CN108902982A - 一种益生菌微胶囊冻干粉及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种益生菌微胶囊及其冻干粉的制备方法，该制备方法包括菌株活化、发酵脱脂乳菌液制备、微胶囊制备与冷冻干燥等步骤。本发明制备得到的微胶囊颗粒形态特征良好，表面致密、粒径70～130μm，包埋率达到85％以上，耐胃酸性好、肠液释放性、抗冷冻干燥性和贮藏稳定性均好，从而能够保护益生菌免受不良环境影响，提高益生菌在人体中的健康作用，解决了传统包埋方法存在的弊端。本发明制备益生菌微胶囊的技术可以广泛应用于食品、生物技术等多个技术领域中。

Description

一种益生菌微胶囊冻干粉及其制备方法

【技术领域】

本发明属于食品生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种采用水相分离法制备益生菌微胶囊冻干粉的方法，本发明还涉及所述的益生菌微胶囊冻干粉。

【背景技术】

世界卫生组织(WHO)和粮农组织(FAO)联合将益生菌定义为“当其被摄入充足数量时，能够赋予机体某种健康益处的活微生物”。益生菌具有多种生理功能，其中包括改善人体肠道功能、抑制有害菌生长、减少肠道疾病、缓解乳糖不耐症、促进糖、蛋白质及钙、镁等营养物质的吸收、降胆固醇、调节免疫系统、抗肿瘤、预防癌症等。若想使益生菌充分发挥其有益作用必须满足两个条件：1)在被人体摄入时必须保持一定活性；2)必须有足够数量的益生菌定植于肠道中，通常认为每g或ml产品不低于10⁷cfu。实际情况是在生产、贮运以及消化过程中，益生菌容易受到所处不利环境(温度、O₂、pH值、过氧化物)和宿主消化系统(胃酸、胆盐、各种酶)的影响，导致益生菌存活率大幅下降，无法实现良好的益生效果。

对于生产者而言，微胶囊化加工的益生菌可以多种方式添加到食品中，不仅极大程度地避免了不利生产环境对菌体的破坏，提高食品营养价值，而且不会改变食品的感官特性。对于消费者而言，含有益生菌微胶囊的食品可以很好地解决益生菌难以抵御宿主消化系统的消化从而存活率低的问题，益生菌在肠道内适时受控释放、定殖并维持其代谢活动。不断改良微胶囊化技术是保护益生菌，保障其对人体发挥保健作用的有效手段。

目前，Thomas Heidebach的微胶囊制备方法(Heidebach T, P,KulozikU.Microencapsulation of probiotic cells by means of rennet-gelation of milkproteins.[J].Food Hydrocolloids,2009,23(7):1670-1677.)较受欢迎，其运用内源乳化法，以牛奶蛋白为壁材制备微胶囊，利用凝乳酶低温降解酪蛋白，在CaCl₂存在下迅速升温触发凝胶形成。但是，由于CaCl₂为可溶性钙盐，体系中充满Ca²⁺，当温度突然升高，Ca²⁺不但会在W/O乳状液内部交联，在乳状液之间也会交联，导致形成的微胶囊粘连程度较大，分散性不好，粒径大，影响食品的口感和品质。另外，采用乳化法消耗大量植物油，不仅增加成本，而且在贮藏期间产生不饱和脂肪氧化酸败，缩短贮藏期。

为此，针对现有这些技术问题，本发明人经过大量实验研究与分析总结，解决了这些技术问题，终于完成了本发明。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种益生菌微胶囊冻干粉。

本发明的另一个目的是提供一种采用水相分离法制备益生菌微胶囊冻干粉的方法。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种采用水相分离法制备益生菌微胶囊冻干粉的方法。

该益生菌微胶囊冻干粉的制备步骤如下：

A、菌株活化

将选用的益生菌按照以MRS液体培养基计1～3％接种量接种于MRS液体培养基中，在培养箱中在温度37℃的条件下培养16～24h，以相同方式活化培养三代，离心分离，收集菌泥；按照菌泥与生理盐水重量比1：10～16，所述的菌泥用灭菌生理盐水洗涤2～3次，再按照菌泥与无菌水的重量比1：6～10，将洗涤的菌泥重悬于无菌水中，震荡混匀，得到一种活菌数在10⁹cfu/ml以上的浓缩菌液，并用MRS琼脂培养基准确计数浓缩菌液的活菌数；

B、发酵脱脂乳制备

将32～38重量份脱脂乳粉、0.3～0.7重量份酵母粉与1.2～1.8重量份葡萄糖与补充至总量为100重量份的水制成一种脱脂乳溶液；然后，按照浓缩菌液与脱脂乳溶液的重量比为1.8～2.2：16～20，把步骤A得到的浓缩菌液接种于所述的脱脂乳溶液中，在温度37℃的条件下发酵至90～95°T，得到一种活菌数为10⁹cfu/ml以上的发酵脱脂乳，并用MRS琼脂培养基准确计数发酵脱脂乳的活菌数；

C、水相分离法制备益生菌微胶囊

将步骤B得到的发酵脱脂乳菌液在冰浴中降温至0～4℃，接着加入浓度10～15mg/ml、活力80～120IMCU/ml的凝乳酶，在转速400～600r/min下搅拌0.8～1.2h使酪蛋白充分降解，得到一种降解发酵脱脂乳；按照以毫升计降解发酵脱脂乳与以毫升计氯化钙溶液的比为1：1.0～1.4，往降解发酵脱脂乳中加入浓度为以重量计0.80～1.20％的CaCl₂水溶液，在冰浴中搅拌5～10min，使降解发酵脱脂乳均匀地分散在CaCl₂水溶液中，再转移到水浴中在温度35～45℃下继续搅拌，使Ca²⁺与酪蛋白片段共价交联生成微胶囊颗粒，然后静置，离心分离，收集所述的益生菌微胶囊颗粒；

D、冷冻干燥

让步骤C得到的微胶囊颗粒置于冰箱中进行预冷冻，接着置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，得到所述的活菌数在10⁹cfu/ml以上的益生菌微胶囊冻干粉，并用MRS琼脂培养基准确计数微胶囊冻干粉的活菌数。

根据本发明的一种优选实施方式，在步骤A中，所述的益生菌是植物乳杆菌LIP-1、干酪乳杆菌ZHANG、双歧杆菌V9或植物乳杆菌P8。

根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤A中，所述菌泥与生理盐水的重量比是1：12～14；所述菌泥与无菌水的重量比是1：7～9。

根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤B中，浓缩菌液与脱脂乳溶液的重量比是1.9～2.1：17～19，将脱脂乳与浓缩菌液混合液适度发酵后得到的发酵脱脂乳的滴定酸度为92～93°T。

根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C中，所述CaCl₂水溶液的浓度是以重量计0.90～1.0％。

根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C中，所述的降解发酵脱脂乳与CaCl₂水溶液在冰浴中搅拌混合5～10min，然后在水浴中继续搅拌4～6min。

根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C中，所述的静置是在温度35～45℃下放置8～12min；所述的离心分离是在转速1400～1800r/min的条件下进行的。

根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤D中，所述的微胶囊颗粒先在冰箱中在温度-79～-82℃下预冷冻22～24h，然后在真空冷冻干燥机中在温度-49～-50℃与真空度-0.01～0.02MPa的条件下冷冻干燥22～24h。

本发明还涉及所述制备方法制备得到的益生菌微胶囊冻干粉。

根据本发明的一种优选实施方式，所述的益生菌微胶囊冻干粉具有下述特性：

包埋率：85％以上；

形态特征：粒径70～130μm；

耐胃酸性：在模拟胃液中在2.5h后益生菌活菌数减少0.27(Log CFU/g)以下；

肠液释放性：在模拟肠液中在2.0h后释放益生菌活菌数达到8.720(Log CFU/g)以上；

抗冷冻性：存活率为75％以上；

贮藏稳定性：在温度4℃下贮存28d后，益生菌活菌数为10⁹CFU/g以上。

下面将更详细地描述本发明。

本发明涉及一种采用水相分离法制备益生菌微胶囊冻干粉的方法。

不同于传统的乳化包埋方法，本发明采用水相分离法制备益生菌微胶囊。根据本发明，高乳蛋白浓度的脱脂乳混合溶液不只作为壁材，还作为益生菌天然的培养基，35％脱脂乳粉含量保证了体系极强的缓冲力，适量的促益生菌生长因子(葡萄糖和酵母粉)加快了发酵速率。适度发酵营造微酸性环境，酸胁迫作用使益生菌各方面抗性增强，并且在一定程度上加速其代谢和增殖，代谢产生的蛋白酶有利于酪蛋白的分解破碎，产生的胞外多糖丰富了壁材成分，再利用凝乳酶降解，形成更丰富的蛋白片段。CaCl₂溶液在微酸环境释放的可溶性Ca²⁺与酪蛋白碎片共价交联，形成稳定酸-酶共促乳凝胶体系，精确控制温度变化和搅拌速度使微胶囊成型。整个过程操作简单，条件温和，制得的微胶囊颗粒粒径较小，分散性好，包埋效率高、表面致密、耐受力强、肠溶性好、耐贮藏，解决了传统包埋方法存在的弊端，如乳化法的成本高，植物油回收利用难，有脂肪氧化味等。

该益生菌微胶囊冻干粉的制备步骤如下：

A、菌株活化

将选用的益生菌按照以MRS液体培养基计1～3％接种量接种于MRS液体培养基中，在培养箱中在温度37℃的条件下培养16～24h，以相同方式活化培养三代，离心分离，收集菌泥；按照菌泥与生理盐水重量比1：10～16，所述的菌泥用灭菌生理盐水洗涤2～3次，再按照菌泥与无菌水的重量比1：6～10，将洗涤的菌泥重悬于无菌水中，震荡混匀，得到一种活菌数在10⁹cfu/ml以上的浓缩菌液，并用MRS琼脂培养基准确计数浓缩菌液的活菌数；

根据本发明，所述的益生菌选自由内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源库保藏的植物乳杆菌LIP-1、干酪乳杆菌ZHANG、双歧杆菌V9或植物乳杆菌P8。

在本发明中，所述的益生菌是一类“当摄入一定量时能对宿主健康有作用的微生物活体”。

植物乳杆菌(L.plantarum)LIP-1是一株从新疆地区酸马奶样品中分离的乳杆菌，经体外实验证实该菌具有较好的耐酸性和胆盐耐受性以及较强的降胆固醇活性。利用16SrDNA序列同源性分析对该菌进行鉴定，植物乳杆菌在Genbank/EMBL/DDBJ上的序列注册号是EU213062。

干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)ZHANG是从酸马奶中分离得到的耐酸耐胆汁酸的益生菌；干酪乳杆菌ZHANG作为一种益生菌具有优良的益生特性，具有良好的耐酸性、人工肠胃液耐受性及胆盐耐受性，对免疫系统具有显著的调节功能等。

双歧杆菌V9是“乳品生物技术与工程”重点实验室于2005年分离自内蒙古草原上健康儿童肠道中的一株具有优良益生特性的乳双歧杆菌，该菌株在消化系统中具有优异的耐受胃酸、胆碱、肠液能力，具有调节肠道菌群平衡、拮抗体内致病菌、防止腹泻、增强免疫的功能。

植物乳杆菌P8是2005年从内蒙古巴彦淖尔市乌拉特中旗牧民家庭自然发酵酸牛奶中分离的102株植物乳杆菌中筛选出的一株益生性能优异的乳杆菌。它具有免疫调节特性，并已被用于发酵剂和乳制品的工业化生产，及在医学上作为活疫苗提供更广泛的治疗。

当然，本发明也可以使用其它的益生菌，只是它们对所述的益生菌微胶囊及其冻干粉没有任何负面影响或任何不良作用，这些益生菌都可以用于本发明，也都在本发明保护范围之内。

MRS液体培养基制备方法如下：将10g蛋白胨、5g酵母提取粉、10g牛肉膏、2g柠檬酸铵、1ml吐温80、5g乙酸钠、2g磷酸氢二钾、0.58g硫酸镁、0.25g硫酸锰与20g葡萄糖溶于1000ml蒸馏水中，得到的溶液调节至pH值6.2～6.6，在温度121℃灭菌15min，得到所述的MRS培养基。

在1000mLMRS液体培养基中添加15g琼脂所得到的培养基就是MRS琼脂培养基。制备MRS培养基所使用的化学物质都是目前市场上销售的产品。

本发明使用的培养箱是本技术领域通常使用的、在目前市场上销售的产品，例如由SANYO公司生产的CO₂恒温培养箱。本发明在离心分离时使用的离心设备是本技术领域通常使用的、在目前市场上销售的产品，例如由Eppendorf公司生产的5810R离心机。

在本发明中，生理盐水应该理解是在生物技术领域里通常使用的、浓度为以重量计0.8～0.85％的盐水。生理盐水在高压蒸汽灭菌锅中在温度121℃下灭菌15min，并将其微生物含量控制在10²CFU/ml以下的生理盐水称之灭菌生理盐水。菌泥与灭菌生理盐水重量比为1：10～16，如果菌泥与灭菌生理盐水重量比大于1：10，则残留的培养基洗涤不净；如果菌泥与灭菌生理盐水重量比小于1：16，则浪费生理盐水；因此，菌泥与灭菌生理盐水重量比为1：10～16，是合理的，优选地是1：12～14；

在本发明中，蒸馏水在高压蒸汽灭菌锅中在温度121℃下灭菌15min，并将其微生物含量控制在10²CFU/ml以下的水称之无菌水。所述菌泥与无菌水的重量比为1：6～10，如果所述菌泥与无菌水的重量比大于1：6，则得到的菌液浓度过高；如果所述菌泥与无菌水的重量比小于1：10，则得到的菌液浓度过低；因此，所述菌泥与无菌水的重量比为1：6～10是恰当的；优选地是1：7～9。

得到浓缩菌液的活菌数是用MRS琼脂培养基进行准确计数的。MRS琼脂培养基计数具体操作如下：将用灭菌生理盐水梯度稀释的浓缩菌液与MRS琼脂培养基按照体积比1：20～25混匀，然后在温度37℃下培养36～48h，采用平板计数法计数得到，所述浓缩菌液的活菌数为(3～8)×10⁹cfu/ml。

在本发明中，将该浓缩菌液的菌密度控制在(3～8)×10⁹cfu/ml这个范围内的主要目的在于提高包埋率。

B、发酵脱脂乳菌液制备

将32～38重量份脱脂乳粉、0.3～0.7重量份酵母粉与1.2～1.8重量份葡萄糖与补充至总量为100重量份的水制成一种脱脂乳溶液；然后，按照浓缩菌液与脱脂乳溶液的重量比为1.8～2.2：16～20，把步骤A得到的浓缩菌液接种于所述的脱脂乳溶液中，在温度37℃的条件下发酵至90～95°T，得到一种活菌数为10⁹cfu/ml以上的发酵脱脂乳，并用MRS琼脂培养基准确计数发酵脱脂乳的活菌数；

在本发明中，往步骤A得到的浓缩菌液中添加脱脂乳溶液的主要作用在于将微胶囊壁材(脱脂乳溶液)和芯材(浓缩菌液)混合并适度发酵，乳酸菌能利用脱脂乳溶液中的营养物质生长繁殖，菌量升高，并且两者在后续步骤中发生一系列物理化学作用逐步成为微胶囊凝胶颗粒体系。

根据本发明，浓缩菌液与脱脂乳溶液的重量比为1.8～2.2：16～20。浓缩菌液为1.8～2.2时，如果脱脂乳溶液的量小于16，则蛋白质壁材基质不足、其他营养成分不足；如果脱脂乳溶液的量大于20，则浪费脱脂乳；因此，脱脂乳溶液的量为16～20是合适的；脱脂乳溶液为16～20时，如果浓缩菌液的量小于1.8，则包埋率过低；如果浓缩菌液的量大于2.2，则包埋率下降；因此，浓缩菌液的量为1.8～2.2是恰当的。

优选地，脱脂乳溶液与浓缩菌液的重量比是17～19：1.9～2.1。

含促益生菌生长因子的脱脂乳溶液与浓缩菌液混匀后，在37℃的条件下发酵至90～95°T，如果发酵脱脂乳菌液的滴定酸度大于95°T或小于90°T，则不利于后期加入的凝乳酶发挥降解作用；因此，发酵脱脂乳菌液的滴定酸度为90～95°T是恰当的。优选地，发酵脱脂乳菌液的滴定酸度为92～93°T。

得到发酵脱脂乳的活菌数是用MRS琼脂培养基进行准确计数的。MRS琼脂培养基计数具体操作如下：将用灭菌生理盐水梯度稀释的发酵脱脂乳与MRS琼脂培养基按照体积比1：20～25混匀，然后在温度37℃下培养36～48h，采用平板计数法计数得到，所述发酵脱脂乳的活菌数为(1～3)×10⁹cfu/ml。

本发明使用的酵母粉与葡萄糖都是目前市场上销售的产品。

所述的脱脂乳粉是将鲜牛奶脱去脂肪后在进行干燥所得到的产品，除脂肪可降低至1％外，其他组分变化不大。脱脂奶粉为乳白色或淡黄色粉末。本发明使用的脱脂乳粉是目前市场上销售的产品，例如由恒天然有限公司以商品名skimmedmilkpowder销售的产品。

C、水相分离法制备益生菌微胶囊

将步骤B得到的发酵脱脂乳菌液在冰浴中降温至0～4℃，接着加入浓度10～15mg/ml、活力80～120IMCU/ml的凝乳酶，在转速400～600r/min下搅拌0.8～1.2h使酪蛋白充分降解，得到一种降解发酵脱脂乳；按照以毫升计降解发酵脱脂乳与以毫升计氯化钙溶液的比为1：1.0～1.4，往降解发酵脱脂乳中加入浓度为以重量计0.80～1.20％的CaCl₂水溶液，在冰浴中搅拌5～10min，使降解发酵脱脂乳均匀地分散在CaCl₂水溶液中，再转移到水浴中在温度35～45℃下继续搅拌，使Ca²⁺与酪蛋白片段共价交联生成微胶囊颗粒，然后静置，离心分离，收集所述的益生菌微胶囊颗粒；

凝乳酶是一种天门冬氨酸蛋白酶，可专一地切割乳中的κ酪蛋白的Phe105-Met106之间的肽键，破坏酪蛋白胶束使牛奶凝结，凝乳酶的凝乳能力及蛋白水解能力使其成为干酪生产中形成质构和特殊风味的关键性酶。

本发明使用的凝乳酶是目前市场上销售的产品，例如由北京博奥拓达科技有限公司以商品名小牛皱胃酶销售的动物性凝乳酶；由北京博奥拓达科技有限公司以商品名木瓜蛋白酶销售的植物性凝乳酶。

在本发明中，酶活力是指1ml凝乳酶溶液或1g干粉在温度35℃条件下在40分钟内能凝结原奶的毫升数。

本发明使用的凝乳酶酶活力为80～120IMCU/ml，如果其酶活力小于80IMCU/ml，则不能更彻底地降解酪蛋白片段，为微胶囊结构提供足够的壁材，使益生菌不能完全被包被，包埋率降低，影响包埋效果；如果酶活力高于120IMCU/ml，则凝乳酶费用较高，而包埋效果几乎没有提升，则会造成生产成本增加；因此酶活力为80～120IMCU/ml是合理的。

在本发明中，往发酵的脱脂乳菌液中添加凝乳酶的基本目的在于使酪蛋白片段进一步充分降解，以产生大量小分子蛋白片段，丰富微胶囊壁材成分，使微胶囊凝胶网络结构足够致密，从而提高包埋率。

酪蛋白降解是根据SDS-PAGE法检测确定的。

在本发明中，酪蛋白充分降解应该理解是在所述的脱脂乳菌液中酪蛋白含量在以重量计3.1％以下。

在本发明中，往降解发酵脱脂乳中加入氯化钙溶液的主要目的是使Ca²⁺与酪蛋白片段共价交联生成微胶囊颗粒，其基本化学反应过程如下：

αs1酪蛋白片段

αs2酪蛋白片段

Ca²⁺+β酪蛋白片段→微胶囊颗粒

其他被水解的蛋白片段

优选地，所述CaCl₂水溶液的浓度是以重量计0.90～1.00％。

根据本发明，首先，让所述降解发酵脱脂乳菌液与CaCl₂水溶液在冰浴中搅拌混合的目的是使降解发酵脱脂乳菌液均匀地分散在CaCl₂水溶液中；然后在温度35～45℃的水浴中继续搅拌混合的目的是使Ca²⁺与酪蛋白小分子片段共价交联反应生成微胶囊颗粒；

优选地，所述降解发酵脱脂乳菌液与CaCl₂水溶液在冰浴中搅拌混合5～10min，然后在水浴中继续搅拌4～6min。

在这个步骤中，所述的静置是让降解发酵脱脂乳菌液与CaCl₂水溶液体系在温度35～45℃下放置8～12min，以便让Ca²⁺与酪蛋白小分子片段共价交联反应更彻底，使微胶囊凝胶网络结构更致密，同时凝乳酶继续切割已经微胶囊化的酪蛋白凝胶，使微胶囊产品粒径更小，分布更均匀。

D、冷冻干燥

让步骤C得到的微胶囊颗粒置于冰箱中进行预冷冻，接着置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，得到所述的活菌数在10⁹cfu/ml以上的益生菌微胶囊冻干粉，并用MRS琼脂培养基准确计数微胶囊冻干粉的活菌数；

在本发明中，让微胶囊颗粒预冷冻的基本作用是使湿微胶囊中的液态水快速凝固成冰，防止形成较大的冰晶对微胶囊和菌体造成机械伤害，同时便于冷冻干燥过程中，湿微胶囊中的水由冰直接升华从而在真空条件下升华除去，达到干燥的目的，若没有完全冻结，在抽真空时会膨胀起泡，还可能造成干燥不完全(成粘稠状)影响微胶囊的质量和菌的存活。

冰箱是一种为了达到深度冷冻效果的低温冷藏冷冻设备。本发明使用的冰箱是目前市场上销售的产品，例如由海尔公司以商品名超低温冰箱销售的冰箱。

根据本发明，所述的微胶囊颗粒在真空冷冻干燥机中在温度-49～-50℃与真空度-0.01～0.02MPa的条件下冷冻干燥22～24h，以达到使微胶囊干粉的水分含量低于0.01％。

得到的微胶囊冻干粉的活菌数是用MRS琼脂培养基进行准确计数的。MRS琼脂培养基计数具体操作如下：将用灭菌生理盐水梯度稀释的微胶囊冻干粉与MRS琼脂培养基按照体积比1：20～25混匀，然后在温度37℃下培养36～48h，采用平板计数法计数得到，所述微胶囊的干粉的活菌数为(2～6)×10⁹cfu/ml。

真空冷冻干燥机将制冷系统、真空系统、导热油加热系统、排湿系统等组合成一种新型箱体结构，进行真空冷冻干燥。本发明使用的真空冷冻干燥机是目前市场上销售的产品，例如日本SANYO公司以商品名真空冷冻干燥机销售的真空冷冻干燥机。

本发明还涉及所述制备方法制备得到的益生菌微胶囊。

根据肠液释放性实验和平板计数法对本发明益生菌微胶囊进行包埋率测定，具体步骤如下：

称取0.5g本发明制备的益生菌微胶囊(活菌数(1～3)×10⁹cfu/ml)，加入到4.5ml模拟肠液(用NaOH溶液将以重量计0.8～0.85％无菌生理盐水的pH值调节至8.0后，加入0.1％胰蛋白酶，用0.22μm膜进行过滤灭菌)中，在温度37℃下震摇培养120分钟，使菌体完全释放，然后取样、梯度稀释，采用平板计数法进行活菌计数，按照下述公式(1)进行计算，其结果表明本发明益生菌微胶囊中的益生菌包埋率达到85％以上。

ME(％)＝微胶囊中活菌数量/初始活菌数量×100％ (1)

式中：

微胶囊中活菌数量为每克湿微胶囊的含菌量与收集得到的微胶囊总质量的乘积；

初始活菌量为每毫升浓缩菌液的含菌量与加入的浓缩菌液总体积的乘积。

采用扫描电子显微镜(SEM)观测本发明益生菌微胶囊形态。

使用双面胶将益生菌微胶囊粉粘在样品台上，喷金，用扫描电镜观察微胶囊表面结构，观测结果表明，益生菌微胶囊表面结构致密且光滑，粒径较小，分散性好，具体参见附图1。

根据胃酸耐受性实验和平板计数法对本发明益生菌微胶囊进行耐胃酸性检测，具体步骤如下：

取0.5g本发明新制备的益生菌微胶囊(活菌数(1～3)×10⁹cfu/g)，将其分散于4.5ml模拟胃液(用浓盐酸将以重量计0.8～0.85％无菌生理盐水的pH值调节至2.0后，加入0.3％的胃蛋白酶，用0.22μm膜进行过滤灭菌)中，在温度37℃下分别震荡培养2.5h，并每隔30min移取0.5ml样品溶液于模拟肠液中振荡培养2h，使菌体完全释放，从中移取0.5ml进行梯度稀释，采用MRS琼脂培养基倾注培养法进行活菌计数，根据下述公式计算：

G(％)＝培养后的活菌数/为培养前的活菌数×100％

试验结果表明，在模拟胃液中该益生菌微胶囊中的活菌数下降幅度较小，在2.5h后益生菌活菌数仅减少0.27(Log CFU/g)。具体参见附图2。

根据肠液释放性实验和平板计数法对本发明益生菌微胶囊进行肠液释放性检测，具体步骤如下：

称取0.5g本发明益生菌微胶囊(活菌数(1～3)×10⁹cfu/g)，将其分散于4.5mL模拟肠液(与包埋率测定中的相同)由无菌生理盐水、胰蛋白酶(质量分数0.1％)、NaOH组成的模拟肠液，在温度37℃下分别震荡培养2.5h，然后采用平板计数法分别计数，在120min后在益生菌微胶囊中的益生菌被完全释放出来，活菌数达到10⁹cfu/g以上，说明微胶囊产品释放性好，并可以在肠液中有较高的活菌数，具体参见附图3。

根据肠液释放性实验和平板计数法对本发明益生菌微胶囊进行抗冷冻性检测，具体步骤如下：

称取0.5g未冻干益生菌微胶囊(活菌数(1～3)×10⁹cfu/g)与0.5g益生菌微胶囊冻干粉(活菌数(2～6)×10⁹cfu/g)，分别加到4.5ml由无菌生理盐水、胰蛋白酶(质量分数0.1％)、NaOH组成的模拟肠液中，在温度37℃下震荡培养2.0小时，这些益生菌完全释放，采用平板计数法进行菌落计数，按照下述公式计算：

FD(％)＝n/N×m/M×100％

式中：

n为冻干微胶囊的活菌数；

N为未冻干微胶囊的活菌数；

m为冻干微胶囊质量；

M为未冻干微胶囊质量；

试验检测表明，经冷冻干燥后益生菌的存活率为75.0％以上。

根据肠液释放性实验和平板计数法对植物乳杆菌LIP-1(内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源库)益生菌微胶囊冻干粉进行贮藏稳定性检测。

将植物乳杆菌LIP-1益生菌微胶囊冻干粉(活菌数(2～6)×10⁹cfu/g)分别在温度4℃、25℃与37℃下贮存0、7、14、21、28d，每周取样一次，采用平板计数法检测其植物乳杆菌LIP-1的活菌数。结果表明，贮藏28d后，在4℃贮存的益生菌活力仍较高，活菌数大于9(logCFU/g)，具体参见附图4。

这些检测结果表明，本发明益生菌微胶囊具有下述特性：

包埋率：85％以上；

形态特征：粒径70～130μm；

耐胃酸性：在模拟胃液中在2.5h后益生菌活菌数减少0.27(Log CFU/g)以下；

肠液释放性：在模拟肠液中在2.0h后释放益生菌活菌数达到8.720(Log CFU/g)以上；

抗冷冻性：存活率为75％以上；

贮藏稳定性：在温度4℃下贮存28d后，益生菌活菌数为10⁹CFU/g以上，具体参见附图4。

本发明整个制备过程操作简单，条件温和，制得的微胶囊颗粒粒径较小，分散性好，包埋效率高、表面致密、耐受力强、肠溶性好、耐贮藏，解决了传统包埋方法存在的弊端，如乳化法成本高，植物油回收利用难，有脂肪氧化味等。

[有益效果]

本发明的有益效果是：本发明制备方法操作简单，条件温和，成本较低，得到的微胶囊颗粒形态特征良好，表面致密、粒径70～130μm，包埋率达到85％以上，耐胃酸性好、肠液释放性、抗冷冻干燥性和贮藏稳定性均好，从而能够保护益生菌免受不良环境影响，提高益生菌在人体中的健康作用，解决了传统包埋方法存在的弊端。本发明制备益生菌微胶囊及其冻干粉的技术可以广泛应用于食品、生物技术等多个技术领域中。

【附图说明】

图1是本发明益生菌微胶囊的扫描电镜(SEM)图；

图2是本发明益生菌微胶囊的耐胃酸性随时间的变化图；

图3是本发明益生菌微胶囊的肠液释放随时间的变化图；

图4是本发明益生菌微胶囊的耐贮藏性随时间的变化图。

【具体实施方式】

通过下述实施例将能够更好地理解本发明。

实施例1：本发明益生菌微胶囊及其冻干粉的制备

该实施例的实施步骤如下：

A、菌株活化

由内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源库保藏的益生菌植物乳杆菌LIP-1按照以MRS液体培养基计1％接种量接种于MRS液体培养基中，在培养箱中在温度37℃的条件下培养21h，以相同方式活化培养三代，离心分离，收集菌泥；按照菌泥与生理盐水重量比1：10，所述的菌泥用灭菌生理盐水洗涤2次，再按照菌泥与无菌水的重量比1：7，将洗涤菌泥重悬于无菌水中，得到浓缩菌液，震荡混匀，接着采用平板计数法用MRS琼脂培养基准确计数浓缩菌液的活菌数，得到该浓缩菌液的菌密度为3×10⁹cfu/ml；

B、发酵脱脂乳菌液制备

将32重量份脱脂乳粉、0.5重量份酵母粉与1.8重量份葡萄糖与补充至总量为100重量份的水制成一种脱脂乳溶液；然后，按照浓缩菌液与脱脂乳溶液的重量比为2.1：16，把步骤A所述的浓缩菌液接种于脱脂乳溶液中，在温度37℃的条件下发酵至95°T，采用平板计数法用MRS琼脂培养基准确计数发酵脱脂乳的活菌数，得到该发酵脱脂乳菌液的菌密度为1.9×10⁹cfu/ml；

C、水相分离法制备益生菌微胶囊

将步骤B得到的发酵脱脂乳在冰浴中降温至0℃，加入浓度12mg/ml、活力114IMCU/ml的凝乳酶，在磁力搅拌器转速500r/min下搅拌1.0h，使酪蛋白充分降解，得到一种降解发酵脱脂乳；按照以克计降解发酵脱脂乳与以毫升计氯化钙溶液的比为1：1.0，往降解发酵脱脂乳菌液中加入浓度为以重量计0.80％的CaCl₂水溶液，在冰浴中使用磁力搅拌器搅拌8min，使降解发酵脱脂乳菌液均匀地分散在CaCl₂水溶液中，再转移到温度为35℃水浴中继续搅拌5min，使Ca²⁺与酪蛋白片段共价交联生成微胶囊颗粒，然后在温度35℃下放置11min，在转速1400r/min下离心分离，收集所述的益生菌微胶囊颗粒；

D、冷冻干燥

让步骤C得到的微胶囊颗粒置于冰箱中在温度-80℃的条件下冷冻24小时，接着置于真空冷冻干燥机中在温度-50℃与真空度-0.014MPa的条件下冷冻干燥19h，得到所述的益生菌微胶囊冻干粉。采用平板计数法用MRS琼脂培养基准确计数微胶囊冻干粉的活菌数，得到该微胶囊冻干粉的菌密度为4.0×10⁹cfu/ml；

采用本说明书描述的检测方法检测确定，该实施例制备的益生菌微胶囊冻干粉的包埋率为85.8％；平均粒径100μm；耐胃酸性：在模拟胃液中在2.5h后益生菌活菌数减少0.26(Log CFU/g)；肠液释放性：在模拟肠液中在2.0h后释放益生菌活菌数达到8.80(LogCFU/g)；抗冷冻性：存活率为75.9％；贮藏稳定性：在温度4℃下贮存28d后，益生菌活菌数为1.5×10⁹CFU/g。

实施例2：本发明益生菌微胶囊及其冻干粉的制备

该实施例的实施步骤如下：

A、菌株活化

由内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源库保藏的益生菌干酪乳杆菌ZHANG按照以MRS液体培养基计1％接种量接种于MRS液体培养基中，在培养箱中在温度37℃的条件下培养16h，以相同方式活化培养三代，离心分离，收集菌泥；按照菌泥与生理盐水重量比1：12，所述的菌泥用灭菌生理盐水洗涤3次，再按照菌泥与无菌水的重量比1：9，将洗涤菌泥重悬于无菌水中，得到浓缩菌液，震荡混匀，接着采用平板计数法用MRS琼脂培养基准确计数浓缩菌液的活菌数，得到该浓缩菌液的菌密度为5×10⁹cfu/ml；

B、发酵脱脂乳菌液制备

将34重量份脱脂乳粉、0.3重量份酵母粉与1.4重量份葡萄糖与补充至总量为100重量份的水制成一种一种含促益生菌生长因子的脱脂乳溶液；然后，按照浓缩菌液与脱脂乳溶液的重量比为1.8：19，把步骤A所述的浓缩菌液接种于脱脂乳溶液中，在温度37℃的条件下发酵至95°T，采用平板计数法用MRS琼脂培养基准确计数发酵脱脂乳的活菌数，得到该发酵脱脂乳菌液的菌密度为1.2×10⁹cfu/ml；

C、水相分离法制备益生菌微胶囊

将步骤B得到的发酵脱脂乳在冰浴中降温至1℃，加入浓度14mg/ml、活力114IMCU/ml的凝乳酶，在磁力搅拌器转速400r/min下搅拌1.1h，使酪蛋白充分降解，得到一种降解发酵脱脂乳；按照以克计降解发酵脱脂乳与以毫升计氯化钙溶液的比为1：1.4，往降解发酵脱脂乳中加入浓度为以重量计0.90％的CaCl₂水溶液，在冰浴中使用磁力搅拌器搅拌5min，使降解发酵脱脂乳均匀地分散在CaCl₂水溶液中，再转移到温度为38℃水浴中继续搅拌4min，使Ca²⁺与酪蛋白片段共价交联生成微胶囊颗粒，然后在温度45℃下放置8min，在转速1600r/min下离心分离，收集所述的益生菌微胶囊颗粒；

D、冷冻干燥

让步骤C得到的微胶囊颗粒置于冰箱中在温度-80℃的条件下冷冻24小时，接着置于真空冷冻干燥机中在温度-50℃与真空度-0.015MPa的条件下冷冻干燥16h，得到所述的益生菌微胶囊冻干粉。采用平板计数法用MRS琼脂培养基准确计数微胶囊冻干粉的活菌数，得到该微胶囊冻干粉的菌密度为2.6×10⁹cfu/ml；

采用本说明书描述的检测方法检测确定，该实施例制备的益生菌微胶囊冻干粉的包埋率为86.1％；平均粒径104μm；耐胃酸性：在模拟胃液中在2.5h后益生菌活菌数减少0.26(Log CFU/g)；肠液释放性：在模拟肠液中在2.0h后释放益生菌活菌数达到8.820(LogCFU/g)；抗冷冻性：存活率为78％；贮藏稳定性：在温度4℃下贮存28d后，益生菌活菌数为1.9×10⁹CFU/g。

实施例3：本发明益生菌微胶囊及其冻干粉的制备

该实施例的实施步骤如下：

A、菌株活化

由内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源库保藏的益生菌双歧杆菌V9按照以MRS液体培养基计1％接种量接种于MRS液体培养基中，在培养箱中在温度37℃的条件下培养18h，以相同方式活化培养三代，离心分离，收集菌泥；按照菌泥与生理盐水重量比1：14，所述的菌泥用灭菌生理盐水洗涤2次，再按照菌泥与无菌水的重量比1：6，将洗涤菌泥重悬于无菌水中，得到浓缩菌液，震荡混匀，接着采用平板计数法用MRS琼脂培养基准确计数浓缩菌液的活菌数，得到该浓缩菌液的菌密度为8×10⁹cfu/ml；

B、发酵脱脂乳菌液制备

将38重量份脱脂乳粉、0.7重量份酵母粉与1.2重量份葡萄糖与补充至总量为100重量份的水制成一种脱脂乳溶液；然后，按照浓缩菌液与脱脂乳溶液的重量比为2.2：20，把步骤A所述的浓缩菌液接种于脱脂乳溶液中，在温度37℃的条件下发酵至95°T，采用平板计数法用MRS琼脂培养基准确计数发酵脱脂乳的活菌数，得到该发酵脱脂乳菌液的菌密度为1.6×10⁹cfu/ml；

C、水相分离法制备益生菌微胶囊

将步骤B得到的发酵脱脂乳在冰浴中降温至2℃，然后加入浓度13mg/ml、活力120IMCU/ml的凝乳酶，在磁力搅拌器转速600r/min下搅拌1.2h，使酪蛋白充分降解，得到一种降解发酵脱脂乳；按照以克计降解发酵脱脂乳与以毫升计氯化钙溶液的比为1：1.2，往步骤B得到的降解发酵脱脂乳中加入浓度为以重量计1.0％的CaCl₂水溶液，在冰浴中使用磁力搅拌器搅拌10min，使降解发酵脱脂乳均匀地分散在CaCl₂水溶液中，再转移到温度为45℃水浴中继续搅拌6min，使Ca²⁺与酪蛋白片段共价交联生成微胶囊颗粒，然后在温度42℃下放置12min，在转速1800r/min下离心分离，收集所述的益生菌微胶囊颗粒；

D、冷冻干燥

让步骤C得到的微胶囊颗粒置于冰箱中在温度-80℃的条件下冷冻24小时，接着置于真空冷冻干燥机中在温度-50℃与真空度-0.012MPa的条件下冷冻干燥18h，得到所述的益生菌微胶囊冻干粉。采用平板计数法用MRS琼脂培养基准确计数微胶囊冻干粉的活菌数，得到该微胶囊冻干粉的菌密度为3.3×10⁹cfu/ml；

采用本说明书描述的检测方法检测确定，该实施例制备的益生菌微胶囊冻干粉的包埋率为85％；粒径92μm；耐胃酸性：在模拟胃液中在2.5h后益生菌活菌数减少0.25(LogCFU/g)；肠液释放性：在模拟肠液中在2.0h后释放益生菌活菌数达到8.80(Log CFU/g)；抗冷冻性：存活率为79.1％；贮藏稳定性：在温度4℃下贮存28d后，益生菌活菌数为1.9×10⁹CFU/g。

实施例4：本发明益生菌微胶囊及其冻干粉的制备

该实施例的实施步骤如下：

A、菌株活化

由内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源库保藏的益生菌植物乳杆菌P8按照以MRS液体培养基计1％接种量接种于MRS液体培养基中，在培养箱中在温度37℃的条件下培养24h，以相同方式活化培养三代，离心分离，收集菌泥；按照菌泥与生理盐水重量比1：16，将所述菌泥用灭菌生理盐水洗涤3次，再按照菌泥与无菌水的重量比1：10，将洗涤菌泥重悬于无菌水中，得到浓缩菌液，震荡混匀，接着采用平板计数法用MRS琼脂培养基准确计数浓缩菌液的活菌数，得到该浓缩菌液的菌密度为6×10⁸cfu/ml；

B、发酵脱脂乳菌液制备

将36重量份脱脂乳粉、0.4重量份酵母粉与1.6重量份葡萄糖与补充至总量为100重量份的水制成一种含促益生菌生长因子的脱脂乳溶液；然后，按照浓缩菌液与脱脂乳溶液的重量比为2.0：17，把步骤A所述的浓缩菌液接种于脱脂乳溶液中，在温度37℃的条件下发酵至95°T，采用平板计数法用MRS琼脂培养基准确计数发酵脱脂乳的活菌数，得到该发酵脱脂乳菌液的活菌数为1.8×10⁹cfu/ml；

C、水相分离法制备益生菌微胶囊

将步骤B得到的发酵脱脂乳在冰浴中降温至3℃，加入浓度10mg/ml、活力114IMCU/ml的凝乳酶，在磁力搅拌器转速450r/min下搅拌1.0h，使酪蛋白充分降解，得到一种降解发酵脱脂乳；按照以克计降解发酵脱脂乳与以毫升计氯化钙溶液的比为1：1.3，往降解发酵脱脂乳中加入浓度为以重量计1.1％的CaCl₂水溶液，在冰浴中使用磁力搅拌器搅拌6min，使降解发酵脱脂乳菌液均匀地分散在CaCl₂水溶液中，再转移到温度为42℃水浴中继续搅拌5min，使Ca²⁺与酪蛋白片段共价交联生成微胶囊颗粒，然后在温度38℃下放置10min，在转速1500r/min下离心分离，收集所述的益生菌微胶囊颗粒；

D、冷冻干燥

让步骤C得到的微胶囊颗粒置于冰箱中在温度-80℃的条件下冷冻24小时，接着置于真空冷冻干燥机中在温度-50℃与真空度-0.020MPa的条件下冷冻干燥20h，得到所述的益生菌微胶囊冻干粉。采用平板计数法用MRS琼脂培养基准确计数微胶囊冻干粉的活菌数，得到该微胶囊冻干粉的菌密度为3.8×10⁹cfu/ml；

采用本说明书描述的检测方法检测确定，该实施例制备的益生菌微胶囊冻干粉的包埋率为88.1％；粒径85μm；耐胃酸性：在模拟胃液中在2.5h后益生菌活菌数减少0.26(LogCFU/g)；肠液释放性：在模拟肠液中在2.0h后释放益生菌活菌数达到8.780(Log CFU/g)；抗冷冻性：存活率为77.4％；贮藏稳定性：在温度4℃下贮存28d后，益生菌活菌数为1.4×10⁹CFU/g。

Claims (10)

1.一种采用水相分离法制备益生菌微胶囊冻干粉的方法，其特征在于该方法的步骤如下：

A、菌株活化

将选用的益生菌按照以MRS液体培养基计1～3％接种量接种于MRS液体培养基中，在培养箱中在温度37℃的条件下培养16～24h，以相同方式活化培养三代，离心分离，收集菌泥；按照菌泥与生理盐水重量比1：10～16，所述的菌泥用灭菌生理盐水洗涤2～3次，再按照菌泥与无菌水的重量比1：6～10，将洗涤的菌泥重悬于无菌水中，震荡混匀，得到一种活菌数在10⁹cfu/ml以上的浓缩菌液，并用MRS琼脂培养基准确计数浓缩菌液的活菌数

B、发酵脱脂乳制备

将32～38重量份脱脂乳粉、0.3～0.7重量份酵母粉与1.2～1.8重量份葡萄糖与补充至总量为100重量份的水制成一种脱脂乳溶液；然后，按照浓缩菌液与脱脂乳溶液的重量比为1.8～2.2：16～20，把步骤A得到的浓缩菌液接种于所述的脱脂乳溶液中，在温度37℃的条件下发酵至90～95°T，得到一种活菌数为10⁹cfu/ml以上的发酵脱脂乳，并用MRS琼脂培养基准确计数发酵脱脂乳的活菌数；

C、水相分离法制备益生菌微胶囊

将步骤B得到的发酵脱脂乳在冰浴中降温至0～4℃，接着加入浓度10～15mg/ml、活力80～120IMCU/ml的凝乳酶，在转速400～600r/min下搅拌0.8～1.2h使酪蛋白充分降解，得到一种降解发酵脱脂乳；按照以毫升计降解发酵脱脂乳与以毫升计氯化钙溶液的比为1：1.0～1.4，往降解发酵脱脂乳中加入浓度为以重量计0.80～1.20％的CaCl₂水溶液，在冰浴中搅拌5～10min，使降解发酵脱脂乳均匀地分散在CaCl₂水溶液中，再转移到水浴中在温度35～45℃下继续搅拌，使Ca²⁺与酪蛋白片段共价交联生成微胶囊颗粒，然后静置，离心分离，收集所述的益生菌微胶囊颗粒；

D、冷冻干燥

让步骤C得到的微胶囊颗粒置于冰箱中进行预冷冻，接着置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，得到所述的活菌数在10⁹cfu/ml以上的益生菌微胶囊冻干粉，并用MRS琼脂培养基准确计数微胶囊冻干粉的活菌数。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤A中，所述的益生菌是植物乳杆菌LIP-1、干酪乳杆菌ZHANG、双歧杆菌V9或植物乳杆菌P8。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤A中，所述菌泥与生理盐水的重量比是1：12～14；所述菌泥与无菌水的重量比是1：7～9。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤B中，浓缩菌液与脱脂乳溶液的重量比是1.9～2.1：17～19，将脱脂乳与浓缩菌液混合液适度发酵后得到的发酵脱脂乳的滴定酸度为92～93°T。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤C中，所述CaCl₂水溶液的浓度是以重量计0.90～1.0％。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤C中，所述的降解发酵脱脂乳与CaCl₂水溶液在冰浴中搅拌混合5～10min，然后在水浴中继续搅拌4～6min。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤C中，所述的静置是在温度35～45℃下放置8～12min；所述的离心分离是在转速1400～1800r/min的条件下进行的。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤D中，所述的微胶囊颗粒先在冰箱中在温度-79～-82℃下预冷冻22～24h，然后在真空冷冻干燥机中在温度-49～-50℃与真空度-0.01～0.02MPa的条件下冷冻干燥22～24h。

9.根据权利要求1-8中任一项权利要求所述制备方法制备得到的益生菌微胶囊冻干粉。

10.根据权利要求10所述的益生菌微胶囊冻干粉，其特征在于它具有下述特性：

包埋率：85％以上；

形态特征：粒径70～130μm；

耐胃酸性：在模拟胃液中在2.5h后益生菌活菌数减少0.27(Log CFU/g)以下；

肠液释放性：在模拟肠液中在2.0h后释放益生菌活菌数达到8.720(Log CFU/g)以上；

抗冷冻性：存活率为75％以上；

贮藏稳定性：在温度4℃下贮存28d后，益生菌活菌数为10⁹CFU/g以上。