CN113817694A

CN113817694A - 草铵膦脱氢酶突变体、编码基因、基因工程菌及其应用

Info

Publication number: CN113817694A
Application number: CN202111022013.5A
Authority: CN
Inventors: 薛亚平; 邹树平; 姜镇涛; 徐建妙; 程峰; 郑裕国
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2021-09-01
Filing date: 2021-09-01
Publication date: 2021-12-21
Anticipated expiration: 2041-09-01
Also published as: CN113817694B

Abstract

本发明涉及一种草铵膦脱氢酶突变体及其编码基因，以及利用该突变体构建的基因工程菌菌及其在催化PPO制备L‑草铵膦中的应用。所述突变体氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码基因如SEQ ID No.2所示。本发明构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet‑1‑PPTGDHE3(A164G‑V354A‑R205K)‑GDH，具有高产草铵膦脱氢酶的性质，用于发酵罐生产，最高酶活力可达6605U/L，可用于微生物催化PPO制备L‑草铵膦，大大节约了成本，具有十分重要的产业价值和显著的社会效益；含草铵膦脱氢酶的固定化全细胞用于催化PPO生产L‑草铵膦，重复使用20次后，固定化细胞仍能保持100％的转化率，具有良好的工业化应用前景。

Description

草铵膦脱氢酶突变体、编码基因、基因工程菌及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种草铵膦脱氢酶突变体及其编码基因，以及利用该突变体构建的基因工程菌菌及其在催化PPO制备L-草铵膦中的应用。

(二)背景技术

草铵膦(glufosinate-ammonium)是世界第二大转基因作物耐受除草剂，由赫斯特公司(几经合并后现归属拜耳公司)开发生产，化学名称为4-[羟基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸，又称草铵膦铵盐、Basta、Buster等，属膦酸类除草剂，是谷氨酰胺合成酶抑制剂，非选择性(灭生性)触杀型除草剂。

目前，世界上的三大除草剂品种是草甘膦、草铵膦和百草枯，相对于百草枯和草甘膦，草铵膦具有优异的除草性能及较小的药害副作用，随着抗草铵膦转基因作物的快速发展，草铵膦在未来一段时间内市场需求巨大，前景非常广阔。

草铵膦有两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦。但只有L-型具有生理活性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。

草铵膦只有L-构型具有植物毒性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性小，对环境的破坏力小。目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。如果草铵膦产品能以L-构型的光学纯异构体形式使用，可使草铵膦的使用量降低50％，这对于提高原子经济性、降低成本、减轻环境压力都具有十分重要的意义。目前报道的L-草铵膦的方法主要有化学合成法，包括消旋草铵膦的拆分、手性原料法、手性辅基法和不对称催化法，但存在D-草铵膦不易消旋再利用、合成步骤冗长，反应需要超低温，产物ee值较低，收率低，且手性拆分试剂价格昂贵等问题。相比之下，生物合成法具有立体选择性严格、反应条件温和及产物易分离纯化的优点，因此探索生物法生产L-草铵膦的可行性具有十分重要的产业价值和显著的社会效益。

以D,L-草铵膦为原料，其中的D-草铵膦经D-氨基酸氧化酶催化得到L-草铵膦前体2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(PPO)，再经氨基酸脱氢酶或转氨酶催化得到L-草铵膦，该方法不仅解决了消旋化的问题，也节约了成本。

大肠杆菌菌株生长快、蛋白表达量高，是重组蛋白表达最常用的宿主。然而目前对氨基酸脱氢酶的产酶研究仍停留在摇瓶发酵水平，尚未出现大规模发酵产酶工艺的报道，但是大肠杆菌E.coli BL21(DE3)已被报道用于脂肪酶等的产酶发酵，具有较高的大规模发酵潜力。

在前期工作中，申请人构建了包含草铵膦脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌工程菌株，该菌株能够在NADPH存在下催化2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸不对称胺化还原为L-草铵膦，并通过葡萄糖脱氢酶实现辅酶再生，但缺乏高密度发酵工艺进行大规模产酶发酵限制了其工业化应用。

由于发酵制备氨基酸脱氢酶的成本较高，为了降低发酵成本，需要实现生物催化剂的重复使用。大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表达的氨基酸脱氢酶是胞内酶，因此可以利用固定化细胞技术将包含氨基酸脱氢酶的大肠杆菌全细胞进行固定化，提高其热稳定性和操作稳定性，实现重复使用，降低生产成本。

交联法是一种优异的固定化方法，该方法制备的固定化细胞具有传质阻力小，稳定性高，易回收等优点。但传统的交联剂由于毒性高，在交联过程中对细胞的损伤较大，因此有必要对其进行改进。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种草铵膦脱氢酶突变体及其编码基因，以及利用该突变体构建的基因工程菌进行高密度发酵并对发酵所得全细胞催化剂进行固定化，并利用该固定化细胞在催化PPO制备L-草铵膦中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种草铵膦脱氢酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还涉及编码所述突变体的基因。具体的，所述编码基因的核苷酸序列如SEQID No.2所示。

本发明还涉及一种高产NADPH依赖型草铵膦脱氢酶的基因工程菌，所述基因工程菌是以E.coli BL21(DE3)为宿主，表达SEQ ID No.1所示草铵膦脱氢酶突变体和SEQ IDNo.3所示葡萄糖脱氢酶获得。

构建所述基因工程菌的方法，所述方法包括：将序列如SEQ ID No.2所示的草铵膦脱氢酶突变体编码基因连接至表达载体pETDuet-1的MCSⅠ上，将核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的葡萄糖脱氢酶编码基因连接至表达载体pETDuet-1的MCSⅡ上，然后再转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，筛选正确的转化子，得到基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH，即所述高产NADPH依赖型草铵膦脱氢酶的基因工程菌。

利用所述基因工程菌可发酵生产草铵膦脱氢酶，在发酵罐中，采用不同诱导策略发酵生产草铵膦脱氢酶，诱导策略包括：

(1)脉冲补加诱导剂进行诱导：分批发酵阶段：将种子液以5～10％接种量接种于发酵罐中，控制温度35-38℃、pH 6.8～7.2，补料发酵阶段：待溶氧上升至50～70％，进行补料培养，控制温度36-38℃、溶氧20-30％、pH 6.8～7.2，当细胞浓度达到20～30g/L时，调整温度为24℃～28℃，每隔2～4h补加乳糖产酶，每次补加量为1g/L～4g/L；诱导16～24h；

(2)连续流加诱导剂进行诱导：分批发酵阶段：将种子液以5％～10％接种量接种于发酵罐中，控制温度35℃～38℃，pH 6.8～7.2；补料发酵阶段：待溶氧上升至50％～70％，进行补料培养，控制温度在35℃～38℃，pH 6.8～7.2；诱导培养阶段：当菌体浓度达到20～30g/L，开始连续流加乳糖诱导产酶，控制温度24℃～28℃，溶氧20％～40％，pH 6.8～7.2，诱导16～30h。

本发明还涉及所述草铵膦脱氢酶突变体在微生物催化PPO制备L-草铵膦中的应用。

具体的，所述应用为：向含有PPO、硫酸铵和葡萄糖的混合液中加入所述基因工程菌经发酵获得的酶液或湿菌体细胞，混合液在30～35℃下反应3～6h，得到L-草铵膦。

优选的，所述湿菌体细胞经全细胞固定化之后用于反应，所述全细胞固定化方法如下：

(1)向含谷氨酸脱氢酶的大肠杆菌菌体中加入磷酸缓冲液，制成50～200g/L的菌悬液，然后加入载体，充分搅拌20～30min，得混合液；

(2)向步骤(1)混合液加入聚乙烯亚胺，充分搅拌20～30min，得混合液；

(3)向步骤(2)混合液中加入葡聚糖多醛，充分搅拌20～30min，得混合液；

(4)步骤(3)混合液减压抽滤，取滤饼水洗，得到含谷氨酸脱氢酶的固定化全细胞。

本发明利用载体吸附、交联剂形成交联网络的方法对大肠杆菌进行固定化，实现生物催化剂稳定性大幅提高，易回收且可重复使用多个批次。

所述载体为活性炭、硅藻土、膨润土或蒙脱土，质量用量为菌体质量的5～15％。

更为优选的，所述载体为蒙脱土。

步骤(2)所用聚乙烯亚胺分子量为600～70000，质量用量为菌体质量的1～10％。

更为优选的，步骤(2)所用聚乙烯亚胺分子量为1800。

具体的，步骤(3)中葡聚糖多醛质量用量为菌体质量的5～10％。

利用所述固定化全细胞催化PPO制备L-草铵膦的方法如下：向含有PPO、硫酸铵和葡萄糖的混合液中加入所述含草铵膦脱氢酶的固定化细胞，混合液在30～35℃下反应3～6h，得到L-草铵膦，过滤回收固定化细胞，加入新鲜的反应底物混合液，进行下一批次反应。

优选的，反应液中各物质的初始浓度为：PPO 200～300mM，硫酸铵300～450mM，葡萄糖250～375mM，固定化全细胞80～120g/L。

本发明的有益效果主要体现在：本发明构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE3(A164G-V354A-R205K)-GDH，具有高产草铵膦脱氢酶的性质，用于发酵罐生产，最高酶活力可达6605U/L，可用于微生物催化PPO制备L-草铵膦，大大节约了成本，具有十分重要的产业价值和显著的社会效益；将含草铵膦脱氢酶的固定化全细胞用于催化PPO生产L-草铵膦，重复使用20次后，固定化细胞仍能保持100％的转化率，具有良好的工业化应用前景。

(四)附图说明

图1为摇瓶发酵所得细胞破碎上清液10g/L的SDS-page凝胶电泳图，泳道1为marker，泳道2为样品。

图2为在5L发酵罐中，恒残糖浓度补料模式下，乳糖脉冲补加诱导的发酵结果图。

图3为在5L发酵罐中，DO-stat补料模式下，乳糖脉冲补加诱导的发酵结果图。

图4为在5L发酵罐中，pH-stat补料模式下，乳糖脉冲补加诱导的发酵结果图。

图5为在5L发酵罐中，pH-stat补料模式下，乳糖连续流加诱导的发酵结果图。

图6为2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸标准曲线。

图7为L-草铵膦标准曲线。

图8为实施例6制备的固定全化细胞和实施例5制备的游离细胞重复使用批次转化率对比图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

上游基因工程所用试剂：本发明实施例中使用的质粒提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒购自康宁生命科学(吴江)有限公司；E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)等购自上海旭冠生物科技发展有限公司；DNA marker、低分子量标准蛋白、蛋白胶等购自北京GenStar有限公司；引物合成，序列测序工作由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。

下游催化工艺所用试剂2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(简称PPO)为实验室合成；D,L-草铵膦购自Sigma-Aldrich公司；其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

以下实施例中，硅藻土分子式为SiO₂，分子量为60.08，中位粒径19.6μm，购自阿拉丁公司。膨润土分子式为Al₂O₃·4(SiO₂)·H₂O，分子量360.31，购自阿拉丁公司。活性炭分子式为C，分子量12.01，购自阿拉丁公司。蒙脱土成分为Al₂O₃16.54％；MgO₄ 65％；SiO₂50.95％，购自阿拉丁公司。聚乙烯亚胺分子量分别为700、1800、10000、70000，购自阿拉丁公司。

培养基：

LB液体培养基(g/L)：蛋白胨10；酵母粉5；NaCl 10。

LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10；酵母粉5；NaCl 10；琼脂2。

发酵培养基(g/L)：蛋白胨24，酵母粉16，NaCl 5，NaSO₄ 2，(NH₄)₂SO₄ 2.5，NH₄Cl0.5，一水合柠檬酸1，K₂HPO₄·3H₂O 9.56，Na₂H₂PO₄·2H₂O 1.8，MgSO4·7H2O 2，甘油8，trace metal solution 1mL/L，消泡剂1mL/L。其中trace metal solution(g/L)：FeSO₄·7H₂O 10，CaCl₂ 2，ZnSO₄·7H₂O 2.2，MnSO₄·4H₂O 0.5，CuSO₄·5H₂O 1，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O0.1，NaB₄O₇·10H₂O 0.02。

补料培养基(g/L)：甘油500；蛋白胨75；酵母粉50；MgSO₄·7H₂O 5；(NH₄)₂SO₄ 20；KH₂PO₄ 3，K₂HPO₄ 3，NaCl 5。

本发明通过高效液相色谱(HPLC)检测反应的进行，并对产物和底物进行分析。HPLC分析方法为：色谱柱/AQ-C18；柱温/30℃；流速/1mL/min；检测波长/232nm；流动相：50mM(NH₄)₂HPO₄，加入1％的10％的四丁基溴化铵水溶液，用磷酸调pH至3.8，加入12％的乙腈。

通过手性HPLC分析方法检查草铵膦的两个构型含量，手性HPLC分析方法为：色谱柱/Pntulips QS-C18；流动相/50mM乙酸铵溶液：甲醇＝9∶1；荧光检测器检测，激发波长/350nm，发射波长/450nm；流速/1mL/min；柱温/30℃。衍生化试剂：分别称取0.1g邻苯二甲醛与0.12g N-乙酰-L-半胱氨酸，用10ml乙醇助溶，在加入40ml 0.1M硼酸缓冲液(pH9.8)。振荡使其充分溶解，4℃冰箱保存备用(不超过3天)。衍生化反应与测定：取200μL样品加入400μL衍生化试剂，混匀至30℃保温5min，加入400μL超纯水混合，进样10μL进行分析。

实施例1：草铵膦脱氢酶突变文库的构建及筛选

以实验室前期构建的pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH质粒为模板专利公开号CN109609475A，对草铵膦脱氢酶进行易错PCR，引入随机突变，易错PCR引物、体系、条件分别如表1、表2、表3所示。

表1：易错PCR引物表

引物名称	DNA序列
		PPTGDHE3-F	GAGCTCATGATTGAGAGCGTCGAGTCT
PPTGDHE3-R	GCGGCCGCTTAGACGACCCCCTGTGCC

表2：易错PCR体系

表3：易错PCR扩增条件

易错PCR产物经过DpnⅠ消化模板并利用DNA纯化回收试剂盒纯化后获得草铵膦脱氢酶的突变文库。以易错PCR产物为引物，pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH全质粒为模板，进行第二轮大引物PCR，PCR过程中使用高保真DNA聚合酶，从而将带有突变的草铵膦脱氢酶基因克隆至表达载体上，获得含有易错基因序列的重组质粒。大引物PCR反应体系及条件如表4、表5所示。

表4：大引物PCR体系

成分	用量(μL)
		2×PCR buffer	25
PCR dNTP	1
		Megaprimer	1
模板	1
		Phanta DNA polymerase	1
ddH<sub>2</sub>O	21

表5：大引物PCR扩增条件

PCR产物经过DpnⅠ消化模板后转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，涂布至氨苄青霉素抗性平板，待长出菌落后，用灭菌的牙签挑取单菌落到灭好菌的96深孔板中，每孔有1mL含有终浓度为0.135mM的氨苄抗性的LB培养基，在37℃、转速为200rpm的摇床中培养8h后，每孔吸取200μL的菌液，转移到另一每孔有800μL的含有终浓度为0.135mM的氨苄和终浓度为0.1mM IPTG诱导剂的LB培养基的96深孔板中，然后放在18℃、200rpm的条件下培养16h后，离心，收取菌体于96孔板底。

高通量筛选50mL衍生化试剂工作液的配制：邻苯二甲醛0.026g，N-乙酰-L-半胱氨酸0.032g，用pH＝9.8硼酸缓冲液溶解定容到50mL，作为高通量工作液。取出50μL样品与50μL工作液震荡反应30s，再加入100μL ddH2O，在λex＝340nm，λem＝450nm下测荧值，筛选荧光值高于原始菌株的菌株。

初筛：终浓度100mM底物PPO，200mM的硫酸铵和120mM的葡萄糖，以pH 7.5的磷酸钠缓冲液为反应介质构成反应液。96深孔板每孔加入500μL的反应液，同时用移液枪反复吹打，将96孔板收集的菌体重悬，然后将96深孔板放入40℃、200rpm的摇床上反应1小时后，离心取上清，测荧光值。

复筛：终浓度300mM底物PPO，500mM的硫酸铵和450mM的葡萄糖，以pH 7.5的磷酸钠缓冲液做为反应介质构成反应液。将初筛获得的菌株的湿菌体作为催化剂，40℃、600rpm条件下进行反应，间隔10min取样，取反应液100μL，加5μL 6M盐酸终止反应，以超纯水补足至1mL，即反应液稀释10倍，12000rpm离心1分钟，取上清，过0.22μM微滤膜，衍生化处理后HPLC检测L-草铵膦含量，并计算活力。酶活定义为：pH7.5、35℃下，每分钟转化生成1μM L-PPT所需的酶量为1U；比活力定义为：每克湿细胞具有的酶活单位数。其中正向突变株筛选结果如表6所示。

表6：正突变筛选结果

实施例2：摇瓶筛选培养基及发酵产酶

将-80℃甘油管保存的E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE3-A164G-V354A-R205K-GDH菌株(对应突变体序列为SEQ ID No.1)转接发酵培养基中36～38℃培养8-10h，后将所得培养液按4-6％的接种量接入不同培养基中，36～38℃，200r/min培养2h后，用终浓度为0.1mM的IPTG诱导，在24℃下继续培养14h。测其细胞浓度，收集菌体。冷冻24h后测量细胞比活力以及胞内辅酶浓度。

活力测定方法：将细胞用pH 7.5的磷酸缓冲液悬浮至100g/L，取100μL，加入到900μL含有100mM PPO，150mM硫酸铵，125mM葡萄糖的磷酸缓冲液中，35℃、600r/min孵育10min。10min后取样100μL，加入5μL 6M HCl终止反应。稀释100倍后按手性HPLC方法检测L-草铵膦的增加量。

图1为摇瓶诱导14h时重组菌破壁上清的SDS-PAGE蛋白电泳图，蛋白电泳结果显示在约49kDa处有一条与理论分子量一致的条带。此时，重组大肠杆菌的比活力为89.2U/g，发酵结束时细胞浓度为13.5g/L，体积活力为1204.2U/L。

实施例3：不同补料模式对重组菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE3-A164G-V354A-R205K-GDH发酵产酶的影响

(1)恒残糖补料模式：分批发酵阶段：将种子液以5～10％接种量接种于发酵罐中，控制温度35～38℃、pH 6.8～7.2，补料发酵阶段：待溶氧上升至50～70％，进行补料培养，控制温度36-38℃、pH 6.8-7.2，调整补料速率使培养基中甘油浓度低于4g/L。当细胞浓度达到20～30g/L时，调整温度为25℃，每隔2h补加乳糖产酶，每次补加量为2g/L；诱导18h。最终诱导8h时获得最大细胞浓度61.3g/L，最大体积活力1489U/L(图2)。

(2)DO-stat补料模式：分批发酵阶段：将种子液以5～10％接种量接种于发酵罐中，控制温度35～38℃、pH 6.8～7.2，补料发酵阶段：待溶氧上升至50-70％，进行补料培养，控制温度36～38℃、pH 6.8～7.2，当溶氧高于30％时开始补加培养基，维持溶氧浓度为30％。当细胞浓度达到20～30g/L时，调整温度为25℃，每隔2h补加乳糖产酶，每次补加量为2g/L；诱导18h。最终诱导10h时获得最大体积活力1783U/L(图3)。

(3)pH-stat补料模式：分批发酵阶段：将种子液以5～10％接种量接种于发酵罐中，控制温度35～38℃、pH 6.8～7.2，补料发酵阶段：待溶氧上升至50～70％，进行补料培养，控制温度36～38℃、溶氧20％～30％，当pH超过7.0时开始补加培养基，维持pH在7.0。当细胞浓度达到20～30g/L时，调整温度为25℃，每隔2h补加乳糖产酶，每次补加量为2g/L；诱导24h。最终诱导16h时获得最大体积活力3401U/L(图4)。

实施例4：pH-stat补料模式下的乳糖连续流加诱导策略产酶

分批发酵阶段：将E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE3-A164G-V354A-R205K-GDH种子液以5～10％接种量接种于发酵罐中，控制温度35～38℃、pH 6.8～7.2，补料发酵阶段：待溶氧上升至50～70％，进行补料培养，控制温度36～38℃、溶氧20％～30％，当pH超过7.0时开始补加培养基，维持pH在7.0。当细胞浓度达到20～30g/L时，调整温度为25℃，连续流加乳糖产酶，乳糖流速为0.8g/L/h；诱导24h。最终诱导22h时获得最大细胞浓度91.1g/L，最大体积活力6605U/L(图5)。

实施例5：游离细胞性能测定

取收集的湿菌体于10mL离心管中，加入pH 7.5的磷酸缓冲液配制成菌体浓度10g/L的悬浮液；加入100mM PPO，150mM硫酸铵，125mM葡萄糖，35℃，600rpm搅拌转速反应10min，取样，HPLC检测产物L-草铵膦浓度，根据酶活定义计算游离细胞酶活。

取收集的湿菌体25g于3L容积装有1L pH 7.5磷酸缓冲液的反应器中，加入PPO200mM，硫酸铵300mM，葡萄糖250mM，35℃，600rpm反应4h，真空抽滤固液分离后，反应液用HPLC检测残留底物，计算转化率。游离细胞经3次洗涤后进入下一批转化，计算每一批次的转化率。

酶活定义：35℃，pH 7.5条件下，每分钟催化生成1μmol L-草铵膦需要的细胞量定义为1U。比活力定义：每克细胞具有的酶活单位数。

利用2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸和草铵膦标准品绘制浓度-峰面积标准曲线(分别为图6和图7)，利用标准曲线计算样品浓度，根据产物生成量计算细胞活力。

根据上述方法，所得游离细胞性能如下：含谷氨酸脱氢酶游离细胞酶活为200.5U/g，PPO 200mM，硫酸铵300mM，葡萄糖250mM下连续操作4批后转化率为10.5％，结果如附图8所示。

实施例6：含草铵膦脱氢酶固定化细胞的制备

(1)取实施例1中制备的湿菌体25g，加入pH 7.5的磷酸缓冲液，配制成100g/L的悬浮液，加入2.25g蒙脱土，充分搅拌30min；

(2)向步骤(1)的混合液中加入聚乙烯亚胺(分子量1800)3mL(用盐酸预调pH至7.0)，充分搅拌30min；

(3)向步骤(2)的混合液中加入葡聚糖多醛2.25g葡聚糖多醛，继续充分搅拌30min；

所述步骤(3)中葡聚糖多醛的制备方法为：取1.65g分子量为150kDa的葡聚糖溶于50ml水中，加入3.85g NaIO₄，用HCl调pH至2.7，室温避光搅拌90min，透析12h，冷冻干燥。

(4)获得棕红色交联细胞后真空抽滤固液分离，固定化细胞用水洗涤3次，保存于4℃冰箱中。

实施例7：固定化细胞性能测定及用于L-草铵膦合成

取实施例6制得的球形固定化含草铵膦脱氢酶细胞100g(含湿菌体25g)于3L装有1L磷酸盐缓冲液(pH＝7.5，100mM)的机械搅拌反应器中，加入PPO 200mM，硫酸铵300mM，葡萄糖250mM，35℃，600rpm搅拌转速，反应4h，真空抽滤进行固液分离后，转化液用HPLC检测残余底物浓度，根据酶活定义计算固定化细胞酶活；固定化细胞酶活测试方法同实施例5。固定化细胞酶活除以游离细胞酶活计算出固定化细胞酶活回收率，并计算转化率。固定化细胞经三次洗涤后，进行下一批转化，计算每一批次的转化率。

结果表明，固定化细胞性能如下：固定化细胞酶活为135.3U/g，酶活回收率为67.5％，连续操作20批次仍能保持100％的转化率，结果如附图8所示。

实施例8：含谷氨酸脱氢酶固定化细胞的制备

制备方法同实施例6，不同之处在于，步骤(1)中载体为活性炭，步骤(2)中聚乙烯亚胺分子量为700，步骤(3)中所用交联剂为双醛淀粉。

经测定，所得固定化细胞性能如下：固定化细胞酶活为106.4U/g，连续转化20批次后转化率为87.2％。

实施例9：含谷氨酸脱氢酶固定化细胞的制备

制备方法同实施例6，不同之处在于，步骤(1)中载体为硅藻土，步骤(2)中聚乙烯亚胺分子量为10000，步骤(3)中所用交联剂为戊二醛。

经测定，所得固定化细胞性能如下：固定化细胞酶活为147.5U/g，连续转化20批次后转化率为59.4％。

实施例10：含谷氨酸脱氢酶固定化细胞的制备

制备方法同实施例6，不同之处在于，步骤(1)中载体为膨润土，步骤(2)中聚乙烯亚胺分子量为70000，步骤(3)中所用交联剂为乙二醛。

经测定，所得固定化细胞性能如下：固定化细胞酶活为98.1U/g，连续转化20批次后转化率为76.6％。

实施例11：含谷氨酸脱氢酶固定化细胞的制备

制备方法同实施例6，不同之处在于，步骤(1)无载体添加，步骤(2)中聚乙烯亚胺分子量为1800，步骤(3)中所用交联剂为双醛淀粉。

经测定，所得固定化细胞性能如下：固定化细胞酶活为89.4U/g，连续转化20批次后转化率为88.3％。

实施例12：含谷氨酸脱氢酶固定化细胞的制备

制备方法同实施例6，不同之处在于，步骤(1)无载体添加，步骤(2)中聚乙烯亚胺分子量为10000，步骤(3)中所用交联剂为乙二醛。

经测定，所得固定化细胞性能如下：固定化细胞酶活为97.2U/g，连续转化20批次后转化率为53.7％。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 草铵膦脱氢酶突变体、编码基因、基因工程菌及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 445

<212> PRT

<213> unk

<400> 1

Met Ile Glu Ser Val Glu Ser Phe Leu Ala Arg Leu Lys Lys Arg Asp

1 5 10 15

Pro Asp Gln Pro Glu Phe His Gln Ala Val Glu Glu Val Leu Arg Ser

20 25 30

Leu Trp Pro Phe Leu Glu Ala Asn Pro Arg Tyr Leu Thr Ser Gly Ile

35 40 45

Leu Glu Arg Ile Cys Glu Pro Glu Arg Ala Ile Val Phe Arg Val Ser

50 55 60

Trp Val Asp Asp Gln Gly Lys Val Gln Val Asn Arg Gly Phe Arg Ile

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His

85 90 95

Pro Ser Val Asn Leu Gly Val Leu Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln Thr

100 105 110

Phe Lys Asn Ser Leu Thr Ser Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly

115 120 125

Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Ala Glu Val Met Arg Phe

130 135 140

Cys Gln Ala Phe Met Ser Glu Leu Tyr Arg His Ile Gly Ala Asp Val

145 150 155 160

Asp Val Pro Gly Gly Asp Ile Gly Val Gly Ala Arg Glu Ile Gly Phe

165 170 175

Leu Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Leu Ser Asn Gln Phe Thr Ser Val Leu

180 185 190

Thr Gly Lys Gly Pro Ser Tyr Gly Gly Ser Leu Ile Lys Pro Glu Ala

195 200 205

Thr Gly Phe Gly Cys Val Tyr Phe Ala Glu Glu Met Leu Lys Arg Arg

210 215 220

Gly Glu Thr Val Glu Gly Lys Arg Val Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asn

225 230 235 240

Val Ala Gln Tyr Ala Ala Arg Lys Val Met Asp Leu Gly Gly Lys Val

245 250 255

Ile Ser Leu Ser Asp Ser Glu Gly Thr Leu Tyr Cys Glu Ser Gly Leu

260 265 270

Thr Glu Ala Gln Trp Gln Ala Val Leu Glu Leu Lys Asn Val Gln Arg

275 280 285

Gly Arg Ile Ser Glu Leu Ala Gly Arg Phe Gly Leu Glu Phe Leu Ala

290 295 300

Gly Gln Arg Pro Trp Gly Leu Ser Cys Asp Ile Ala Leu Pro Cys Ala

305 310 315 320

Thr Gln Asn Glu Leu Asp Ala Glu Ala Ala Arg Ala Leu Leu Arg Asn

325 330 335

Gly Cys Thr Cys Val Ala Glu Gly Ala Asn Met Pro Thr Thr Leu Glu

340 345 350

Ala Ala Asp Leu Phe Ile Glu Ala Gly Ile Leu Phe Ala Pro Gly Lys

355 360 365

Ala Ser Asn Ala Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Ser Gln

370 375 380

Asn Ala Met Arg Leu Leu Trp Thr Gly Gly Glu Val Asp Ser Lys Leu

385 390 395 400

His Ala Ile Met Gln Ser Ile His His Ala Cys Val His Tyr Gly Glu

405 410 415

Glu Asn Gly Gln Val Asn Tyr Val Lys Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe

420 425 430

Val Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Val Val

435 440 445

<210> 2

<211> 1338

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

atgattgaga gcgtcgagtc tttcttggcc cgccttaaaa agcgcgaccc tgaccagccg 60

gagtttcatc aggcagttga ggaagtctta cgctcattat ggccgttcct ggaagctaac 120

ccccgttatt tgactagcgg cattcttgaa cgtatttgcg agccggaacg tgccatcgtt 180

ttccgtgtga gctgggtaga cgaccaagga aaggtgcaag tgaaccgtgg cttccgcatc 240

cagatgaact cagctatcgg cccatataaa ggcgggttgc gttttcatcc aagcgttaat 300

ttgggtgtct taaaattctt agcgttcgag caaacattta aaaacagctt aacatcgtta 360

cccatgggtg gaggaaaggg tggtagtgac ttcgacccaa aggggaagag cgatgcggaa 420

gtcatgcgtt tctgccaggc attcatgtca gagctttacc gtcacatcgg ggcggacgtc 480

gatgtgccag gcggagatat tggcgtgggt gcgcgcgaga ttggattttt attcggtcag 540

tataagcgtc tgtctaacca gttcacctcg gtacttacgg gtaagggacc gtcatatggc 600

ggcagtttga ttaagccaga agctaccgga tttggttgtg tttattttgc cgaagaaatg 660

cttaagcgcc gtggagaaac cgtggaaggc aagcgtgttg ccattagtgg ctctgggaac 720

gtagcgcagt atgcggcccg caaggtgatg gatcttggcg gaaaagtcat ttctttatca 780

gacagcgagg gcacattata ctgcgaatcc ggtttgactg aagctcaatg gcaagcagtg 840

ttggaactga agaatgtaca acgtggccgt atttcagaat tagccggacg ctttggtctt 900

gaatttttag cgggccaacg cccctggggt ttatcttgcg atatcgccct tccttgcgcg 960

acgcagaacg agcttgacgc cgaagctgcg cgtgctttac ttcgtaatgg atgcacgtgc 1020

gtcgctgaag gggcgaacat gccgacaacc cttgaggcgg ctgatctgtt tatcgaagcg 1080

ggtattctgt tcgctccagg taaagcctcg aatgctggcg gggttgcagt gtcgggttta 1140

gagatgtcgc aaaacgcaat gcgtttattg tggacagggg gcgaggttga ctcaaaattg 1200

catgctatca tgcagagcat ccatcatgct tgcgtacatt acggtgaaga gaacggtcag 1260

gtaaactacg taaagggggc gaatattgct ggattcgtga aggttgctga tgcaatgctg 1320

gcacaggggg tcgtctaa 1338

<210> 3

<211> 262

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

Met Gly Tyr Asn Ser Leu Lys Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Gly Ile Gly Glu Ala Ile Ile Arg Arg Tyr Ala Glu Glu Gly

20 25 30

Met Arg Val Val Ile Asn Tyr Arg Ser His Pro Glu Glu Ala Lys Lys

35 40 45

Ile Ala Glu Asp Ile Lys Gln Ala Gly Gly Glu Ala Leu Thr Val Gln

50 55 60

Gly Asp Val Ser Lys Glu Glu Asp Met Ile Asn Leu Val Lys Gln Thr

65 70 75 80

Val Asp His Phe Gly Gln Leu Asp Val Phe Val Asn Asn Ala Gly Val

85 90 95

Glu Met Pro Ser Pro Ser His Glu Met Ser Leu Glu Asp Trp Gln Lys

100 105 110

Val Ile Asp Val Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ala Arg Glu Ala

115 120 125

Leu Lys Tyr Phe Val Glu His Asn Val Lys Gly Asn Ile Ile Asn Met

130 135 140

Ser Ser Val His Glu Ile Ile Pro Trp Pro Thr Phe Val His Tyr Ala

145 150 155 160

Ala Ser Lys Gly Gly Val Lys Leu Met Thr Gln Thr Leu Ala Met Glu

165 170 175

Tyr Ala Pro Lys Gly Ile Arg Ile Asn Ala Ile Gly Pro Gly Ala Ile

180 185 190

Asn Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Glu Asp Pro Lys Gln Arg Ala

195 200 205

Asp Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Asn Ile Gly Lys Pro Glu Glu

210 215 220

Ile Ser Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Asp Glu Ala Ser Tyr Val

225 230 235 240

Thr Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Leu Tyr Pro Ser

245 250 255

Phe Gln Ala Gly Arg Gly

260

<210> 4

<211> 789

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

atgggttata attctctgaa aggcaaagtc gcgattgtta ctggtggtag catgggcatt 60

ggcgaagcga tcatccgtcg ctatgcagaa gaaggcatgc gcgttgttat caactatcgt 120

agccatccgg aggaagccaa aaagatcgcc gaagatatta aacaggcagg tggtgaagcc 180

ctgaccgtcc agggtgacgt ttctaaagag gaagacatga tcaacctggt gaaacagact 240

gttgatcact tcggtcagct ggacgtcttt gtgaacaacg ctggcgttga gatgccttct 300

ccgtcccacg aaatgtccct ggaagactgg cagaaagtga tcgatgttaa tctgacgggt 360

gcgttcctgg gcgctcgtga agctctgaaa tacttcgttg aacataacgt gaaaggcaac 420

attatcaata tgtctagcgt ccacgaaatc atcccgtggc ctactttcgt acattacgct 480

gcttctaagg gtggcgttaa actgatgacc cagactctgg ctatggaata tgcaccgaaa 540

ggtatccgca ttaacgctat cggtccaggc gcgatcaaca ctccaattaa tgcagaaaaa 600

ttcgaggatc cgaaacagcg tgcagacgtg gaaagcatga tcccgatggg caacatcggc 660

aagccagagg agatttccgc tgtcgcggca tggctggctt ctgacgaagc gtcttacgtt 720

accggcatca ccctgttcgc agatggtggc atgaccctgt acccgagctt tcaggctggc 780

cgtggttga 789

Claims

1.一种草铵膦脱氢酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述草铵膦脱氢酶突变体的编码基因。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.一种高产NADPH依赖型草铵膦脱氢酶的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌是以E.coli BL21(DE3)为宿主，表达SEQ ID No.1所示草铵膦脱氢酶突变体和SEQ ID No.3所示葡萄糖脱氢酶获得。

5.构建权利要求4所述基因工程菌的方法，所述方法包括：将序列如SEQ ID No.2所示的草铵膦脱氢酶突变体编码基因连接至表达载体pETDuet-1的MCSⅠ上，将核苷酸序列如SEQID No.4所示的葡萄糖脱氢酶编码基因连接至表达载体pETDuet-1的MCSⅡ上，然后再转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，筛选正确的转化子，得到基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH，即所述高产NADPH依赖型草铵膦脱氢酶的基因工程菌。

6.权利要求4所述基因工程菌在微生物催化PPO制备L-草铵膦中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用为：向含有PPO、硫酸铵和葡萄糖的混合液中加入所述基因工程菌经发酵获得的酶液或湿菌体细胞，混合液在30～35℃下反应3～6h，得到L-草铵膦。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述湿菌体细胞经全细胞固定化之后用于反应，所述全细胞固定化方法如下：

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述载体为活性炭、硅藻土、膨润土或蒙脱土，质量用量为菌体质量的5～15％。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于步骤(2)所用聚乙烯亚胺分子量为600～70000，质量用量为菌体质量的1～10％。