CN105861361A - 谷氨酸棒杆菌fx69在净化猪场污水厌氧出水中的应用 - Google Patents

谷氨酸棒杆菌fx69在净化猪场污水厌氧出水中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了谷氨酸棒杆菌FX69在净化猪场污水厌氧出水中的应用。本发明通过对采集自福州某富营养化河道底泥的样品进行富集培养，利用溴百里酚蓝(BTB)选择性培养基和硝酸盐还原试验初筛，模拟人工合成污水净化试验复筛，获得一株具有较好脱氮功效的谷氨酸棒杆菌FX69。该菌对猪场污水厌氧出水处理液中NH4 +‑N去除率为87％，NO2 ‑‑N去除率为92％，COD降解率为71％，具有较好的除氮和降解COD的效果。本发明提供了谷氨酸棒杆菌的新的应用方向，也为污水处理提供了新的菌种资源。

Description

谷氨酸棒杆菌FX69在净化猪场污水厌氧出水中的应用
技术领域
本发明属于生物技术与污水处理技术领域，具体涉及谷氨酸棒杆菌FX69在净化猪场污水厌氧出水中的应用。
背景技术
随着经济和社会的快速发展，人类对水生态系统带来的影响日益加剧，尤其近年来我国养猪业集约化和规模化快速发展，规模化猪场排放的粪尿污水也在剧增，粪尿污水经厌氧发酵处理，大部分有机质得到去除，但N、P和COD等指标仍很高。过量氮、磷等营养物质流入水体，使得藻类和其它浮游动物迅速繁殖，水体透明度和溶解氧发生变化，水质不断恶化，从而使水体生态系统和水功能受到阻碍和破坏。富营养化水体的治理成为急需解决的问题。目前富营养化水体治理和修复有物理、化学和生物等手段。物理方法工程量大、耗能高且不彻底。投加化学药剂短期效果明显，但容易发生水质反弹并造成水体二次污染，会对水体的整体生态环境造成一定的不良影响。微生物富营养化水体修复技术通过微生物之间的食物链关系建立相应的微生态系统，加快水中的能量流动和物质循环，强化微生物对水体中过量氮、磷的吸附、转化和降解圈，以此修复水体自净功能，减轻水体富营养化程度。由于微生物修复技术的投入低于传统环境工程技术，且具有环境友好，无二次污染，处理效率高，处理时间短，操作简便等优势，因而成为关注的焦点。不同种类微生物对各类物质的代谢和利用能力相差较大，所以从环境中寻找环境友好且治污能力强的微生物资源具有重要的现实意义。
谷氨酸棒杆菌(或称谷氨酸棒状杆菌)(Corynebacterium glutamicum)是一种兼性好氧、生长快速的革兰氏阳性菌，自1957年被分离出来，便逐渐被广泛应用于氨基酸、核苷酸、生物塑料及其它专用化学品的工业化生产，但未见其在污水处理方面的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)FX69在净化猪场污水厌氧出水中的应用。
本发明通过对采集自福州某富营养化河道底泥的样品进行富集培养，利用溴百里酚蓝(BTB)选择性培养基和硝酸盐还原试验初筛，模拟人工合成污水净化试验复筛，获得一株具有较好脱氮功效的菌株FX69。对扩增到的菌株FX69的16S rRNA基因序列进行测序，其序列如SEQ ID NO.1所示，将该序列进行比对分析确定该菌株FX69为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，由此将其命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)FX69。谷氨酸棒杆菌FX69对人工合成污水和养猪污水厌氧出水具有较好的除氮和降解COD的效果。本发明的谷氨酸棒杆菌FX69具有易培养、生长速度快和环境适应能力强的特点。本发明提供了谷氨酸棒杆菌的新的应用方向，也为污水处理提供了新的菌种资源。
本发明的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)FX69于2015年3月18日保藏于福建省微生物研究所的保藏中心，其保藏号为：FIM-201503180069。该保藏中心的菌株是对外销售的，因此本领域技术人员可以自2015年03月18日之后从该保藏中心购买到该菌株。
本发明的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)FX69还于2015年5月19日公开于非专利文献中(网页)，其网址为：http://www.fjim.org.cn/kytd/ktz/getNews.jsp？newsid＝220，该菌种申请人本人也持有，并保证自申请日起20年内向公众提供。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：目标菌种的分离、纯化和鉴定
1样品采集
细菌样品采自福州某富营养化河道底泥。使用自制底泥采样器采取底泥放入无菌袋，置于4℃冰箱保存。
2菌种分离
2.1初筛
无菌条件下称取5g底泥，置于带有磁力搅拌子的无菌带塞锥形瓶中，加入质量分数0.8％无菌生理盐水100mL，在磁力搅拌器上振荡30min，打散底泥中的菌胶团，制成菌悬液。用已灭菌的移液管每次吸取5mL菌悬液，分别加入装有100mL反硝化富集培养基的250mL三角瓶中，于28℃、120r/min的摇床上振荡富集培养5d得到培养液。从上述的每个三角瓶中分别吸取0.5mL培养液，分别加入到质量分数0.8％无菌生理盐水中，得到10-1，10-2，10-3，10-4，10-5和10-6梯度的稀释溶液，吸取不同浓度的稀释溶液各0.2mL涂布于溴百里酚蓝(BTB)选择性培养基，28℃培养1～2d。从这几个稀释梯度中挑选出1个最合适的梯度，要求平板上菌落分布清晰均匀(菌落数在20-200个)，从平板上挑取蓝色或周围有蓝色晕圈的单菌落。单菌落经重复3次涂布、挑种，至菌落特征一致，无异常菌落出现者，认为是完全纯化。将纯化的单菌落接种到营养琼脂斜面培养基上培养，从营养琼脂斜面培养基上挑取少量菌体，接种至装有10mL无菌反硝化富集培养基的试管中，以胶塞密闭瓶口，置培养箱中28℃恒温培养。每隔一定时间取样1mL，分别加入2只干净试管中，分别滴加二苯胺试剂和格林斯试剂0.2mL，根据溶液的颜色变化了解培养基中硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的含量变化。依据硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的含量变化定性判断反硝化速率，选取数株反硝化速率较高的菌株，由此得到初筛的反硝化菌。
所述的反硝化富集培养基每升含有：KNO3 2.0g、MgSO4·7H20 0.2g、K2HPO4 0.5g、酒石酸钾钠20g和CaCl2 0.02g，余量为H2O，pH 7.2。配制方法是将所有成分混合均匀后，调pH，然后灭菌备用。
所述的溴百里酚蓝(BTB)选择性培养基每升含有：琼脂20g、KNO3 1g、KH2PO4 1g、FeCl2·6H2O 0.5g、CaCl2·7H2O 0.2g、MgSO4·7H2O 1g、琥珀酸钠8.5g和质量分数1％的BTB乙醇溶液mL，余量为蒸馏水，用1mol/LNaOH调节pH7.0-7.3。配制方法是将所有成分混合均匀后，调pH，然后灭菌备用。
所述的营养琼脂斜面培养基每升含有：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g和琼脂15～20g，余量为蒸馏水。配制方法是将所有成分混合均匀后，121℃高压灭菌15min。
2.2复筛
分别将初筛获得的反硝化菌接入合成污水中，以不添加菌剂的合成污水为空白对照组，均设立三个平行组，28℃、150rpm震荡培养，培养96h后取样测定合成污水中NH4 +-N、NO2 --N和COD的含量。选取其中一株对合成污水处理效果最佳的菌株，将该菌株命名为FX69。FX69菌株处理合成污水96h，其NH4 +-N去除率为52％，NO2 --N去除率为92％，COD降解率为80％。
合成污水的组成成份，每升含有：葡萄糖360mg、酵母膏80.0mg、KH2PO4 14.0mg、MgSO4·7H2O 24.0mg、NH4Cl 60.0mg、CaCl2 18.0mg、NaHCO3 24.0mg、MnSO4·7H2O 6.0mg、FeCl3 0.3mg、NaNO2 30.0mg和KNO330.0mg，余量为蒸馏水，调节pH至7.0。配制方法是将所有成分混合均匀后，调pH，然后分装于500mL三角瓶中，121℃高压灭菌15min。
3菌种的鉴定
取FX69在发酵培养基(与实施例2中的相同)培养至对数生长期的菌液10mL，8000r/min离心15min，倾去上清液，收集菌体。采用CTAB/NaCl法提取菌体基因组DNA。步骤如下：菌体中加入500mL TE溶液(pH 8.0)，悬浮，加入60μL质量分数10％十二烷基硫酸钠(SDS)和6μL 10mg/ml蛋白酶K，混匀，60℃水浴1h，加100mL 5mol/L NaCl和80mL CTAB/NaCl溶液(含有50g/L CTAB和0.5mol/L NaCl)，65℃水浴10min，以等体积的氯仿/异戊醇(体积比24：1)和酚/氯仿/异戊醇(体积比25:24:1)各抽提1次，异丙醇沉淀DNA，得到FX69的基因组DNA，将其溶于50μLTE溶液(pH 8.0)中，-20℃保存备用。利用1％琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA完整性。采用16S rRNA基因的通用引物27F
(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')对提取的基因组DNA进行PCR扩增。将扩增后的DNA产物送至上海生物工程有限公司进行测序。测序扩增到的16S rRNA基因的序列如SEQ ID NO.1所示，将该序列用BLAST软件与NCBI的GenBank数据库收录的的16S rRNA序列进行比对分析。FX69与Corynebacterium glutamicumstrain ALK062和Corynebacterium glutamicum strain ALK063的16S rRNA基因序列的相似性均为99％，因而确定菌株FX69属于谷氨酸棒杆菌，并将该菌株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)FX69。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)FX69于2015年3月18日保藏于福建省微生物研究所的保藏中心，其保藏号为：FIM-201503180069。
实施例2：谷氨酸棒杆菌FX69的制备
(1)斜面培养：
将谷氨酸棒杆菌FX69接种至营养琼脂斜面培养基上，于28℃培养箱培养2～3d。营养琼脂斜面培养基配方同实施例1。
(2)发酵培养：
用接种环挑起少量营养琼脂斜面培养基上的谷氨酸棒杆菌FX69菌体接入发酵培养基中，于28℃、150r/min的摇床上振荡培养2～3d。由此发酵培养得到谷氨酸棒杆菌FX69菌液。
发酵培养基配方，每升含有：胰蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g和氯化钠10.0g，余量为水，pH不调。配制方法是将上述成份混合均匀后，灭菌备用。
实施例3：谷氨酸棒杆菌FX69对猪场污水厌氧出水的净化试验
取实施例2制备的谷氨酸棒杆菌FX69菌液5～10mL，8000r/min离心5min，弃上清液得到菌体。用质量分数0.8％生理盐水洗去菌体上的培养基，用无菌水溶解，离心，重复3次得湿菌体，菌体接入分装于500mL三角瓶中的猪场污水厌氧出水处理液(具体组成为：20mL猪场污水厌氧出水+180mL自来水，按0.4g/L的浓度添加葡萄糖)；以不添加谷氨酸棒杆菌FX69的猪场污水厌氧出水处理液为空白对照组，均设立三个平行组，28℃、150rpm震荡培养。培养2d后取样测定水体中NH4 +-N、NO2 --N和COD的含量。
结果表明，与不添加谷氨酸棒杆菌FX69组相比，添加谷氨酸棒杆菌FX69组的猪场污水厌氧出水处理液中NH4 +-N去除率为87％，NO2 --N去除率为92％，COD降解率为71％。谷氨酸棒杆菌FX69对猪场污水厌氧出水的净化效果显著。

Claims (1)

1.谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)FX69在净化猪场污水厌氧出水中的应用。
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