CN103154235B - 乳杆菌属菌株的免疫调节性质的改善 - Google Patents

乳杆菌属菌株的免疫调节性质的改善 Download PDF

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Abstract

本发明提供了使用具有特定伯碳源的生长培养基来改善乳杆菌属菌株的免疫调节性质的特定方法，包括通过使用特定的生长条件提高非致病的抗炎细菌菌株的抗炎效果的方法。

Description

乳杆菌属菌株的免疫调节性质的改善
技术领域
本发明涉及通过使用特定生长条件来提高乳杆菌属物种的某些细菌菌株的免疫调节效果例如抗炎效果的方法、产品制剂、产品，以及为在宿主中的免疫调节目的使用这样的细菌的方法，例如有引发炎症的病原体所引起的炎症的治疗和预防。
背景技术
联合国粮农组织将益生菌定义为“以适当数量施用时为宿主赋予健康效益的活的微生物”。现今，许多种不同的细菌被用作益生菌，例如，产乳酸细菌，例如乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacteria)的菌株。
益生元(prebiotics)被定义为“通过选择性地刺激结肠中一种或有限几种细菌的生长和/或活性来有益地影响宿主、可以改善宿主健康的不可消化的食物成分”。益生元的靶点通常是双歧杆菌和乳酸杆菌。然而，益生元的选择性不总是完全确定的，因此，可能难以实现单独对有益菌种的刺激。为了减轻益生菌和益生元方法的局限性，可以作为一种溶液来以合生素(synbiotic)的形式组合这两者。
合生素由Gibson和Roberfroid(1995)在十余年前定义为“益生菌和益生元的混合物，其通过改善胃肠道(GT)中活的微生物食物增补剂的存活和植入来有益地影响宿主”。益生元应当是益生菌的一种特定基质，能够刺激它的生长和/或活性，同时增强本地的有益细菌。
产乳酸细菌不仅因为它们对人类或动物健康的有益效果而被使用，它们还在食品工业中广泛地用于发酵过程。益生菌的有效性是菌株特异性的，每种菌株可能通过不同的机制有助于宿主健康。益生菌可以阻止或抑制病原体的增殖，抑制病原体的毒力因子的产生，或调节前炎症性或抗炎性途径中的免疫反应。对于婴儿急腹痛、湿疹的减轻、疾病的急性发作的降低、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)感染的抑制，使用益生菌产乳酸细菌罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)的不同菌株是一种有前景的疗法。罗伊氏乳杆菌被认为是人胃肠道的本地微生物，存在于胃体、胃窦、十二指肠和回肠的粘膜上。参见，例如，美国专利No.5,439,678、5,458,875、5,534,253、5,837,238和5,849,289。当罗伊氏乳杆菌细胞在存在甘油的厌氧条件下生长时，它们产生称为罗伊氏菌素(β-羟基丙醛)的抗微生物物质。
单核细胞离开骨髓并穿过外周血管，直到它们到达胃肠道的粘膜/浆膜。这些推测的巨噬细胞对于调节免疫系统所必需的信号的相互作用和增殖是关键的。例如在胃肠道中，在粘膜上皮的巨噬细胞与肠腔中和附着于肠粘膜的细菌间存在稳定水平的免疫反应。在正常状态下，这种反应涉及细胞因子信号的产生，以限制和包含不必要的炎性反应。然而，当病原体或毒素被呈递给这些细胞时，它们形成第一线的防御，并通过产生提高数量的前炎症性细胞因子来反应，这提高了炎性反应直到威胁被去除。与共生(非威胁)细菌的相互作用有关的细胞因子以及涉及对病原体的完全炎性反应的那些细胞因子的产生，经受了乳酸细菌本身(包括表面抗原)、或这些乳酸细菌产生的物质的干涉，明显的是，共生的菌群具有与粘膜的巨噬细胞的广泛相互作用，以维持对肠道菌群的平衡反应，从而维持最佳的健康状态。
业已知道，各种病原体可能在例如胃肠道中导致炎症。这样的炎症，例如，在胃和胃肠道中，受到称为细胞因子的细胞间的信号蛋白质的介导，其由上皮中的巨噬细胞和树突状细胞响应于例如病原体产生的抗原刺激而产生。在上皮与病原体的抗原或它产生的内毒素例如脂多糖(LPS)之间接触时，上皮中的抗原递呈细胞(包括树突状细胞)增大了给天然巨噬细胞的信号，其然后以所谓的Th-1型应答来响应，此时包括TNFα、IL-1、IL-6、IL-12的前炎症性细胞因子有巨噬细胞产生。这些细胞因子随后刺激天然杀伤细胞、T-细胞和其他细胞来产生干扰素γ(IFNγ)，它是炎症的关键介体。IFNγ引起炎性反应和如上所述导致细胞毒性的反应的提高。天然巨噬细胞也可以以Th-2型应答响应抗原。这种应答受到IFNγ的抑制。这些Th-2型细胞产生抗炎性细胞因子，例如IL-4、IL-5、IL-9和IL-10。
已知IL-10抑制IFNγ的产生，因而抑制免疫反应。Th-1和Th-2型细胞之间的平衡以及它们的相应细胞因子的产生限定了对给定抗原的炎症应答的程度。Th-2型细胞也可以通过免疫系统刺激免疫球蛋白的产生。在具有降低的TNFα水平的胃肠道中的抗炎症活性与增强的上皮细胞(肠道壁内层完整性)相关，因而，相关于胃肠病原体和毒素引起的负面作用的降低。
炎症可能涉及哺乳动物的几种疾病，体表的，例如，在皮肤和眼睛上的体内的，例如在各种粘膜上，在口腔、胃肠(GI)道、阴道等中以及在肌肉、骨-关节、心血管器官和组织，包括血管和脑组织中等等。在GI道中，存在着几种与炎症相关的疾病，例如，胃炎、溃疡和炎症性肠病(IBD)。疾病已经与肠微生物群落的不平衡、以及对正常的肠菌群成分的过度表达的炎症反应相关联，这种反应当前用一系列的药物治疗很少成功，其中一种是基于抗-TNFα疗法，被设计以降低胃肠粘膜中的TNFα的水平。还有与炎症相关的几种其他疾病，例如，齿龈炎、阴道炎、动脉粥样硬化和和各种癌症形式，它们被认为与身体不同位置中微生物群落的组成相关。
对于上述想到的抗-TNFα疗法的缺点，非常令人惊讶的是，本发明的发明人在此揭示了将作为唯一碳源的葡萄糖替换蔗糖用于罗伊氏乳杆菌的特定抗炎性菌株在合成培养基中的生长，显著地抑制了LPS-刺激的巨噬细胞中的TNFα产生。因而，用限定的碳源例如葡萄糖来生长特定的抗炎性乳杆菌属菌株，产生了提供具有更强抗炎性质的罗伊氏乳杆菌抗炎菌株的机会。
根据此处的本发明可以理解的是，前炎症性细菌菌株也可以通过修改细菌生长用的碳源来修改它们的免疫调节性质。
如上文提及的，抗炎活性已经与各种乳杆菌相关联，例如，美国专利No.7,105,336B2描述了乳杆菌属菌株，利用对于TNFα活性的小鼠巨噬细胞分析，筛选了它们降低哺乳动物中与幽门螺杆菌感染相关的胃肠炎症的能力。提及罗伊氏乳杆菌的抗炎活性的另一个专利申请是US2008/0254011A1，其描述了乳酸细菌的菌株，筛选了它们提高BSH活性、因而降低血清LDL-胆固醇、同时降低前炎症性细胞因子TNF-α水平的能力，用于心血管疾病的治疗。
US2006/0233775A1描述了乳酸细菌菌株的选择，筛选了它们降低炎症，例如，肠疾病的能力。然而，上述发明都没有提及碳源的选择对于TNFα生产的降低的重要性。
通过不同糖类的选择来调节乳杆菌属物种的其他不同活性是本领域已知的。例如，Avila等(2009)显示了生长条件对于α-L-鼠李糖苷酶的调节是重要的，通过添加葡萄糖，活性被减量调节。
Arskold等(2008)研究了在葡萄糖和蔗糖上的生长行为。显示的是，糖类来源的选择明显地影响罗伊氏乳杆菌ATCC55730的生长性能。在蔗糖上的生长产生了高生长速度和合适的生物量产量，而使用葡萄糖的生长的特点是最大的比生长速率和低ATP水平。
然而，迄今为止没有人揭示生长培养基中的特定碳源可以调节TNFα的产生。因而本发明的一个目的是增强罗伊氏乳杆菌的已经为抗炎性的菌株的抗炎作用，例如其通过宿主中降低的TNFα生产所显示的。本发明的进一步的目的是提供含有所述菌株的产品，包括用于向人施用的、用于炎症引发病原体所引起的炎症的治疗或预防的试剂，包括其中生长所述菌株的条件培养基，以及含有蛋白质的其提取物。
本发明的另一个目的是提供含有所述菌株以及特定碳源的产品，以成为合益素(synbiotic)产品。本发明的进一步的目标是提供特定的碳源，例如，糖类，用于已经定殖了乳酸细菌的抗炎菌株的个体消费。
根据以下的公开内容和附随的权利要求，其他目的和优点将更为显而易见。
发明内容
本发明在此提供了使用具有特定碳源的生长培养基来改善乳酸细菌菌株的免疫调节性质的特定方法，包括通过使用特定的生长条件提高非致病抗炎细菌菌株的抗炎效果的方法。
本发明的基本目的是通过使用特定的生长条件来提高乳酸细菌的某些细菌菌株在哺乳动物中的免疫调节效果。
另一个目的是通过选择生长培养基中碳源来增强罗伊氏乳杆菌的抗炎菌株的抗炎效果。
本发明的另一个目的是，与在生长培养基中作为基础碳源的葡萄糖、乳糖、果糖、淀粉、1，2-丙二醇或益生元例如低聚果糖一起，增强抗炎的罗伊氏乳杆菌菌株在哺乳动物中的抗炎效果，表现为降低的TNFα产生。
本发明的进一步的目的是提供含有所述菌株的产品。
本发明的另一个目的是提供含有与特定碳源一起的所述菌株的产品，以获得合生产品。
本发明的另一个目的是向已经定殖了罗伊氏乳杆菌的抗炎菌株的个体这样地提供特定的碳源，从而它们在胃肠道中是不可消化的，例如益生元。
因而本发明提供了通过将乳酸细菌在特定碳源上生长来增强它们的免疫调节效果的方法。在一个实施方式中，所述方法包括增强抗炎乳酸细菌的抗炎效果，包括在包含特定碳源的培养基中生长所述乳酸细菌，所述碳源选自由葡萄糖、乳糖、果糖、淀粉和1，2-丙二醇构成的组。在优选的实施方式中，在包含特定碳源的培养基中生长的抗炎乳酸细菌由罗伊氏乳杆菌的抗炎菌株组成。更优选的，所述罗伊氏乳杆菌菌株是ATCCPTA6475或ATCCPTA5289。
本发明还提供了通过上述方法生产的产品。在一个实施方式中，所述产品用于疾病的治疗，例如，用于个体中炎症的降低。
本发明进一步提供了抑制患者中的TNFα产生的方法，包括(a)在包含碳源的培养基中生长罗伊氏乳杆菌的抗炎菌株，所述碳源选自由葡萄糖、乳糖、果糖、淀粉和1，2-丙二醇构成的组；(b)将步骤(a)中生长的菌株添加到将要口服给与所述患者的产品中；和(c)施用所述产品以降低所述患者中的炎症。
本发明进一步提供了用于在个体中抑制TNFα产生和/或降低炎症的产品，所述产品包含与特定碳源一起的抗炎乳酸细菌菌株，所述碳源选自由葡萄糖、乳糖、果糖、淀粉和1，2-丙二醇构成的组。
在一个实施方式中，所述特定碳源是密封的。
在所述产品中，所述抗炎乳酸细菌菌株优选地是抗炎的罗伊氏乳杆菌菌株，更优选的，所述罗伊氏乳杆菌菌株是ATCCPTA6475或ATCCPTA5289。
本发明还提供了适合于口服给药的药物组合物，其包含如上所述的产品，任选地进一步包含药学上可接受的赋形剂。
本发明的其他目的和优点对于读者将变得显而易见，希望的是这些目的和优点处在本发明的范围之内。
附图说明
图1显示了在作为唯一碳源的不同糖类中生长罗伊氏乳杆菌ATCC5289的条件培养基如何影响TNFα抑制作用的示意图。
图2显示了如果用蔗糖替代葡萄糖(在LDMIII培养基中)罗伊氏乳杆菌条件培养基如何提高TNF-α产生的示意图。
图3显示了用不同的碳源生长的罗伊氏乳杆菌DSM17938和ATCCPTA6475的条件培养基如何影响TNF-α抑制作用的示意图。
图4显示了与罗伊氏乳杆菌一起的不同的碳源能够抑制TNFα生产、(+)表示TNFα生产的抑制作用的表格。
发明详细说明
罗伊氏乳杆菌是天然地存在于人和动物的肠内的异型发酵型乳酸细菌物种。特定的益生的罗伊氏乳杆菌菌株有力地抑制人TNFα产生，而其他益生的罗伊氏乳杆菌菌株增强人TNFα产生。
为了显示用不同的碳源生长的罗伊氏乳杆菌的抗炎菌株如何影响TNFα产生，罗伊氏乳杆菌(ATCC5289)在具有作为唯一碳源的不同糖的所确定的培养基中厌氧地生长直到晚期稳定期。令人惊讶地，与在蔗糖上生长相比，在作为碳源的葡萄糖上生长显著地降低了TNF-α产生。结果在附图1中显示。
进行研究来鉴定在罗伊氏乳杆菌的不同菌株的生长培养基中葡萄糖和蔗糖如何影响TNF-α生产。已知为TNF抑制性的(ATCCPTA6475和ATCCPTA5289)或TNF刺激性的(ATCC55730和CF483A)罗伊氏乳杆菌的菌株在具有作为唯一碳源的葡萄糖或蔗糖的所确定的培养基中厌氧地生长直到晚期稳定期(24-48小时)。这些结果显示了，与在葡萄糖上生长相比，在例如菌株罗伊氏乳杆菌ATCCPTA-6475和罗伊氏乳杆菌ATCCPTA-5289中使用蔗糖作为基础碳生长显著地提高了人细胞中LPS-刺激的TNF-α的产生。
图2中显示的结果也引出了一种思想，通过生长培养基来影响例如罗伊氏乳杆菌的前炎症性菌株的可能性，即，使得它们更具炎症性。提高的炎症性质在某些疾病状态，例如癌症或过敏预防方面可能是有用的。
还研究了其他碳源的作用。罗伊氏乳杆菌(ATCCPTA6475，DSM17938)在具有作为唯一碳源的葡萄糖、1，2-丙二醇或淀粉的所确定的培养基中厌氧地生长直到晚期稳定期。这些结果显示了，当在作为唯一碳源的1，2-丙二醇或淀粉上生长时，DSM17938变为TNF抑制性的，对所有三种碳源ATCCPTA6475显示了相似的结果(图3)。
进一步的，当罗伊氏乳杆菌在具有作为唯一碳源的乳糖或果糖的所确定的培养基中生长时，也看到了这种提高的TNF抑制效果(数据未显示)。
在具有葡萄糖、乳糖、果糖、淀粉或1，2-丙二醇的所确定的培养基中生长，能够降低TNFα产生的罗伊氏乳杆菌的菌株包括但不限于ATCCPTA6475、ATCCPTA5289、ATCC4659、JCM1112和DSM20016。使得罗伊氏乳杆菌降低TNFα生产的碳源列表见附图4。
含有能够降低TNF-α生产的菌株或条件培养基的产品可以在冻干后补充特定碳源，例如葡萄糖，以获得合生的产品。
与乳酸细菌一起能够降低TNFα生产的碳源优选地是，但不限于葡萄糖、乳糖、果糖、淀粉、1，2-丙二醇或益生元例如具有不同聚合度的低聚果糖，例如，Synergy1(低聚果糖和菊粉的混合物，Orafti)。
产品优选地被配制为、但不限于片剂或胶囊剂。
所述碳源这样地整合到产品中，从而它不会在胃肠道中被消化，例如，在与选定的乳杆菌属菌株一起整合到片剂或胶囊剂中之前葡萄糖可以单独地密封在微囊中，这是本领域已知的。
特定的碳源，例如密封的葡萄糖，可以被已知已经定殖了抗炎性菌株例如罗伊氏乳杆菌的个体消费。
由于许多修改和改变对于本领域技术人员将是容易想到的，不希望将本发明限制到所显示和描述的确切结构和操作，因而，所有适合的修改和等效物都诉求落入本发明的范围。
实施例1
用不同的糖源生长的罗伊氏乳杆菌ATCC5289的条件培养基影响TNFα抑制作用
THP-1细胞与来自罗伊氏乳杆菌ATCC5289的生长的条件培养基(CM)一起孵育。条件培养基是来自在补充有作为唯一碳源的一种特定的糖的LDMIII(S.JonesandJ.Versalovic，BMCMicrobiol.2009；9：35)中培养罗伊氏乳杆菌ATCC5289的24小时培养物的无细胞上清液。在3.5小时孵育期间，THP-1细胞用对照培养基或E.coli衍生的LPS(其引起正常的炎性反应中TNFα的产生)或PCK刺激，之后除去细胞，如本领域已知的使用ELISA技术分析上清液的TNFα水平。
材料和方法：
关键试剂、细菌菌株和哺乳动物细胞系
罗伊氏乳杆菌菌株在具有唯一糖源(对于LMD培养基成分，参见下文的使用的糖源的列表)的deMan、Rogosa、Sharpe(MRS；Difco，FranklinLakes，NJ)或LDMIII(pH6.5)中生长。补充有10％CO2、10％H2和80％N2的混合物的厌氧室(1025AnaerobicSystem，FormaScientific，Waltham，MA)用于乳杆菌的厌氧培养。
BiogaiaAB(Raleigh，NC)提供了罗伊氏乳杆菌菌株ATCCPTA5289。THP-1细胞(ATCCTIB-202)维持在37℃和5％CO2下补充有10％胎儿牛血清(Invitrogen，Carlsbad，CA)的RPMI1640中。除非另有说明，所有化学试剂获自Sigma-Aldrich(StLouis，MO)。用于生物膜和组织培养研究的聚苯乙烯96孔和24孔平板获自Corning(Corning，NY)。具有聚偏二氟乙烯膜(0.22μm孔径大小)的滤器(Millipore，Bedford，MA)用于灭菌。
LDMIII培养基中使用的糖源：
●D-葡萄糖(G8270，＞99.5％葡萄糖，Sigma)
●蔗糖(S9378，99.9％蔗糖，Sigma)
●D-半乳糖(G0750，＞99％半乳糖，Sigma)
●棉子糖(R0260，＞98％棉子糖，Sigma)
●低聚果糖，Raftilose，(OraftiP95，平均聚合度＝11，92％低聚果糖，8％葡萄糖、果糖和蔗糖，BeneoOrafti)
●低聚果糖和菊粉的1∶1混合物(OraftiSynergy1，92％低聚果糖和菊粉，8％葡萄糖、果糖和蔗糖，BeneoOrafti)
用于免疫调节研究的来自罗伊氏乳杆菌培养物的无细胞上清液的制备
对于免疫调节研究，具有唯一碳源的10mL的LDMIII用罗伊氏乳杆菌培养物接种(在MRS肉汤中过夜生长16-18小时)并调节到OD600＝0.1。细菌然后在厌氧条件中在37℃孵育24小时。测量最终的OD600，对所有的样品，LDM稀释到相同的OD，以考虑不同的糖类源的可能的生长变异。细胞进行丸粒化(4000×g，RT，10分钟)并丢弃。上清液进行过滤消毒(0.22μm孔径大小)。将等分量真空干燥，使用RPMI重悬浮到原始体积。
TNF抑制实验
如早先描述的(Linetal，2008)，罗伊氏乳杆菌浮游生细胞(5％v/v)和E.coli0127：B8LPS(100ng/ml)的上清液添加给人THP-1细胞(大约5×104个细胞)。平板在37℃和5％CO2下孵育3.5小时。THP-1细胞进行丸粒化(1500×g，5分钟，4℃)，通过定量ELISA(R&DSystems，Minneapolis，MN)测定单核细胞上清液中的TNF数量。RPMI和培养基都用作对照(一般RPMI95％和培养基＝LDM5％)。
结果
在3.5小时孵育期期间，在存在1)Synergyl(BENEO-OraftiInc.2740Route10WestMorrisPlains，NJ07950，USA)；2)葡萄糖；3)Raftilose；4)半乳糖；5)棉子糖；和6)蔗糖的情况下添加LPS到THP-1细胞中，分别导致1)145.3pg/mlTNFα；2)104.3pg/mlTNFα，3)204.3pg/mlTNFα，4)260pg/mlTNFα，5)517.8pg/mlTNFα和5)347.9pg/mlTNFα的产生。作为CM添加物的对照，添加生长培养基(RPMI和LDM)分别导致396和352pg/mlTNFα产生。结果显示，与RPMI和LDM对照相比，作为唯一碳源的葡萄糖和/或Synergyl抑制了TNFα产生超过50％。当用蔗糖或棉子糖生长菌株时不是这样。结果在附图1中显示。也尝试了没有菌株单独的每种糖的LDM+，以确定糖不直接对TNF响应的改变负责(结果未显示)。
实施例2
用不同的糖源生长的对TNF抑制性(ATCCPTA6475和ATCCPTA5289)或INF刺激性(ATCC55730和CF483A)的罗伊氏乳杆菌的菌株的条件培养基影响TNFα抑制作用
THP-1细胞与条件培养基(CM)一起孵育，所述条件培养基来自用葡萄糖生长的选定罗伊氏乳杆菌菌株，罗伊氏乳杆菌ATCCPTA-6475、罗伊氏乳杆菌ATCCPTA-5289、罗伊氏乳杆菌ATCC55730和罗伊氏乳杆菌菌株CF48-3A，以及用蔗糖生长的相同菌株。在3.5小时孵育期间，THP-1细胞用对照培养基(LDMIII)或E.coli衍生的LPS刺激，此后除去细胞，利用ELISA技术分析上清液的TNFα水平。分别具有葡萄糖和蔗糖的LDMIII用作对照。
材料和方法如实施例1。
结果
结果显示(参见附图2)，如果在LDMIII中用蔗糖代替葡萄糖，两种抗炎菌株罗伊氏乳杆菌ATCCPTA-6475和罗伊氏乳杆菌ATCCPTA-5289的罗伊氏乳杆菌条件培养基提高了TNF-α生产。
实施例3
在作为唯一碳源的葡萄糖中生长的罗伊氏乳杆菌ATCCPTA-5289的条件培养基的制剂
使用实施例1中的方法，选择了来自一种有效的TNF-α降低菌株的条件培养基，在这个实施例中，是来自用作为唯一碳源的葡萄糖生长的罗伊氏乳杆菌ATCCPTA-5289的培养基。通过在deMan，Rogosa，Sharpe(MRS)(Difco，Sparks，MD)中生长菌株来大规模产生这种培养基。乳杆菌的过夜培养物稀释到OD600为1.0(代表约109个细胞/ml)，进一步1∶10稀释，另外生长24h。通过在8500rpm4℃离心10分钟采集无细菌细胞的条件培养基。从细胞丸粒分离条件培养基，然后通过0.22μm微孔过滤装置(Millipore，Bedford，Mass.)过滤。然后使用标准方法冻干并配制条件培养基，来制作片剂。
实施例4
在冻干后补充葡萄糖的，以标准方式冻干的罗伊氏乳杆菌ATCCPTA-5289粉末的制剂
发酵培养基组成：
葡萄糖单水化物60g/l
酵母提取物KAV20g/l
PS型蛋白胨(猪来源的)20g/l
柠檬酸氢二氨5g/l
乙酸钠(×3H2O)4.7g/l
磷酸氢二钾2g/l
Tween800.5g/l
Silibione(抗泡沫)0.14g/l
硫酸镁0.10g/l
硫酸锰0.03g/l
硫酸锌七水化物0.01g/l
水适量
离心介质
蛋白胨0-24Orthana(猪来源的)
防冻剂；
乳糖(牛来源的)33％
明胶水解产物(牛来源的)22％
谷氨酸钠22％
麦芽糊精11％
抗坏血酸11％
冻干的乳酸细菌粉剂的生产步骤
1、20ml的培养基用来自工作细胞库小瓶的0.6ml冻干的乳酸细菌粉剂接种。没有搅动或pH值控制，即静态地在37℃在瓶子中进行发酵18-20小时。
2、两个1升烧瓶的培养基用每升9ml细胞浆液来接种。没有搅动或pH值控制，即静态地在37℃在瓶子中进行发酵20-22小时。
3、来自步骤no.2的两个1升细胞浆液接种到600升器皿中。搅动和pH控制地在37℃进行发酵13小时。发酵开始时pH值是6.5。当pH值降至低于5.4，利用20％氢氧化钠溶液开始pH值控制。pH值控制设置到pH5.5。
4、第四和和最终的发酵步骤在来自步骤no.3的细胞浆液接种到的15000升器皿中进行。搅动和pH值控制地在37℃进行发酵9到12小时。发酵开始时pH值是6.5。当pH值降至低于5.4，利用20％氢氧化钠溶液开始pH值控制。pH值控制设置到pH5.5。当培养物到达稳定期，发酵完成，稳定期可以通过氢氧化钠溶液添加的减少来看出。在发酵期间，大约930升的氢氧化钠溶液添加到10200升的培养基和600升的接种物中。
5、来自最终发酵的细胞浆液在来自AlfaLaval的连续离心机中10℃分离两次。在首次离心之后，细胞浆液的体积从约11730升降低到1200升。这个体积在3000升器皿中用1200升蛋白胨(Peptone0-24，Orthana)溶液洗涤，在与防冻剂混合前再次分离。进行蛋白胨的洗涤步骤来避免冻干过程中任何凝固点的降低。
6、在第二次离心之后，细胞浆液的体积降低到495升。这个体积与156kg的防冻剂溶液混合，达到大约650升的细胞浆液。
7、细胞浆液泵送到1000升器皿中。该器皿然后转运到冻干厂。
8、在冻干厂，精确地2升的细胞浆液倾倒在冰冻干燥器的每个平板上。冰冻干燥器的最大能力是600升，所有过多的细胞浆液体积被弃去。
9、罗伊氏乳杆菌的细胞浆液具有18％的干物质含量，冻干四到五天。
10、在冻干过程期间，所述过程中的压力在0.176mbar和0.42mbar之间。当压力达到0.42mbar时开启真空泵。当过程完成时，使用PRT(压力测试)来确定。如果PRT或压力的提高在120秒后低于0.02毫巴，停止该过程。
冻干的罗伊氏乳杆菌然后补充葡萄糖并使用标准方法配制，来生产片剂或胶囊剂，如在实施例6中描述的。
实施例5
冻干的罗伊氏乳杆菌ATCCPTA-5289与作为唯一碳源的蔗糖配制
如实施例4中描述的进行，只是在发酵期间用作为唯一碳源蔗糖代替葡萄糖。
然后使用标准方法配制冻干的罗伊氏乳杆菌，如实施例6中描述的来产生片剂或胶囊剂(但是没有添加葡萄糖，段落4)。
实施例6
含有选定菌株的产品的制造
在这个实施例中，根据良好的抗炎特征以及TNF抑制性质选择罗伊氏乳杆菌(ATCCPTA-5289)以将该菌株添加到片剂中。使用工业上生长乳杆菌的标准方法生长并冻干罗伊氏乳杆菌，这可以在实施例4中读到。
含有选定菌株的片剂的制造过程的实例的步骤包括密封的葡萄糖，要理解的是可以使用本领域已知的赋形剂、填充剂、调味剂、胶囊、润滑剂、防结块剂、甜味剂和片剂产品的其他成分而不影响产品的效力：
1、熔化。在容器中熔化SOFTISANTM154(SASOLGMBH，BadHomburg，Germany)，加热到70℃以确保完全破坏晶体结构。然后冷却到52-55℃(仅高于它的硬化点)。
2、造粒。将罗伊氏乳杆菌冻干粉末转移到Diosna高剪切混和器/造粒机，或等效物中。在大约1分钟时间内将熔化的SOFTISANTM154慢慢地添加到罗伊氏乳杆菌粉末中。在添加期间使用切碎机。
3、湿筛。在造粒之后直接地，通过使用Tornado磨粉机使颗粒体通过1mm筛网。筛分的颗粒包装在铝袋中，其由PVC包被的铝箔制成，用热密封机密封来形成小袋，与干燥剂小袋一起，冷却保存等待混合。对于两个片剂批次，分开造粒的批次。
4、添加密封的D-葡萄糖(G8270，＞99.5％葡萄糖，Sigma)，使用本领域已知的标准微胶囊包装方法来密封。糖的数量取决于添加的干燥罗伊氏乳杆菌的粉末的总CFU，标准水平是每1克糖总CFU为1E+08，但是这也可以变为低至0.1克或0.01，高达10克甚至100克糖。
5、混合。在混合器中混合所有成分，得到同质的共混物。
6、压缩。将最终的共混物转移到旋转压片机的储槽中，在Kilian压缩机中用765mg的总重量压缩片剂。
7、成批包装。片剂与分子筛的干燥小袋一起包装在铝袋中。铝袋放入塑料桶中，在最终包装前，在凉爽位置保存至少1周。
SOFTISANTM、一种氢化的棕榈油的用途，允许乳杆菌属细胞密封在脂肪中并在环境上保护。
如上所述，本发明的产品可以是片剂以外的形式，本领域已知的制备基础产品的标准方法被有益地用于制备包括选定的罗伊氏乳杆菌培养物的本发明的产品。
实施例7
患有结肠炎的女性受试者用实施例4中生产的产品治疗。受试者每日治疗两次，早晨和晚上。
两周后，结肠的炎症显著地降低了。在停止罗伊氏乳杆菌治疗时，状况复发，但是被罗伊氏乳杆菌的定期给药所抑制。
虽然参考特定实施方式描述了本发明，要理解的是许多变体、修改和实施方式是可能的，和因而所有这样的变体、修改和实施方式被认为处于本发明的精神和范围之内。

Claims (11)

1.一种增强抗炎乳酸菌的抗炎效果的方法，通过在包含唯一碳源的培养基中生长抗炎乳酸菌，所述唯一碳源选自由葡萄糖、乳糖、果糖、淀粉和1，2-丙二醇构成的组，所述抗炎乳酸菌为罗伊氏乳杆菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述罗伊氏乳杆菌为罗伊氏乳杆菌菌株ATCCPTA6475。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述罗伊氏乳杆菌为罗伊氏乳杆菌菌株ATCCPTA5289。
4.一种用于在个体中抑制TNFα产生和/或降低炎症的产品，所述产品包含与唯一碳源一起的抗炎乳酸菌的菌株，所述唯一碳源选自由葡萄糖、乳糖、果糖、淀粉和1，2-丙二醇构成的组，所述抗炎乳酸菌的菌株为罗伊氏乳杆菌ATCCPTA6475或罗伊氏乳杆菌ATCCPTA5289。
5.一种用于在个体中抑制TNFα产生和/或降低炎症的产品，所述产品包含与唯一碳源一起的抗炎乳酸菌的菌株，所述抗炎乳酸菌的菌株为罗伊氏乳杆菌，所述罗伊氏乳杆菌在包括选自由葡萄糖、乳糖、果糖、淀粉和1，2-丙二醇构成的组的唯一碳源中生长，所述唯一碳源选自由葡萄糖、乳糖、果糖、淀粉和1，2-丙二醇构成的组。
6.根据权利要求5所述的产品，其中，所述唯一碳源被密封。
7.一种用于在个体中抑制TNFα产生和/或降低炎症的产品，所述产品包含与唯一碳源一起的抗炎乳酸菌的菌株，所述唯一碳源选自由葡萄糖、乳糖、果糖、淀粉和1，2-丙二醇构成的组，所述抗炎乳酸菌的菌株为罗伊氏乳杆菌。
8.根据权利要求7所述的产品，其中，所述唯一碳源被密封。
9.根据权利要求7所述的产品，其中，所述罗伊氏乳杆菌为罗伊氏乳杆菌菌株ATCCPTA6475。
10.根据权利要求7所述的产品，其中，所述罗伊氏乳杆菌为罗伊氏乳杆菌菌株ATCCPTA5289。
11.一种适合于口服给药的药物组合物，其包含根据权利要求4～11任一所述的产品，任选地进一步包含药学上可接受的赋形剂。
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