CN113832059A - 一种抑菌型芽孢杆菌及其固体发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抑菌型芽孢杆菌及其固体发酵方法；本发明所述的抑菌型芽孢杆菌保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间为2021年4月6日；保藏登记入册编号为CGMCC No.22124。本发明的优点有：通过固体发酵后仍然对对大肠杆菌和沙门氏菌等致病菌具显著的抑菌性能，并且长期放置稳定性高，耐酸、耐胆盐强、能够工业规模化生产，更有利于微生态制剂产品的替抗。
Description
技术领域
本发明属于新保藏菌种种类技术领域；尤其涉及该菌种的液体发酵步骤、抑菌试验方法。
背景技术
抗生素是20世纪最伟大的发现之一，近百年来，仅青霉素就拯救了大约2 亿人的生命。抗生素在给人类带来益处的同时也给养殖业创造了巨大的经济效益。1951年，随着美国食品与药物管理局(FDA)首次批准在饲料中添加非处方型抗生素。由此，在全球范围内，低剂量的抗生素作为生长促进剂(Antibiotics as Growth Promoter，AGP)被加入常规饲料中在畜牧行业内广泛应用。它也见证了国际畜牧业的飞速发展。近70年来，先后有60余种抗生素应用于畜牧养殖业。然而由于抗生素在畜禽饲料中的广泛使用尤其是超标使用，给细菌提供了足够的机会以进化出应对各种药物的耐药性，进而导致各种病原菌的耐药性得出现，直接威胁着畜牧和人类健康。随着1986年，瑞典的在饲料中全面禁止添加抗生素，国外等国家开始陆续禁抗，随着2019年农业农村部第194号公告的颁布，我国在2020年7月1号开始也实行全面禁抗，微生态制剂通过改变肠道菌群平衡，促进动物肠道健康，提高动物的免疫力和消化吸收率，同时也可以产生抑菌型的代谢产物，对各种致病菌具有很强的抑菌效果，并且不会产生耐药性，是替代抗生素的首要手段之一。
发明内容
本发明正是为了解决上述问题缺陷，提供一种抑菌型芽孢杆菌及其固体发酵方法。本发明通过筛选得到一株芽孢杆菌，创造性的通过固体发酵的方式进行生产，在保留其抑菌效果同时也可以实现规模放大生产，使得其产能得到很大的提高，使其更加有利的用于饲料替抗产品的使用。
本发明采用如下技术方案实现。
一种抑菌型芽孢杆菌，本发明所述的抑菌型芽孢杆菌保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间为2021年4月6日；保藏登记入册编号为CGMCC No.22124。分类命名：地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis。
本发明所述的抑菌型芽孢杆菌参据生物材料为OKX101。
本发明上述的抑菌型芽孢杆菌的固体发酵方法，包括如下步骤：
步骤1)菌种活化；
步骤2)制备一级种子；
步骤3)制备二级种子罐；
步骤4)撒制备三级种子罐；
步骤5)固体发酵物料的灭菌；
步骤6)固体发酵。
本发明上述的液体发酵步骤，其步骤具体为，
步骤1)菌种活化：
将OKX101(保藏号为GCMCC22124)的甘油管通过划线接入到LB固体的平板上，37℃倒置培养18-24h，然后挑取单菌落接入到LB液体摇瓶中，37℃、 200r/min摇床培养12-16h左右，然后将其稀释涂布到LB平板，37℃倒置培养 12-18h，作为种子平板；
步骤2)制备一级种子
用接种环从种子平板上挑取单菌落接入到装有LB培养基中的三角摇瓶中， 30-40℃静置培养12-18h，作为一级种子摇瓶；
步骤3)制备二级种子罐
按照1～10％的比例接入到装有LB液体培养基的种子罐中，装液量为20-40L，发酵温度30-40℃、搅拌转速150-250转/min，培养12-18h，作为二级种子罐；
步骤4)制备三级种子罐
按照1～10％的比例接入到装有LB液体培养基的种子罐中，装液量为20-40L，发酵温度30-40℃、搅拌转速150-250转/min，培养12-18h，作为三级种子罐；
步骤5)固体发酵物料的灭菌
固体发酵物料：玉米粉、麸皮、豆粕、稻壳粉、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰、碳酸钙；原料当以kg计，通过调制器121℃灭菌5～15min，保质器保温5～15min，待温度冷却到50℃以下，等待接种；
步骤6)固体发酵
按照10-40％的比例将三级发酵物料接入到灭菌冷却后的固体原料中，搅拌均匀，然后通过传送带传入到净化的发酵房间，通过翻料和通气控制温度为 30-40℃，发酵24-48h。
本发明上述的固体发酵方法，所述的固体发酵物料以重量计，具体为：玉米粉100-500份、麸皮100-300份、豆粕10-50份、稻壳粉100-300份、氯化钠 1-5份、磷酸氢二钾0-5份、磷酸二氢钾0-5份、硫酸镁1-5份、硫酸锰0-0.5份、碳酸钙10-20份。
本发明所述的固体发酵方法还包括步骤7)烘干及其粉碎。
本发明所述的步骤7)烘干及其粉碎，具体为，将气流干燥的设置条件为：进风温度120℃-170℃，出风温度为65℃-90℃，用气流干燥设备将发酵好的物料烘干和粉碎，可得到既保留大量活菌同时又有很强抑菌效果的产品，其活菌数可达1.0-9.9×109cfu/g。
本发明上述抑菌型芽孢杆菌的应用，所述的抑菌型芽孢杆菌用于大肠杆菌的抑菌。
本发明上述抑菌型芽孢杆菌的应用，所述的抑菌型芽孢杆菌用于沙门氏菌、的抑菌。
本发明上述抑菌型芽孢杆菌的应用，所述的抑菌型芽孢杆菌用于金黄色葡萄球菌的抑菌。
本发明上述抑菌型芽孢杆菌的应用，所述的抑菌型芽孢杆菌用于产气荚膜梭菌的抑菌。
本发明的有益效果为，通过抑菌评估发现其对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌都有很好的抑菌效果，同时对其最小抑菌浓度、稳定性评估以及动物试验验证，证明其确实可以用于替抗。
下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。
附图说明
图1为本发明试验1，平均日增重试验结果对比图。
图2为本发明试验1，平均日采食量试验结果对比图。
图3为本发明试验1，料肉比试验结果对比图。
图4为本发明试验1，腹泻率试验结果对比图。
图5为本发明试验2，平均日增重试验结果对比图。
图6为本发明试验2，平均日采食量试验结果对比图。
图7为本发明试验2，料肉比试验结果对比图。
图8为本发明试验2，腹泻率试验结果对比图。
图9为本发明对大肠杆菌的抑菌效果图。
图10为本发明对沙门沙门氏菌的抑菌效果图。
图11为本发明对金黄色葡萄球菌的抑菌效果图。
图12为本发明对产气荚膜梭菌的抑菌效果图。
具体实施方式
一种抑菌型芽孢杆菌，本发明所述的抑菌型芽孢杆菌保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间为2021年4月6日；保藏登记入册编号为CGMCC No.22124。分类命名：地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis。
本发明所述的抑菌型芽孢杆菌参据生物材料为OKX101。
本发明上述的抑菌型芽孢杆菌的固体发酵方法，包括如下步骤：
步骤1)菌种活化；
步骤2)制备一级种子；
步骤3)制备二级种子罐；
步骤4)撒制备三级种子罐；
步骤5)固体发酵物料的灭菌；
步骤6)固体发酵。
本发明上述的液体发酵步骤，其步骤具体为，步骤1)菌种活化：
将OKX101(保藏号为GCMCC22124)的甘油管通过划线接入到LB固体的平板上，37℃倒置培养18-24h，然后挑取单菌落接入到LB液体摇瓶中，37℃、 200r/min摇床培养12-16h左右，然后将其稀释涂布到LB平板，37℃倒置培养 12-18h，作为种子平板；
步骤2)制备一级种子
用接种环从种子平板上挑取单菌落接入到装有LB培养基中的三角摇瓶中， 30-40℃静置培养12-18h，作为一级种子摇瓶；
步骤3)制备二级种子罐
按照1～10％的比例接入到装有LB液体培养基的种子罐中，装液量为20-40L，发酵温度30-40℃、搅拌转速150-250转/min，培养12-18h，作为二级种子罐；
步骤4)制备三级种子罐
按照1～10％的比例接入到装有LB液体培养基的种子罐中，装液量为20-40L，发酵温度30-40℃、搅拌转速150-250转/min，培养12-18h，作为二级种子罐；
步骤5)固体发酵物料的灭菌
固体发酵物料：玉米粉、麸皮、豆粕、稻壳粉、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰、碳酸钙；原料当以kg计，通过调制器121℃灭菌5～15min，保质器保温5～15min，待温度冷却到50℃以下，等待接种；
步骤6)固体发酵
按照10-40％的比例将三级发酵物料接入到灭菌冷却后的固体原料中，搅拌均匀，然后通过传送带传入到净化的发酵房间，通过翻料和通气控制温度为 30-40℃，发酵24-48h。
本发明上述的固体发酵方法，所述的固体发酵物料以重量计，具体为：玉米粉100-500份、麸皮100-300份、豆粕10-50份、稻壳粉100-300份、氯化钠 1-5份、磷酸氢二钾0-5份、磷酸二氢钾0-5份、硫酸镁1-5份、硫酸锰0-0.5份、碳酸钙10-20份。
本发明所述的固体发酵方法还包括步骤7)烘干及其粉碎。
本发明所述的步骤7)烘干及其粉碎，具体为，将气流干燥的设置条件为：进风温度120℃-170℃，出风温度为65℃-90℃，用气流干燥设备将发酵好的物料烘干和粉碎，可得到既保留大量活菌同时又有很强抑菌效果的产品，其活菌数可达1.0-9.9×109cfu/g。
本发明上述抑菌型芽孢杆菌的应用，所述的抑菌型芽孢杆菌用于大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌的抑菌。
实施例：
试验1：该固体发酵培养物在断奶仔猪上的应用效果
试验地点：河南洛阳某猪场
试验时间：2020年
试验设计：选用120头体重在15±0.5kg体重阶段，健康的杜长大三元仔猪，随机区组分为4个处理，每个处理3个重复，每个重复10头猪。试验周期15d。
试验分组
| 分组 | 添加方案 |
| A | 基础日粮+抗菌肽 |
| B | 基础日粮+饲用天然植物提取物 |
| C | 基础日粮+微生态制剂 |
| D | 基础日粮+该固体发酵培养物1kg |
试验结果，见图1，图2，图3，图4所示。
试验小结：
从结果可以看出，采食量方面和日增重方面该固体发酵培养物组要高于另外3个产品组。料肉比方面该固体发酵培养物组要低于另外3个产品组，同时腹泻率也低于另外3个产品组。
试验2：该固体发酵培养物在断奶仔猪上的应用效果
试验地点：河南漯河某猪场
试验时间：2020年
试验设计：选用90头体重在7±0.5kg体重阶段，健康的杜长大三元乳仔猪，按随机区组分为3个处理，每个处理3个重复，每个重复10头猪，试验期15d。
试验分组
| 分组 | 添加方案 |
| A | 基础日粮+抗生素组 |
| B | 基础日粮+该固体发酵培养物500g |
| C | 基础日粮+抗菌肽组 |
注：抗生素包括：喹烯酮、亚甲基水杨酸杆菌肽、金霉素。
试验结果，见图5，图6，图7，图8所示。
试验小结
从结果可以看出，采食量方面该固体发酵培养物组低于对照组和另外一个产品组，但是日增重方面，该固体发酵培养物组要高于对照组和另外一个产品组。料肉比方面，该固体发酵培养物组也要低于对照组和另外一个产品组，同时腹泻率方面也低于对照组和另外一个产品组。
试验3：该固体发酵培养物在禽上的应用效果
试验地点：河南洛阳6个养殖场
试验时间：2020年
养殖场1：养殖规模：5000只蛋鸡，330日龄
来诊：日死亡14只，剖检：败血型大肠杆菌(心包炎，肝周炎，腹膜炎)
处方：君清(穿参止痢散)8公斤+该固体发酵培养物500g/吨料用3天。随后该固体发酵培养物500g/吨料再用3天。
回访：用药3天死亡3只，5天后没再死亡，产蛋率，食饮欲正常。
养殖场2：养殖规模3600只蛋鸡，230日龄
来诊：日死亡8余只，剖检：肝脾肿大，肾脏肿大，卵泡呈菜花样。诊断为成鸡沙门氏菌病
处方：穿参止痢散10Kg/吨+该固体发酵培养物500g/吨料，用3天，该固体发酵培养物500g/吨料，再用3天
回访：3天后死亡2只，5天彻底无再死亡。
养殖场3：养殖规模9300只蛋鸡，180日龄
来诊：育雏阶段出现过沙门氏菌，整个饲养期死淘率高，开产后蛋壳质量差，拉稀，日死亡8只左右。剖检：肝脾肿大，腹腔有血凝不良的血水，卵泡呈菜花样。
处方：该固体发酵培养物500g/吨料，连用7天
回访：4天蛋壳好转，粪便好转，日死亡3只左右，6天后死亡停止。
养殖场4：养殖规模1200只蛋鸡，300日龄
来诊，日死亡7只，剖检：败血型大肠杆菌(心包炎，肝周炎，腹膜炎)
处方：恩诺沙星注射1次(以往连用3天，1次/天)，该固体发酵培养物500g/ 吨料连用6天
回访：3天无再死亡，6天无再发生。
养殖场5：养殖规模：1700只蛋鸡，170日龄
来诊：日死亡6只，剖检，败血型大肠杆菌(心包炎，肝周炎，腹膜炎)
处方：氟苯尼考用3天，该固体发酵培养物500g/吨料，用6天
回访：3天停死亡，6天正常。
养殖场6：养殖规模：2300只蛋鸡，180日龄
来诊：日死亡10只，剖检：败血型大肠杆菌(心包炎，肝周炎，腹膜炎)
处方：该固体发酵培养物500g/吨料，连用8天。
回访：3天后死亡减少，6天后死亡停止。
本发明抑菌型芽孢杆菌的稳定性考察：
将得到的该产品在pH 2的人工胃液和胰液中作用3h，在0.1％猪胆盐浓度下作用3h，在80℃作用5min，在pH 3-10作用1h，仍然具有很好的抑菌活性，说明通过该方法制得的产品具有很好的抗逆性。
表1温度对芽孢杆菌抑菌活性的影响mm
表2胆盐对芽孢杆菌产品抑菌活性的影响mm
表3胃蛋白酶和胰蛋白酶对芽孢杆菌抑菌活性的影响mm
表4不同pH对芽孢杆菌抑菌活性的影响mm
以上所述的仅是本发明的部分具体实施例(由于本发明的技术方案涉及数值范围，故实施例不能穷举，本发明所记载的保护范围以本发明的数值范围和其他技术要点范围为准)，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.一种抑菌型芽孢杆菌，其特征在于，所述的抑菌型芽孢杆菌保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间为2021年4月6日；保藏登记入册编号为CGMCC No.22124。
2.根据权利要求1所述的抑菌型芽孢杆菌，其特征在于，所述的抑菌型芽孢杆菌参据生物材料为OKX101。
3.根据权利要求1所述的抑菌型芽孢杆菌的固体发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1)菌种活化；
步骤2)制备一级种子；
步骤3)制备二级种子罐；
步骤4)撒制备三级种子罐；
步骤5)固体发酵物料的灭菌；
步骤6)固体发酵。
4.根据权利要求3所述的液体发酵步骤，其特征在于，其步骤具体为，步骤1)菌种活化：
将OKX101(保藏号为GCMCC22124)的甘油管通过划线接入到LB固体的平板上，37℃倒置培养18-24h，然后挑取单菌落接入到LB液体摇瓶中，37℃、200r/min摇床培养12-16h左右，然后将其稀释涂布到LB平板，37℃倒置培养12-18h，作为种子平板；
步骤2)制备一级种子
用接种环从种子平板上挑取单菌落接入到装有LB培养基中的三角摇瓶中，30-40℃静置培养12-18h，作为一级种子摇瓶；
步骤3)制备二级种子罐
按照1～10％的比例接入到装有LB液体培养基的种子罐中，装液量为20-40L，发酵温度30-40℃、搅拌转速150-250转/min，培养12-18h，作为二级种子罐；
步骤4)制备三级种子罐
按照1～10％的比例接入到装有LB液体培养基的种子罐中，装液量为1000-2000L，发酵温度30-40℃、搅拌转速150-250转/min，培养12-18h，作为三级种子罐；
步骤5)固体发酵物料的灭菌
固体发酵物料：玉米粉、麸皮、豆粕、稻壳粉、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰、碳酸钙；原料当以kg计，通过调制器121℃灭菌5～15min，保质器保温5～15min，待温度冷却到50℃以下，等待接种；
步骤6)固体发酵
按照10-40％的比例将三级种子接入到灭菌冷却后的固体原料中，搅拌均匀，然后通过传送带传入到净化的发酵房间，通过翻料和通气控制温度为30-40℃，发酵24-48h。
5.根据权利要求4所述的固体发酵方法，其特征在于，所述的固体发酵物料以重量计，具体为：玉米粉100-500份、麸皮100-300份、豆粕10-50份、稻壳粉100-300份、氯化钠1-5份、磷酸氢二钾0-5份、磷酸二氢钾0-5份、硫酸镁1-5份、硫酸锰0-0.5份、碳酸钙10-20份。
6.根据权利要求4所述的固体发酵方法，其特征在于，所述的固体发酵方法还包括步骤7)烘干及其粉碎；具体为，将气流干燥的设置条件为：进风温度120℃-170℃，出风温度为65℃-90℃，用气流干燥设备将发酵好的物料烘干和粉碎，可得到既保留大量活菌同时又有很强抑菌效果的产品，其活菌数可达1.0-9.9×109cfu/g。
7.根据权利要求1所述抑菌型芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述的抑菌型芽孢杆菌用于大肠杆菌的抑菌。
8.根据权利要求1所述抑菌型芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述的抑菌型芽孢杆菌用于沙门氏菌的抑菌。
9.据权利要求1所述抑菌型芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述的抑菌型芽孢杆菌用于金黄色葡萄球菌的抑菌。
10.据权利要求1所述抑菌型芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述的抑菌型芽孢杆菌用于产气荚膜梭菌的抑菌。
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| CN113717895A (zh) * | 2021-09-23 | 2021-11-30 | 洛阳欧科拜克生物技术股份有限公司 | 一种抑菌型芽孢杆菌及其液体发酵步骤、抑菌试验方法 |
| CN113717895B (zh) * | 2021-09-23 | 2024-02-23 | 洛阳欧科拜克生物技术股份有限公司 | 一种抑菌型芽孢杆菌及其液体发酵步骤、抑菌试验方法 |
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