KR102645749B1 - 면역 증진 및 장 건강 증진 활성을 가진 락토바실러스 루테리 mg5462 균주 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents
면역 증진 및 장 건강 증진 활성을 가진 락토바실러스 루테리 mg5462 균주 및 이를 포함하는 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) MG5462 균주 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명 균주의 CFS 처리는 대식세포의 식균 작용을 자극하고 NF-κB 및 MAPK 신호 전달 경로를 활성화함으로써 NO, TNF-α, IL-6, iNOS 및 COX-2와 같은 면역 조절제의 발현을 향상시키는 효과가 있으므로, 면역 강화 효과가 있는 프로바이오틱으로 이용 가능하다.
Description
본 발명은 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) MG5462 균주 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명 균주의 CFS 처리는 대식세포의 식균 작용을 자극하고 NF-κB 및 MAPK 신호 전달 경로를 활성화함으로써 NO, TNF-α, IL-6, iNOS 및 COX-2와 같은 면역 조절제의 발현을 향상시키는 효과가 있으므로, 면역 강화 효과가 있는 프로바이오틱으로 이용 가능하다.
인간의 면역계는 세균, 바이러스, 유해물질로부터 신체를 보호하는 중요한 역할을 하며 선천면역과 적응면역으로 구성되어 있다. 일반적으로 선천면역은 비특이적 반응으로 간주되며, 적응면역계는 항원 특이적 면역 반응을 유도하는 역할을 한다.
선천면역은 수지상 세포(dendritic cells), 대식세포(macrophage), 호중구(neutrophils), 호산구(eosinophils) 및 자연 살해(natural killer)(NK) 세포와 같은 면역 세포를 포함한다. 특히 대식세포는 식세포작용 유도를 통해 죽은 세포, 종양 세포 및 이물질을 제거하는 데 중요한 역할을 한다.
또한, 대식세포는 인터페론(interferon)(IFN)-γ, 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor)(TNF)-α, 인터루킨(interleukin)(IL)-1β, IL-6 및 IL-12와 같은 전염증성 사이토카인을 분비하고, 유도성 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase)(iNOS), 사이클로옥시게나아제(cyclooxygenase)-2(COX-2), 산화질소(nitric oxide)(NO) 및 프로스타글란딘(prostaglandin) E2(PGE2)와 같은 많은 매개체를 생성하여 적응면역에 영향을 미치는 것으로 보고되었다.
이러한 매개체의 합성은 주로 핵 인자-κB(NF-κB) 및 미토겐 활성화 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinase)(MAPK) 신호 전달 경로의 활성화를 통해 유도된다.
프로바이오틱스는 적당한 양을 섭취할 때 숙주의 건강에 도움이 되는 살아있는 미생물이다. 유산균(LAB), 비피더스균(Bifidobacteria)과 같은 프로바이오틱스는 장 건강 개선, 면역 강화, 혈청 콜레스테롤 감소, 항암 효과, 관상동맥질환 예방에 효과가 있는 것으로 보고되고 있다.
또한, 프로바이오틱스의 면역 조절 활성은 설사, 과민성 대장 증후군 등의 장 질환과 알레르기와 같은 장외 질환의 예방 및 치료에 적용할 수 있다. 특히, 프로바이오틱스는 수지상 세포(dendritic cells), 세포, T 및 B 림프구와 상호작용하여 숙주의 선천성 및 적응성 면역을 조절한다.
최근에는 프로바이오틱스를 적용하여 면역력을 향상시키는 것에 대한 관심이 높아짐에 따라 프로바이오틱스의 면역조절 효과에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
따라서, 본 발명에서는 면역자극 활성을 통해 면역계를 개선할 수 있는 기능성 프로바이오틱 균주를 찾고자 하였다.
유산균(LAB)은 숙주의 건강을 향상시킬 수 있으며 건강기능식품으로 활용될 가능성이 크다. 유산균의 특정 균주는 면역자극 효과를 가지고 있는 것으로 보고되었다.
본 발명의 일차적 목적은 새로운 유산균 균주의 면역 자극 활성을 평가하고, 이들 균주의 프로바이오틱 특성을 조사하는 것이다. 선택된 유산균 균주에서 얻은 무세포 상청액(cell-free supernatants)(CFS)은 RAW 264.7 대식세포에서 식세포 작용과 산화질소(NO) 및 종양 괴사 인자(TNF)-α 및 인터루킨(IL)-6와 같은 전염증성 사이토카인(cytokine)의 수준을 상당히 증가시켰다. 면역 조절제로서 유도성 NO 합성효소(inducible NO synthase)(iNOS) 및 사이클로옥시게나아제(cyclooxygenase)(COX)-2의 단백질 발현도 CFS 처리에 의해 상향조절 되었다. 또한, CFS는 핵인자-κB(NF-κB) 및 MAPKs(ERK, JNK 및 p38)의 인산화를 현저하게 유도하였다. 게다가, 본 연구에 사용된 유산균 균주의 안전성은 용혈 및 항생제 내성 테스트를 기반으로 입증되었다. 그들의 안정성은 시뮬레이션된 위장 조건에서 확인되었다.
결과적으로 본 발명의 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) MG5462 균주가 면역 자극 활성을 갖는 프로바이오틱으로 사용할 수 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 면역 증진 활성을 갖는 락토바실러스 루테리 MG5462 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 락토바실러스 루테리 MG5462 균주, 이의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 면역 증진용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 루테리 MG5462 균주, 이의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 루테리 MG5462 균주, 이의 배양액 또는 이의 추출물의 면역 증진 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 루테리 MG5462 균주, 이의 배양액 또는 이의 추출물의 면역질환의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
본 발명은 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) MG5462 균주 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명 균주의 CFS 처리는 대식세포의 식균 작용을 자극하고 NF-κB 및 MAPK 신호 전달 경로를 활성화함으로써 NO, TNF-α, IL-6, iNOS 및 COX-2와 같은 면역 조절제의 발현을 향상시키는 효과가 있으므로, 면역 강화 효과가 있는 프로바이오틱으로 이용 가능하다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 면역 증진 활성을 갖는 락토바실러스 루테리 MG5462 균주에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 면역 증진 활성을 갖는 락토바실러스 루테리 MG5462 균주의 16s rRNA는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 면역 증진 활성을 갖는 락토바실러스 루테리 MG5462 균주는 기탁번호 KCTC 15120BP로 기탁된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 예는 락토바실러스 루테리 MG5462 균주, 이의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 면역 증진용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 면역증진은 대식세포에서 식세포 작용 증가; TNF-α 또는 IL-6의 사이토카인 생성 증진; 또는 NF-kB 활성 증진을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 예는 락토바실러스 루테리 MG5462 균주, 이의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 면역질환의 예방 또는 치료는 대식세포에서 식세포 작용 증가; TNF-α 또는 IL-6의 사이토카인 생성 증진; 또는 NF-kB 활성 증진을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 면역질환은 자가면역질환, 감염성질환, 이식거부 질환 및 염증질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) MG5462 균주 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명 균주의 CFS 처리는 대식세포의 식균 작용을 자극하고 NF-κB 및 MAPK 신호 전달 경로를 활성화함으로써 NO, TNF-α, IL-6, iNOS 및 COX-2와 같은 면역 조절제의 발현을 향상시키는 효과가 있으므로, 면역 강화 효과가 있는 프로바이오틱으로 이용 가능하다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따라 RAW 264.7 대식세포의 식균 작용에 대한 LAB 균주의 CFS 효과를 측정한 것으로, 처리되지 않은(대조군) 및 처리된 세포의 형태를 20배 배율에서 위상차 광 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따라 RAW 264.7 대식세포의 식균 작용에 대한 LAB 균주의 CFS 효과를 측정한 것으로, 식세포 활성을 마이크로플레이트 리더를 사용하여 대수 강도(phagocytic activity)를 측정하여 정량화한 그래프이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따라 LAB 균주의 CFS가 RAW 264.7 세포에서 iNOS 단백질 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따라 LAB 균주의 CFS가 RAW 264.7 세포에서 iNOS 단백질 발현에 미치는 영향을 측정한 결과 그래프이다.
도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따라 LAB 균주의 CFS가 RAW 264.7 세포에서 COX-2 단백질 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과이다.
도 2d는 본 발명의 일 실시예에 따라 LAB 균주의 CFS가 RAW 264.7 세포에서 COX-2 단백질 발현에 미치는 영향을 측정한 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 RAW 264.7 세포에서 사이토카인(cytokines) 생산에 대한 LAB 균주의 CFS 효과로 세포에서 분비되는 TNF-α의 양을 ELISA 키트로 측정한 결과 그래프이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따라 RAW 264.7 세포에서 NF-κB 활성화에 대한 LAB 균주의 CFS 효과를 웨스턴 블롯으로 측정한 결과이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따라 RAW 264.7 세포에서 NF-κB 활성화에 대한 LAB 균주의 CFS 효과로 NF-κB의 활성화 수준을 측정한 결과 그래프이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따라 RAW 264.7 세포에서 MAPK 활성화에 대한 LAB 균주의 CFS의 효과를 측정한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따라 RAW 264.7 세포에서 MAPK 활성화에 대한 LAB 균주의 CFS의 효과를 MAPK의 활성화 수준(ERK)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따라 RAW 264.7 세포에서 MAPK 활성화에 대한 LAB 균주의 CFS의 효과를 MAPK의 활성화 수준(JNK)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5d는 본 발명의 일 실시예에 따라 RAW 264.7 세포에서 MAPK 활성화에 대한 LAB 균주의 CFS의 효과를 MAPK의 활성화 수준(p38)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따라 RAW 264.7 대식세포의 식균 작용에 대한 LAB 균주의 CFS 효과를 측정한 것으로, 식세포 활성을 마이크로플레이트 리더를 사용하여 대수 강도(phagocytic activity)를 측정하여 정량화한 그래프이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따라 LAB 균주의 CFS가 RAW 264.7 세포에서 iNOS 단백질 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따라 LAB 균주의 CFS가 RAW 264.7 세포에서 iNOS 단백질 발현에 미치는 영향을 측정한 결과 그래프이다.
도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따라 LAB 균주의 CFS가 RAW 264.7 세포에서 COX-2 단백질 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과이다.
도 2d는 본 발명의 일 실시예에 따라 LAB 균주의 CFS가 RAW 264.7 세포에서 COX-2 단백질 발현에 미치는 영향을 측정한 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 RAW 264.7 세포에서 사이토카인(cytokines) 생산에 대한 LAB 균주의 CFS 효과로 세포에서 분비되는 TNF-α의 양을 ELISA 키트로 측정한 결과 그래프이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따라 RAW 264.7 세포에서 NF-κB 활성화에 대한 LAB 균주의 CFS 효과를 웨스턴 블롯으로 측정한 결과이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따라 RAW 264.7 세포에서 NF-κB 활성화에 대한 LAB 균주의 CFS 효과로 NF-κB의 활성화 수준을 측정한 결과 그래프이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따라 RAW 264.7 세포에서 MAPK 활성화에 대한 LAB 균주의 CFS의 효과를 측정한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따라 RAW 264.7 세포에서 MAPK 활성화에 대한 LAB 균주의 CFS의 효과를 MAPK의 활성화 수준(ERK)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따라 RAW 264.7 세포에서 MAPK 활성화에 대한 LAB 균주의 CFS의 효과를 MAPK의 활성화 수준(JNK)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5d는 본 발명의 일 실시예에 따라 RAW 264.7 세포에서 MAPK 활성화에 대한 LAB 균주의 CFS의 효과를 MAPK의 활성화 수준(p38)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실험예 1. LAB 균주 및 배양 조건
프로바이오틱 균주들은 MEDIOGEN Co., Ltd.(제천, 대한민국)에서 입수하였다. 모든 균주는 혐기성 조건에서 37℃의 MRS 브로쓰(broth) 배지(Difco Laboratories, MI, USA)에서 배양 및 유지되었다. 실험에 사용된 모든 LAB 균주의 기원과 종은 표 1과 같다. (L.: 락토바실러스(Lactobacillus); Lc.: 락토코쿠스(Lactococcus); Bi.: 비피도박테리움(Bifidobacterium))
| Origin | Strains |
| Untreated | |
| LPS (10 ng/mL) | |
| Food | L. reuteri MG5462 |
| Fermented food | Lc. lactis MG5278 |
| Lc. lactis MG5474 | |
| Human | L. fermentum MG4263 |
| L. fermentum MG4268 | |
| L. fermentum MG4282 | |
| Lc. lactis MG4668 |
락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) MG5462 균주는 16S rRNA 유전자 염기서열분석 (㈜솔젠트코리아)에 의해 동정하였으며, 그 DNA 염기서열은 Basic Local Alignment Search Tool을 사용하여 국립 생명 공학 정보 센터 (NCBI) 데이터베이스에 등록되었다. 락토바실러스 루테리 MG5462 균주의 16s rRNA 시퀀싱은 표 2에 나타냈다.
| 서열번호 | 1 |
| 명칭 | Lactobacillus reuteri MG5462 16s rRNA |
| 서열 (5'->3') | 1 gcagtcgtac gcactggccc aactgattga tggtgcttgc acctgattga cgatggatca 61 ccagtgagtg gcggacgggt gagtaacacg taggtaacct gccccggagc gggggataac 121 atttggaaac agatgctaat accgcataac aacaaaagcc gcatggcttt tgtttgaaag 181 atggctttgg ctatcactct gggatggacc tgcggtgcat tagctagttg gtaaggtaac 241 ggcttaccaa ggcgatgatg catagccgag ttgagagact gatcggccac aatggaactg 301 agacacggtc catactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccacaa tgggcgcaag 361 cctgatggag caacaccgcg tgagtgaaga agggtttcgg ctcgtaaagc tctgttgttg 421 gagaagaacg tgcgtgagag taactgttca cgcagtgacg gtatccaacc agaaagtcac 481 ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttat ccggatttat 541 tgggcgtaaa gcgagcgcag gcggttgctt aggtctgatg tgaaagcctt cggcttaacc 601 gaagaagtgc atcggaaacc gggcgacttg agtgcagaag aggacagtgg aactccatgt 661 gtagcggtgg aatgcgtaga tatatggaag aacaccagtg gcgaaggcgg ctgtctggtc 721 tgcaactgac gctgaggctc gaaagcatgg gtagcgaaca ggattagata ccctggtagt 781 ccatgccgta aacgatgagt gctaggtgtt ggagggtttc cgcccttcag tgccggagct 841 aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac gaccgcaagg ttgaaactca aaggaattga 901 cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagctacgcg aagaacctta 961 ccaggtcttg acatcttgcg ctaaccttag agataaggcg ttcccttcgg ggacgcaatg 1021 acaggtggtg catggtcgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1081 gagcgcaacc cttgttacta gttgccagca ttgagttggg cactctagtg agactgccgg 1141 tgacaaaccg gaggaaggtg gggacgacgt cagatcatca tgccccttat gacctgggct 1201 acacacgtgc tacaatggac ggtacaacga gtcgcaaact cgcgagagta agctaatctc 1261 ttaaagccgt tctcagttcg gactgtaggc tgcaactcgc ctacacgaag tcggaatcgc 1321 tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1381 gtcacaccat gggagtttgt aacgcccaaa gtcggtggcc taacctttat ggagggagcc 1441 gcctaagccg |
실험예 2. 무세포 상층액(CFS)의 준비
균주의 면역자극 활성을 평가하기 위해 4,000 X g에서 20분 동안 원심분리한 후 0.2 μm 필터를 사용하여 여과한 후 동결 건조하여 세균 배양액에서 CFS를 얻었다. 동결 건조된 CFS를 DMEM에 재현탁하고 세포 배양 연구에 사용하였다.
실험예 3. 세포 배양
RAW 264.7 세포는 한국 세포주 은행(서울, 한국)에서 입수하였다. RAW 264.7 세포는 10% 열불활성화 소태아혈청(heat-inactivated fetal bovine serum), 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)(Welgene Inc.)이 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)(DMEM; Welgene Inc., 경산, 한국)에서 유지되었다. 세포는 5% CO2 습도의 대기에서 37℃에서 일상적으로 배양되었다. 세포를 70-80% 합류점에서 계대배양하였다.
실험예 4. 세포 생존력 분석
RAW 264.7 세포의 세포 독성은 이전 연구에 따라 3-[4,5-Dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 분석(Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA)에 의해 조사되었다. 간단히 말해서, RAW 264.7 세포를 1 X 105 세포/웰(100 μL/웰)의 밀도로 96웰 플레이트에 접종하고 37℃에서 배양하였다. RAW 264.7 세포가 70% 컨플루언스(confluence)에 도달하면 CFS를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.
그 후, RAW 264.7 세포를 PBS(phosphate-buffered saline)로 3회 세척하고, MTT 용액(100 μL)을 각 웰에 첨가하고 4시간 동안 더 배양하였다. MTT 용액을 제거한 후, 형성된 MTT 포르마잔(formazan)을 100 μL의 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide)(DMSO)에 용해시켰다. 흡광도는 Epoch 2 마이크로플레이트 리더(Epoch 2 microplate reader)(Biotek Instruments Inc., Winooski, VT, USA)를 사용하여 570 nm에서 측정되었다.
실험예 5. NO 생산량 측정
RAW 264.7 세포에서 방출되는 NO는 이전 연구에 따라 Griess 분석으로 측정되었다. 간단히 말해서, RAW 264.7 세포를 1 X 105 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 접종한 다음 밤새 배양하였다. 세포를 CFS(5 mg/mL)로 24시간 동안 자극하였다. 10 ng/mL의 지질다당류(lipopolysaccharide)(LPS; Sigma-Aldrich Inc.)를 양성 대조군으로 사용하였다.
이후, 수집된 배양 상등액을 Griess 시약(1% sulfanilamide, 0.1% N-(1-naphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride)과 실온에서 15분간 혼합하였다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 540 nm에서 측정하였다.
실험예 6. 식세포 활성에 대한 중성 적색 흡수 분석
RAW 264.7 세포의 식세포 활성은 중성 적색 흡수 분석을 사용하여 측정되었다. 구체적으로, RAW 264.7 세포(1 X 105 세포/웰)를 96웰 플레이트에 추가하고 37℃에서 5% CO2로 배양하였다. 밤새 성장시킨 후, 세포를 24시간 동안 CFS(5 mg/mL)로 처리하였다.
그 후, RAW 264.7 세포를 PBS로 3회 세척하고, 각 웰에 100 μL의 중성 적색 용액(0.01%)을 첨가하고 2시간 동안 배양하였다. 3회 세척한 후 각 well에 세포용해액(아세트산:에탄올 = 1:1)을 처리하고 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 540 nm에서 측정하였다.
실험예 7. 사이토카인(cytokines) 생산의 측정
RAW 264.7 세포를 2 X 105 세포/웰의 밀도로 24웰 플레이트에 접종하고 밤새 배양하였다. 세포를 LPS(10 ng/mL) 또는 CFS(5 mg/mL)를 포함하는 새로운 DMEM 배지로 24시간 동안 처리하였다. 세포 배양 배지에서 방출되는 사이토카인(TNF-α 및 IL-6)은 제조업체의 지침에 따라 ELISA 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 측정하였다.
실험예 8. 웨스턴 블롯(Western blot) 분석
RAW 264.7 세포는 포스파타제(phosphatase) 억제제 칵테일을 포함하는 RIPA 완충액(Gendepot Inc., Katy, TX, USA)으로 4℃에서 20분 동안 용해되었다. 세포 용해물의 총 단백질 농도는 Bradford assay(Gendepot Inc.)를 사용하여 측정되었다. 40 μg의 단백질을 10% SDS-PAGE로 분리하고 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride) 막(Millipore, Billerica, MA, USA)에 40분 동안 옮겼다.
이후, 0.1% PBS-T에 5% BSA로 상온에서 1시간 동안 막을 차단한 후 밤새 4℃에서 특이적인 1차 항체(iNOS, COX-2, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK, p38, p-p38, NF-κB-p65, p-NF-κB-p65 및 β-액틴)로 처리하였다. 그런 다음, PVDF 막을 0.1% PBS-T로 3회 세척하고 1시간 동안 실온에서 차단 완충액에서 서양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase) 접합된 해당 2차 항체와 함께 배양하였다. 추가 세척 후 ECL 시스템에 의해 단백질 밴드를 식별하였다. β-액틴(β-actin)은 로딩 컨트롤로 사용되었다.
실험예 9. 프로바이오틱 특성
9-1. 시뮬레이션된 위장 상태에 대한 내성
LAB 균주를 MRS broth 배지에서 37℃에서 18시간 동안 배양하고 원심분리(20분 동안 4,000 X g)에 의해 수집하였다. 펠렛을 PBS 용액으로 2회 세척하고 재현탁시켰다. 세포 현탁액 용액의 광학 밀도를 600 nm에서 1.0으로 조정하였다. 1 mL의 세포 현탁액을 9 mL의 시뮬레이션된 위액(SGF; PBS 중 0.3% 펩신, pH 2.5)에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다.
세포 펠렛은 원심분리(20분 동안 4,000 X g)에 의해 얻어지고 자극된 장액(SIF; PBS 중 1% 판크레아틴(pancreatin) 및 1% 담즙염(bile salt), pH 7.4) 10 mL와 혼합된 다음 37℃에서 2.5시간 동안 배양되었다. MRS 한천에서 플레이트 카운팅에 의해 생존 가능한 세포를 결정하고 log CFU mL-1로 표시하였다. 생존율은 다음 방정식 (1)을 이용하여 계산하였다.
[방정식 (1)]
생존율 (Survival rate, (%)) = (Log N / Log N0) X 100
N: 테스트 종료 시 생존 균수
N0: 테스트 시작 시 생존 균수
9-2. 용혈 활성
용혈 활성을 평가하기 위해 선택된 LAB 균주를 MRS broth 배지에서 밤새 배양하였다. 박테리아 배양물을 5% 양 혈액(MB cell, Seoul, Korea)을 포함하는 tryptic soy agar(Difco Laboratories) 플레이트에 도말하고 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 용혈 활성은 콜로니 주변 적혈구의 용해에 따라 분류하고 α-용혈(녹색 영역), β-용혈(투명 영역) 또는 γ-용혈(눈에 띄는 영역 없음)으로 결정하였다.
9-3. 항생제 감수성
선택된 LAB 균주의 항생제 감수성은 제조업체의 지침(bioMerieux, Marcy-l'Etoile, France)에 따라 항생제 최소 억제 농도(minimum inhibitory concentration)(MIC) 스트립 방법을 사용하여 평가되었다. 균주를 MRS broth 배지에서 37℃에서 배양하였다. 18시간 동안 배양한 후, 4,000 X g에서 20분 동안 원심분리하여 세균 배양물로부터 세균 세포를 얻고, PBS로 2회 세척하고, PBS에서 0.5 McFarland 표준으로 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 면봉을 사용하여 Brain infusion agar(Difco, Detroit, MI, USA) 플레이트에 도포한 다음 플레이트를 실온에서 10분 동안 건조시켰다.
항균제가 포함된 MIC 테스트 스트립을 한천 표면에 놓았다. 플레이트는 37℃에서 24시간 동안 배양되었으며 컷오프 값(cut-off value)은 유럽 식품 안전청(European Food Safety Authority)(EFSA) 지침에 따라 결정되었다.
통계 분석
모든 데이터는 삼중 실험의 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시된다. 그룹 간의 차이는 일원배치 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 통계적 유의성을 평가한 후 Duncan의 사후검정분석(p < 0.05)을 수행하였다(SPSS, 버전 21; IBM Inc., Armonk, NY, USA).
실시예 1. RAW 264.7 세포에서 세포 생존율 및 NO 생산에 대한 LAB 균주의 CFS 효과
LAB 균주의 CFS가 세포에서 NO 생산을 증가시킬 수 있는지 여부를 평가하기 위해 CFS를 RAW 264.7 세포에 첨가하고 24시간 동안 배양하였다. RAW 264.7 세포에서 세포 생존율 및 NO 생산에 대한 LAB 균주의 CFS 효과를 측정하여, 그 결과를 표 3에 나타내었다.
| Origin | Strains | Cell viability (%) | NO (μM) |
| Untreated | 100.00 ± 0.48a | 1.00 ± 0.06h | |
| LPS (10 ng/mL) | 99.69 ± 2.92a | 19.27 ± 2.80c | |
| Food | L. reuteri MG5462 | 101.25 ± 1.96a | 21.73 ± 0.95b |
| Fermented food | Lc. lactis MG5278 | 100.62 ± 0.98a | 10.60 ± 0.72e |
| Lc. lactis MG5474 | 101.40 ± 0.76a | 14.13 ± 0.90d | |
| Human | L. fermentum MG4263 | 100.65 ± 2.48a | 21.47 ± 1.14b |
| L. fermentum MG4268 | 101.29 ± 3.44a | 20.87 ± 2.02bc | |
| L. fermentum MG4282 | 101.26 ± 1.77a | 25.73 ± 0.12a | |
| Lc. lactis MG4668 | 101.51 ± 1.65a | 8.04 ± 1.55f |
표 3에서 확인할 수 있듯이, LAB 균주의 CFS는 RAW 264.7 세포에 대한 세포독성 효과를 관찰하지 못하였다. 또한, LAB 균주의 CFS 처리는 NO 생산을 8.04-25.73 μM까지 유의하게 증가시켰다. 특히, 락토바실러스 루테리 MG5462 균주(21.73 ± 0.95 μM)는 LPS(19.27 ± 2.80 μM)와 비교하여 더 높은 NO 생산량을 보였다.
실시예 2. RAW 264.7 세포의 식세포 활성에 대한 LAB 균주의 CFS 효과
LAB 균주에서 CFS의 식세포 활성은 중성 적색 흡수 분석을 사용하여 평가되었다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.
| Strai0ns | Phagocytic activity (fold of control) |
| Untreated Control | 1.0 ± 0.0c |
| LPS (10 ng/mL) | 2.7 ± 0.1a |
| L. reuteri MG5462 | 2.5 ± 0.2ab |
| Lc. lactis MG4668 | 2.3 ± 0.2b |
| Lc. lactis MG5278 | 2.4 ± 0.1ab |
| Lc. lactis MG5474 | 2.4 ± 0.2ab |
| L. fermentum MG4268 | 2.4 ± 0.1ab |
| L. fermentum MG4282 | 2.2 ± 0.1b |
도 1a 및 1b에서 확인할 수 있듯이, 세포 형태 및 통계 데이터 분석은 식세포 활성이 처리되지 않은 대조군 세포와 비교하면 CFS로 처리된 RAW 264.7 세포에서 2배 이상 크게 향상되었음을 보여주었다. 이 결과는 LPS 처리된 양성 대조군만큼 높았다.
실시예 3. RAW 264.7 세포에서 iNOS/COX-2 발현에 대한 LAB 균주의 CFS 효과
LAB 균주의 CFS가 RAW 264.7 세포에서 iNOS 및 COX-2 단백질 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블롯 분석법을 사용하여 분석하였다.
도 2a 및 2b에서 확인할 수 있듯이, Lc. lactis MG4668을 제외한 모든 균주의 CFS로 처리된 세포가 처리되지 않은 대조군과 비교하여 iNOS 발현을 유의미하게 유도한다는 것을 확인하였다. 특히, 락토바실러스 루테리 MG5462 균주를 처리한 세포에서 iNOS의 발현 수준은 처리되지 않은 대조군 세포에 비해 약 6배, LPS 처리된 세포에 비해 약 2배 증가하였으며, 이는 NO 생산의 결과와 일치하였다.
도 2c 및 2d에서 확인할 수 있듯이, 모든 CFS 처리 세포에서 COX-2의 발현 수준은 처리되지 않은 대조군 세포에 비해 약 20배 범위였으며, CFS 처리 세포는 LPS 처리된 세포보다 2배 이상 높았다. 이러한 결과는 LAB 균주의 CFS가 세포를 활성화하여 iNOS 및 COX-2와 같은 전염증성 매개체를 유도할 수 있음을 시사한다.
실시예 4. RAW 264.7 세포에서 사이토카인(cytokine) 생산에 대한 LAB 균주의 CFS 효과
LAB 균주의 CFS가 면역 강화 활성에 미치는 영향을 평가하기 위해 RAW 264.7 세포에서 분비되는 TNF-α 농도를 조사하였다. 세포 배양 배지로 방출된 사이토카인의 수준은 ELISA 키트를 사용하여 결정되었다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 확인할 수 있듯이, LPS로 자극된 RAW 264.7 세포(각각 72.67 ± 3.30 및 4.81 ± 0.81 ng/mL)의 TNF-α 수준은 처리되지 않은 세포에 비해 유의미하게 상승하였다. 또한, TNF-α 수준은 락토바실러스 퍼멘텀 MG4282를 제외한 모든 CFS 처리 세포에서 LPS 처리 세포보다 효과적으로 더 높았다. 특히, 락토바실러스 루테리 MG5462 균주의 CFS 처리 세포(176.94 ± 12.15 ng/mL)는 LPS 처리 세포(72.67 ± 3.30 ng/mL)에 비해 약 2배가량 가장 높은 TNF-α 수치를 보였다.
실시예 5. RAW 264.7 세포에서 NF-κB 및 MAPKs 활성화에 대한 LAB 균주의 CFS 효과
ERK, JNK 및 p38과 같은 MAPK와 NF-κB는 세포 활성화와 관련된 대표적인 신호 경로이다. 본 발명자들은 LAB 균주에서 CFS의 면역 강화 활성을 조절하는 신호 전달 경로를 이해하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 CFS가 NF-κB 및 MAPKs의 활성화를 유도하는지 여부를 평가하였다. 그 결과를 도 4a 내지 도 5d에 나타내었다.
도 4a 및 4b에서 확인할 수 있듯이, 균주의 CFS가 처리되지 않은 대조군 세포와 비교하면 RAW 264.7 세포에서 NF-κB의 인산화를 유의미하게 촉진한다는 것을 보여주었다. 이 결과는 선별된 LAB 균주가 p65의 인산화를 유도하여 NF-κB의 활성화를 자극함을 시사한다.
또한, 도 5a 내지 5d에서 확인할 수 있듯이, ERK, JNK 및 p38의 인산화는 처리되지 않은 대조군과 비교하여 모든 CFS 처리 및 LPS에 의해 유도되었다. MAPKs 신호 전달 경로는 세포 증식, 분화 및 세포 활성화에 중요한 역할을 한다. MAPKs 인산화는 NF-κB 전사 활성화를 유도한다. 따라서, CFS가 RAW 264.7 세포에서 ERK, JNK 및 p38과 같은 MAPKs의 인산화를 효과적으로 자극한다는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 선별된 LAB 균주가 NF-κB 및 MAPKs 신호 전달 경로의 활성화를 증가시켜 결과적으로 NO, TNF-α 및 IL-6과 같은 면역 조절제의 생산을 유도함을 시사한다.
실시예 6. LAB 균주의 프로바이오틱 특성
6-1. 시뮬레이션된 위장 조건에서 LAB 균주의 안정성
LAB 균주의 안정성은 일정 기간 동안 인공 GIT에서 균주를 배양하여 조사하여, 그 결과를 표 5에 나타내었다. (SGF: 시뮬레이션된 위액(simulated gastric fluid); SIF: 자극된 장액(stimulated intestinal fluid))
| Strains |
Initial counts
(log CFU/mL) |
SGF
(log CFU/mL) |
SIF
(log CFU/mL) |
Survival
rate (%) |
| L. reuteri MG5462 | 7.70 ± 0.01 | 7.66 ± 0.00 | 7.50 ± 0.00 | 97.41 ± 0.02 |
| Lc. lactis MG4668 | 7.59 ± 0.06 | 2.85 ± 0.00 | 2.75 ± 0.10 | 36.27 ± 1.27 |
| Lc. lactis MG5278 | 7.29 ± 0.06 | 2.74 ± 0.04 | 2.61 ± 0.01 | 35.78 ± 0.07 |
| Lc. lactis MG5474 | 7.66 ± 0.02 | 2.78 ± 0.07 | 2.39 ± 0.36 | 31.24 ± 4.66 |
| L. fermentum MG4263 | 7.87 ± 0.01 | 3.27 ± 0.01 | 3.09 ± 0.01 | 39.25 ± 0.09 |
| L. fermentum MG4268 | 7.89 ± 0.02 | 4.11 ± 0.05 | 3.74 ± 0.15 | 47.40 ± 1.84 |
| L. fermentum MG4282 | 7.92 ± 0.01 | 3.96 ± 0.03 | 3.92 ± 0.08 | 49.58 ± 0.98 |
표 5에서 확인할 수 있듯이, 시뮬레이션된 위장 조건에 4.5시간 노출 후 락토바실러스 루테리 MG5462 균주의 생존율은 97.41%로 가장 높은 생존율을 보였다. 따라서 본 발명의 균주가 프로바이오틱스로 사용될 가능성이 있음을 확인하였다.
소결
결론적으로, 본 발명의 균주가 RAW 264.7 세포에서 면역 자극 활성을 유도한다는 것을 입증하였다. 또한, 본 발명의 균주의 CFS 처리는 대식세포의 식균 작용을 자극하고 NF-κB 및 MAPK 신호 전달 경로를 활성화함으로써 NO, TNF-α, IL-6, iNOS 및 COX-2와 같은 면역 조절제의 발현을 향상시켰다. 상기 결과는 락토바실러스 루테리 MG5462 균주는 면역 증진 효과가 있는 프로바이오틱으로 이용 가능함을 보여주는 것이다.
Claims (8)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 서열번호 1로 표시되는 16s rRNA 서열을 포함하고, 기탁번호 KCTC 15120BP로 기탁된, 프로바이오틱스 활성을 갖는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) MG5462 균주의 무세포 상층액(cell-free supernatants)(CFS)을 포함하는 면역 증진용 식품 조성물로서,
상기 면역증진은 대식세포에서 식세포 작용 증가; TNF-α 또는 IL-6의 사이토카인 생성 증진; 또는 NF-kB 활성 증진을 통해 이루어지는 것인, 면역 증진용 식품 조성물. - 삭제
- 서열번호 1로 표시되는 16s rRNA 서열을 포함하고, 기탁번호 KCTC 15120BP로 기탁된, 프로바이오틱스 활성을 갖는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) MG5462 균주의 무세포 상층액(cell-free supernatants)(CFS)을 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 면역질환의 예방 또는 치료는 대식세포에서 식세포 작용 증가; TNF-α 또는 IL-6의 사이토카인 생성 증진; 또는 NF-kB 활성 증진을 통해 이루어지는 것인, 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 삭제
- 제6항에 있어서, 상기 면역질환은 자가면역질환, 감염성질환, 이식거부 질환 및 염증질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013518573A (ja) * | 2010-02-02 | 2013-05-23 | バイオガイア・エイ・ビー | ラクトバチルス株の免疫調節特性の改良 |
| KR20160043809A (ko) * | 2014-10-14 | 2016-04-22 | 대한민국(농촌진흥청장) | 락토바실러스 루테리 블랙8, 및 이를 함유하는 항종양 조성물 |
| JP2020534853A (ja) * | 2017-09-29 | 2020-12-03 | ユニバーシティ−インダストリー コーオペレイション グループ オブ キョンヒ ユニバーシティＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ−Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｏｆ Ｋｙｕｎｇ Ｈｅｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ | 新規な乳酸菌およびその用途 |
| KR20210080264A (ko) * | 2019-12-20 | 2021-06-30 | 충북대학교 산학협력단 | 신규한 락토바실러스 루테리 ｄｂ２ 균주 및 이의 용도 |
| KR102296288B1 (ko) * | 2020-12-31 | 2021-09-01 | 주식회사 바이오뱅크힐링 | 락토바실러스 루테리 균주, 및 그의 유래의 소포체 및 그의 항염증 및 항균 용도 |
| KR102479732B1 (ko) * | 2022-03-22 | 2022-12-20 | 주식회사 메디오젠 | 리모실락토바실러스 루테리 mg5458 균주 및 이를 포함하는 알콜성 지방간 예방, 개선 또는 치료용 조성물 |
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013518573A (ja) * | 2010-02-02 | 2013-05-23 | バイオガイア・エイ・ビー | ラクトバチルス株の免疫調節特性の改良 |
| KR20160043809A (ko) * | 2014-10-14 | 2016-04-22 | 대한민국(농촌진흥청장) | 락토바실러스 루테리 블랙8, 및 이를 함유하는 항종양 조성물 |
| JP2020534853A (ja) * | 2017-09-29 | 2020-12-03 | ユニバーシティ−インダストリー コーオペレイション グループ オブ キョンヒ ユニバーシティＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ−Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｏｆ Ｋｙｕｎｇ Ｈｅｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ | 新規な乳酸菌およびその用途 |
| KR20210080264A (ko) * | 2019-12-20 | 2021-06-30 | 충북대학교 산학협력단 | 신규한 락토바실러스 루테리 ｄｂ２ 균주 및 이의 용도 |
| KR102296288B1 (ko) * | 2020-12-31 | 2021-09-01 | 주식회사 바이오뱅크힐링 | 락토바실러스 루테리 균주, 및 그의 유래의 소포체 및 그의 항염증 및 항균 용도 |
| KR102479732B1 (ko) * | 2022-03-22 | 2022-12-20 | 주식회사 메디오젠 | 리모실락토바실러스 루테리 mg5458 균주 및 이를 포함하는 알콜성 지방간 예방, 개선 또는 치료용 조성물 |
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