌が、好ましくはリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属菌であり、より好ましくはリゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ Ｄｅｌｅｍｅｒ）、又はリゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）である＜１＞に記載の有機酸の製造方法。
＜４＞糸状菌が、好ましくはペレット状、綿状、塊状、及び固定化糸状菌から選ばれる形態であり、より好ましくは糸状菌ペレット、及び固定化糸状菌から選ばれる形態であり、更に好ましくは糸状菌ペレットである＜１＞〜＜３＞のいずれか１に記載の有機酸の製造方法。
＜５＞炭素源が、好ましくはグリセリン、ソルビトール、及び糖類から選ばれる少なくとも１種であり、より好ましくは糖類であり、また、より好ましくはグルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、ラクトース、マルトース、及びソルビトールから選ばれる少なくとも１種であり、更に好ましくはグルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、ラクトース、及びマルトースから選ばれる少なくとも１種であり、更に好ましくはグルコースである＜１＞〜＜４＞のいずれか１に記載の有機酸の製造方法。
＜６＞液体培地中の炭素源の濃度が、好ましくは１質量％以上、より好ましくは２質量％以上、更に好ましくは３質量％以上であって、また、好ましくは４０質量％以下、より好ましくは３０質量％以下、更に好ましくは２０質量％以下、更により好ましくは１５質量％以下であり、また、好ましくは１〜４０質量％、より好ましくは２〜３０質量％、更に好ましくは３〜２０質量％、更に好ましくは３〜２０質量％である＜１＞〜＜５＞のいずれか１に記載の有機酸の製造方法。
＜７＞液体培地が、好ましくは窒素源及び無機塩類を更に含む＜１＞〜＜６＞のいずれか１に記載の有機酸の製造方法。
＜８＞窒素源が、好ましくは硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸カリウム、又は硝酸ナトリウムであり、無機塩が、好ましくは硫酸塩、マグネシウム塩、又は亜鉛塩であり、より好ましくは硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、硫酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、又は塩化亜鉛である＜１＞〜＜７＞のいずれか１に記載の有機酸の製造方法。
＜９＞液体培地中の窒素濃度が、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．００２質量％以上、更に好ましくは０．００４質量％以上であり、また、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０８質量％以下、更に好ましくは０．０６質量％以下であり、また、好ましくは０．００１〜０．１質量％、より好ましくは０．００２〜０．０８質量％、更に好ましくは０．００４〜０．０６質量％である＜７＞又は＜８＞に記載の有機酸の製造方法。
＜１０＞液体培地中の硫酸イオン濃度が、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．００５質量％以上、更に好ましくは０．０１質量％以上であり、また、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０８質量％以下、更に好ましくは０．０４質量％以下であり、好ましくは０．００１〜０．１質量％、より好ましくは０．００５〜０．０８質量％、更に好ましくは０．０１〜０．０４質量％である＜７＞又は＜８＞に記載の有機酸の製造方法。
＜１１＞液体培地中のマグネシウムイオン濃度が、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．００２質量％以上であり、また、好ましくは０．５質量％以下、より好ましくは０．２質量％以下、更に好ましくは０．１質量％以下であり、また、好ましくは０．００１〜０．５質量％、より好ましくは０．００２〜０．２質量％、更に好ましくは０．００２〜０．１質量％である＜７＞又は＜８＞に記載の有機酸の製造方法。
＜１２＞液体培地中の亜鉛イオン濃度が、好ましくは０．００００１質量％以上、より好ましくは０．００００５質量％以上であり、また、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０１質量％以下、更に好ましくは０．００５質量％以下であり、また、好ましくは０．００００１〜０．１質量％、より好ましくは０．００００５〜０．０１質量％、更に好ましくは０．００００５〜０．００５質量％である＜７＞又は＜８＞に記載の有機酸の製造方法。
＜１３＞液体培地のｐＨ（３５℃）が、好ましくは２以上、より好ましくは３以上であり、また、好ましくは７以下、より好ましくは６以下であり、また、好ましくは２〜７、より好ましくは３〜６である＜１＞〜＜１２＞のいずれか１に記載の有機酸の製造方法。
＜１４＞培養温度が、好ましくは２０℃以上、より好ましくは３０℃以上であって、また、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３７℃以下であり、また、好ましくは２０〜４０℃、より好ましくは３０〜３７℃である＜１＞〜＜１３＞のいずれか１に記載の有機酸の製造方法。
＜１５＞液体培地中の溶存酸素濃度が、好ましくは８．５ｐｐｍ以上、より好ましくは９ｐｐｍ以上、更に好ましくは１２ｐｐｍ以上、更により好ましくは１５ｐｐｍ以上、更により好ましくは２８ｐｐｍ以上であり、また、好ましくは３４ｐｐｍ以下、更に好ましくは３３ｐｐｍ以下であり、また、好ましくは８．５〜３４ｐｐｍ、より好ましくは９〜３３ｐｐｍ、更に好ましくは１２〜３３ｐｐｍ、更に好ましくは１５〜３３ｐｐｍ、更に好ましくは２８〜３３ｐｐｍである＜１＞〜＜１４＞のいずれか１に記載の有機酸の製造方法。
＜１６＞液体培地中の溶存酸素濃度を、好ましくは通気酸素濃度、通気速度（通気量）、撹拌回転数、又は圧力によって制御する＜１＞〜＜１５＞のいずれか１に記載の有機酸の製造方法。
＜１７＞通気酸素濃度が、好ましくは２１％（体積比率、以下同じ）以上、より好ましくは３５％以上、より好ましくは４０％以上であり、また、好ましくは１００％以下であり、また、好ましくは２１〜１００％、より好ましくは３５〜１００％、更に好ましくは４０〜１００％である＜１６＞に記載の有機酸の製造方法。
＜１８＞通気速度（通気量）が、好ましくは０．１ｖｖｍ以上、より好ましくは０．２ｖｖｍ以上であって、また、好ましくは２ｖｖｍ以下、より好ましくは１ｖｖｍ以下であり、また、好ましくは０．１〜２ｖｖｍ、より好ましくは０．２〜１ｖｖｍである＜１６＞又は＜１７＞に記載の有機酸の製造方法。
＜１９＞圧力が、好ましくは常圧から微加圧の条件であり、加圧する場合は、好ましくは０〜０．１ＭＰａの範囲である＜１６＞〜＜１８＞のいずれか１に記載の有機酸の製造方法。
＜２０＞好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上の変換率でグルコースから有機酸を製造する＜１＞〜＜１９＞のいずれか１に記載の有機酸の製造方法。
＜２１＞有機酸が、好ましくはフマル酸、乳酸、イタコン酸、リンゴ酸、及びピルビン酸から選ばれる少なくとも１種であり、より好ましくはフマル酸、ピルビン酸、乳酸及びリンゴ酸から選ばれる少なくとも１種であり、更に好ましくはフマル酸、及びピルビン酸から選ばれる少なくとも１種であり、更に好ましくはフマル酸である＜１＞〜＜２０＞のいずれか１に記載の有機酸の製造方法。
＜分析方法＞
［高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）による各種成分の測定］
培養液を０．００８５規定硫酸水溶液で適宜希釈し、孔径が０．２２μｍのセルロースアセテート製メンブレンフィルタ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて濾過を行い、ＨＰＬＣ分析用サンプルとした。ＨＰＬＣの分析条件は、次の通りである。
・カラム ：ＩＣＳｅｐ ＩＣＥ−ＩＯＮ−３００
・溶離液 ：０．００８５規定 硫酸、０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・検出法（ｉ） ：ＲＩ（ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｌ−２４９０）
・検出法（ii） ：ＵＶ（ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｌ−２４５５、測定波長２５０ｎｍ）
・カラム温度：４０℃
・注入液量 ：２０μＬ
・保持時間 ：４０ｍｉｎ
［高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）による各種成分の測定］
培養液を０．００８５規定硫酸水溶液で適宜希釈し、孔径が０．２２μｍのセルロースアセテート製メンブレンフィルタ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて濾過を行い、ＨＰＬＣ分析用サンプルとした。ＨＰＬＣの分析条件は、次の通りである。
・カラム ：ＩＣＳｅｐ ＩＣＥ−ＩＯＮ−３００
・溶離液 ：０．００８５規定 硫酸、０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・検出法（ｉ） ：ＲＩ（ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｌ−２４９０）
・検出法（ii） ：ＵＶ（ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｌ−２４５５、測定波長２５０ｎｍ）
・カラム温度：４０℃
・注入液量 ：２０μＬ
・保持時間 ：４０ｍｉｎ
この分析系における各成分の保持時間は、次の通りである。
・ピルビン酸：１５ｍｉｎ
・グルコース：１６ｍｉｎ
・フマル酸 ：２６ｍｉｎ
・エタノール：３４ｍｉｎ
・ピルビン酸：１５ｍｉｎ
・グルコース：１６ｍｉｎ
・フマル酸 ：２６ｍｉｎ
・エタノール：３４ｍｉｎ
［溶存酸素濃度の測定］
メトラートレド社製のＤＯセンサー（Ｏ２４１００ｅ）を用いて培養液中の溶存酸素濃度の測定を行った。
メトラートレド社製のＤＯセンサー（Ｏ２４１００ｅ）を用いて培養液中の溶存酸素濃度の測定を行った。
＜糸状菌ペレットの調製＞
〔胞子懸濁液の調製〕
菌株は独立行政法人 製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）より入手した糸状菌リゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ） ＪＣＭ５５５７及びＮＢＲＣ５４４１を使用した。糸状菌は、各々別々に試験管内に形成させた斜面状寒天培地（Ｄｉｆｃｏ Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇａｒ、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）上に菌体を画線／塗布し、３０℃にて静置培養し、定期的に継代を行った。菌体使用時には菌体増殖した試験管に１０ｍＬの滅菌蒸留水を添加後、タッチミキサにて４分間撹拌することで胞子を回収し、更に無菌の蒸留水を添加して希釈することで１×１０6 ｓｐｏｒｅｓ／ｍＬに調整したものを胞子懸濁液とした。
〔胞子懸濁液の調製〕
菌株は独立行政法人 製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）より入手した糸状菌リゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ） ＪＣＭ５５５７及びＮＢＲＣ５４４１を使用した。糸状菌は、各々別々に試験管内に形成させた斜面状寒天培地（Ｄｉｆｃｏ Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇａｒ、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）上に菌体を画線／塗布し、３０℃にて静置培養し、定期的に継代を行った。菌体使用時には菌体増殖した試験管に１０ｍＬの滅菌蒸留水を添加後、タッチミキサにて４分間撹拌することで胞子を回収し、更に無菌の蒸留水を添加して希釈することで１×１０6 ｓｐｏｒｅｓ／ｍＬに調整したものを胞子懸濁液とした。
〔糸状菌のペレット化〕
糸状菌ペレットの調製は以下の２段階の培養にて行った。
１段目の培養は、２００ｍＬのＰＤＢ培地（Ｄｉｆｃｏ Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｂｒｏｔｈ、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）を仕込んだ５００ｍＬ容バッフル付き三角フラスコを滅菌し、前述の方法で調製した胞子懸濁液を１×１０4個−胞子／ｍＬとなるように植菌して、ｐＨが３〜６の範囲で、２７℃、１７０ｒ／ｍ（ＰＲＥＣＩ社、ＰＲＸＹｇ−９８Ｒ）の培養条件にて３日間行った。
２段目の培養は、ペレット形成培地（グルコース（和光純薬工業社製）１０質量％、硫酸マグネシウム七水和物 ０．０２５質量％、硫酸亜鉛七水和物 ０．００９質量％、硫酸アンモニウム ０．１質量％、リン酸二水素一カリウム ０．０６質量％）５００ｍＬを仕込んだ１Ｌ容通気撹拌槽を滅菌し、１段目の培養液５００ｍＬ分の菌体を植菌して２７℃、撹拌速度５００ｒ／ｍｉｎ、通気速度０．３ｖｖｍで空気を供給した条件にて２日間行った。ｐＨは７Ｎ水酸化ナトリウム溶液を適宜添加して、ｐＨ（２７℃）４．０を維持した。
糸状菌ペレットの調製は以下の２段階の培養にて行った。
１段目の培養は、２００ｍＬのＰＤＢ培地（Ｄｉｆｃｏ Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｂｒｏｔｈ、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）を仕込んだ５００ｍＬ容バッフル付き三角フラスコを滅菌し、前述の方法で調製した胞子懸濁液を１×１０4個−胞子／ｍＬとなるように植菌して、ｐＨが３〜６の範囲で、２７℃、１７０ｒ／ｍ（ＰＲＥＣＩ社、ＰＲＸＹｇ−９８Ｒ）の培養条件にて３日間行った。
２段目の培養は、ペレット形成培地（グルコース（和光純薬工業社製）１０質量％、硫酸マグネシウム七水和物 ０．０２５質量％、硫酸亜鉛七水和物 ０．００９質量％、硫酸アンモニウム ０．１質量％、リン酸二水素一カリウム ０．０６質量％）５００ｍＬを仕込んだ１Ｌ容通気撹拌槽を滅菌し、１段目の培養液５００ｍＬ分の菌体を植菌して２７℃、撹拌速度５００ｒ／ｍｉｎ、通気速度０．３ｖｖｍで空気を供給した条件にて２日間行った。ｐＨは７Ｎ水酸化ナトリウム溶液を適宜添加して、ｐＨ（２７℃）４．０を維持した。
〔ペレットの回収〕
上記の各段で得られた糸状菌ペレット培養液を、ナイロンメッシュフィルターにてろ液のドリップが落ち着くまで数十秒ろ過し、ウエット状態の糸状菌ペレットを得た。２段目で得られたペレットは速やかに下記培養工程に供した。
上記の各段で得られた糸状菌ペレット培養液を、ナイロンメッシュフィルターにてろ液のドリップが落ち着くまで数十秒ろ過し、ウエット状態の糸状菌ペレットを得た。２段目で得られたペレットは速やかに下記培養工程に供した。
＜有機酸の製造＞
〔培養方法〕
実施例１
液体培地（組成：グルコース（和光純薬工業社製）１０質量％、硫酸マグネシウム七水和物 ０．０２５質量％、硫酸亜鉛七水和物 ０．００９質量％、硫酸アンモニウム０．１質量％）５００ｍＬを滅菌済の１Ｌ容の通気撹拌槽に添加し、続いて上記で調製したＪＣＭ５５５７糸状菌ペレット全量（ウエット状態）を添加した。その直後に培養０時間目のサンプリングを行った後、酸素発生装置（ＡＩＲ ＳＥＰ社、ＮＥＷＬＩＦＥ Ｊ）を用いて酸素濃度を１００％にした気体を通気しながら、温度３５℃、撹拌回転数５００ｒ／ｍｉｎ、通気速度０．３ｖｖｍの条件で、経時的にサンプリングを行いながら２日間撹拌培養を行った。
培養期間中、培養液中の溶存酸素濃度は３２ｐｐｍであった。また、培養期間中、培養液のｐＨは７Ｎ水酸化ナトリウム溶液を適宜添加して、ｐＨ（３５℃）４．０を維持した。培養終了後、培養液を濾過することで菌体を除去し、フマル酸を含有する培養液を得た。
〔培養方法〕
実施例１
液体培地（組成：グルコース（和光純薬工業社製）１０質量％、硫酸マグネシウム七水和物 ０．０２５質量％、硫酸亜鉛七水和物 ０．００９質量％、硫酸アンモニウム０．１質量％）５００ｍＬを滅菌済の１Ｌ容の通気撹拌槽に添加し、続いて上記で調製したＪＣＭ５５５７糸状菌ペレット全量（ウエット状態）を添加した。その直後に培養０時間目のサンプリングを行った後、酸素発生装置（ＡＩＲ ＳＥＰ社、ＮＥＷＬＩＦＥ Ｊ）を用いて酸素濃度を１００％にした気体を通気しながら、温度３５℃、撹拌回転数５００ｒ／ｍｉｎ、通気速度０．３ｖｖｍの条件で、経時的にサンプリングを行いながら２日間撹拌培養を行った。
培養期間中、培養液中の溶存酸素濃度は３２ｐｐｍであった。また、培養期間中、培養液のｐＨは７Ｎ水酸化ナトリウム溶液を適宜添加して、ｐＨ（３５℃）４．０を維持した。培養終了後、培養液を濾過することで菌体を除去し、フマル酸を含有する培養液を得た。
実施例２
酸素発生装置（ＡＩＲ ＳＥＰ社、ＮＥＷＬＩＦＥ Ｊ）を用いて生成した気体と空気を混合して通気酸素濃度を５０％にした以外は実施例１と同様に培養を行い、フマル酸を含有する培養液を得た。培養期間中、培養液中の溶存酸素濃度は９．５ｐｐｍであった。
酸素発生装置（ＡＩＲ ＳＥＰ社、ＮＥＷＬＩＦＥ Ｊ）を用いて生成した気体と空気を混合して通気酸素濃度を５０％にした以外は実施例１と同様に培養を行い、フマル酸を含有する培養液を得た。培養期間中、培養液中の溶存酸素濃度は９．５ｐｐｍであった。
実施例３
酸素発生装置（ＡＩＲ ＳＥＰ社、ＮＥＷＬＩＦＥ Ｊ）を用いて生成した気体と空気を混合して通気酸素濃度を３５％にした以外は実施例１と同様に培養を行い、フマル酸を含有する培養液を得た。培養期間中、培養液中の溶存酸素濃度は８．０ｐｐｍであった。
酸素発生装置（ＡＩＲ ＳＥＰ社、ＮＥＷＬＩＦＥ Ｊ）を用いて生成した気体と空気を混合して通気酸素濃度を３５％にした以外は実施例１と同様に培養を行い、フマル酸を含有する培養液を得た。培養期間中、培養液中の溶存酸素濃度は８．０ｐｐｍであった。
比較例１
通気する気体を空気（通気酸素濃度２１％）とした以外は実施例１と同様に培養を行い、フマル酸を含有する培養液を得た。培養期間中、培養液中の溶存酸素濃度は５．４ｐｐｍであった。
通気する気体を空気（通気酸素濃度２１％）とした以外は実施例１と同様に培養を行い、フマル酸を含有する培養液を得た。培養期間中、培養液中の溶存酸素濃度は５．４ｐｐｍであった。
実施例４
液体培地（組成：グルコース（和光純薬工業社製）３質量％、硫酸マグネシウム七水和物 ０．０２５質量％、硫酸亜鉛七水和物 ０．００９質量％、硫酸アンモニウム０．１質量％）５００ｍＬを滅菌済の１Ｌ容の通気撹拌槽に添加し、続いて上記で調製したＮＢＲＣ５４４１糸状菌ペレット全量（ウエット状態）を添加した。その直後に培養０時間目のサンプリングを行った後、酸素発生装置（ＡＩＲ ＳＥＰ社、ＮＥＷＬＩＦＥ Ｊ）を用いて酸素濃度を１００％にした気体を通気しながら、温度３５℃、撹拌回転数５００ｒ／ｍｉｎ、通気速度０．３ｖｖｍの条件で、経時的にサンプリングを行いながら２日間撹拌培養を行った。培養期間中、培養液中の溶存酸素濃度は２８ｐｐｍであった。また、培養期間中、培養液のｐＨは７Ｎ水酸化ナトリウム溶液を適宜添加して、ｐＨ（３５℃）３．０を維持した。培養終了後、培養液を濾過することで菌体を除去し、有機酸を含有する培養液を得た。
液体培地（組成：グルコース（和光純薬工業社製）３質量％、硫酸マグネシウム七水和物 ０．０２５質量％、硫酸亜鉛七水和物 ０．００９質量％、硫酸アンモニウム０．１質量％）５００ｍＬを滅菌済の１Ｌ容の通気撹拌槽に添加し、続いて上記で調製したＮＢＲＣ５４４１糸状菌ペレット全量（ウエット状態）を添加した。その直後に培養０時間目のサンプリングを行った後、酸素発生装置（ＡＩＲ ＳＥＰ社、ＮＥＷＬＩＦＥ Ｊ）を用いて酸素濃度を１００％にした気体を通気しながら、温度３５℃、撹拌回転数５００ｒ／ｍｉｎ、通気速度０．３ｖｖｍの条件で、経時的にサンプリングを行いながら２日間撹拌培養を行った。培養期間中、培養液中の溶存酸素濃度は２８ｐｐｍであった。また、培養期間中、培養液のｐＨは７Ｎ水酸化ナトリウム溶液を適宜添加して、ｐＨ（３５℃）３．０を維持した。培養終了後、培養液を濾過することで菌体を除去し、有機酸を含有する培養液を得た。
比較例２
通気する気体を空気（通気酸素濃度２１％）にした以外は実施例４と同様に培養を行い、有機酸を含有する培養液を得た。培養期間中、培養液中の溶存酸素濃度は５．０ｐｐｍであった。
通気する気体を空気（通気酸素濃度２１％）にした以外は実施例４と同様に培養を行い、有機酸を含有する培養液を得た。培養期間中、培養液中の溶存酸素濃度は５．０ｐｐｍであった。
実施例５
液体培地（組成：グルコース（和光純薬工業社製）３質量％、硫酸マグネシウム七水和物 ０．０２５質量％、硫酸亜鉛七水和物 ０．００９質量％、硫酸アンモニウム０．１質量％）５００ｍＬを滅菌済の１Ｌ容の通気撹拌槽に添加し、続いて上記で調製したＮＢＲＣ５４４１糸状菌ペレット全量（ウエット状態）を添加した。その直後に培養０時間目のサンプリングを行った後、酸素発生装置（ＡＩＲ ＳＥＰ社、ＮＥＷＬＩＦＥ Ｊ）を用いて酸素濃度を１００％にした気体を通気しながら、温度３５℃、撹拌回転数５００ｒ／ｍｉｎ、通気速度０．３ｖｖｍの条件で、経時的にサンプリングを行いながら２日間撹拌培養を行った。培養期間中、培養液中の溶存酸素濃度は２８ｐｐｍであった。また、培養期間中、培養液のｐＨは７Ｎ水酸化ナトリウム溶液を適宜添加して、ｐＨ（３５℃）７．０を維持した。培養終了後、培養液を濾過することで菌体を除去し、有機酸を含有する培養液を得た。
液体培地（組成：グルコース（和光純薬工業社製）３質量％、硫酸マグネシウム七水和物 ０．０２５質量％、硫酸亜鉛七水和物 ０．００９質量％、硫酸アンモニウム０．１質量％）５００ｍＬを滅菌済の１Ｌ容の通気撹拌槽に添加し、続いて上記で調製したＮＢＲＣ５４４１糸状菌ペレット全量（ウエット状態）を添加した。その直後に培養０時間目のサンプリングを行った後、酸素発生装置（ＡＩＲ ＳＥＰ社、ＮＥＷＬＩＦＥ Ｊ）を用いて酸素濃度を１００％にした気体を通気しながら、温度３５℃、撹拌回転数５００ｒ／ｍｉｎ、通気速度０．３ｖｖｍの条件で、経時的にサンプリングを行いながら２日間撹拌培養を行った。培養期間中、培養液中の溶存酸素濃度は２８ｐｐｍであった。また、培養期間中、培養液のｐＨは７Ｎ水酸化ナトリウム溶液を適宜添加して、ｐＨ（３５℃）７．０を維持した。培養終了後、培養液を濾過することで菌体を除去し、有機酸を含有する培養液を得た。
比較例３
酸素発生装置（ＡＩＲ ＳＥＰ社、ＮＥＷＬＩＦＥ Ｊ）を用いて生成した気体と空気を混合して通気酸素濃度を２１％にした以外は実施例５と同様に培養を行い、有機酸を含有する培養液を得た。培養期間中、培養液中の溶存酸素濃度は５．０ｐｐｍであった。
酸素発生装置（ＡＩＲ ＳＥＰ社、ＮＥＷＬＩＦＥ Ｊ）を用いて生成した気体と空気を混合して通気酸素濃度を２１％にした以外は実施例５と同様に培養を行い、有機酸を含有する培養液を得た。培養期間中、培養液中の溶存酸素濃度は５．０ｐｐｍであった。
実施例６
液体培地（組成：混合糖（グルコース：フルクトース：スクロース：キシロース：ラクトース：マルトース＝5：5：2：1：1：1混合比）５質量％、硫酸マグネシウム七水和物 ０．０２５質量％、硫酸亜鉛七水和物 ０．００９質量％、硫酸アンモニウム０．１質量％）５００ｍＬを滅菌済の１Ｌ容の通気撹拌槽に添加し、続いて上記で調製したＪＣＭ５５５７糸状菌ペレット全量（ウエット状態）を添加した。その直後に培養０時間目のサンプリングを行った後、酸素発生装置（ＡＩＲ ＳＥＰ社、ＮＥＷＬＩＦＥ Ｊ）を用いて酸素濃度を１００％にした気体を通気しながら、温度３５℃、撹拌回転数５００ｒ／ｍｉｎ、通気速度０．３ｖｖｍの条件で、経時的にサンプリングを行いながら２日間撹拌培養を行った。培養期間中、培養液中の溶存酸素濃度は３０ｐｐｍであった。また、培養期間中、培養液のｐＨは７Ｎ水酸化ナトリウム溶液を適宜添加して、ｐＨ（３５℃）４．０を維持した。培養終了後、培養液を濾過することで菌体を除去し、有機酸を含有する培養液を得た。
液体培地（組成：混合糖（グルコース：フルクトース：スクロース：キシロース：ラクトース：マルトース＝5：5：2：1：1：1混合比）５質量％、硫酸マグネシウム七水和物 ０．０２５質量％、硫酸亜鉛七水和物 ０．００９質量％、硫酸アンモニウム０．１質量％）５００ｍＬを滅菌済の１Ｌ容の通気撹拌槽に添加し、続いて上記で調製したＪＣＭ５５５７糸状菌ペレット全量（ウエット状態）を添加した。その直後に培養０時間目のサンプリングを行った後、酸素発生装置（ＡＩＲ ＳＥＰ社、ＮＥＷＬＩＦＥ Ｊ）を用いて酸素濃度を１００％にした気体を通気しながら、温度３５℃、撹拌回転数５００ｒ／ｍｉｎ、通気速度０．３ｖｖｍの条件で、経時的にサンプリングを行いながら２日間撹拌培養を行った。培養期間中、培養液中の溶存酸素濃度は３０ｐｐｍであった。また、培養期間中、培養液のｐＨは７Ｎ水酸化ナトリウム溶液を適宜添加して、ｐＨ（３５℃）４．０を維持した。培養終了後、培養液を濾過することで菌体を除去し、有機酸を含有する培養液を得た。
比較例４
酸素発生装置（ＡＩＲ ＳＥＰ社、ＮＥＷＬＩＦＥ Ｊ）を用いて生成した気体と空気を混合して通気酸素濃度を２１％にした以外は実施例６と同様に培養を行い、有機酸を含有する培養液を得た。培養期間中、培養液中の溶存酸素濃度は５．０ｐｐｍであった。
酸素発生装置（ＡＩＲ ＳＥＰ社、ＮＥＷＬＩＦＥ Ｊ）を用いて生成した気体と空気を混合して通気酸素濃度を２１％にした以外は実施例６と同様に培養を行い、有機酸を含有する培養液を得た。培養期間中、培養液中の溶存酸素濃度は５．０ｐｐｍであった。
〔評価方法〕
培養液の分析値から、次の（１）〜（６）の項目を評価軸とした。各項目の算出式を表１及び式（１）〜（６）に示す。
培養液の分析値から、次の（１）〜（６）の項目を評価軸とした。各項目の算出式を表１及び式（１）〜（６）に示す。
（１）糖からフマル酸への変換率
Ｐ１［％］＝（Ｆ−Ｆ０）／（Ｇ０−Ｇ）×１００ （１）
（２）糖からエタノールへの変換率
Ｑ［％］＝（Ｅ−Ｅ０）／（Ｇ０−Ｇ）×１００ （２）
（３）前記エタノール変換で発生する二酸化炭素への変換率
Ｒ［％］＝Ｑ×（ＣＯ2分子量／ＥｔＯＨ分子量）×１００ （３）
（４）糖からピルビン酸への変換率
Ｓ１［％］＝（Ｐｙ−Ｐｙ０）／（Ｇ０−Ｇ）×１００ （４）
（５）混合糖からフマル酸への変換率
Ｐ２［％］＝（Ｆ−Ｆ０）／（Ｍ０−Ｍ）×１００ （５）
（６）混合糖からピルビン酸への変換率
Ｓ２［％］＝（Ｐｙ−Ｐｙ０）／（Ｍ０−Ｍ）×１００ （６）
（式中、Ｇ０、Ｍ０、Ｆ０、Ｅ０及びＰｙ０は、培養０時間のグルコース濃度、混合糖濃度、フマル酸濃度、エタノール濃度、ピルビン酸濃度、を示し、Ｇ、Ｍ、Ｆ、Ｅ及びＰｙは、培養後のグルコース濃度、混合糖濃度、フマル酸濃度、エタノール濃度、ピルビン酸濃度を示す。）
Ｐ１［％］＝（Ｆ−Ｆ０）／（Ｇ０−Ｇ）×１００ （１）
（２）糖からエタノールへの変換率
Ｑ［％］＝（Ｅ−Ｅ０）／（Ｇ０−Ｇ）×１００ （２）
（３）前記エタノール変換で発生する二酸化炭素への変換率
Ｒ［％］＝Ｑ×（ＣＯ2分子量／ＥｔＯＨ分子量）×１００ （３）
（４）糖からピルビン酸への変換率
Ｓ１［％］＝（Ｐｙ−Ｐｙ０）／（Ｇ０−Ｇ）×１００ （４）
（５）混合糖からフマル酸への変換率
Ｐ２［％］＝（Ｆ−Ｆ０）／（Ｍ０−Ｍ）×１００ （５）
（６）混合糖からピルビン酸への変換率
Ｓ２［％］＝（Ｐｙ−Ｐｙ０）／（Ｍ０−Ｍ）×１００ （６）
（式中、Ｇ０、Ｍ０、Ｆ０、Ｅ０及びＰｙ０は、培養０時間のグルコース濃度、混合糖濃度、フマル酸濃度、エタノール濃度、ピルビン酸濃度、を示し、Ｇ、Ｍ、Ｆ、Ｅ及びＰｙは、培養後のグルコース濃度、混合糖濃度、フマル酸濃度、エタノール濃度、ピルビン酸濃度を示す。）
各実施例、比較例の条件と結果を表２〜表４に示す。
表２〜表４に示すように、糸状菌の培養工程において培養液中の溶存酸素濃度を本発明の範囲内に制御することで、グルコース又は混合糖からフマル酸、ピルビン酸への変換が進み、一方、エタノールの副生は低減し、高い収率で有機酸が得られることが確認された。
通常の空気を供給した比較例１〜４では、エタノールが多く副生され、有機酸の収率は低かった。
通常の空気を供給した比較例１〜４では、エタノールが多く副生され、有機酸の収率は低かった。
Claims (7)
- 糸状菌を用いて、培地中の炭素源から有機酸を製造する方法であって、炭素源を含み、かつ、溶存酸素濃度を８ｐｐｍ以上、３５ｐｐｍ以下に制御した液体培地にて糸状菌を培養し、有機酸を得る、有機酸の製造方法。
- 糸状菌がリゾプス属菌である請求項１記載の有機酸の製造方法。
- 有機酸がフマル酸、ピルビン酸、乳酸及びリンゴ酸から選ばれる少なくとも１種である請求項１又は２記載の有機酸の製造方法。
- 有機酸がフマル酸である請求項１又は２記載の有機酸の製造方法。
- 液体培地に酸素濃度が２１％以上、１００％以下の気体を通気させる請求項１〜４のいずれか１項記載の有機酸の製造方法。
- 炭素源が糖類である請求項１〜５のいずれか１項記載の有機酸の製造方法。
- 培養工程における液体培地のｐＨ（３５℃）が２以上、７以下である請求項１〜６のいずれか１項記載の有機酸の製造方法。
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