CN117264850A - 一种具有辅助治疗阴道炎和增强免疫力功能的戊糖片球菌sw006及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有辅助治疗阴道炎和增强免疫力功能的戊糖片球菌SW006及其应用，戊糖片球菌SW006菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22834。本发明提供的戊糖片球菌SW006，不仅具有较好的体外耐受性和较高的安全性，还兼具辅助治疗阴道炎和增强免疫力的双重功效，可应用于制备具有增强免疫力、预防或辅助治疗阴道炎功能的产品；此外本发明还提供了戊糖片球菌SW006冻干菌粉的制备方法，该制备方法简便、生产效率高，利于该菌的工业化应用。本发明提供的戊糖片球菌SW006可进一步应用于制备具有增强免疫力和/或辅助治疗阴道炎功能的产品。

Description

一种具有辅助治疗阴道炎和增强免疫力功能的戊糖片球菌 SW006及其应用

技术领域

本发明属于微生物工程领域，涉及一种益生菌，具体地说是一种具有辅助治疗阴道炎和增强免疫力功能的戊糖片球菌SW006及其应用。

背景技术

医学上认为机体对抗外来病原菌的能力发生了障碍，可称为免疫力低下。近十几年来，随着人们生活方式和膳食结构的不断改变，如今免疫力低下发病率越来越高。因为人体免疫力低下时，会导致身体对外界的毒素以及病菌抵抗力差，因而受到各种毒素以及病菌的侵扰，从而患病。因此，现代特别是后疫情时代人们越来越重视自身免疫力的提高。

妇科阴道炎，是一种由于阴道黏膜下结缔组织、阴道黏膜等组织部位出现炎症反应后导致的炎性疾病，这类疾病在各年龄阶段的女性中均有可能发生，给女性身体健康以及生活质量均造成严重影响。在临床上，阴道炎是一种十分常见的妇科疾病，据统计阴道炎患者在妇产科总患者例数中占比在30%左右，且由于生活压力的增加和生活环境的改变发病率呈逐年上升趋势。阴道炎临床上常见有细菌性阴道炎、念珠菌性阴道炎、滴虫性阴道炎、老年性阴道炎、幼女性阴道炎。目前临床中治疗阴道炎多以杀菌为主，常见药物为甲硝唑等抗生素，早期治疗效果较为理想，但是停药后极易复发；阴道炎致病菌多样化，而不当使用抗生素药物会导致病菌具有更强的耐药性，以及病原体的产生，让治疗更加困难。

目前发现，益生菌在增强免疫力、防治阴道炎和维持肠道菌群平衡等方面均具有重要的作用。但是，首先，益生菌要想发挥作用必须能定殖于人体肠道内，而大多数菌体很难有效定殖；其次，发现的具有双重功效或多重功效的益生菌菌种有限，特别是兼具辅助治疗阴道炎和增强免疫力功效的、来源安全的益生菌鲜有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的益生菌，即戊糖片球菌SW006，该菌具有良好的体外耐受性和安全性，具有辅助治疗阴道炎和增强免疫力的双重功效；

本发明还有一个目的，是要提供上述戊糖片球菌SW006的一种应用，该菌可广泛用于制备具有增强免疫力和/或辅助治疗阴道炎的食品、保健食品或药品。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种戊糖片球菌SW006，所述戊糖片球菌SW006已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22834，拉丁文名称为Pediococcus pentosaceus。

本发明还提供了上述戊糖片球菌SW006的一种应用，该菌株可用于制备具有增强免疫力和/或辅助治疗阴道炎功能的产品，所述产品包括食品、保健食品或药品。

优选地，所述产品中包含戊糖片球菌SW006冻干菌粉。

优选地，所述戊糖片球菌SW006冻干菌粉的制备方法包括依次进行以下步骤：

S1.将戊糖片球菌SW006种液以2~4%（v/v）的接种量接种于改良的SWP液体培养基中进行发酵培养，发酵结束后将发酵液离心，收集菌泥；

S2.将菌泥与冻干保护液混匀，经冷冻干燥，即得戊糖片球菌SW006冻干菌粉；

所述改良的SWP液体培养基中包括枸杞多糖和黄芪多糖。

优选地，步骤S1中，所述发酵培养的温度为36.5~37.5℃、转速为50~100rpm、时间为16~24h。

优选地，步骤S2中，所述混匀时，菌泥与冻干保护液的质量比为1:1~5；

所述冻干保护液中脱脂乳粉的质量百分比浓度为8~20%，海藻糖的质量百分比浓度为10~25%，山梨糖醇的质量百分比浓度为2~10%，维生素E的质量百分比浓度为0.1~0.5%，余量为水。

优选地，所述戊糖片球菌SW006冻干菌粉中活菌数为6.0×10¹¹～8.0×10¹¹cfu/g。

优选地，所述改良的SWP液体培养基中还包括JM培养液；

所述JM培养液在改良的SWP液体培养基中的质量占比为13~20%；

所述JM培养液的制备方法包括以下步骤：将酿酒酵母接种于YPD培养基中培养，培养液中残糖小于0.05%时结束培养，离心、过滤除去酵母菌后，所得上清液即为JM培养液。

优选地，所述改良的SWP液体培养基由SWP培养基和JM培养液组成；

所述SWP培养基中包括葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、牛肉浸粉、乙酸钠、柠檬酸氢二铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、枸杞多糖和黄芪多糖。

优选地，所述SWP培养基为液态培养基，其中枸杞多糖为1g/L，黄芪多糖为0.75g/L。

由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：

①本发明提供的戊糖片球菌SW006采集于贵州省遵义市农家特色酸肉，其来源安全；

②本发明提供的戊糖片球菌SW006在pH为4的人工胃液处理4h后，存活率仍能保持在98%以上；置于0.1%胆盐浓度4h后，该菌存活率仍在94%以上；说明该菌具有较强的耐酸耐胆盐特性；

③本发明发现，较戊糖片球菌CICC22227和戊糖片球菌CECT8330而言，戊糖片球菌SW006能更好地吸附于阴道上皮细胞上；在干预阴道炎的动物试验中，与阴性对照组相比，灌胃戊糖片球菌SW006冻干菌粉的三个剂量组的试验动物的阴道环境中，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌这三种致病菌的含量显著降低，取到了减轻炎症的效果；说明戊糖片球菌SW006可用于预防或者辅助治疗阴道炎；

④在有助于增强免疫力动物实验中，与空白对照组相比较，灌胃戊糖片球菌SW006冻干菌粉的中剂量组和高剂量组试验动物在胸腺/体重、脾脏/体重、足趾增厚、脾淋巴细胞转化光密度差值、溶血空斑数、抗体积数和NK细胞活性等指标均出现显著差异性，即在细胞免疫功能、体液免疫功能和NK细胞活性三个方面结果均为阳性，证实戊糖片球菌SW006具有增强免疫力的功能；

⑤本发明发现黄芪多糖、枸杞多糖和酿酒酵母的发酵产物可以促进戊糖片球菌SW006的增长，将三者用于戊糖片球菌SW006的发酵利于获得活菌数高的菌粉，摸索出操作简便、生产效率高的菌粉制备工艺，为戊糖片球菌SW006的规模化生产奠定基础。

本发明提供的戊糖片球菌SW006潜在的应用领域广泛，可用于制备具有辅助治疗阴道炎或增强免疫力功效的产品，且无副作用。

附图说明

下面结合附图及具体实施例对本发明作更进一步详细说明。

图1为本发明实施例1中SW006菌株的16SrDNA基因序列与NCBI数据库比对表。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。

本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。

实施例1一种戊糖片球菌SW006

本实施例包括戊糖片球菌SW006的鉴定、保藏，还包括对戊糖片球菌SW006的体外耐受性、上皮细胞吸附能力和抑菌能力进行了考察，具体方法如下。

一、戊糖片球菌SW006菌株的鉴定及保藏

本发明提供的菌株是发明人从贵州省遵义市的农家特色酸肉中分离得到的，命名为SW006。经北京擎科新业生物技术有限公司进行菌种鉴定，SW006菌株为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），发明人将该菌株保存至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.22834。SW006菌株的生物学鉴定依据如下：

对SW006菌株的16SrDNA基因进行测序，其基因序列如下：

CATACTGCAGTCGAACGAACTTCCGTTAATTGATTATGACGTACTTGTACTGATTGAGATTTTAACACGAAGTGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAGAAGTAGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGTATAACAGAGAAAACCGCATGGTTTTCTTTTAAAAGATGGCTCTGCTATCACTTCTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCAGTGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACGTGGGTAAGAGTAACTGTTTACCCAGTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTAATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGATTACTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGTAATCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAAGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTCTGACAGTCTAAGAGATTAGAGGTTCCCTTCGGGGACAGAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTCGCGAGACCGCGAGGTTAAGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGCCGGTGGGGTAACCTTTAGGAGCTAGCCGCT。

将上述测定的SW006菌株的16SrDNA基因序列与以NCBI数据库为基源的专业数据库经BLAST软件进行序列比对，比对表如图1所示，确定SW006菌株为戊糖片球菌，拉丁文名称为Pediococcus pentosaceus。

2021年07月06日，发明人将戊糖片球菌SW006菌株保存至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该菌株的保藏号为CGMCC No.22834，其分类命名为戊糖片球菌Pediococcuspentosaceus；其中，该保藏单位地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

二、戊糖片球菌SW006的体外耐受性实验

本部分为戊糖片球菌SW006耐受性实验，分别开展了该菌株的耐酸性实验和耐胆盐实验，包含以下内容。

S1’ 人工胃液及人工肠液的制备

S11’ 取体积分数为10%的盐酸溶液加去离子水稀释，分别调节pH为2.0、3.0、4.0，加入胃蛋白酶使其终浓度为1%，再用盐酸调整溶液的pH为2.0、3.0、4.0。在无菌操作台中，用0.22μm的微孔滤膜过滤后备用；

S12’ 配制含胆盐浓度分别为0.1%，0.2%，0.3%的MRS培养基，备用；

S2’ 戊糖片球菌SW006的活化

S21’ 将戊糖片球菌SW006冻存管自-18℃冰箱中取出，室温融化，取100μL接种到10mL灭菌的MRS培养基中，37℃厌氧培养24h后即获得一代菌液;

S22’ 取一代菌液，以3%接种量接种到灭菌的MRS培养基中，37℃培养12h后即获得二代菌液；

S23’ 取二代菌液10mL，以8000r/min离心10min，分离得菌体；

S3’ 菌悬液的制备

用0.85%的生理盐水，清洗上述步骤S23’制备的菌体，清洗2~3遍，并制成菌悬液，调节菌悬液中活菌浓度为1×10⁸cfu/mL。

S4’ 耐酸性及耐胆盐研究

S41’ 耐酸性研究

取0.5mL菌悬液与4.5mL不同pH值的人工胃液混合（菌悬液终浓度为10⁷cfu/mL），于37℃培养箱中静置培养4h后取样，稀释涂布平板后，于37℃厌氧培养24h，测定菌落数，以未经人工胃液处理的菌悬液作为对照并计算存活率；

戊糖片球菌SW006耐酸性研究结果见下表表1所示；

表1 戊糖片球菌SW006耐酸性实验结果

由表1数据可看出，戊糖片球菌SW006在胃酸pH为2时4h存活率为35%左右，在pH为4时经过4h后存活率在98%以上，在pH为4的普通培养环境中经检测戊糖片球菌SW006未出现损失，在胃液中可能含有胃蛋白酶对菌体有影响造成少量损失。人体饭后胃酸能达到3.5~4.0之间，而胃排空时间在4小时左右，因此，人体在饭后食用戊糖片球菌SW006，该菌能有效通过胃液到达肠道。

S42’ 耐胆盐研究

按2%的接种量将步骤S22’获得的二代菌液分别接入50mL含不同浓度胆盐的培养基中，37℃培养4h后取样，梯度稀释，涂布于灭菌的MRS平板中，37℃培养24h，测定菌落数。以未经胆盐溶液处理的菌落数作为对照，计算存活率，戊糖片球菌SW006耐胆盐实验结果见下表表2。

表2 戊糖片球菌SW006耐胆盐实验结果

由表2数据可知，随着胆盐浓度的升高，戊糖片球菌SW006的活菌数下降，在0.3%胆盐浓度下，活菌存活率在62%以上，该菌能有效在肠道存活定殖。

三、戊糖片球菌SW006上皮细胞吸附能力

本实施例考察了戊糖片球菌SW006对上皮细胞的吸附能力，并与市场上应用范围较广的两种戊糖片球菌（即戊糖片球菌CICC22227和戊糖片球菌CECT8330）的吸附能力进行了比较，的具体方法如下：

采用人类子宫颈癌细胞株Hela细胞模拟阴道上皮细胞，以5×10⁴个/mL的浓度接种至96孔板内，置于二氧化碳培养箱中于37℃培养24h后，定植，分别加入戊糖片球菌SW006、戊糖片球菌CICC22227和戊糖片球菌CECT8330（上述三种戊糖片球菌接入含Hela细胞的培养基后，调节每种菌的终浓度为2×10⁸cfu/mL），置于二氧化碳培养箱中于37℃培养2h，然后用pH为6.5的PBS缓冲液缓慢冲洗，去除未吸附在阴道上皮细胞的游离的戊糖片球菌，镜检，分别对每个视野随机选取五个Hela细胞，对黏附Hela细胞上的戊糖片球菌SW006、戊糖片球菌CICC22227或戊糖片球菌CECT8330的数量进行计数，每组随机取五个视野，求均值并取整。检测结果如下表表3所示。

表3 三种戊糖片球菌对Hela细胞吸附能力实验结果

表3中，细胞吸附数（n/cell）代表每个Hela细胞吸附的戊糖片球菌的个数。

由上表可知：较戊糖片球菌CICC22227和戊糖片球菌CECT8330而言，戊糖片球菌SW006对Hela细胞有较强的吸附定殖能力，进一步表明戊糖片球菌SW006能很好地吸附于阴道上皮细胞上。

四、戊糖片球菌SW006的抑菌能力

本实施例对戊糖片球菌SW006、戊糖片球菌CICC22227和戊糖片球菌CECT8330的抑菌能力进行了测定，具体方法如下：

采用大肠杆菌CMCC44102、金黄色葡萄球菌CMCC26003、沙门氏菌CMCC50094和白色念珠菌CMCC98001为指示菌株，以牛津杯法对戊糖片球菌SW006的抑菌活性进行测定。具体方法如下：

分别将戊糖片球菌SW006、戊糖片球菌CICC22227和戊糖片球菌CECT8330在M17培养基中于37℃培养18h后，低温离心去上清液得到菌泥，依次记为SW006菌泥、CICC22227菌泥和CECT8330菌泥。

取三种菌泥各1g，分别溶于9mL 0.9%的无菌生理盐水制成待测液。分别取待测液200μL加至含有大肠杆菌CMCC44102、金黄色葡萄球菌CMCC26003、沙门氏菌CMCC50094和白色念珠菌CMCC98001的无菌营养琼脂平板的牛津杯中，37℃培养72h后观察、测定结果，三种戊糖片球菌对四种致病菌的抑菌圈统计结果如下表表4所示。

表4 三种戊糖片球菌对四种致病菌的抑菌圈统计结果

由表4数据可知：体外抑菌试验中，戊糖片球菌SW006、戊糖片球菌CICC22227、和戊糖片球菌CECT8330这三种菌株对大肠杆菌CMCC44102、金黄色葡萄球菌CMCC26003、沙门氏菌CMCC50094和白色念珠菌CMCC98001均有抑制作用，但戊糖片球菌SW006在抑菌效果上要显著好于戊糖片球菌CICC22227和戊糖片球菌CECT8330这两菌株，抑菌效果显著，说明戊糖片球菌SW006具有作为一株抑菌的益生菌进行开发的潜力。

实施例2一种戊糖片球菌SW006冻干菌粉的制备方法

本实施例首先制备了一种戊糖片球菌SW006冻干菌粉，然后对戊糖片球菌SW006冻干菌粉进行了干预阴道炎试验、有助于增强免疫力的功效学试验以及安全性试验，具体方法如下。

一、一种戊糖片球菌SW006冻干菌粉的制备方法

本部分首先通过筛选戊糖片球菌SW006的促生长因子，优化培养基成分，再制备戊糖片球菌SW006冻干菌粉，具体方法如下：

（1）促生长因子的筛选

S1’’ 单因素试验

通过预实验和调研，自黄芪多糖、枸杞多糖、大豆多糖、大豆蛋白肽和牛骨蛋白肽等原料中，筛选能够促进戊糖片球菌SW006生长的原料。具体方法为：在MRS培养基的基础添加0.5%的上述成分，做成五种改良的MRS培养基，依次记为改良MRS培养基1~改良MRS培养基5，改良的MRS培养基配料表表表5所示。

表5 改良的MRS培养基配料表

其中，MRS培养基的成分为葡萄糖30g/L、酵母浸粉5g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸粉10g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L，pH6.8-7.0，余量为水。

按3%接种量，将经实施例1中步骤S22’制得的戊糖片球菌SW006二代菌液接种于上述五种改良MRS培养基中，于37℃、静置培养18h后，活菌计数。其结果如表6所示：

表6 戊糖片球菌SW006在不同的改良MRS培养基中活菌数统计表

由表6数据可知，枸杞多糖对戊糖片球菌SW006有很好的促进作用，效果显著；黄芪多糖次之，有效果；大豆多糖、大豆蛋白肽和牛骨蛋白肽作用不显著与对照无差异性。因此拟选用枸杞多糖和黄芪多糖作为组合，对MRS培养基进行改良，看是否可通过确定枸杞多糖或黄芪多糖的添加量后作为另一种改良的MRS培养基，以用于戊糖片球菌SW006菌液的制备。

S2’’ 正交试验

采用正交试验确定枸杞多糖和黄芪多糖的在MRS培养基中的添加量，其中枸杞多糖的添加量选择0.5g/L、1.0g/L和1.5g/L三个水平，黄芪多糖的添加量选择0.5g/L、0.75g/L和1.0g/L三个水平；目标因子为以本实施例S1’’步骤中戊糖片球菌SW006二代菌液的接种量，在添加上述不同水平的枸杞多糖和黄芪多糖改良的MRS培养基中于37℃培养18h后的活菌计数。正交试验结果如表7所示。

表7 正交试验结果

由表7可知：在MRS培养基的基础上，当枸杞多糖添加量为1g/L、黄芪多糖添加量为0.75g/L时，可促进戊糖片球菌SW006的快速增长。因此，确定戊糖片球菌SW006的培养基为SWP培养基，其中SWP培养基组成为：葡萄糖30g/L、酵母浸粉5g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸粉10g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L、枸杞多糖1g/L、黄芪多糖0.75g/L。

由此SWP培养基对戊糖片球菌SW006二代菌液进行发酵，37℃、60rmp，pH控制在5.0，当残糖达到0.1%时达到发酵终点，发酵液活菌数达到9.5×10⁹cfu/ml。

S3’’ SWP培养基的改进

在上述确定的SWP培养基的基础上，本发明对发酵培养基进一步进行改进，具体方法如下：

将30mL活菌数为8.5×10⁶~4.5×10⁷cfu/mL酿酒酵母（市售安琪高活性干酵母）接种于体积为1L的灭菌YPD培养基中，于30℃、转速220rpm条件下培养48小时后检测其培养基残糖含量，在残糖小于0.05%时结束培养，对其进行离心去除菌体，采用无菌过滤器对上清液进行过滤去除残留的酵母菌，制成无菌培养液JM。

其中，YPD培养基包括酵母浸粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，余量为水。

在无菌SWP培养基中以3%接种量接入戊糖片球菌SW006二代菌液，同时加入20%无菌培养液JM进行发酵，于37℃培养，培养过程中控制pH为5.5，当残糖达到0.1%时达到发酵终点，经检测发酵液活菌数为1.1×10¹⁰cfu/ml。

莫海燕在对比文件《饲用粪肠球菌、戊糖片球菌发酵工艺研究》中通过对戊糖片球菌的种子培养基和培养条件进行优化，令戊糖片球菌的活菌数有了较大程度的提升。本申请对该对比文件确定的培养基与发酵方式（pH=5.5、温度为30℃、装液量为70%、转速为200rmp、接种量为4%），与本发明确定的培养基，对戊糖片球菌SW006二代菌液在37℃下培养18h后所得发酵液进行活菌计数，实验结果如表8所示。

其中，对比文件的培养基为：蔗糖20%、酵母粉15.6%、蛋白胨13.5%、磷酸氢二钾0.2%、硫酸镁0.04%、硫酸锰0.002%、碳酸钙1%,发酵条件为pH=5.5、温度为30℃、装液量为70%、转速为200rmp、接种量为4%，发酵时间为18h。

表8 两种培养方式所得发酵液中戊糖片球菌SW006活菌数统计表

由表8数据可知：本研究采用的发酵方式培养的活菌数达到1.2×10¹⁰，比论文中的发酵方式培养的活菌数有很大提升，差异性显著。

因此，本发明将无菌培养液JM作为本实施例中改良的SWP液体培养基中的部分原料。

（2）一种戊糖片球菌SW006冻干菌粉的制备方法

S1. 将戊糖片球菌SW006种液以3%（v/v）的接种量接种于改良的SWP液体培养基中，在37℃、转速为60rpm条件下进行厌氧发酵，发酵时间为18h；

发酵结束后，将发酵液在4℃环境中，8000rpm离心20min，弃去上清收集菌泥。

其中，所述戊糖片球菌SW006种液为实施例1中步骤S22’制得的二代菌液；

所述改良的SWP液体培养基由800mL灭菌的SWP培养基和200mL无菌的JM培养液组成。SWP培养基的组成见本实施例步骤S2’’的记载；JM培养液的制备方法如本实施例步骤S3’’制备所得。

S2.将10g菌泥与20g冻干保护液混匀，预冷3h后，经冷冻干燥，即得戊糖片球菌SW006冻干菌粉，记为戊糖片球菌SW006冻干菌粉1；

所述冻干保护液的制备方法为：向50mL蒸馏水中分别添加脱脂乳粉10g、海藻糖20g、山梨糖醇8g、维生素E 0.3g，定容至100mL，经121℃灭菌后制得冻干保护液；

所述冷冻干燥条件为本领域技术冷冻干燥的常规条件，本实施例中冻干条件选定的为：冷阱温度为-50℃，冷冻干燥48h。

对戊糖片球菌SW006冻干菌粉1进行活菌计数，测得活菌数为6.0×10¹¹cfu/g。

二、戊糖片球菌SW006干预动物阴道炎实验

本实施例考察了戊糖片球菌SW006对动物阴道炎的治疗效果，以具体方法如下：

经适应性饲喂，选取6～8周龄、180～220g的SPF级SD雌性大鼠60只，将大鼠随机分为六组，10只/组，六组分别为正常组、模型组、阳性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组；

除正常组小鼠外，其余组小鼠均皮下注射100μL戊酸雌二醇，连续注射3天，诱导小鼠发情。然后向阴道内注入混合菌（大肠埃希氏菌CMCC44102、金黄色葡萄球菌CMCC26003、白色念珠菌CMCC98001），三菌株活菌数比例为1:1:1，单菌株活菌数为1.0×10⁸cfu/mL，注入量为50μL/只/次，每天1次，连续3天，制备阴道炎症模型。

正常组大鼠阴道注入50μL不含菌株的无菌PBS缓冲液；

阴道炎症模型组和正常组大鼠分别于给药前向大鼠阴道内注入50μL无菌PBS缓冲液，移液枪轻轻吹打5次后吸出冲洗液（约250μL），采用荧光定量PCR对大肠埃希氏菌CMCC44102、金黄色葡萄球菌CMCC26003、白色念珠菌CMCC98001进行定量检测，根据荧光定量CT值、标准曲线得到菌体基因组拷贝数，换算成活菌数并观察其异常症状与临床上阴道炎的临床表现相似，确定造模成功。

低剂量组、中剂量组和高剂量组灌胃所用的戊糖片球菌SW006为本实施例中第一部分部分制备的含有戊糖片球菌SW006冻干菌粉1，其活菌数为6.0×10¹¹cfu/g，将戊糖片球菌SW006冻干菌粉1用生理盐水进行梯度稀释，分别制成菌浓度为4.0×10⁸cfu/mL、8.0×10⁸cfu/mL和4.0×10⁹cfu/mL的菌悬液以备低剂量组、中剂量组和高剂量组灌胃；制成每1mL生理盐水中含有100mg阿莫西林和1mg氟康唑的溶液；不同组别动物的灌胃剂量均为0.5mL/天；不同组别灌胃的物质及剂量如表9所示。

表9 不同组别灌胃剂量统计表

给药1个月，给药结束时向大鼠阴道内注入50μL无菌PBS缓冲液，移液枪轻轻吹打5次后吸出冲洗液（约250μL），采用荧光定量PCR对大肠埃希氏菌CMCC44102、金黄色葡萄球菌CMCC26003、白色念珠菌CMCC98001进行定量检测，根据荧光定量CT值、标准曲线得到菌体基因组拷贝数，换算成活菌数，实验结果统计表如表10所示。

表10 实验结果统计表

由表10结果可知：通过灌胃戊糖片球菌SW006，对大鼠阴道炎干预起到作用，低、中、高剂量组与模型组相比较效果差异性显著（P<0.01）；本部分实验证实服用戊糖片球菌SW006可用于辅助治疗/治疗阴道炎，达到减少炎症的效果，可作为一种食品级预防和干预用料。

三、戊糖片球菌SW006有助于增强免疫力功效学试验

本部分采用《保健食品功能检验与评价方法（2022年版）》中“一、有助于增强免疫力检验方法”记载的评价方法开展戊糖片球菌SW006是否有助于增强免疫力的功能检验。

选取60只6~8周、体重在18~22g之间的雄性昆明种小白鼠，按体重随机分为四组，每组15只；四组分别为空白对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。不同组别喂食饲料的种类及灌胃剂量如表11所示，其中，中剂量组为人体推荐量的10倍。

表11 不同组别的喂食饲料种类及灌胃剂量

试验期间小鼠饲喂基础饲料，其中基础饲料按《保健食品功能检验与评价方法（2022年版）》中“一、有助于增强免疫力检验方法”项下记载的方法配置；低剂量组、中剂量组和高剂量组灌胃所用的戊糖片球菌SW006为本实施例中制备的戊糖片球菌SW006冻干菌粉1，其活菌数为6.0×10¹¹CFU/g，低、中、高剂量组分别灌胃菌浓度为6.0×10⁸CFU/mL、1.2×10⁹CFU/mL、2.4×10⁹CFU/mL的菌悬液，灌胃剂量均为0.5mL/天。其中，中剂量组为人体推荐量的10倍。

本试验周期为4周，分别进行以下研究：

①测量小鼠体重变化

②测定小白鼠脏体比值：小鼠免疫器官胸腺、脾脏的重量与体重的比值

③细胞免疫功能测定：小鼠脾淋巴细胞转化实验，迟发型变态反应实验

小鼠脾淋巴细胞转化实验采用MTT法，测定淋巴细胞增殖能力，淋巴细胞增值能力越强，说明免疫力越强；

小鼠迟发型变态反应试验(足跖厚度增加法)：实验结束前的第4天免疫动物，用2％(v/v)绵羊红细胞腹腔注射0.2mL致敏动物，5天后测定左后足跖部厚度，接着于该处皮下注射20％(v/v)绵羊红细胞(20μL/每鼠)，注射后24h测定左后足跖部厚度三次，得平均值；

④体液免疫功能测定：抗体生成细胞检测，血清溶血素测定

抗体生成细胞数的测定：即测定溶血空斑数，溶血空斑数越大，说明小鼠体液免疫功能越强；

血清溶血素测定：即抗体积数，抗体积数越大，体液免疫能力越强；

⑤NK细胞活性测定

本发明采用乳酸脱氢酶（LDH）法检测NK细胞活性，具体方法如下：

依据《保健食品功能检验与评价方法（2022年版）》中“一、有助于增强免疫力检验方法”中记载的方法，制备脾细胞悬液（效应细胞），制得空白组、低剂量组、中剂量组和高剂量组的四种效应细胞。

反应孔中取浓度为4×10⁵个/mL的YAC-1靶细胞和效应细胞各100μL（效靶比50：1），加入U型96孔培养板；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1% NP-40各100μL；上述各项均设三个复孔，于37℃、5%CO₂培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500rpm离心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，反应3min，每孔加入30μL 1mol/L HCl，在酶联仪492nm处测定光密度值。

NK细胞活性(％)＝(反应孔OD-自然释放孔OD)/(最大释放孔OD-自然释放孔OD)×100％。

不同组别昆明小鼠的体重、脏体比、免疫功能及NK细胞活性等指标测定结果统计表见下表12。

表12 不同组别小鼠的体重、脏体比、免疫功能指标及NK细胞活性测定结果统计表

由表12试验结果可知，本试验中各组小鼠的体重均值未出现显著差异；与空白对照组相比较，中剂量组和高剂量组在胸腺/体重、脾脏/体重、足趾增厚、脾淋巴细胞转化光密度差值、溶血空斑数、抗体积数和NK细胞活性等指标均出现显著差异性，即在细胞免疫功能、体液免疫功能和NK细胞活性三个方面结果均为阳性。因此，根据《保健食品功能检验与评价方法（2022年版）》中有助于增强免疫力功能检验方法及结果判定，判定该受试样品-戊糖片球菌SW006具有有助于增强免疫力的作用。

四、戊糖片球菌SW006急性毒性试验

本实施例通过《GB 15193.3-2014 食品安全国家标准 急性经口毒性试验》记载的方法进行试验，考察了戊糖片球菌SW006的安全性，具体方法如下：

试验动物的选取及饲喂条件：选取体重在18g～22g的SPF级KM种小鼠20只（雌雄各半），20℃～26℃，光照12h敏感交替，自有饮水，饲以标准块状维持饲料，适应性饲喂一周；

采用限量实验法，对提供小鼠一次性经口给予受试物为本实施例制备的戊糖片球菌SW006冻干菌粉1，灌胃剂量为10000mg/kg·BW；灌胃时将受试物戊糖片球菌SW006冻干菌粉1配置的菌液，现用现配。称取样品10.00g，加去离子水至20mL，充分混匀备用；

给予小鼠戊糖片球菌SW006前禁食4h，不禁水，实验当日称重、标记，灌胃体积为20mL/kg·BW，单次经口灌胃给予小鼠戊糖片球菌SW006，给予小鼠受试物2h后给予饲料；给予戊糖片球菌SW006后连续观察2h～4h，之后每天观察一次，观察期为14天。通过观察是否存在与戊糖片球菌SW006相关的动物死亡，确定受试物经口毒性，并确定是否有必要采用霍恩氏法进行后续试验；若有中毒现象，则记录小鼠中毒体征、症状出现和消失、以及动物死亡时间。

经实验，戊糖片球菌SW006的急性毒性试验中死亡动物数统计结果如下表表13所示；试验期间动物体重变化统计表如表14所示。

表13 急性毒性试验过程中死亡动物数统计表

表14 急性毒性试验过程中动物体重变化

由表13~14数据可知：灌胃戊糖片球菌SW006后，实验动物未出现明显中毒体征；急性经口毒性试验结果显示戊糖片球菌SW006对KM种雌、雄小鼠的经口半数致死剂量（LD₅₀）均大于10000mg/kg·BW，依据《GB15193.3-2014食品安全国家标准 急性经口毒性试验》中的剂量分级标准，戊糖片球菌SW006冻干菌粉1属于实际无毒级。

实施例3~7戊糖片球菌SW006冻干菌粉的制备方法

实施例3~7分别为一种戊糖片球菌SW006冻干菌粉的制备方法，它们的步骤与实施例2提供的戊糖片球菌SW006冻干菌粉1的制备方法基本相同，不同之处仅在于各项参数不同，具体详见表15。

表15 实施例3~7中各项参数一览表

实施例7戊糖片球菌SW006菌在制备具有防治阴道炎和/或增强免疫力功能的产品中的应用

鉴于戊糖片球菌SW006具有预防或辅助治疗阴道炎的功效，可将戊糖片球菌SW006菌液或其冻干菌粉作为食品、保健食品或药品的原料，按照现有技术中益生菌的常规应用方法进一步用于制备具有预防或辅助治疗阴道炎的食品、保健食品或药品。

鉴于戊糖片球菌SW006具有增强免疫力的功效，可将戊糖片球菌SW006菌液或其冻干菌粉作为食品、保健食品或药品的原料，按照现有技术中益生菌的常规应用方法进一步用于制备具有增强免疫力功能的食品、保健食品或药品。

Claims (10)

1.一种戊糖片球菌SW006，其特征在于，所述戊糖片球菌SW006已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22834，拉丁文名称为Pediococcus pentosaceus。

2.根据权利要求1所述的戊糖片球菌SW006在制备具有增强免疫力和/或辅助治疗阴道炎功能的产品中的应用，所述产品包括食品、保健食品或药品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品中包含戊糖片球菌SW006冻干菌粉。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述戊糖片球菌SW006冻干菌粉的制备方法包括依次进行以下步骤：

S1.将戊糖片球菌SW006种液以2~4%（v/v）的接种量接种于改良的SWP液体培养基中发酵培养，发酵结束后将发酵液离心，收集菌泥；

S2.将菌泥与冻干保护液混匀，经冷冻干燥，即得戊糖片球菌SW006冻干菌粉；

所述改良的SWP液体培养基中包括枸杞多糖和黄芪多糖。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤S1中，

所述发酵培养的温度为36.5~37.5℃、转速为50~100rpm、时间为16~24h。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤S2中，

所述混匀时，菌泥与冻干保护液的质量比为1:1~5；

所述冻干保护液中脱脂乳粉的质量百分比浓度为8~20%，海藻糖的质量百分比浓度为10~25%，山梨糖醇的质量百分比浓度为2~10%，维生素E的质量百分比浓度为0.1~0.5%，余量为水。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述戊糖片球菌SW006冻干菌粉中活菌数为6.0×10¹¹～8.0×10¹¹cfu/g。

8.根据权利要求4~7任一项所述的应用，其特征在于，所述改良的SWP液体培养基中还包括JM培养液；

所述JM培养液在改良的SWP液体培养基中的质量占比为13~20%；

所述JM培养液的制备方法包括以下步骤：将酿酒酵母接种于YPD培养基中培养，培养液中残糖小于0.05%时结束培养，离心、过滤除去酵母菌后，所得上清液即为JM培养液。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述改良的SWP液体培养基由SWP培养基和JM培养液组成；

所述SWP培养基中包括葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、牛肉浸粉、乙酸钠、柠檬酸氢二铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、枸杞多糖和黄芪多糖。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述SWP培养基为液态培养基，其中枸杞多糖为1g/L，黄芪多糖为0.75g/L。