CN117778288A - 一种通过动态调控TCA途径生产β-丙氨酸的重组基因工程菌及应用 - Google Patents
一种通过动态调控TCA途径生产β-丙氨酸的重组基因工程菌及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种通过动态调控TCA途径生产β‑丙氨酸的重组基因工程菌及应用，所述重组基因工程菌是以大肠杆菌630B1为出发菌株进行下列之一或多种基因编辑：敲除基因ptsG、敲除基因galR、基因glk启动子替换成启动子Trc、基因poxB替换成调控元件EsaR，基因ldhA替换成带有启动子Pbs的调控元件EsaI，基因gltA启动子替换成启动子PesaS，在质粒pTrc99a‑panDBS K104S‑aspBCG‑aspA上过表达pycCG基因；本发明对于提高β‑丙氨酸的产率具有强有力的理论依据，提高了碳源的利用率，在摇瓶水平上β‑丙氨酸的产量是5.61g/L。在补料发酵罐水平上，β‑丙氨酸的产量是108.5g/L，其糖酸转化率是51.53％，为工业化生产β‑丙氨酸奠定了基础。
Description
(一)技术领域
本发明涉及到一种高产β-丙氨酸的基因工程菌及构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备β-丙氨酸中应用。
(二)技术背景
β-丙氨酸，学名3-氨基丙酸，分子量89.09，密度1.2g/L，熔点197℃，分子式C3H7NO2，同分异构体为α-丙氨酸，区别在于氨基的位置不同。是自然界存在的唯一一种β型非蛋白氨基酸，无色晶体，易溶于水，是生物体内合成D-泛酸(VB5)的重要前体，在维持细胞生长起到重要的生理作用。虽然β-丙氨酸在生物体内不参与蛋白质和酶的合成，但是作为一种潜在的功能性氨基酸，其广泛应用于医药，化工，食品，饲料和环境等领域，因此也具有非常广阔的市场前景和价值。在医药领域，β-丙氨酸主要用于合成D-泛酸或者D-泛酸钙，亦是酰基载体蛋白和辅酶A的重要前体，参与细胞内脂肪、蛋白质和糖类的新陈代谢。另外β-丙氨酸作为一种补充剂，提高细胞内肌肽水平，降低肌肉内的酸性，达到抗疲劳的作用。β-丙氨酸也可以用于合成金属配合物、帕米磷酸钠和巴柳氮等药物，用于治疗肿瘤类、溃疡性结肠炎等疾病；在精细化工领域，β-丙氨酸可用于制备药剂中的沉淀剂，电镀缓蚀剂及铅中毒解毒剂；在食品领域，抗氧化，合成甜味剂、改善醇类饮料的味道；在饲料领域，在饲料中添加β-丙氨酸能显著提高家禽的生长性能；在环境领域，聚β-丙氨酸可以作为高效净化凝聚剂可以用于水的净化。在D-泛酸钙每年只有6000-8000吨的情况下，β-丙氨酸的需求量则高达上万吨，并且β-丙氨酸的需求量不断上涨。目前β-丙氨酸系列产品的全球需求量不断增加，从近些年的5万吨需求量不断提高至2023年的8.1万吨，预计至2026年市场规模可达6.22亿元，被称为未来全球12种最具开发潜力的三碳化工产品之一。
目前主流的生产β-丙氨酸的方法主要包括化学合成法、酶催化法和微生物发酵法。化学合成法，利用丙烯腈、丙烯酸和β-氨基丙腈等腈类物质通过高压高温，在强酸强碱的条件下合成β-丙氨酸。但是，化学合成法对设备要求高，能耗大，并且在生产过程中产生大量的副产物，不利于后续的分离和纯化；酶催化法，主要是利用枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒状杆菌等微生物来源的天冬氨酸脱羧酶在宿主E.coli BL21(DE3)中高效表达，以L-天冬氨酸作为底物，催化合成β-丙氨酸。另一种酶催化策略是以富马酸作为底物，将天冬氨酸氨基裂解酶和天冬氨酸脱羧酶双酶耦连生产β-丙氨酸。此两种方法的生产条件更加温和，安全和污染少，引起更多学者的关注，但是也存在底物抑制，产率低和分离纯化成本高等问题。另外底物天冬氨酸或者富马酸的价格较贵，直接导致利用酶法催化生产β-丙氨酸的成本较高；由于气候变化和环境污染日益严重，利用微生物发酵等清洁环保的生产方法日益引起学者关注。微生物发酵法生产β-丙氨酸主要是利用合成生物学、系统代谢工程、蛋白质工程、启动子工程及转录组和代谢组等技术，改造大肠杆菌等其他微生物的β-丙氨酸合成途径，使更多的碳流量流向β-丙氨酸合成途径方向。在当前严峻的环境条件下，利用廉价葡萄糖等为碳源，寻求清洁环保低能耗的发酵法生产β-丙氨酸引起众多学者的关注。
随着对微生物代谢过程的不断了解，以及代谢改造技术(系统代谢工程、合成生物学、启动子工程、蛋白质工程及转录组和代谢组)的不断发展，利用廉价葡萄糖等为碳源生成包括β-丙氨酸在内的多种高附加值产物具有广阔的生产应用前景。然而，由于野生型大肠杆菌本身的生理特性，在大肠杆菌细胞中合成的β-丙氨酸只能满足自身生长所需，不会大量积累，在发酵液中检测不到β-丙氨酸。因此为了发酵法合成β-丙氨酸，必需对β-丙氨酸的合成途径进行理性改造，构建稳定高效的细胞工厂。高产β-丙氨酸的菌株可以由基因工程好代谢工程等策略获得。但是在基因工程菌构建过程中需要考虑到不同代谢途径之间的关联，在提高目的产物产量的同时不能影响细胞的正常生长，所以需要从多个角度出发进行理性代谢工程改造。
在大肠杆菌中β-丙氨酸的从头合成途径包括了葡萄糖摄取，糖酵解途径，TCA循环，L-天冬氨酸合成及其β-丙氨酸合成途径。首先是葡萄糖在PTS或者非PTS系统下完成葡萄糖的磷酸化从而合成葡萄糖-6-磷酸，碳流量进入糖酵解途径，在糖酵解途径中合成β-丙氨酸的前体物磷酸烯醇式丙酮酸，在磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)催化作用在磷酸烯醇式丙酮酸生成草酰乙酸，其中草酰乙酸不稳定易分解，在天冬氨酸转氨酶催化下生成L-天冬氨酸，随后在天冬氨酸脱羧酶催下生成β-丙氨酸。其中L-懒氨酸，L-苏氨酸，O-琥珀酰高丝氨酸和高丝氨酸同属于天冬氨酸组氨基酸，它们和β-丙氨酸拥有共同的前体L-天冬氨酸，所以削弱竞争支路是一种有效的构建策略，但是还需要深入探究影响β-丙氨酸产量的瓶颈。
在传统的代谢工程研究中，为了使代谢流量尽可能的流向目的产物合成途径，往往会对代谢网络进行一系列的静态调控。静态调控策略一般指过表达目标途径基因、弱化或敲除目的产物的降解路径以及竞争性代谢途径、解除产物抑制，或利用定点突变等蛋白质工程技术对关键酶进行改造，提升目的产物转化率等过。虽然在以往的代谢调控策略中，静态调控作为一种主要的调控手段表现出了相当的稳健性，但对基因做出调控以后，其不可逆性往往会导致表达产物并不能完全适应细胞生长环境的需要，最终可能会导致代谢流量在菌体生长与产物成之间的不均衡分布，降低产物合成速率，甚至会造成细胞营养缺陷或死亡。
因此，在构建目的代谢产物的生物合成途径时，为了平衡合成产物所需的基因表达水平与细胞生长代谢之间的关系,需要进一步对途径中的关键基因进行精细调控。近年来，合成生物学调控元件的研究与运用实现了对代谢网络的动态调控。动态调控基因线路能够根据细胞环境信号实时调控基因表达，以便适应细胞代谢或环境的变化，稳定合成所需产物。通常来说。动态调控一般包括温度调控、光感应调控、群体感应调控、非编码RNA调控等策略。
(三)发明内容
本发明的目的是利用代谢工程和基因编辑技术，提供一种通过动态调控TCA途径生产β-丙氨酸的重组基因工程菌及应用，选用基于群体感应基因线路的动态调控策略，群体感应系统中，在细菌释放的诱导物类信号分子达到一定的浓度后，就会激活依赖细胞密度的特定基因表达，从而使细菌在整体上表现出新的行为特征，解决了化学法合成β-丙氨酸高耗能、高污染、高成本的问题及酶催化合成β-丙氨酸存在的底物抑制、产率低、分离成本高的问题。
本发明的技术方案：
本发明提供一种通过动态调控TCA途径生产β-丙氨酸的重组基因工程菌，所述重组基因工程菌是以大肠杆菌630B1为出发菌株进行下列之一或多种基因编辑：敲除基因ptsG、敲除基因galR、基因glk启动子替换成启动子Trc、基因poxB替换成调控元件EsaR，基因ldhA替换成带有启动子Pbs的调控元件EsaI，基因gltA启动子替换成启动子PesaS，在质粒pTrc99a-panDBS K104S-aspBCG-aspA上过表达pycCG基因；所述出发菌株630B1：E.coliW3110Trc-panDTrc-ppcΔpykAΔcycA/pTrc99a-panDBS K104S-aspBCG-aspA，构建参照Li,B.,Zhang,B.,Wang,P.,Cai,X.,Chen,Y.Y.,Yang,Y.F.,Liu,Z.Q.,Zheng,Y.G.,2022.Rerouting fluxes of the central carbon metabolism and relievingmechanism-based inactivation of L-aspartate-α-decarboxylase for fermentativeproduction ofβ-alanine in Escherichia coli。
优选的，所述基因ptsG核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因galR核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，基因glk核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，基因poxB核苷酸序列如SEQID NO.5所示，基因gltA核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，基因ldhA核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示。
优选的，调控元件EsaR核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，基因调控元件EsaI核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，启动子PesaS核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，启动子Pbs核苷酸序列如SEQ ID NO.11，基因pyc核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，Trc启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
优选的，所述重组基因工程菌是以大肠杆菌630B1为出发菌株，敲除基因ptsG、敲除基因galR、基因glk启动子替换成启动子Trc、基因poxB替换成调控元件EsaR，基因ldhA替换成带有启动子Pbs的调控元件EsaI，基因gltA启动子替换成启动子PesaS，且在质粒pTrc99a-panDBS K104S-aspBCG-aspA上过表达pycCG基因。
本发明所述重组基因工程菌按如下方法构建：
(1)敲除基因ptsG：以菌株630B1为出发菌株，以质粒pTarget为模板，以pTarget-ptsG-F/pTarget-ptsG-R为引物扩增得到线性化质粒pTarget-ptsG；以E.coli W3110基因组为模版，以L-ptsG-F/L-ptsG-R和R-ptsG-F/R-ptsG-R为引物，PCR扩增得到上下游同源臂；将上下游同源臂和线性化质粒pTarget-ptsG连接后转化出发菌株630B1感受态细胞，消除pTarget和pCas9质粒，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将基因组上的ptsG敲除，构建菌株630B1(ΔptsG)，记为菌株630B2；
(2)敲除基因galR：以质粒pTarget为模板，以pTarget-galR-F/pTarget-galR-R为引物扩增得到线性化质粒pTarget-galR；以E.coli W3110基因组为模版，以L-galR-F/L-galR-R和R-galR-F/R-galR-R为引物，PCR扩增得到上下游同源臂；将上下游同源臂和线性化质粒pTarget-galR连接后转化菌株630B2感受态细胞，消除pTarget和pCas9质粒，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将菌株630B2基因组上的基因galR敲除，构建菌株630B1(ΔptsGΔgalR)，记为菌株B3；
(3)Trc启动子替换基因glk启动子：以pTarget质粒为模板，以pTarget-glk-F/pTarget-glk-R为引物扩增得到线性化质粒pTarget-glk；以E.coli W3110基因组为模版，L-glk-F/L-glk-R和R-glk-F/R-glk-R为引物，扩增到的原始启动子上下游同源臂；利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将上下游同源臂和线性化质粒pTarget-glk转入菌株630B3感受态细胞，消除pTarget和pCas9质粒，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将菌株630B3基因组上的基因glk启动子替换成Trc启动子，构建菌株630B1(ΔptsGΔgalRTrc-glk)，记为菌株B4；
(4)基因poxB的替换：以质粒pTarget为模板，以pTarget-poxB-F/pTarget-poxB-R为引物扩增得到线性化质粒pTarget-poxB::EsaR；以E.coli W3110基因组为模版，以L-poxB::EsaR-F/L-poxB::EsaR-R和R-poxB::EsaR-F/R-poxB::EsaR-R为引物，PCR扩增得到上下游同源臂；以合成的元件EsaR为模板，以EsaR-F/EsaR-R为引物，扩增得到元件EsaR；将上下游同源臂、EsaR和线性化质粒pTarget-poxB::EsaR连接后转化菌株630B4感受态细胞，消除pTarget和pCas9质粒，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将将菌株630B4基因组上的基因poxB替换成调控元件EsaR，构建菌株630B1(ΔptsGΔgalRTrc-glkΔpoxB::EsaR)，记为菌株630B6；
(5)gltA启动子的替换：以质粒pTarget为模板，以pTarget-gltA-F/pTarget-gltA-R为引物扩增得到线性化质粒pTarget-gltA；以E.coli W3110基因组为模版，以L-gltA-F/L-gltA-R和R-gltA-F/R-gltA-R为引物，PCR扩增得到上下游同源臂；以合成的启动子PesaS为模板，以PesaS-F/PesaS-R为引物，扩增得到启动子PesaS；将上下游同源臂、PesaS和线性化质粒pTarget-Pesas-gltA连接后转化菌株630B6感受态细胞，消除pTarget和pCas9质粒，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将菌株630B6基因组上的基因gltA的启动子替换成启动子PesaS，构建菌株630B1(ΔptsGΔgalRTrc-glkΔpoxB::EsaRΔgltA::PesaS-gltA)，记为菌株630B7；
(6)基因ldhA的替换：以质粒pTarget为模板，以pTarget-ldhA-F/pTarget-ldhA-R为引物扩增得到线性化质粒pTarget-ldhA；以E.coli W3110基因组为模版，L-ldhA-F/L-ldhA-Pbs-R和esaI-ldhA-R-F/R-ldhA-R为引物，扩增得到上下游同源臂。以质粒pET28-EsaI为模板，以引物Pbs-esaI-F/esaI-R扩增esaI片段，利用Clean up纯化试剂盒回收PCR产物。以上下游同源臂F1、R1和esaI为模板，以L-ldhA-F/R-ldhA-R为引物融合得到含有esaI的上下游同源臂，经过Clean up试剂盒回收DNA片段，获得融合后的片段。将融合后的片段和线性化质粒pTarget-ldhA连接后转化菌株630B7感受态细胞，消除pTarget和pCas9质粒，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将菌株630B7基因组上的基因ldhA替换成调控元件Pbs-EsaI，构建菌株630B1(ΔptsGΔgalRTrc-glkΔpoxB::EsaRΔgltA::PesaS-gltAΔldhA::Pbs-EsaI)，记为菌株630B8；
(7)在质粒pTrc99a上过表达经过密码子优化来源于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032的pycCG：以质粒pTrc99a-panDBS K104S-aspBCG-aspA为模板，以pTrc99a-line-F/pTrc99a-line-R引物获得线性化质粒pTrc99a-panDBS K104S-aspBCG-aspA；将线性化质粒pTrc99a-panDBS K104S-aspBCG-aspA与SEQ ID NO.12所示密码子优化pycCG基因片段连接构建质粒pTrc99a-panDBS K104S-aspBCG-aspA-pycCG并转化到菌株630B8感受态细胞中，构建菌株630B1(ΔptsGΔgalRTrc-glkΔpoxB::EsaRΔgltA::PesaS-gltAΔldhA::Pbs-EsaI/pTrc99a-panDBS K104S-aspB CG-aspA-pycCG)，记为菌株630B9。
本发明以菌株630B1为出发菌株，改造了大肠杆菌的β-丙氨酸合成网络，为了在代谢途径中平衡菌株生长与产物合成两个阶段的碳流，选择动态降低TCA循环代谢流，以实现前期菌株正常生长，后期TCA循环减弱，使代谢流量更多流入产物合成途径。通过敲除了基因ptsG以降低PTS途径中PEP向PYR的转化，增加前体草酰乙酸的积累量，构建菌株630B1(ΔptsG)；通过敲除基因galR，开启非PTS糖转运蛋白galP基因的结构性表达，从而提高了发酵液中β-丙氨酸的浓度，构建菌株630B1(ΔptsGΔgalR)；通过Trc启动子替换基因glk以后，进一步加强非PTS系统对葡萄糖的摄取，为β-丙氨酸合成提供充分的前体L-天冬氨酸，构建菌株630B1(ΔptsGΔgalRTrc-glk)；为了实现对TCA循环代谢流量的动态调节，将群体感应调控元件基因EsaR整合到基因poxB原位点，构建菌株630B1(ΔptsGΔgalRTrc-glkΔpoxB::EsaR)；通过将基因gltA的启动子替换成启动子PesaS，构建菌株630B1(ΔptsGΔgalRTrc-glkΔpoxB::EsaRΔgltA::PesaS-gltA)；将具有人工启动子的群体感应调控元件基因Pbs-EsaI整合到基因ldhA原位点上，有效减弱代谢流量过量的进入TCA循环，最大限度将碳流量拉向β-丙氨酸的合成方向，提高β-丙氨酸的产量，构建了菌株630B1(ΔptsGΔgalRTrc-glkΔpoxB::EsaRΔgltA::PesaS-gltAΔldhA::Pbs-EsaI)。最后在质粒pTrc99a上过表达经过密码子优化来源于谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的pycCG基因，并将此质粒转化至构架的基因工程菌中，从而得到高产β-丙氨酸的基因工程菌630B1(ΔptsGΔgalRTrc-glkΔpoxB::EsaRΔgltA::PesaS-gltAΔldhA::Pbs-EsaI/pTrc99a-panDBS K104S-aspB CG-aspA-pycCG)。
本发明还涉及到所述的重组基因工程菌在微生物发酵制备β-丙氨酸中应用，所述的应用为：将所述重组基因工程菌接种到发酵培养基中，20-40℃，100-300rpm(优选30℃，180rpm)条件下培养48h至发酵结束，获得含β-丙氨酸的发酵液，将发酵液分离纯化，获得β-丙氨酸。
所述发酵培养基配方如下：葡萄糖20g/L，(NH4)2SO4 16g/L，酵母提取物2g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，无水甜菜碱0.5g/L，5mg/L VB1，2mg/L VB12，48mg/L IPTG，50mg/L卡那霉素，1mL/L微量元素溶液，无需调节pH值；其中微量元素溶液的组分如下：10g/L CaCl2，10g/L FeSO4·7H2O，1g/L ZnSO4·7H2O，0.2g/L CuSO4，0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
所述重组基因工程菌在发酵前，先将所述重组基因工程菌接种至含有50mg/L卡那霉素的LB培养基，挑取单菌落接种至含有50mg/L卡那霉素的LB培养基，37℃、180rpm过夜，制备种子液，将种子液以体积浓度5-6％的接种量接种至发酵培养基。
所述发酵在发酵罐中进行，将所述重组基因工程菌接种至含有50mg/L卡那霉素的LB培养基，挑取单菌落接种至含有50mg/L卡那霉素的LB培养基，37℃、180rpm培养过夜，作为一级种子液；将一级种子液以体积浓度1％的接种量接种LB培养基中，37℃、180rpm过夜培养，作为二级种子液；将二级种子液以体积浓度15％接种量接种至装有2L发酵培养基的发酵罐中，在30℃、转速300rpm，通气量0.5V/V·min，pH值维持在6.80条件下发酵培养，当pH值高于6.82时(初始糖消耗完毕)，自动补料开启，补加补料培养基至pH低于6.80时停止补料，在30℃、转速300rpm，通气量0.5V/V·min，pH值维持在6.80条件下培养90-110h，获得含β-丙氨酸的发酵液。补料培养基总添加量为1800mL/2L，添加速度为10-12mL/h。发酵培养基配方：葡萄糖20g/L，(NH4)2SO4 16g/L，酵母提取物2g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，无水甜菜碱0.5g/L，5mg/L VB1，2mg/L VB12，48mg/L IPTG，50mg/L卡那霉素，1mL/L微量元素溶液，无需调节pH；微量元素溶液组成为：10g/L CaCl2，10g/L FeSO4·7H2O，1g/L ZnSO4·7H2O，0.2g/L CuSO4，0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
补料培养基组成：葡萄糖500g/L，(NH4)2SO4 16g/L，酵母提取物2g/L，KH2PO4 14g/L，MgSO4 8g/L，无水甜菜碱0.5g/L，5mg/L VB1，2mg/L VB12，48mg/L IPTG，50mg/L卡那霉素，2mL/L微量元素溶液，溶剂为水，用14％的氨水调节pH为6.8。
所述发酵液分离纯化采用本领域公知方法即可，比如：首先12000rpm、4℃离心10min除去发酵液中的菌体及其他固体颗粒，再采用微滤的方法去除其中的大分子蛋白，再用去离子技术除去其中的无机盐，加入活性炭脱色，离子交换树脂分离得到β-丙氨酸，真空浓缩，加入乙醇降温结晶，获得β-丙氨酸晶体。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明利用“推拉阻”的策略定向强化β-丙氨酸的合成途径，利用基因工程和代谢工程技术改造大肠杆菌β-丙氨酸生物合成途径，对合成β-丙氨酸的部分关键基因进行静态调控，在TCA循环还原支路的β-丙氨酸转化路径中，增加β-丙氨酸前体L-天冬氨酸池和草酰乙酸池的积累，敲除部分副产物合成基因以减少碳流的损失，提高发酵液中产物产量，在质粒上过表达异源关键基因，结合群体感应基因线路的动态调控策略，进一步对草酰乙酸底物池及TCA循环代谢流量做出动态调控，大幅度提高β-丙氨酸的产量。
本发明在基因组水平先敲除了基因ptsG以降低PTS途径中PEP向PYR的转化，增加前体草酰乙酸的积累量；通过敲除基因galR，开启非PTS糖转运蛋白galP基因的结构性表达，强化了非PTS糖转运蛋白galP，从而提高了发酵液中β-丙氨酸的浓度；通过Trc启动子替换基因glk以后，进一步加强非PTS系统对葡萄糖的摄取，为β-丙氨酸合成提供充分的前体OAA；另外又引入玉米细菌性枯萎病菌Pantoea stewartia菌株中的EsaI/EsaR群感系统后，对TCA循环关键基因gltA进行动态调控，在代谢途径中平衡菌株生长与产物合成两个阶段的碳流，使代谢流量更多流入产物合成途径，在质粒pTrc99a上过表达经过密码子优化的来源谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicumATCC 13032)的pycCG，增加β-丙氨酸合成途径中的碳流量，构建高产菌630B1
(ΔptsGΔgalRTrc-glkΔpoxB::EsaRΔgltA::PesaS-gltAΔldhA::Pbs-EsaI/pTrc99a-panDBS K104S-aspB CG-aspA-pycCG)。
本发明方法构建的菌株630B9在摇瓶水平上β-丙氨酸的产量达到5.6g/L。在补料发酵罐水平上，β-丙氨酸的产量达到108.54g/L，相较于出发菌株630B1提高了61.2％，其糖酸转化率是51％，为工业化生产β-丙氨酸奠定了基础。
(四)附图说明
图1为菌株630B2和菌株630B1的生物量OD600和β-丙氨酸浓度的柱形图。
图2为菌株630B3和菌株630B2的生物量OD600和β-丙氨酸浓度的柱形图。
图3为菌株630B4和菌株630B3的生物量OD600和β-丙氨酸浓度的柱形图。
图4为菌株630B5和菌株630B4的生物量OD600和β-丙氨酸浓度的柱形图。
图5为菌株630B8和菌株630B4的生物量OD600和β-丙氨酸浓度的柱形图。
图6为菌株630B9和菌株630B8的生物量OD600和β-丙氨酸浓度的柱形图。
图7为菌株630B9在5-L发酵罐补料发酵的生物量OD600，残糖和β-丙氨酸的浓度曲线图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
LB平板组成：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH自然。
LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，溶剂为去离子水，pH值自然。
发酵培养基：葡萄糖20g/L，(NH4)2SO4 16g/L，酵母提取物2g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO40.5g/L，无水甜菜碱0.5g/L，5mg/L VB1，2mg/L VB12，48mg/L IPTG，50mg/L卡那霉素，1mL/L微量元素溶液，无需调节pH值；其中微量元素溶液组分如下：10g/L CaCl2，10g/LFeSO4·7H2O，1g/L ZnSO4·7H2O，0.2g/L CuSO4，0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
菌株E.coli W3110来自耶鲁大学CGSC保藏中心(Coli Genetic Stock Center)，保藏日期1975年8月5日，保藏编号CGSC#4474，已在专利US2009/0298135 A1，US2010/0248311A1中公开。
大肠杆菌630B1：
E.coli W3110TrcpanDTrcppcΔpykAΔcycA/pTrc99a-panDBS K104S-aspBCG-aspA。
大肠杆菌630B1、质粒pTrc99a-panDBS K104S-aspBCG-aspA的构建均参照Li,B.,Zhang,B.,Wang,P.,Cai,X.,Chen,Y.Y.,Yang,Y.F.,Liu,Z.Q.,Zheng,Y.G.,2022.Rerouting fluxes of the central carbon metabolism and relievingmechanism-based inactivation of L-aspartate-α-decarboxylase for fermentativeproduction ofβ-alanine in Escherichia coli.
表1菌株改造涉及到的基因及其相应的途径
表2基因编辑过程中使用到的引物
实施例1：β-丙氨酸浓度测定
1％2,4-二硝基氟苯配置：取1mL 2,4-二硝基氟苯溶解于99mL乙腈中。
0.5M NaHCO3溶液配置：取21g NaHCO3溶解于500mL去离子水中。
0.2M PB缓冲液：称量8.74g Na2HPO4·12H2O和2.43g Na2HPO4·2H2O溶于200mL去离子水中，溶解保存备用。
样品处理：将样品浓度用超纯水稀释到0.1-1g/L之间。
反应条件：分别取样品100μL，0.5M NaHCO3溶液100μL和1％2,4-二硝基氟苯100μL，60℃保温60min，最后加入700μL 0.2M PB缓冲液混合均匀，过膜(聚偏氟乙烯，有机膜，0.22μm)备用。
HPLC型号：Thermo Scientific Utimate 3000，HPLC检测波长是360nm，采用梯度洗脱程序分离β-丙氨酸，其中流动相A组分是甲醇：乙腈：超纯水＝45:45:10(v:v:v)；流动相B组分：10mM磷酸二氢钾，用KOH调pH值至7.0。
洗脱程序是：0-2.5min 12％ A，88％ B；2.5-2.6min A 12％→16％，B 88％→84％；2.6-13min A 16％→36％，B 84％→64％；13-13.1min A36％→38％ B 64％→62％；13.1-28min A38％→100％ B 62％→0；28-28.1min A 100％-10％ B 0→90％；28.1-32min A 10％→12％ B90％→88％。
实施例2：菌株630B2的构建及其摇瓶发酵
以大肠杆菌630B1为出发菌株，利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，敲除了基因ptsG以降低PTS葡萄糖摄取途径中PEP向PYR的转化，具体操作如下：
(1)构建pTarget-ptsG质粒：以质粒pTarget为模板，以pTarget-ptsG-F/pTarget-ptsG-R为引物进行PCR扩增，PCR产物加入Dpn I后在37℃保温消化1h，采用Clean up试剂盒回收纯化，再转化到E.coli DH5α中，涂布到含有50mg/L壮观霉素的LB固体平板上，37℃倒置培养12h，先菌落PCR初步验证，再经过测序验证pTarget-ptsG质粒的正确性，获得质粒pTarget-ptsG。以pTD-line-F/pTD-line-R为引物，以质粒pTarget-ptsG为模板PCR扩增质粒线性化片段，PCR产物经过Dpn I酶切后在37℃保温消化3h，Clean up试剂盒回收DNA片段，获得线性化的质粒pTarget-ptsG。
(2)构建含有Donor的pTD-ptsG质粒：以E.coli W3110的基因组为模板，以L-ptsG-F/L-ptsG-R为引物扩增上游同源臂F1；以R-ptsG-F/R-ptsG-R为引物扩增下游同源臂R1。利用Clean up纯化试剂盒回收PCR产物。以上下游同源臂F1、R1为模板，以L-ptsG-F/R-ptsG-R为引物融合得到ptsG的上下游同源臂，经过Clean up试剂盒回收DNA片段，获得融合后的片段。再以融合后的片段和线性化的质粒pTarget-ptsG通过一步克隆方法构建质粒pTD-ptsG，经过转化E.coli DH5α中，涂布到含有50mg/L壮观霉素的LB固体平板上，37℃倒置培养12h，菌落PCR初步筛选正确菌株，最后经过测序验证质粒pTD-ptsG的正确性。
(3)将质粒pCas9转化感受态细胞630B1中，涂布到含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，30℃过夜培养，挑取单菌落至含有50mg/L卡那霉素的LB试管培养基中，30℃过夜培养。再按体积浓度1％接种量接种到100mL的LB培养基中，并加入终浓度为50mg/L的卡那霉素和10mM的L-阿拉伯糖，180rpm、30℃培养至OD600＝0.5，4℃、4000rpm离心。利用4℃冷的超纯水洗涤2次，再用10％冷的甘油洗涤一次，最后用10％甘油重悬分装保存，获得电转感受态细胞，备用。
(4)取2μL步骤(2)方法构建的pTD-ptsG质粒与100μL步骤(3)方法电转感受态细胞混合，转入到2mm的电击杯中，冰浴45s，用电穿孔仪(MicroPluserTM,BIO-RAD)电击转化，选择的电压为2500V，电击完成后立即加入700μL、4℃预冷的LB培养基，混合均匀后立即转移至新的无菌1.5mL的EP管中，30℃、150rpm震荡培养3h，涂布在含有50mg/L卡那霉素和50mg/L壮观霉素的LB固体培养基上，30℃倒置培养24h，以T-ptsG-F/T-ptsG-R为引物菌落PCR验证，并测序验证菌株构建正确性，成功构建菌株630B1(ΔptsG)。
(5)pTarget和pCas9质粒消除：挑取步骤(4)阳性单菌落接种到含有2mM IPTG和50mg/L卡那霉素LB液体培养基试管中，30℃过夜培养，蘸取菌液划线至含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上，30℃倒置培养20h至单菌落出现，挑取单菌落至含有50mg/L壮观霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养12h，若没有单菌落出现说明此菌株中已经消除pTarget质粒。挑取消除掉pTarget质粒的菌株接种到无抗的LB液体培养基试管中，42℃培养10h，蘸取菌液划线至含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上，30℃倒置培养20h，若无单菌落出现说明pCas9质粒消除成功，最终得到无质粒菌株630B1(ΔptsG)，记为菌株630B2。
(6)将步骤(5)菌株630B2单菌落挑取到含有50mg/L卡那霉素的LB试管培养基中，37℃、180rpm过夜培养，获得种子液。接种3mL种子液至装有50mL发酵培养基的500mL摇瓶中，于30℃、180rpm震荡培养48h。发酵结束后取1mL发酵液12000rpm离心3min，弃全部上清液，加入1mL蒸馏水重悬菌体和其中的碳酸钙，12000rpm离心3min弃上清，再次加入1mL蒸馏水重悬菌体和碳酸钙，12000rpm离心3min弃上清。最后加入800μL蒸馏水，重悬菌体和碳酸钙，再加入200μL体积浓度20％乙酸水溶液，室温放置5min溶解其中的碳酸钙。取100μL溶解碳酸钙的菌液加入到1900μL蒸馏水中，稀释20倍，最后用分光光度计测定生物量OD600。再取1mL发酵液12000rpm离心3min，取100μL上清液，加入100μL 0.5M NaHCO3溶液和100μL 1％2,4-二硝基氟苯，60℃、400rpm震荡保温75min，最后加入700μL 0.2M PB缓冲液混合均匀，过膜备用。根据实施例1检测β-丙氨酸的含量。同样条件下，将菌株630B2替换为菌株630B1，测量生物量OD600和β-丙氨酸的含量，如图1所示，菌株630B1的生物量OD600＝15.8，β-丙氨酸的含量为3.87g/L；菌株630B2的生物量OD600＝13.7，β-丙氨酸的含量为4.22g/L。
由图1可见，敲除了基因ptsG以降低PTS系统途径中PEP向PYR的转化，发酵结果表明β-丙氨酸从3.87增长到4.22g/L，说明将编码葡萄糖特异性PTS酶的基因ptsG敲除，减少PEP向PYR的转化，降低PEP的碳流失，增强ppc酶的活性以增加OAA的积累，有利于β-丙氨酸在发酵液中的积累。
实施例3：菌株630B3的构建及其摇瓶发酵
(1)构建pTarget-galR质粒：以质粒pTarget为模板，pTarget-galR-F/pTarget-galR-R为引物扩增，PCR产物中加入Dpn I，37℃保温1h，消除甲基化的质粒模板。转化到E.coliDH5α感受态细胞中，涂布到含有50mg/L壮观霉素的LB固体培养上，37℃培养12h至单菌落出现，菌落PCR初步验证，最后经过测序验证构建质粒的正确性。线性化处理同实施例2，获得线性化质粒pTarget-galR。
(2)构建质粒pTD-galR:以E.coli W3110基因组为模版，以L-galR-F/L-galR-R和R-galR-F/R-galR-R为引物，PCR扩增得到上下游同源臂，将上下游同源臂克隆至线性化质粒pTarget-galR，其余构建步骤同实施例2，得到质粒pTD-galR。
(3)将pCas9质粒导入到菌株630B2中，同实施例2方法制备630B2的感受态细胞。
(4)采用实施例2方法，将质粒pTD-galR转入步骤(3)感受态细胞，构建菌株630B1(ΔptsGΔgalR)。
(5)质粒消除：采用实施例2方法消除步骤(4)菌株质粒pTarget和pCas9，获得无质粒菌株630B1(ΔptsGΔgalR)，记为菌株630B3。
(6)将构建的菌株630B3发酵验证，其中以630B2为对照菌，按照实施例2的方法进行摇瓶发酵和检测。发酵液中的生物量OD600和β-丙氨酸的产量如图2所示。菌株630B3生物量OD600为14.5，β-丙氨酸的产量4.52g/L；菌株630B2生物量OD600为13.8，β-丙氨酸的产量4.25g/L。
由图2可见，敲除galR，β-丙氨酸的产量从4.25g/L增加到4.52g/L，说明敲除激活了非PTS糖转运蛋白galP基因的结构性表达，有利于β-丙氨酸在发酵液中的积累。
实施例4、菌株630B4的构建及其摇瓶发酵
(1)构建pTarget-glk质粒：以质粒pTarget为模板，pTarget-glk-F/pTarget-glk-R为引物扩增，PCR产物中加入Dpn I，37℃保温1h，消除甲基化的质粒模板。转化到E.coliDH5α感受态细胞中，涂布到含有50mg/L壮观霉素的LB固体培养上，37℃培养12h至单菌落出现，菌落PCR初步验证，最后经过测序验证构建质粒的正确性。线性化处理同实施例2，获得线性化质粒pTarget-glk。
(2)构建质粒pTD-glk:以E.coli W3110基因组为模版，以L-glk-F/L-glk-R和R-glk-F/R-glk-R为引物，PCR扩增得到上下游同源臂，将上下游同源臂克隆至线性化质粒pTarget-glk，其余构建步骤同实施例2，得到质粒pTD-glk。
(3)将pCas9质粒导入到实施例3中的菌株630B3中，同实施例2方法制备630B3的感受态细胞。
(4)采用实施例2方法，将质粒pTD-glk转入步骤(3)感受态细胞，构建菌株630B1(ΔptsGΔgalRTrc-glk)。
(5)质粒消除：采用实施例2方法消除步骤(4)菌株质粒pTarget和pCas9，获得无质粒菌株630B1(ΔptsGΔgalRTrc-glk)，记为菌株630B4。
(6)将构建的菌株630B4发酵验证，其中以实施例3构建的菌株630B3为对照菌，按照实施例2的方法进行摇瓶发酵和检测。发酵液中的生物量OD600和β-丙氨酸的产量如图3所示。菌株630B4生物量OD600为15.8，β-丙氨酸的产量4.68g/L；菌株630B3生物量OD600为14.5，β-丙氨酸的产量4.51g/L。
由图3可见，强化基因glk以后，不但β-丙氨酸产量具有一定提升，而且菌体量也得到了提升，这些改造用于维持氧化还原平衡的PEP，以及通过消除需要从PEP产生额外的PYR来提高能源效率，最终在提升了β-丙氨酸产量的同时，降低了菌株的代谢负担。
实施例5、菌株630B5的构建及其摇瓶发酵
(1)构建pTarget-galP质粒：以质粒pTarget为模板，pTarget-galP-F/pTarget-galP-R为引物扩增，PCR产物中加入Dpn I，37℃保温1h，消除甲基化的质粒模板。转化到E.coliDH5α感受态细胞中，涂布到含有50mg/L壮观霉素的LB固体培养上，37℃培养12h至单菌落出现，菌落PCR初步验证，最后经过测序验证构建质粒的正确性。线性化处理同实施例2，获得线性化质粒pTarget-galP。
(2)构建质粒pTD-galP:以E.coli W3110基因组为模版，以L-galP-F/L-galP-R和R-galP-F/R-galP-R为引物，PCR扩增得到上下游同源臂，将上下游同源臂克隆至线性化质粒pTarget-galP，其余构建步骤同实施例2，得到质粒pTD-galP。
(3)将pCas9质粒导入到实施例3中的菌株630B4中，同实施例2方法制备630B4的感受态细胞。
(4)采用实施例2方法，将质粒pTD-galP转入步骤(3)感受态细胞，构建菌株630B1(ΔptsGΔgalRTrc-glkTrc-galP)。
(5)质粒消除：采用实施例2方法消除步骤(4)菌株质粒pTarget和pCas9，获得无质粒菌株630B1(ΔptsGΔgalRTrc-glkTrc-galP)，记为菌株630B5。
(6)将构建的菌株630B5发酵验证，其中以实施例4构建的菌株630B4为对照菌，按照实施例2的方法进行摇瓶发酵和检测。发酵液中的生物量OD600和β-丙氨酸的产量如图3所示。菌株630B5生物量OD600为14.8，β-丙氨酸的产量4.53g/L；菌株630B4生物量OD600为15.5，β-丙氨酸的产量4.71g/L。
由图4可见，强化基因galP以后，并没有出现预期中产量提升的情况，不但β-丙氨酸产量具有一定下跌，而且菌体量也有所下跌。故此由菌株630B4重新向下构建。
实施例6：动态调控型菌株630B6的构建
(1)构建质粒pTarget-poxB：以pTarget质粒为模板，以pTarget-poxB-F/pTarget-poxB-R为引物扩增，PCR产物中加入Dpn I后37℃保温2h，消化其中的甲基化质粒模板，经过纯化后转化到E.coli DH5α感受态细胞中。利用含有50mg/L壮观霉素的LB平板筛选阳性菌株，在经过测序验证其正确性，采用实施例2方法，得到线性化质粒pTarget-poxB。
(2)构建质粒pTD-poxB：以E.coli W3110基因组为模版，L-poxB-F/L-poxB-R和R-poxB-F/R-poxB-R为引物，扩增得到上下游同源臂。以质粒pET28-EsaR为模板，以引物EsaR-F/EsaR-R扩增EsaR片段，利用Clean up纯化试剂盒回收PCR产物。以上下游同源臂F1、R1和EsaR为模板，以L-poxB-F/R-poxB-R为引物融合得到含有EsaR的上下游同源臂，经过Cleanup试剂盒回收DNA片段，获得融合后的片段。采用实施例2方法将融合后的片段克隆至步骤(1)线性化质粒pTarget-poxB，得到质粒pTD-poxB。
(3)采用实施例2方法，将质粒pCas9导入到菌株630B4中并制备感受态细胞。
(4)采用实施例2方法，将质粒pTD-poxB转入步骤(3)感受态细胞，构建菌株630B1(ΔptsGΔgalRTrc-glkΔpoxB::EsaR)。
(5)质粒消除：采用实施例2，消除步骤(4)菌株pTarget和pCas9质粒，得到无质粒菌株630B6(ΔptsGΔgalRTrc-glkΔpoxB::EsaR)，记为菌株630B6。
实施例7：动态调控型菌株630B7的构建
(1)构建质粒pTarget-gltA：以pTarget质粒为模板，以pTarget-gltA-F/pTarget-gltA-R为引物扩增，PCR产物中加入Dpn I后37℃保温2h，消化其中的甲基化质粒模板，经过纯化后转化到E.coli DH5α感受态细胞中。利用含有50mg/L壮观霉素的LB平板筛选阳性菌株，在经过测序验证其正确性，采用实施例2方法，得到线性化质粒pTarget-gltA。
(2)构建质粒pTD-gltA：以E.coli W3110基因组为模版，L-gltA-F/L-gltA-R和R-gltA-F/R-gltA-R为引物，扩增得到上下游同源臂。以质粒pET28-PesaS为模板，以引物Pesas-F/Pesas-R扩增Pesas片段，利用Clean up纯化试剂盒回收PCR产物。以上下游同源臂F1、R1和Pesas为模板，以L-gltA-F/R-gltA-R为引物融合得到含有Pesas的上下游同源臂，经过Clean up试剂盒回收DNA片段，获得融合后的片段。采用实施例2方法将融合后的片段克隆至步骤(1)线性化质粒pTarget-gltA，得到质粒pTD-gltA。
(3)采用实施例2方法，将质粒pCas9导入到菌株630B6中并制备感受态细胞。
(4)采用实施例2方法，将质粒pTD-gltA转入步骤(3)感受态细胞，构建菌株630B1(ΔptsGΔgalRTrc-glkΔpoxB::EsaRΔgltA::PesaS-gltA)。
(5)质粒消除：采用实施例2，消除步骤(4)菌株pTarget和pCas9质粒，得到无质粒菌株630B1(ΔptsGΔgalRTrc-glkΔpoxB::EsaRΔgltA::PesaS-gltA)，记为菌株630B7。
实施例8：动态调控型菌株630B8的构建及其摇瓶发酵
(1)构建质粒pTarget-ldhA：以pTarget质粒为模板，以pTarget-ldhA-F/pTarget-ldhA-R为引物扩增，PCR产物中加入Dpn I后37℃保温2h，消化其中的甲基化质粒模板，经过纯化后转化到E.coli DH5α感受态细胞中。利用含有50mg/L壮观霉素的LB平板筛选阳性菌株，在经过测序验证其正确性，采用实施例2方法，得到线性化质粒pTarget-ldhA。
(2)构建质粒pTD-ldhA：以E.coli W3110基因组为模版，L-ldhA-F/L-ldhA-Pbs-R和esaI-ldhA-R-F/R-ldhA-R为引物，扩增得到上下游同源臂。以质粒pET28-EsaI为模板，以引物Pbs-esaI-F/esaI-R扩增esaI片段，利用Clean up纯化试剂盒回收PCR产物。以上下游同源臂F1、R1和esaI为模板，以L-ldhA-F/R-ldhA-R为引物融合得到含有esaI的上下游同源臂，经过Clean up试剂盒回收DNA片段，获得融合后的片段。采用实施例2方法将融合后的片段克隆至步骤(1)线性化质粒pTarget-ldhA，得到质粒pTD-ldhA。
(3)采用实施例2方法，将质粒pCas9导入到菌株630B1(ΔptsGΔgalRTrc-glkΔpoxB::EsaRΔgltA::PesaS-gltA)中并制备感受态细胞。
(4)采用实施例2方法，将质粒pTD-ldhA转入步骤(3)感受态细胞，构建菌株630B1(ΔptsGΔgalRTrc-glkΔpoxB::EsaRΔgltA::PesaS-gltAΔldhA::Pbs-EsaI)。
(5)质粒消除：采用实施例2，消除步骤(4)菌株pTarget和pCas9质粒，得到无质粒菌株630B1(ΔptsGΔgalRTrc-glkΔpoxB::EsaRΔgltA::PesaS-gltAΔldhA::Pbs-EsaI)，记为菌株630B8。
(6)采用实施例2方法对菌株630B8进行摇瓶发酵，其中以630B4为对照菌株。摇瓶发酵中的生物量OD600和β-丙氨酸的产量如图5所示。菌株630B8生物量OD600为12.8，β-丙氨酸的产量4.96g/L；菌株630B4生物量OD600为15.8，β-丙氨酸的产量4.68g/L。
由图5可见，选择动态降低TCA循环代谢流，平衡菌株生长与产物合成两个阶段，前期菌株正常生长，后期TCA循环减弱，代谢流量更多流入产物合成途径。同时阻断副产物形成途径减少碳流损失，菌体不但生长情况变好，β-丙氨酸的产量也从4.68g/L增加到了4.96g/L，说明引入玉米细菌性枯萎病菌Pantoea stewartia菌株中的Esa群感系统后，动态降低TCA循环代谢流，平衡菌株生长与产物合成两个阶段，有利于β-丙氨酸的合成。
实施例9：在菌株630B8中过表达pTrc99a-panDBS K104S-aspBCG-aspA-pycCG菌株的构建及其摇瓶发酵
(1)构建pTrc99a-panDBS K104S-aspBCG-aspA-pycCG质粒：以质粒pTrc99a-panDBS K104S-aspBCG-aspA为模板，以pTrc99a-line-F/pTrc99a-line-R为引物PCR扩增，其中PCR产物经过Dpn I酶切后在37℃保温消化2h，去除其中的甲基化载体，再用Clean up试剂盒回收DNA片段，备用。再以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032的基因组为模板，以引物pyc-F和pyc-R，PCR扩增pycCG片段，再用Clean up试剂盒回收DNA片段，备用。按照(One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将线性化pTrc99a-panDBS K104S-aspBCG-aspA质粒、片段pycCG连接在一起，将连接产物转化到E.coliDH5α感受态中；最后挑选克隆子，通过测序验证得到pTrc99a-panDBS K104S-aspBCG-aspA-pycCG质粒。
(2)制备630B8感受态，阳性菌落验证以及质粒消除同实施例2。
(3)同实施例2，将步骤(1)中构建pTrc99a-panDBS K104S-aspBCG-aspA-pycCG质粒转化到步骤(2)菌株630B8的感受态细胞中，从而获得最终构建的菌株630B1(ΔptsGΔgalRTrc-glkΔpoxB::EsaRΔgltA::PesaS-gltAΔldhA::Pbs-EsaI/pTrc99a-panDBS K104S-aspB CG-aspA-pycCG)，记为菌株630B9。
(4)采用实施例2方法对菌株630B9进行摇瓶发酵，其中以630B8为对照菌株。摇瓶发酵中的生物量OD600和β-丙氨酸的产量如图6所示。菌株630B9生物量OD600为16.8，β-丙氨酸的产量5.60g/L；菌株630B8生物量OD600为12.8，β-丙氨酸的产量4.96g/L。
由图6可见，在质粒上过表达来源于Corynebacterium glutamicum的pyc强化OAA合成途径关键酶的表达，有利于β-丙氨酸的合成。从而使β-丙氨酸的产量从4.96g/L增加到5.60g/L。
实施例10：5-L发酵罐的补料发酵
将实施例9中菌株630B9划线至含有50mg/L卡那抗性的LB平板上，挑取单菌落至含有50mg/L卡那霉素抗性的LB试管，37℃、180rpm过夜培养，制备一级种子液。将一级种子液以体积浓度1％的接种量接种至100mL含有50mg/L卡那抗性的LB培养基中，37℃、180rpm过夜培养，作为二级种子液。
将二级种子液按体积浓度15％接种至装有2L发酵培养基的5-L发酵罐中，在30℃、转速300rpm，通气量0.5V/V·min，pH值维持在6.80条件下发酵培养，当pH值高于6.82时(初始糖消耗完毕)，自动补料开启，补加补料培养基至pH低于6.80时，停止补料，补料速度为10mL/h，补料量为1800mL。在30℃、转速500rpm，通气量0.5V/V·min，pH值维持在6.80条件下培养110h；发酵液采用实施例1高效液相色谱法检测β-丙氨酸的产量，采用分光光度法检测生物量OD600，采用DNS法检测糖浓度，结果如图7所示。
如图7所示，菌株630B9在发酵97h后β-丙氨酸的产量为108.5g/L；糖酸转化率51％；最终生物量OD600维持在100；发酵罐中的残糖维持在较低水平，糖浓度维持2g/L。发酵结果表明，经过代谢工程改造的β-丙氨酸生产菌具有良好的生产性能，发酵液中并未检测到其他氨基酸的积累，为工业化生产β-丙氨酸奠定了基础。
发酵培养基配方：葡萄糖20g/L，(NH4)2SO4 16g/L，酵母提取物2g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，无水甜菜碱0.5g/L，5mg/L VB1，2mg/L VB12，48mg/L IPTG，50mg/L卡那霉素，1mL/L微量元素溶液，无需调节pH；微量元素溶液组成为：10g/L CaCl2，10g/L FeSO4·7H2O，1g/L ZnSO4·7H2O，0.2g/L CuSO4，0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
补料培养基：葡萄糖500g/L，(NH4)2SO4 16g/L，酵母提取物2g/L，KH2PO4 14g/L，MgSO4 8g/L，无水甜菜碱0.5g/L，5mg/L VB1，2mg/L VB12，48mg/L IPTG，50mg/L卡那霉素，2mL/L微量元素溶液，溶剂为水，用14％的氨水调节pH为6.8。
Claims (9)
1.一种通过动态调控TCA途径生产β-丙氨酸的重组基因工程菌，其特征在于，所述重组基因工程菌是以大肠杆菌630B1为出发菌株进行下列之一或多种基因编辑：敲除基因ptsG、敲除基因galR、基因glk启动子替换成启动子Trc、基因poxB替换成调控元件EsaR，基因ldhA替换成带有启动子Pbs的调控元件EsaI，基因gltA启动子替换成启动子PesaS，在质粒pTrc99a-panDBS K104S-aspBCG-aspA上过表达pycCG基因；所述出发菌株630B1：E.coliW3110Trc-panDTrc-ppcΔpykAΔcycA/pTrc99a-panDBS K104S-aspBCG-aspA。
2.如权利要求1所述重组基因工程菌，其特征在于，所述基因ptsG核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述基因galR核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，基因glk核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，基因poxB核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，基因gltA核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，基因ldhA核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
3.如权利要求1所述重组基因工程菌，其特征在于，调控元件EsaR核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示，调控元件EsaI核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，启动子PesaS核苷酸序列如SEQID NO.10所示，启动子Pbs核苷酸序列如SEQ ID NO.11，基因pyc核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示，Trc启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
4.如权利要求1所述重组基因工程菌，其特征在于，所述重组基因工程菌是以大肠杆菌630B1为出发菌株，敲除基因ptsG、敲除基因galR、基因glk启动子替换成启动子Trc、基因poxB替换成调控元件EsaR，基因ldhA替换成带有启动子Pbs的调控元件EsaI，基因gltA启动子替换成启动子PesaS，且在质粒pTrc99a-panDBS K104S-aspBCG-aspA上过表达pycCG基因。
5.一种权利要求1所述重组基因工程菌在微生物发酵法制备β-丙氨酸中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的应用为：将所述的重组基因工程菌接种到发酵培养基中，20-40℃，100-300rpm条件下培养48h至发酵结束，获得含β-丙氨酸的发酵液，将发酵液分离纯化，获得β-丙氨酸；所述发酵培养基配方如下：葡萄糖20g/L，(NH4)2SO4 16g/L，酵母提取物2g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，无水甜菜碱0.5g/L，5mg/L VB1，2mg/L VB12，48mg/L IPTG，50mg/L卡那霉素，1mL/L微量元素溶液，溶剂为水，无需调节pH值；微量元素溶液的组分如下：10g/L CaCl2，10g/L FeSO4·7H2O，1g/L ZnSO4·7H2O，0.2g/LCuSO4，0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述重组基因工程菌在发酵前，先将所述重组基因工程菌接种至含有50mg/L卡那霉素的LB培养基，挑取单菌落接种至含有50mg/L卡那霉素的LB培养基，37℃、180rpm过夜，制备种子液，将种子液以体积浓度5-6％的接种量接种至发酵培养基。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵在发酵罐中进行：将所述重组基因工程菌接种至含有50mg/L卡那霉素抗性LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落至含有50mg/L卡那霉素抗性的LB试管，37℃、150rpm培养过夜，制备一级种子液；将一级种子液以体积浓度1％的量接种LB培养基中，37℃、150rpm培养过夜，作为二级种子液；将二级种子液按体积浓度15％接种至装有发酵培养基的发酵罐中，在30℃、300rpm、通气量0.5V/V·min条件下发酵培养，当pH值高于6.80时，自动补料开启，补加补料培养基至pH低于6.80时停止补料，培养90-110h，获得含β-丙氨酸的发酵液；
发酵培养基配方：葡萄糖20g/L，(NH4)2SO4 16g/L，酵母提取物2g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO40.5g/L，无水甜菜碱0.5g/L，5mg/L VB1，2mg/L VB12，48mg/L IPTG，50mg/L卡那霉素，1mL/L微量元素溶液，无需调节pH；微量元素溶液组成为：10g/L CaCl2，10g/L FeSO4·7H2O，1g/LZnSO4·7H2O，0.2g/L CuSO4，0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水；
所述补料培养基：葡萄糖500g/L，(NH4)2SO4 16g/L，酵母提取物2g/L，KH2PO4 14g/L，MgSO48g/L，无水甜菜碱0.5g/L，5mg/L VB1，2mg/L VB12，48mg/L IPTG，50mg/L卡那霉素，2mL/L微量元素溶液，溶剂为水，用14％的氨水调节pH为6.8。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述补料培养基添加速度为10-12mL/h。
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