CN116200317A - 利用甲酸高产聚3-羟基丁酸酯罗尔斯通氏重组菌株及其构建方法与应用 - Google Patents

利用甲酸高产聚3-羟基丁酸酯罗尔斯通氏重组菌株及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用甲酸高产聚3‑羟基丁酸酯罗尔斯通氏重组菌株及其构建方法与应用。构建方法包括如下步骤：将罗尔斯通氏菌降解PHB的基因phaZ1，phaZ2,phaZ3敲除得到重组菌株PHB01。在PHB01菌株基因组的phaZ1位点引入来自蓝藻细菌的编码Rubisco酶的基因RS7405、RS7400，向上述菌株中导入来自脱硫细菌的丙酮酸合成酶基因pyk与α‑酮戊二酸合成酶基因Idh的基因表达盒，构建从利用甲酸高产聚3‑羟基丁酸酯罗尔斯通氏菌PHB02。本发明构建的重组罗尔斯通氏菌株，能够以甲酸为碳源从头合成聚3‑羟基丁酸酯。本发明方法操作简便，同时能得到产量高的聚3‑羟基丁酸酯。

Description

利用甲酸高产聚3-羟基丁酸酯罗尔斯通氏重组菌株及其构建 方法与应用
技术领域
本发明涉及生物合成技术领域，更具体的说是涉及一种合成聚3-羟基丁酸酯罗尔斯通氏菌株及构建方法与应用。
背景技术
聚3-羟基丁酸酯(PHB)是一种微生物在营养条件受限制的条件下合成的生物塑料，具有生物可降解性和兼容性，因此在代替石油化学衍生的塑料方面具有巨大的发展潜力，在医疗领域、包装行业、纳米技术和农业等领域有广泛的的应用前景。目前，PHB的商业化应用主要受限于其较高的生产成本。罗尔斯通氏菌(R.eutropha)是一种兼性化能自养营养的革兰氏阴性菌。它的代谢方式灵活多样，不仅可以利用果糖、脂质或其他有机碳源进行异养生长，还可以利用H2、CO2和O2的混合气进行自养生长。但不论在哪种营养模式下,当生长环境中氮、氧或磷等必要的营养物质受到限制时，R.eutropha能够天然地合成PHB，并且其含量最高可达细胞干重的90％。因此,R.eutropha被认为是生产PHB的理想底盘之一。
目前，PHB的工业生产主要受限于其较高的生产成本。其主要原因是需要用价格较高的果糖等物质作为底物生产PHB。如果用H2、CO2和O2的混合气体为底物，又因其气体安全问题，很大程度限制其工业化发展。甲酸是一种廉价易得的化学品，常利用工业化废气CO、CO2等制备获得。如果以甲酸作为底物生产PHB，不仅可以降低生产成本，也可为解决CO2引起的环境问题做出一些贡献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用甲酸高产聚3-羟基丁酸酯罗尔斯通氏菌株。
本发明的第二个目的是提供一种利用甲酸高产聚3-羟基丁酸酯罗尔斯通氏菌株的构建方法。
本发明的第三个目的是构建的重组罗尔斯通氏菌株利用甲酸高产聚3-羟基丁酸酯的用途。
本发明的技术方案概述如下：
利用甲酸高产PHB的Ralstoniaeutropha菌株构建方法，包括如下步骤：
将Ralstoniaeutropha H16降解PHB的基因phaZ1，phaZ2,phaZ3敲除得到重组菌株PHB01；
在PHB01菌株基因组的phaZ1位点引入来自Synechococcuselongatus PCC7942的编码Rubisco酶的基因RS7405、RS7400，向上述菌株中导入来自SufurimonasautotrpphicaDSM 16294的丙酮酸合成酶基因pyk与α-酮戊二酸合成酶基因Idh的基因表达盒，构建从利用甲酸高产聚3-羟基丁酸酯罗尔斯通氏菌PHB02；
所述phaZ1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
phaZ2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
phaZ3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
Rubisco大亚基基因序列RS7400的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
Rubisco小亚基基因序列RS7405的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
pyk基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
Idh基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。
上述方法构建得到的利用甲酸高产聚3-羟基丁酸酯罗尔斯通氏菌株。
利用甲酸高产聚3-羟基丁酸酯罗尔斯通氏菌株生产聚3-羟基丁酸酯的应用，包括如下步骤：将合成聚3-羟基丁酸酯罗尔斯通氏菌株PHB02在发酵培养基中培养发酵，获得聚3-羟基丁酸酯，所述甲酸发酵培养基配方为Na2 HPO4 3.57g/L,K H2PO4 1.5g/L,硫酸铵0.167g/L,碳酸氢钠0.02g/L，甲酸钠20g/L，其余为水。
本发明的有益效果：
R.eutropha被认为是生产PHB的理想底盘之一，但PHB的工业生产主要受限于其较高的生产成本。其主要原因是需要用价格较高的果糖等物质作为底物生产PHB。本发明构建的一种利用廉价底物甲酸高产聚3-羟基丁酸酯的罗尔斯通氏菌株，能够以甲酸为碳源从头合成聚3-羟基丁酸酯。这种利用微生物进行甲酸发酵生产聚3-羟基丁酸酯的方法的操作简便，同时能得到产量高的聚3-羟基丁酸酯。
附图说明
图1为重组罗尔斯通氏菌株中的聚3-羟基丁酸酯合成路径；
图2为利用甲酸高产聚3-羟基丁酸酯罗尔斯通氏菌株PHB01产量-时间图；
图3为利用甲酸高产聚3-羟基丁酸酯罗尔斯通氏菌株PHB02产量-时间图；
图4为利用甲酸高产聚3-羟基丁酸酯罗尔斯通氏菌株PHB01、PHB02产量对比图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明。
原始野生型罗尔斯通氏菌Ralstoniaeutropha H16，于2016年10月在ATCC官网购买(https://www.atcc.org/products/17699)。
基因的来源：
phaZ1基因:来自罗尔斯通氏菌(Ralstoniaeutropha H16)
phaZ2基因:来自罗尔斯通氏菌(Ralstoniaeutropha H16)
phaZ3基因:来自罗尔斯通氏菌(Ralstoniaeutropha H16)
Rubisco酶的编码基因RS7405、RS7400:来自蓝藻细菌(SynechococcuselongatusPCC7942)
丙酮酸合成酶pyk基因:来自脱硫细菌(SufurimonasautotrpphicaDSM 16294)
α-酮戊二酸合成酶Idh基因:来自脱硫细菌(SufurimonasautotrpphicaDSM16294)
实施例
1模块构建
利用甲酸高产PHB的Ralstoniaeutropha菌株的构建方法,包括如下步骤：利用位点特异性同源重组的方法敲除PHB降解的基因phaZ1、phaZ2、phaZ3，得到PHB生产菌株PHB01。
利用位点特异性同源重组的方法，将编码核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶(以下简称Rubisco)两个大小亚基的两个基因Rubisco大亚基基因序列RS7400、Rubisco小亚基基因序列RS7405表达盒整合到PHB生产菌株PHB01基因组中phaZ1的位置，之后利用结合转移的方法，将编码丙酮酸合成酶的基因pyk和α-酮戊二酸合成酶的基因Idh的基因表达质粒导入生产菌株PHB01中，得到重组菌株PHB02。
phaZ1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；phaZ2基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；phaZ3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
Rubisco大亚基基因序列RS7400的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；Rubisco小亚基基因序列RS7405的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；pyk基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；Idh基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示
具体步骤为：
(1)利用甲酸高产PHB的Ralstoniaeutropha菌株PHB01的构建方法，包括如下步骤：
筛选抗性基因KanR来自质粒pK18mobSacB(购自Addgene,Inc.WWW.addgene.org)。
从NCBI数据库获得Ralstoniaeutropha H16来源的基因phaZ1、phaZ2、phaZ3的基因序列，同时构建这三个基因的敲除质粒。
phaZ1基因的敲除质粒以野生型Ralstoniaeutropha H16基因组为模板，使用phaZ1-up和phaZ1-down分别作为同源上臂和同源下臂(SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10)，以phaZ1up-F(SEQ ID NO.15)，phaZ1up-R(SEQ ID NO.16)以及phaZ1down-F(SEQ ID NO.17)，phaZ1down-R(SEQ ID NO.18)为引物，分别扩增同源臂phaZ1up(SEQ ID NO.9)和phaZ1down(SEQ ID NO.10)；
phaZ2基因的敲除质粒以野生型Ralstoniaeutropha H16基因组为模板，使用phaZ2-up和phaZ2-down分别作为同源上臂和同源下臂(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)，以phaZ2up-F(SEQ ID NO.19)，phaZ2up-R(SEQ ID NO.20)以及phaZ2down-F(SEQ ID NO.21)，phaZ2down-R(SEQ ID NO.22)为引物，分别扩增同源臂phaZ2up(SEQ ID NO.11)和phaZ2down(SEQ ID NO.12)；
phaZ3基因的敲除质粒以野生型Ralstoniaeutropha H16基因组为模板使用phaZ3-up和phaZ3-down分别作为同源上臂和同源下臂(SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14)，以phaZ3up-F(SEQ ID NO.23)，phaZ3up-R(SEQ ID NO.24)以及phaZ3down-F(SEQ ID NO.25)，phaZ3down-R(SEQ ID NO.26)为引物，分别扩增同源臂phaZ3up(SEQ ID NO.13)和phaZ3down(SEQ ID NO.14)；
本发明所用DNA PCR酶为全式金生物科技有限公司的Fast Pfu聚合酶。50μL的PCR扩增体系如下：DNA模板，1μL；前引(10μM)和后引(10μM)各2.5μL；dNTP(10mM)，5μL；5×PfuBuffer，10μL；Fast Pfu聚合酶，1μL；最后用双蒸水补齐至50μL。
在PCR仪上设置扩增程序。扩增条件为95℃预变性2min(1个循环)；95℃变性20sec、退火55℃20sec、72℃延伸30s(35个循环)；72℃延伸5min(1个循环)。
将上述经过PCR扩增得到的每对同源上下臂片段，与经HindIII与EcoRI限制性内切酶切割后的pK18mobSacB线性化自杀质粒载体，3个片段混合，通过BM无缝连接试剂盒(博迈德生物科技有限公司)拼接成一个完整的重组载体。每个片段的摩尔比为1:1，片段总量达到1μg，连接体积如下，DNA片段5μL,2×Seamless Cloning Mix 5μL。在PCR仪上设置连接程序。连接条件为50℃15min，16℃10min。
将通过上述方法得到的重组载体pK18mobSacB-phaZ1、pK18mobSacB-phaZ2、pK18mobSacB-phaZ3，通过热激法导入到全式金公司生产的Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell中，单个菌落在LB-Kan50琼脂平板上生长(10g/L NaCl、10g/L胰蛋白胨与50g/L酵母提取物，1:1000加入50g/L卡那霉素)。在37℃220rpm的条件下孵育12h后。挑取适当数量的单菌落，养在LB-Kan50液体培养基中，在37℃220rpm的条件下孵育12h后，送至金唯智公司测序。
测序结果无误后，使用全式金公司的试剂盒提取出构建的敲除质粒，依旧使用热激法导入到提前通过化学方法准备好的s17-1菌株的感受态中，单个菌落在LB-Kan50琼脂平板上生长(10g/L NaCl、10g/L胰蛋白胨与50g/L酵母提取物，1:1000加入50g/L卡那霉素)。在37℃220rpm的条件下孵育12h后。挑取适当数量的单菌落，养在LB-Kan50液体培养基中，在37℃220rpm的条件下孵育12h后，送至金唯智公司测序。
测序结果无误后，在LB-Kan50液体培养基中，按照37℃220rpm的条件培养测序无误的s17-1菌株至OD600＝0.6-0.8，取1mL与同体积相同浓度的野生型Ralstoniaeutropha H16离心重悬在200μL的灭菌水中，最后按照2:3的比例混匀，在NB琼脂糖培养基(0.5g/L(N H4)2SO4、10g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物，0.6/L牛肉浸粉)中，30℃230rpm孵化36-48h，使得构建好的敲除质粒导入到野生型Ralstoniaeutropha H16中。
待混合菌株生长到合适的状态后，刮取适量的混合菌株重悬在50μL的无菌水中，稀释适当的倍数后，培养在在NB-Kan200+Gm10琼脂糖(NB培养基中1:1000加入200g/L的青那霉素抗性和10g/L庆大霉素抗性)培养基上，培养条件为30℃230rpm，进行单次交换的初次筛选。长出的单菌落使用菌落PCR的方法，初次验证单次交换的结果。
本发明所用菌落PCR酶为全式金生物科技有限公司的Fastaq聚合酶。15μL的PCR扩增体系如下：前引(10μM)和后引(10μM)各0.3μL；dNTP(10mM)，1.2μL；10×Fastaq Buffer，1.5μL；Fastaq聚合酶，0.15μL；双蒸水：10.15μL，最后挑取适量的菌落。
在PCR仪上设置扩增程序。扩增条件为94℃预变性5min(1个循环)；95℃变性30sec、退火58℃20sec、72℃延伸30s(30个循环)；72℃延伸5min(1个循环)。
选取验证成功后的单菌落，在NB液体培养基中，30℃280rpm高速培养6h后，在NB-15％蔗糖固体培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、150g/L蔗糖，15g/L琼脂粉)上，30℃230rpm培养单菌落至合适的大小，通过菌落PCR验证第二次交换的结果，得到所需要的敲除菌。
通过上述方法一次敲除phaZ1、phaZ2、phaZ3后，得到了利用甲酸高产PHB的Ralstoniaeutropha菌株PHB01。
(2)利用甲酸高产PHB的Ralstoniaeutropha菌株PHB02的构建方法，包括如下步骤：
从NCBI数据库获得Synechococcus elongatus PCC7942来源的基因Rubisco大亚基基因序列RS7400，通过人工合成得到该核苷酸序列(SEQ ID NO.4)；
从NCBI数据库获得Synechococcus elongatus PCC7942来源的基因Rubisco小亚基基因序列RS7405，通过人工合成得到该核苷酸序列(SEQ ID NO.5)；
构建这两个基因的表达盒：
Rubisco大亚基基因序列RS7400、Rubisco小亚基基因序列RS7405表达盒使用PBAD启动子和rrnB T1终止子；通过位点特异性同源重组的方法，向利用甲酸高产PHB的Ralstoniaeutropha菌株PHB01的phaZ1位点导入Rubisco大亚基基因序列RS7400、Rubisco小亚基基因序列RS7405表达盒；
以野生型Ralstoniaeutropha H16基因组为模板，以phaZ1up-F(SEQ ID NO.15)，phaZ1up-Rubisco-R(SEQ ID NO.27)以及phaZ1downRubisco-F(SEQ ID NO.28)，phaZ1down-R(SEQ ID NO.18)为引物，分别扩增同源臂phaZ1up(SEQ ID NO.9)和phaZ1down(SEQ ID NO.10)；
以人工合成的核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶表达质粒PHG12-pBAD-Rubisco大亚基基因序列RS7400-Rubisco小亚基基因序列RS7405为模板，以phaZ1-Rubisco-F(SEQ IDNO.29)和phaZ1-Rubisco-R(SEQ ID NO.30)位引物，扩增含有pBAD启动子和rrnB T1终止子的核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶基因表达盒pBAD-Rubisco大亚基基因序列RS7400-Rubisco小亚基基因序列RS7405。
将经过上述PCR扩增出的phaZ1up、phaZ1down、pBAD-Rubisco大亚基基因序列RS7400-Rubisco小亚基基因序列RS7405与经HindIII与EcoRI限制性内切酶切割后的pK18mobSacB线性化自杀质粒载体，四个片段混合，通过BM无缝连接试剂盒(博迈德生物科技有限公司)拼接成一个完整的重组载体。每个片段的摩尔比为1:1，片段总量达到1μg，连接体积如下，DNA片段5μL,2×Seamless Cloning Mix 5μL。在PCR仪上设置连接程序。连接条件为50℃15min，16℃10min。
将得到的重组载体导入到利用甲酸高产PHB的Ralstoniaeutropha菌株PHB01中，利用上述的同源重组原理，在PHB01基因组phaZ1位点引入Rubisco大亚基基因序列RS7400、Rubisco小亚基基因序列RS7405。
从NCBI数据库获得SulfurimonasautotrophicaDSM 16294来源的基因pyk，通过人工合成得到该核苷酸序列(SEQ ID NO.6)；
从NCBI数据库获得SulfurimonasautotrophicaDSM 16294来源的基因Idh，通过人工合成得到该核苷酸序列(SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9)；
构建这两个基因的表达盒：
pyk基因表达盒使用PBAD启动子和rrnB T1终止子；
Idh基因表达盒使用PBAD启动子和rrnB T1终止子)；
通过结合转移的方法，向导入了Rubisco大亚基基因序列RS7400、Rubisco小亚基基因序列RS7405表达盒的利用甲酸高产PHB的Ralstoniaeutropha菌株PHB01中导入pyk基因表达盒和Idh基因表达盒，得到利用甲酸高产PHB的Ralstoniaeutropha菌株PHB02(见图1)。
将人工合成的丙酮酸合成酶的基因pyk和α-酮戊二酸合成酶的基因Idh的基因表达质粒PHG-pBAD-pyk-Idh通过热激法导入到全式金公司生产的Trans1-T1 PhageResistant Chemically Competent Cell中，单个菌落在LB-Kan50琼脂平板上生长(10g/LNaCl、10g/L胰蛋白胨与50g/L酵母提取物，1:1000加入50g/L卡那霉素)。在37℃220rpm的条件下孵育12h后。挑取适当数量的单菌落，养在LB-Kan50液体培养基中，在37℃220rpm的条件下孵育12h后，送至金唯智公司测序。
测序结果无误后，使用全式金公司的试剂盒提取出构建的表达质粒，依旧使用热激法导入到提前通过化学方法准备好的s17-1菌株的感受态中，单个菌落在LB-Kan50琼脂平板上生长(10g/L NaCl、10g/L胰蛋白胨与50g/L酵母提取物，1:1000加入50g/L卡那霉素)。在37℃220rpm的条件下孵育12h后。挑取适当数量的单菌落，养在LB-Kan50液体培养基中，在37℃220rpm的条件下孵育12h后，送至金唯智公司测序。
测序结果无误后，在LB-Kan50液体培养基中，按照37℃220rpm的条件培养测序无误的s17-1菌株至OD600＝0.6-0.8，取1mL与同体积相同浓度的野生型RalstoniaeutrophaH16离心重悬在200μL的灭菌水中，最后按照2:3的比例混匀，在NB琼脂糖培养基(0.5g/L(NH4)2SO4、10g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物，0.6g/L牛肉浸粉)中，30℃230rpm孵化36-48h，使得构建好的表达质粒导入到构建好的导入了Rubisco大亚基基因序列RS7400、Rubisco小亚基基因序列RS7405的PHB01菌株中，得到利用甲酸高产PHB的Ralstoniaeutropha菌株PHB02.
2、发酵方法
种子培养基：酵母提取物10g/L，胰蛋白胨10g/L，牛肉浸粉6g/L，硫酸铵5g/L，其余为水。
果糖培养基：果糖10g/L，Na2 HPO4 3.57g/L,K H2PO4 1.5g/L,硫酸铵0.167g/L,碳酸氢钠0.02g/L，其余为水。
甲酸发酵培养基：Na2 HPO4 3.57g/L,K H2PO4 1.5g/L,硫酸铵0.167g/L,碳酸氢钠0.02g/L，甲酸钠20g/L，其余为水。
对照组：将重组菌株PHB01接入4mL种子培养基30℃230rpm，培养24h，再将1mL菌液转接到10mL新鲜的果糖培养基中，30℃230rpm，培养24h，再将菌液转接到30mL新鲜的甲酸发酵培养基中，调整菌密度，使最终菌密度在OD600为2，30℃230rpm，培养96h，取培养液用于产物分析。
实验组：将重组菌株PHB02接入4mL种子培养基30℃230rpm，培养24h，再将1mL菌液转接到10mL新鲜的果糖培养基中，30℃230rpm，培养24h，再将菌液转接到30mL新鲜的甲酸发酵培养基中，调整菌密度，使最终菌密度在OD600下为2，30℃230rpm，培养96h，取培养液用于产物分析。
3、产物分析
PHB是本实验的目标产物，对于有机聚合物的含量检测，首先是通过酯化液和三氯甲烷混合液将PHB水解为单体羟基丁酸，而后通过萃取方法将羟基丁酸萃取到水相中。使用1mL注射器吸取样品并通过气相色谱法进行检测。PHB检测过程主要包括以下步骤:菌体收集、冷冻干燥、称重裂解、萃取产物、样品检测和含量计算。
1)菌体收集：使用5mL的一次性注射器从光反应器的底部取样口插入，抽吸几次确保取样均匀，而后缓慢抽取5mL的反应液并转移至离心管内。用移液枪精确吸取4mL反应液转移至离心管内,放置于小型高速离心机内12000rpm，2min的条件下离心。取出后倒掉上清液并用无菌水重悬清洗,离心收集菌体。重复操作2-3次，将菌体清洗干净。而后除去多于的水分，将菌体沉淀保存于-80℃冰箱内等待下步操作。
2)冷冻干燥：取出-80℃冰箱内冷冻完成的菌体，打开离心管盖子并用锡箔纸包裹。使用针头在锡箔纸上扎出细孔后转移至提前预冷至-55℃的冷冻干燥真空机内。密封完毕后抽真空冻干24h。完成后取出置于室温下，等待下步操作。3.称重裂解:将2中干燥完成的样品称取质量，而后将离心管内的干燥菌体转移至5mL西林瓶内。加入500μL的酯化液和500μL的三氯甲烷，用压盖器将顶空盖固定到西林瓶上，要求顶空盖内的橡胶垫片中的聚四氟涂层在下，与西林瓶直接接触。完成后，再用509胶将瓶盖边缘粘牢，防止有机溶剂挥发。将密封完成的西林瓶放入90℃的烘箱内裂解4个小时，期间取出用漩涡振荡器震荡西林瓶，将瓶内的块状菌体打碎，确保裂解充分。裂解完成后取出西林瓶冷却至室温后，进行下步操作。
3)称重裂解：将2中干燥完成的样品称取质量，而后将离心管内的干燥菌体转移至5mL西林瓶内。加入500μL的酯化液和500μL的三氯甲烷，用压盖器将顶空盖固定到西林瓶上，要求顶空盖内的橡胶垫片中的聚四氟涂层在下，与西林瓶直接接触。完成后，再用509胶将瓶盖边缘粘牢，防止有机溶剂挥发。将密封完成的西林瓶放入90℃的烘箱内裂解4个小时，期间取出用漩涡振荡器震荡西林瓶，将瓶内的块状菌体打碎，确保裂解充分。裂解完成后取出西林瓶冷却至室温后，进行下步操作。
4)萃取产物：待西林瓶温度冷却至室温后，除去胶封，打开瓶盖。将瓶内溶液用移液器吸出并转移至10mL离心管内,离心管内提前加入250μL的去离子水。有机相与水相混合均匀后，将离心管置于4℃冰箱内密封过夜静置。完成萃取过程，样品萃取至下层水溶液中，待取样检测。
5)样品检测：使用容量为1mL的一次性注射器吸取4中离心管内的下层的液体，而后转移到气相进样瓶内。盖好盖子后，放入气相色谱仪中，准备进样。仪器的检测参数为，色谱柱初始设定为140℃，停留6min，以40℃/min的升温速度升至250℃，停留14min。AuxI全程温度为250℃，Det全程温度为250℃。溶剂为丙酮，进样前后各清洗5次，进样时用样品清洗3次，每次清洗用量为3uL。气相色谱检测色谱柱为RB-lonWax毛细管柱(0.32mm×30m,0.25mm膜厚)，检测器为240nm(2998PDA detector，Waters)，氮气为载气，压力为0.06Mpa，分流比8:1，进样口色谱柱长度2.5cm，检测器色谱柱长度10.7cm，进样量1μL，运行时间27min。
6)含量计算：根据PHB标准品检测结果绘制标准曲线，将检测结果代入标准曲线内计算样品内PHB含量。
4、结果
在这项研究中，我们首先利用同源重组的方法，敲除了三个与PHB降解有关的基因phaZ1，phaZ2,phaZ3得到了菌株PHB01，该菌株在甲酸发酵120h后可得到1.51g/L的PHB，为了进一步提高菌株生产PHB的能力，利用位点特异性同源重组的方法，将编码核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶(以下简称Rubisco)两个大小亚基的两个基因Rubisco大亚基基因序列RS7400、Rubisco小亚基基因序列RS7405表达盒整合到PHB生产菌株PHB01基因组中phaZ1的位置，之后利用结合转移的方法，将编码丙酮酸合成酶的基因pyk和α-酮戊二酸合成酶的基因Idh的基因表达质粒导入生产菌株PHB01中，得到重组菌株PHB02。重组菌株PHB02在发酵培养基发酵120h后，最终获得了2.36g/L的PHB，比以前的培养基高约1.56倍。

Claims (4)

1.利用甲酸高产聚3-羟基丁酸酯罗尔斯通氏菌株构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将Ralstoniaeutropha H16降解PHB的基因phaZ1，phaZ2,phaZ3敲除得到重组菌株PHB01；
(2)在PHB01菌株基因组的phaZ1位点引入来自Synechococcuselongatus PCC7942的编码Rubisco酶的基因RS7405、RS7400；
(3)向上述菌株中导入来自SufurimonasautotrpphicaDSM 16294的丙酮酸合成酶基因pyk与α-酮戊二酸合成酶基因Idh的基因表达盒，构建从利用甲酸高产聚3-羟基丁酸酯罗尔斯通氏菌PHB02；
所述phaZ1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
phaZ2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
phaZ3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
Rubisco大亚基基因RS7400的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
Rubisco小亚基基因RS7405的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
pyk基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
Idh基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。
2.权利要求1的方法构建得到的利用甲酸高产聚3-羟基丁酸酯罗尔斯通氏菌株。
3.权利要求2的利用甲酸高产聚3-羟基丁酸酯罗尔斯通氏菌株在生产聚3-羟基丁酸酯的用途。
4.根据权利要求3所述用途，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求2的合成聚3-羟基丁酸酯罗尔斯通氏菌株PHB02在发酵培养基中利用甲酸培养发酵，获得聚3-羟基丁酸酯，所述甲酸发酵培养基配方为Na2 HPO4 3.57g/L,K H2PO4 1.5g/L,硫酸铵0.167g/L,碳酸氢钠0.02g/L，甲酸钠20g/L，其余为水。
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