KR102083953B1 - 프로바이오틱, 가교성 반응물, 변성 단백질, 폴리올 가소제 및 트레할로스를 포함하는 미세입자 - Google Patents

프로바이오틱, 가교성 반응물, 변성 단백질, 폴리올 가소제 및 트레할로스를 포함하는 미세입자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미세입자, 미세입자 제조 방법 및 미세입자 전구체 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 보호 기질 및 변성 단백질, 폴리올가소제, 트레할로스 및 담체를 포함하는 보호 기질 전구체 조성물을 포함하는 미세입자에 관한 것이다.

Description

프로바이오틱, 가교성 반응물, 변성 단백질, 폴리올 가소제 및 트레할로스를 포함하는 미세입자{Microparticles Comprising a Probiotic, Cross-Linkable Reagent, a Denatured Protein, Polyol Plasticiser and Trehalose}
본 발명은 미세입자, 미세입자 제조 방법 및 미세입자 전구체 조성물에 관한 것이다.
건강한 장에서, 유익한 박테리아와 병원성 박테리아 사이의 균형이 존재한다. 음식, 스트레스, 병 또는 감염 및 의약을 포함하는 다양한 인자가 이런 균형을 붕괴하여 병원성 박테리아의 과다를 유도할 수 있다. 이런 불균형은 팽만감, 기체 및 변비를 일으킬 수 있다. 최근 동안, 이런 불균형을 해결하기 위해 프로바이오틱 미생물(이하에서 "프로바이오틱스")의 사용에 현저한 증가가 있었다. 프로바이오틱스는 장관에서 병원성 박테리아의 성장 및/또는 신진대사를 억제하거나 영향을 미칠 수 있다고 생각된다. 프로바이오틱스는 또한 면역 기능을 활성화할 수 있다. 이런 이유로, 영양 보충제 또는 식품에 프로바이오틱스를 혼합시키는데 상당한 관심이 있다.
영양 보충제 또는 식품에 프로바이오틱스를 혼합시키는 것과 관련된 어려움이 있다. 하나의 주요 어려움은 관련 제품에 적절한 수의 생존가능한 미생물을 갖거나 유지하는 것이다. 식품에 생존가능한 프로바이오틱스의 농도가 소정의 임계값을 초과하지 않는 경우, 프로바이오틱스의 유익한 효과는 제공되지 않는다. 온도 및 산소에 대한 노출, 물 및 산이 프로바이오틱스 생존 능력에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 고속 혼합, 에멀젼화 및 균질화와 같은 특정 제조 공정에서 발생한 전단력이 세포 파괴 및 생존 능력의 손실을 초래할 수 있다. 이런 민감성이 제품 속에 프로바이오틱스를 혼합하고 프로바이오틱스를 다른 활성제와 혼합하여 유익한 활성이 증가된 제품을 생산하는 것을 어렵게 한다.
프로바이오틱스를 포함하는 제품은 소비자에게 맛있어야 한다. 프로바이오틱스는 제품을 섭취하는 사람 또는 동물에 의해 불쾌하다고 인식될 수 있는 풍미를 가질 수 있다. 프로바이오틱스와 함께 사용될 수 있는 활성제는 또한 불유쾌한 것으로 인식될 수 있는 풍미를 가질 수 있다.
미세입자에 프로바이오틱스를 제공하는데 일부 관심이 있었다. 미세캡슐화는 박막 또는 코팅 또는 고체/겔 기질은 프로바이오틱스와 같은 하나 이상의 활성제의 작은 입자 또는 방울을 둘러싸고, 밀봉하고 및/또는 고정하는 공정이다. 최종 미세입자는 통상적으로 형태가 구형이며 연속 벽에 둘러싸인 고체 또는 겔 기질에 갇힌 활성 재료를 함유한다. 미세캡슐화는 미세하게 분할된 상태로 하나 이상의 활성제를 제공한다.
캡슐화된 프로바이오틱은 외부 환경(예를 들어, 열, 수분, 산, 공기, 빛)에 대한 노출을 제한함으로써 분해로부터 보호될 수 있고 원하는 대로 특정 조건하에서 제어된 속도로 방출될 수 있다. 그러나, 주로 캡슐화 재료는 다공성이다. 따라서, 그럼에도 불구하고 캡슐화된 프로바이오틱은 분해성 외부 환경에 노출될 수 있다. 또한, 프로바이오틱은 다공성 미세입자로부터 새어나올 수 있고 프로바이오틱스와 관련된 임의의 풍미가 미세입자로부터 퍼져나와 이를 섭취하는 사람 또는 동물이 인식할 수 있다.
프로바이오틱를 하나 이상의 다른 활성제와 혼합하여 첨가된 유익한 활성을 가진 미세입자를 생산하는 것이 바람직할 수 있다. 이런 다른 활성제는 분해되기 쉬울 수 있고 미세입자에 외부 환경으로부터 분해 요소에 대한 활성제의 노출을 제한하기 위한 적절한 장벽 성질을 제공하는 것이 바람직하다. 게다가, 특정 활성제는 적절한 장벽 특성을 가진 미세입자를 제공함으로써 캡슐화를 통해 안정성을 부여받을 수 있다. 또한, 프로바이오틱과 유사하게, 다른 활성제는 소비자에게 불유쾌한 것으로 인식될 수 있는 풍미를 가질 수 있다. 따라서, 활성제의 임의의 풍미를 차단하기 위한 적절한 장벽 특성을 제공하는 것이 바람직하다. 상기한 대로, 캡슐화 재료는 주로 다공성이며 캡슐화된 활성제는 분해성 외부 환경에 노출되거나 다공성 미세입자로부터 새나올 수 있다. 이런 누설은 이를 섭취하는 사람 또는 동물에 의해 인식된 활성제와 관련된 풍미를 일으킬 수 있다.
미세입자 전구체 조성물을 제조할 때, 프로바이오틱의 민감성 때문에 프로바이오틱을 다른 활성제와 혼합하는 것이 어려울 수 있다. 다른 활성제를 프로바이오틱을 포함하는 미세입자 전구체 조성물의 잔존 구성요소와 혼합하면, 프로바이오틱의 세포를 파괴하고 이의 생존 능력을 손상시키는 전단율을 수반할 수 있다.
따라서 프로바이오틱스를 미세입자 속에 혼합하고 프로바이오틱스를 다른 활성제와 혼합하는 현존 방법과 관련된 하나 이상의 단점 또는 불이익을 해결하거나 완화 및/또는 이에 대한 유용한 대안을 제공할 기회가 남아있다.
본 발명은 프로바이오틱, 가교성 반응물(cross-linkable reagent), 변성 단백질, 폴리올 가소제, 트레할로스 및 담체의 혼합물(blend)을 포함하는 미세입자 전구체 조성물을 제공한다. 일부 실시태양에서, 혼합물은 소수성 활성제를 포함하는 에멀젼을 더 포함한다.
본 발명은 또한 변성 단백질, 폴리올 가소제, 트레할로스 및 담체의 혼합물을 포함하는 보호 기질 전구체 조성물을 제공한다. 또한, 변성 단백질, 폴리올 가소제, 트레할로스 및 담체와 함께 혼합하는 단계를 포함하여 보호 기질 전구체 조성물을 생산하는 방법이 제공된다.
또한, 본 발명은 프로바이오틱, 보호 기질 전구체 조성물 및 가교성 반응물을 함께 혼합하는 단계를 포함하여 미세입자 전구체 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 프로바이오틱을 보호 기질 전구체 조성물과 혼합하여 프로바이오틱-함유 기질 전구체를 형성하는 단계; 소수성 활성제를 포함하는 에멀젼을 프로바이오틱-함유 기질 전구체와 혼합하여 프로바이오틱-함유 에멀젼을 형성하는 단계; 및 프로바이오틱-함유 에멀젼을 가교성 반응물과 혼합하는 단계를 포함한다. 이 방법에 따라 생산된 미세입자 전구체 조성물이 또한 제공된다.
본 발명은 또한 본 발명의 미세입자 전구체 조성물을 미세하게 나뉜 상태로 제공하는 단계; 및 미세하게 나뉜 미세입자 전구체 조성물을 미세 입자 전구체 조성물의 가교성 반응물과 반응하는 가교제(cross-linking reagent)에 노출시켜 미세입자를 형성하는 단계를 포함하여 미세입자를 생산하는 방법을 더 제공한다.
본 발명에 따라 생산된 미세입자가 또한 제공된다
본 발명에 다른 미세입자를 포함하는 제품을 포함하는 본 발명의 이런 및 다른 양태는 이하에서 더욱 상세하게 기술된다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1은 프로바이오틱 생존능력 및 풍미 인식 테스트 결과를 도시한다.
도 2는 프로바이오틱 생존능력 테스트 결과를 도시한다.
도 3은 프로바이오틱 생존능력 테스트 결과를 도시한다.
도 4는 프로바이오틱 생존능력 테스트 결과를 도시한다.
도 5는 프로바이오틱 생존능력 테스트 결과를 도시한다.
본 발명은 보호 기질 내에 분산된 프로바이오틱의 생존 능력을 강화시키는데 사용될 수 있는 보호 기질을 제공한다. 본 발명에 따른 미세입자 전구체 조성물은 프로바이오틱, 가교성 반응물, 변성 단백질, 폴리올 가소제, 트레할로스 및 담체의 혼합물을 포함한다. 미세입자 전구체 조성물은 통상적으로 변성 단백질, 폴리올 가소제, 트레할로스 및 담체의 혼합물을 포함하는 보호 기질 전구체 조성물을 포함한다는 것을 알 것이다. 즉, 이런 구성요소(예를 들어, 폴리올 가소제, 트레할로스 및 담체)는, 적절하게 혼합될 때, 상호작용하고 결합하여 본 발명의 보호 기질을 생산하는 출발 재료 또는 성분이다. 이하에서 상세하게 기술된 것과 같이, 여러 상승적 상호작용이 보호 기질의 구성요소들 사이에 일어나서 바람직한 특성을 가진 기질을 제공한다. 이런 상호작용은 유익한 수소 및 소수성 결합을 형성하는 변성 단백질의 친수성 및 소수성 특성 및 단백질과 프로바이오틱을 안정화시키는 트레할로스뿐만 아니라 보호 기질 내에 분산된 임의의 다른 활성제의 능력을 이용할 수 있다.
본 발명은 특히 사람에 의해 섭취될 것이나, 잠재적으로 다른 동물에 의해 섭취될 미세입자에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 미세입자의 성분은 목적에 적합하도록 선택된다는 것을 당업자는 알 것이다. 즉, 사람에 의해 섭취될 미세입자의 경우에, 미세입자의 성분은 임의의 필수 기간에 의해 사람 소비를 위해 승인된다. 마찬가지로, 동물 소비를 위한 제품의 경우, 성분은 이런 용도를 위해 승인될 것이다. 예를 들어, 본 발명은 인간 소비를 위한 미세입자에 관해 일반적으로 기술된다.
일반적으로, 인간 소비에 적합한 구성요소는 먹을 수 있거나 식품-등급으로 생각될 수 있다. 즉, 구성요소는 소비될 것으로 생각되며 궁극적이고 의도한 목적에 보조적인 단순히 비독성 형태가 아니다.
본 발명은 미세입자를 포함하는 제품을 제공한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 생산된 미세입자는 약학적 또는 영양학적 제제(예를 들어, 기능식품), 식이 보충제, 기능성 식품 및 음료 제품에 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명의 미세입자로 보충(강화)된 제품이 제공된다. 일부 실시태양에서, 사람뿐만 아니라 동물용 식품 및 음료(예를 들어, 애완용 식품)는 하나 이상의 바람직한 활성제, 즉: 적어도 하나의 프로바이오틱 및 잠재적으로 하나 이상의 다른 활성제를 함유하는 본 발명의 미세입자를 사용하여 보충될 수 있다. 음료 제품의 적절한 예는 물; 우유; 콩, 쌀, 귀리 및 아몬드 "우유"를 포함하나 이에 제한되지 않는 우유 대체품; 물-기반 음료; 우유-기반 음료; 탄산 음료; 비-탄산 음료; 맥주, 와인 및 과일 및/또는 채소-기반 음료를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
적절한 과일 및/또는 채소-기반 음료는 하나 이상의 과일 추출물 및/또는 채소 추출물을 포함할 수 있다. 추출물은 관련 과일 또는 채소로 만든 주스, 넥타, 퓌레 및/또는 과육을 포함한다. 추출물은 새로 만들어지고, 가공되지 않고, 가공되고(예를 들어, 저온 살균되고) 또는 재구성될 수 있다. 하나 이상의 과일 추출물은 사과 주스, 파인애플 주스, 하나 이상의 감귤류 주스(즉, 오렌지, 귤, 레몬, 탄젤로, 금귤 등의 하나 이상 주스), 크랜베리 주스, 노니 주스, 아카이 주스, 고지 주스, 블루베리 주스, 블랙베리 주스, 라즈베리 주스, 석류 주스, 포도 주스, 살구 주스 또는 넥타, 복숭아 주스 또는 넥타, 배 주스, 망고 주스, 패션후르츠 주스 및 구아바 퓌레를 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 하나 이상의 채소 추출물은 알로에 베라 주스, 비트 주스, 당근 주스, 셀러리 주스, 양배추 주스, 시금치 주스, 토마토 주스 및 밀싹 주스를 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 채소 추출물은 생강 주스와 같은 약초 또는 향신료의 추출물을 포함할 수 있다.
프로바이오틱으로 보충될 제품의 킬로그램 또는 리터당 최대 10 그램의 미세입자가 첨가될 수 있다. 예를 들어, 보충될 제품의 킬로그램 또는 리터당 약 7 그램 내지 약 9 그램의 미세입자가 첨가될 수 있다. 보충될 제품의 킬로그램 또는 리터당 약 8 그램의 미세입자가 첨가될 수 있다. 일부 실시태양에서, 신선한 오렌지 주스와 같은 보충될 주스의 리터당 8 그램의 미세입자가 첨가될 수 있다.
단맛 액체 제제와 같은 일부 보충된 제품에서, 제품에서 미세입자의 양은 제품 중량의 최대 13%를 차지할 수 있다.
일부 실시태양에서, 미세입자로 보충된 제품은 분말이다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 제품은 식사 대체 단백질 분말이다. 이런 실시태양에서, 미세입자는 최대 1:9의 중량비로, 미세입자:분말(즉, 다른 제품 구성요소)로 분말 제품에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 미세입자는 1:49의 비로 첨가된다. 일부 다른 실시태양에서, 비는 약 1:9이다.
일부 실시태양에서, 제품의 주요 성분은 미세입자일 것이다. 일부 이런 실시태양에서, 미세입자는 제품 중량의 51% 이상일 수 있다. 예를 들어, 제품 중량의 최대 72%가 미세입자인 제품이 생산될 수 있다. 이런 제품은 약학적 제제 또는 영양학적 제제(예를 들어, 기능식품)일 수 있다.
프로바이오틱스는 점막 및 전신 면역원성을 조절할 뿐만 아니라 장관에서 장 기능과 미생물 균형을 개선함으로써 이를 섭취한 사람 또는 동물에 유익한 영향을 미치는 살아있는 미생물로 정의된다. 프로바이오틱스는 다음 비 제한적인 특성 중 하나 이상을 나타낼 수 있다: 숙주에 대한 비-병원성 또는 비-독성; 바람직하게는 많은 숫자로 생존가능한 세포로 제공되며; 장 환경에서 생존, 신진대사 및 지속 능력(예를 들어, 낮은 pH 및 위장 산과 분비액에 대한 저항); 내피 세포, 특히 위장관의 내피세포에 대한 부착력; 병원성 박테리아에 대한 살균 또는 정균 활성 또는 효과; 항암 활성; 면역 조절 활성; 특히 면역 강화; 신체 내부 균무리에 대한 조절 활성; 강화된 비뇨생식관 건강; 상처 또는 상처 주위에서 멸균 활성 및 강화된 상처 치료; 설사 감소; 알레르기 반응 감소; 신생아 궤사성 장염 감소; 염증성 장 질환 감소; 및 장 투과성 감소.
본 발명에서 활성제로서 사용된 프로바이오틱은 Saccharomyces, Debaromyces, Candida, Pichia 및 Torulopsis와 같은 효모, Aspergillus, Rhizopus, Mucor, 및 Penicillium와 같은 곰팡이, 및 Bifidobacterium, Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Melissococcus, Propionibacterium, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Staphylococcus, Peptostrepococcus, Bacillus, Pediococcus, Micrococcus, Leuconostoc, Weissella, Aerococcus, Oenococcus 및 Lactobacillus 속과 같은 박테리아뿐만 아니라 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되나 이에 제한되지 않는다.
적절한 프로바이오틱스의 예는 Saccharomyces cereviseae (boulardii), Bacillus coagulans, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbruckii subsp . lactis, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus (Lactobacillus GG), Lactobacillus sake, Lactobacillus salivarius, Lactococcus lactis, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus halophilus, Streptococcus faecalis, Streptococcus thermophilus 및 Saccharomyces boulardii를 포함한다. 더욱 구체적으로 프로바이오틱은 Lactobacillus casei Lc431, Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724, Bifidobacterium lactis BB12, Bifidobacterium lactis CNCM I-3446, Bifidobacterium longum ATCC BAA-999, Lactobacillus paracasei CNCM I-2116, Lactobacillus johnsonii CNCM I-1225, Lactobacillus fermentum VRI 003, Bifidobacterium longum CNCM I-2170, Bifidobacterium longum CNCM I-2618, Bifidobacterium breve, Lactobacillus paracasei CNCM I-1292, Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103, Enterococcus faecium SF 68, Lactobacillus reuteri ATCC 55730, Lactobacillus reuteri ATCC PTA 6475, Lactobacillus reuteri ATCC PTA 4659, Lactobacillus reuteri ATCC PTA 5289, Lactobacillus reuteri DSM 17938 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 일부 바람직한 실시태양에서, 미세입자는 Lactobacillus casei Lc431 또는 Bifidobacterium lactis BB12 함유할 수 있다.
프로바이오틱은 살아있고 번식 또는 군집화할 수 있는 경우 생존가능하다. 미세입자에서 생존가능한 프로바이오틱스의 농도는 특정 임계값을 초과해야 하며 그렇지 않으면 프로바이오틱스의 유익한 효과가 제공되지 않는다. 프로바이오틱스의 양은 통상적으로 콜로니 형성 단위(CFU)의 면에서 평가된다. 통상적으로, 1백 내지 2백만 CFU의 복용량이 성인이 프로바이오틱스의 유익한 효과를 얻기 위해 필요로 하다. 이런 정도의 복용량을 얻기 위해서, 미세입자에서 생존가능한 프로바이오틱의 적재량은 주로 약 50억 내지 100억 CFU/g, 예를 들어, 미세입자 중량의 약 2.5% 내지 약 5%이다. 일부 실시태양에서, 프로바이오틱의 적재량은 미세입자 중량의 약 2.5%이다. 일부 다른 실시태양에서, 프로바이오틱의 적재량은 미세입자 중량의 약 4%일 수 있다.
일부 실시태양에서, 미세입자는 프로바이오틱스 이외에 하나 이상의 활성제를 포함할 수 있다. 적절한 추가 활성제는 소비 또는 필요에 따라 다른 목적을 위해 미세캡슐화 형태로 통상적으로 제공된 다양한 기능성 기질로부터 선택될 수 있다. 이런 활성제는 다음을 포함한다:
동물 사료 보충제;
생선 오일, 예를 들어,(오메가-3)와 같은 오일;
이부로펜 및 젠타마이신과 같은 약제;
리소자임 및 인슐린과 같은 효소; 및
비타민 A, E, D, K1, B12, B9, B1 및 B6와 같은 비타민.
프로바이오틱스 이외에 사용될 수 있는 특정 활성제는 소수성 활성제일 수 있다. 소수성 활성제는 일반적으로 물에 혼합되지 않는 활성 화합물이다. 이런 활성제는 수 혼합성 용매와 함께 용액으로 제공되는 지질 또는 활성제일 수 있다. 이런 수 혼합성 용매는 지질일 수 있다.
지질인 소수성 활성제는 생선 오일과 같은 영양 오일을 포함한다. 본 발명에 사용된 용어 "생선 오일"은 생선 및/또는 다른 바다 유기체(들)로부터 유래된 오일을 의미한다. 예를 들어, 생선 오일은 크릴 새우, 오징어(squid), 캐비어, 전복, 조가비, 멸치, 메기, 조개, 대구, 청어, 호수 송어, 고등어, 멘하덴, 오렌지 러피, 연어, 정어리, 필차드, 숭어, 농어, 상어, 새우, 송어 및 참치 및 이의 조합으로부터 유래된 오일을 포함한다.
생선 오일은 오메가-3 지방산의 원료이다. 오메가-3 지방산의 다른 원료는 호두, 아마인(flaxseed), 평지(캐놀라), 시아(통상적으로 Salvia hispanica) 씨 및 대마 씨 오일과 같은 오메가-3 지방산이 풍부한 식물-기반 오일을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 따라서, 오메가-3 지방산의 원료는 본 발명의 목적을 위한 소수성 활성제일 수 있다.
오메가-3 지방산의 원료가 생선 오일 또는 식물-기반 오일일 때, 오일은 미정제 오일, 부분 정제 오일, 정제 오일 또는 오일 농축물일 수 있다.
일부 실시태양에서, 활성제가 오메가-3 지방산의 원료(예를 들어, 생선 오일)일 때, 미세입자에서 소수성 활성제의 양은 미세입자 중량의 최대 20%를 차지할 수 있다. 일부 실시태양에서, 소수성 활성제의 양은 미세입자의 약 10%일 수 있다.
용어 "오메가-3 지방산"은 지방산 사슬의 메틸 말단으로부터 3번째와 4번째 사이의 탄소-탄소 이중 결합을 가진 간 사슬의 불포화 지방산을 의미한다. 일반적인 오메가-3 지방산은 알파 리놀레산(C18:3;(9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트라이에노산, "ALA"), 에코사펜타에노산(C20:5;(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-이코사-5,8,11,14,17-펜타에노산, "EPA") 및 도코사헥세에노산(C22:6; (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-도코사-4,7,10,13,16,19-헥사에노산, "DHA")을 포함한다. 다른 일반적인 오메가-3 지방산은 스테아리돈산(C18:4), 에코사테트라에노산(C20:4) 및 도코사펜타에노산(C22:5)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 목적을 위해 소수성 활성제인 다른 오일은 아보카도 오일, 살구 오일, 아르간 오일, 달맞이꽃 오일, 마늘 오일 및 페파민트 오일을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
소수성 활성제는 지질-수용성 비타민일 수 있으며, 본 발명에서 사용될 수 있는 지질-수용성 비타민은 예를 들어 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K 및 유비퀴논을 포함한다.
비타민 A는 레티놀(비타민 A1 알코올), 레티날(비타민 A1 알데하이드), 비타민 A1 산, 3-디하이드로레티놀(비타민 A2 알코올) 및 3-디하이드로레티날(비타민 A2 알데하이드)과 같은 비타민 A 및 β-카로틴(β,β-카로틴), α-카로틴(β,ε-카로틴) 및 γ-카로틴(β,Ψ-카로틴)과 같은 프로비타민 A를 포함한다. β-카로틴과 같은 프로비타민 A는 본 발명의 미세입자 속에 혼합하기 위한 특히 바람직한 활성제일 수 있다. 일부 실시태양에서, β-카로틴은 프로바이오틱 및 생선 오일과 조합하여 사용될 수 있다.
비타민 D는 예를 들어 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 D4, 비타민 D5, 비타민 D6 및 비타민 D7 및 이의 프로비타민과 같은 비타민 D를 포함한다.
비타민 E는 예를 들어 α-토코페롤, β-토코페롤, γ-토코페롤 및 δ-토코페롤과 같은 토코페롤 및 α-토코트라이에놀, β-토코트라이에놀, γ-토코트라이에놀 및 δ-토코트라이에놀과 같은 토코트라이에놀을 포함한다.
비타민 K는 예를 들어 비타민 K1 및 비타민 K2를 포함한다.
유비퀴논은 예를 들어 유비퀴논-1 내지 유비퀴논-12(Q-1 내지 Q-12) 및 이의 산화 형태 및 이의 아미노 염화물 화합물을 포함한다.
지질-가용성 비타민과 같은 소수성 활성제는 통상적으로 본 발명에 사용하기에 적합한 형태로 만들기 위해 지질(수 혼합성 용매로 작용)에 용해될 것이다. 지질은 포화 또는 불포화인 오일, 왁스, 지방산, 지방 알코올, 모노글리세롤 및 트라이글리세롤일 수 있다. 일부 실시태양에서, 지질의 혼합물이 사용될 수 있다.
일반적으로, 소수성 활성제를 용해하도록 선택된 지질 또는 지질들은 액체일 것이다. 즉, 지질은 25℃ 이하, 바람직하게는 10℃ 이하의 용융점을 가진다. 일부 실시태양에서, 지질은 미세입자의 저장 온도보다 낮은 용융점을 갖는 것이 바람직하다. 액체 지질이 주로 선택되는데 이들이 다른 구성요소와 더욱 쉽게 에멀젼화되어 소수성 활성제를 포함하는 에멀젼을 형성할 수 있기 때문이다. 고체 지질은 활성제와 효과적으로 혼합되기 위해서, 이들의 용융 온도 이상으로 가열될 수 있거나 다른 지질일 수 있는 적절한 용매에 용해될 필요가 있다. 통상적으로, 고체 지질이 사용되는 경우, 이들은 먼저 적절한 용매(예를 들어 액체 지질)와 혼합되어 25℃ 이하, 바람직하게는 10℃ 이하의 액체인 지질 혼합물을 생산한다.
액체 지질은 또한 미세입자를 섭취하는 사람 또는 동물에 의해 더욱 쉽게 소화될 수 있다. 따라서, 액체 지질의 선택은 지질에 용해된 임의의 활성제가 최적 시간에 방출되는 것을 보장하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 실시태양에서 사용된 지질은 여러 다른 원료로부터 유래될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 실시태양에서 사용된 지질은 생물학적 지질을 포함할 수 있다. 생물학적 지질은 채소 오일과 같은 식물의 임의의 형태 또는 동물에 의해 생산된 지질(지방 또는 오일)을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 사용된 생물학적 지질은 트라이글리세라이드를 포함한다.
식물로부터 유래된 여러 다른 생물학적 지질이 사용될 수 있고, 이런 식물은 유전적으로 변형된 작물일 수 있다. 예를 들어, 식물-기반 지질은 대두 오일, 캐놀라 오일, 목화씨 오일, 포도씨 오일, 겨자씨 오일, 옥수수 오일, 아마인 오일, 잇꽃 오일, 해바라기씨 오일, 양귀비씨 오일, 피칸 오일, 호두 오일, 땅콩 오일, 쌀겨 오일, 동백 오일, 올리브 오일, 팜 오일, 팜 커널 오일 및 코코넛 오일 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 다른 식물 기반 지질은 아몬드, 아르간, 아보카도, 바바수 오일, 너도밤나무, (모링가 올레이페라의 씨로부터의) 벤(ben), 보르네오 탈로우 넛, 브라질 넛, 카멜리나, 카리오카르(뻬끼), 캐슈 넛, 코코아, 코훈 팜, 고수, 박(예를 들어, 버터넛 스콰시 씨 오일, 호박 씨 오일 및 수박 씨 오일), 삼, 케나프, 마카다미아, 눅 어비시니아(noog abyssinia), 페릴라(perilla), 필리 넛(pili nut), 퀴노아(quinoa), 사카 인치(sacha inchi), 세제(seje), 참깨, 시아넛, 차 씨 및 파파야 씨로부터 얻을 수 있다. 이들은 단독으로 또는 다른 지질과 조합으로 사용될 수 있다.
동물로부터 유래된 지질이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 화이드 그리스, 라드(돼지 지방), 탈로우(소 지방), 무수 우유 지방, 및/또는 가금류 지방이 사용될 수 있다. 그러나, 상기한 대로, 25℃ 이하의 용융점을 가진 액체 지질이 바람직하다.
지질은 다음 화학식의 합성 트라이글리세라이드일 수 있다.
Figure 112015063039584-pct00001
여기서 R1, R2 및 R3는 동일하거나 다를 수 있으며 7 내지 약 23개 탄소 원자를 함유하는 지방족 하이드로카빌 그룹이다. 본 발명에 사용된 용어 "하이드로카빌 그룹"은 분자의 나머지에 직접 부착된 탄소 원자를 가진 라디칼을 의미한다.
지방족 하이드로카빌 그룹은 다음을 포함한다:
(1) 지방족 탄화수소 그룹: 즉, 헵틸, 논일, 운데실, 트라이데실, 헵타데실과 같은 알킬 그룹; 헵텐일, 노넨일, 운데센일, 트라이데센일, 헵타데센일, 헨에이코센일과 같은 단일 불포화 결합을 함유하는 알켄일 그룹; 복수 불포화결합을 함유하는 알켄일 그룹; 및 이의 모든 이성질체.
(2) 카바알콕시 그룹의 하이드록시와 같은 비-탄화수소 치환체를 함유하는 치환된 지방족 탄화수소 그룹.
(3) 이형 그룹; 즉, 지배적으로 지방족 탄화수소 특성을 가지면서, 지방족 탄소 원자로 구성된 사슬 또는 고리에 존재하는 산소, 질소 또는 황과 같은 탄소 이외의 다른 원소를 함유하는 그룹.
여러 생물학적 지질은 불순물을 제거하기 위해 이들의 천연 원료로부터 추출 이후 가공될 것을 필요로 한다. 예를 들어, 지질은 탈검되어 인지질을 제거하고, 표백되어 불순물과 오일에 색을 제공할 수 있는 엽록소 및 카로티노이드를 제거하고 분별증류하여 정제 오일에 바람직하지 않은 맛 및/또는 냄새를 제공할 수 있는 유리 지방산을 제거할 수 있다. 본 발명에 사용된 "분별증류" 및 이와 관련된 용어는 덜 휘발성인 구성요소가 더욱 휘발성인 구성요소로부터 분리되는 공정을 의미하며, 통상적으로 식물-유래 생물학적 지질(오일)에서 유리 지방산으로부터 트라이글리세라이드의 분리를 포함한다.
처리는 지질의 수소화를 포함할 수 있다. 이런 공정에서, 지질은 지질에서 불포화 결합을 환원시킴으로써 수소화된다. 이것은 주로 니켈 촉매와 같은 촉매의 존재하에서 지질을 수소에 노출함으로써 성취된다. 수소화는 완전할 수 있거나 불완전할 수 있다. 불완전 수소화 지질은 수소처리되지 않은 지질 및 완전 수소화 지질의 혼합물을 포함할 수 있다.
지질을 수소화하는 것은 산화에 대한 지질의 민감성을 감소시키기 때문에 유리할 수 있다. 일부 지질은 특히 산화에 민감하여, 고약한 냄새를 유도하여 불유쾌한 풍미를 일으키며, 이런 지질의 수소화는 유용할 수 있다. 그러나, 수소화는 지질의 용융점을 증가시킬 수 있어서, 액체 지질을 고체 지질로 변형시키며, 이것이 지질이 조성물의 다른 구성요소와 혼합될 수 있는 용이함에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 지질이 수소화될 수 있는 정도는 용융점의 임의의 증가가 지질이 소수성 활성제를 용해하는데 사용될 수 있는 용이함에 미칠 영향을 고려하여 선택될 것이다.
바람직하게는, 지질은 아몬드 오일, 캐놀라 오일, 대구 간 오일, 옥수수 오일, 목화씨 오일, 아마인 오일, 포도씨 오일, 땅콩 오일, 잇꽃 오일, 참깨 오일, 대두 오일, 해바라기 오일, 호두 오일, 코코넛 오일 또는 팜 커널 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택된 식물-기반 지질일 수 있다. 일부 실시태양에서, 소수성 활성제(예를 들어 지질-수용성 비타민)은 자체로 소수성 활성제로 구성된 지질(예를 들어 아마인 오일과 같은 오메가-3 지방산에 풍부한 오일)에 용해될 수 있다는 것을 알 것이다.
본 발명의 미세입자는 통상적으로 구형이다. 따라서, 이들은 약 10㎛ 내지 50㎛의 지름을 가진다. 일반적으로, 미세입자는 적어도 1000㎛ 미만인 치수를 가진다. 그러나, 본 발명의 미세입자는 통상적으로 작으며 적어도 50㎛ 미만인 치수를 가진다.
본 발명에 따른 미세입자는 곱게 나뉜 상태로 가교성 미세입자 전구체 조성물을 제공하고 이를 가교제와 접촉시킴으로써 제조될 수 있다. 본 발명에서 용어 "가교"(및 이의 변형)는 일반적으로 원자의 둘 이상의 폴리머 사슬 사이에 화학적 연결을 의미한다. 본 발명에 따른 가교성 미세입자 전구체 조성물은 가교성 반응물을 포함한다. 가교성 반응물은 분자일 수 있는데, 통상적으로 가교될 수 있는 그룹 또는 모이어티를 포함하는 폴리머 포함 반복 단위일 수 있다. 가교는 분자를 네트워크 속에 서로 결합시켜, 더 큰 분자 상부구조를 형성한다. 가교는 이온 결합, 배위 결합(dative), 착화 및 배위(coordination) 결합, 공유 결합일 수 있으며 또한 수소-결합 상호작용을 필요로 할 수 있다. 따라서, 이온성 가교성 폴리머는 일반적으로 이온성 가교제와 반응하여 가교를 형성하여 미세입자를 형성할 수 있는 폴리머 분자이다. 이온성 가교는 가역적 또는 비가역적일 수 있다. 이온성 가교성 반응물은 하나 이상의 이온화가능 그룹을 가진다. 용어 "이온화가능 그룹"은 부분 또는 완전 이온화가 가능한 화학적 모이어티를 의미한다.
가교성 반응물은 염기성 폴리머 전해질(폴리머 염기), 염기성 아이오노머, 산성 폴리머 전해질(폴리머 산) 또는 산성 아이오노머일 수 있다. 일부 실시태양에서, 가교성 반응물은 하나 이상의 음이온성 모노머 또는 폴리머 양이온으로부터 선택된다. 본 발명에 사용된 용어 "폴리머 양이온" 또는 "양이온 폴리머"과 같은 관련 용어는 양으로 하전된 거대분자로 구성된 폴리머를 의미한다. 일부 실시태양에서, 가교성 반응물은 하나 이상의 음이온성 모노머 또는 폴리머 음이온으로부터 선택된다.
적절한 가교성 폴리머는 하이드로콜로이드를 포함하는 하이드로겔의 종류로부터 선택될 수 있다. 하이드로콜로이드는 일반적으로 여러 하이드록실 그룹을 함유하는 채소, 동물, 미생물 또는 합성 기원의 친수성 폴리머이며 고분자 전해질일 수 있다. 이온 가교성이 아닌 하이드로콜로이드는 이온 가교성인 폴리머와 혼합하여 사용될 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 폴리머는 폴리바이닐 알코올, 알지네이트, 카라긴, 펙틴, 카복시 메틸 셀룰로오스, 히알루로네이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 헤파란, 키토산, 카복시메틸 키토산, 아가, 아라비아 검, 풀루란, 젤라틴, 잔탄, 트라가캔트, 카복시메틸 전분, 카복시메틸 데스트란, 콘드로이틴 설페이트를 포함하는 콘드로이틴, 더마탄, 양이온 구아 및 로커스트 빈, 곤약, 가티검, 자일로글루칸, 카라야 검, 양이온성 전분뿐만 아니라 이의 염 및 에스터를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
예시적 음이온성 폴리머는 알지네이트, 펙틴, 카복시 메틸 셀룰로오스, 히알루로네이트의 하나 또는 혼합물을 포함한다. 예시적 양이온성 폴리머는 키토산, 양이온성 구아 및 양이온성 전분을 포함한다.
본 발명의 미세입자가 생산될 수 있는 음이온성 가교성 폴리머는 카복실, 설페이트, 포스페이트, 설폰아미도, 포스폰아미도, 하이드록시 및 아민 작용기로 기능화될 수 있다.
가교제는 무기염의 용액일 수 있다. 일반적으로, 적절한 가교성 반응물은 용해된 이온의 용액이다. 가교성 반응물을 가교하는데 사용된 가교 이온은 가교성 반응물이 음이온 가교성 또는 양이온 가교성인 지에 따라 음이온 또는 양이온일 수 있다. 적절한 생적합성 가교 이온은 칼슘, 마그네슘, 바륨, 스트론듐, 아연, 붕소, 베릴륨, 알루미늄, 철, 구리, 코발트, 니켈, 납 및 은 이온 또는 이의 임의의 둘 이상의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 양이온을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 음이온은 카복실레이트, 포스페이트, 설페이트, 옥살레이트, 바이카보네이트 및 카보네이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되나 이에 제한되지 않는다. 더욱 넓게는, 음이온은 폴리머 염기 유기 또는 무기산으로부터 유래된다. 바람직한 가교 양이온은 칼슘 이온이다.
본 발명의 한 바람직한 실시태양에서, 미세입자의 형성은 솔-겔 상 전이에 의해 일어나며 본 실시태양에서 사용된 시약은 적절하게 선택되어야 한다. 따라서, 원칙적으로 미세입자 전구체 조성물의 다른 구성요소와 혼합된 가교성 반응물 및 가교제는 가교성 반응물과 결합된 솔-겔 상 전이에 의해 미세입자의 형성을 초래할 임의의 적절한 조합으로부터 선택될 수 있다. 미세입자 속에 혼합된 활성제(들)(즉, 프로바이오틱 및 임의의 다른 활성제)와 반응물의 상용성 및 미세입자에 존재할 때 이런 활성제의 방출 특성이 고려될 필요가 있을 것이다. 따라서, 시약의 선택은 또한 미세입자의 최종 사용에 의존할 것이며 의도한 사용 기간 동안 활성제(들)의 안정성을 최적화하기 위해, 보호 기질의 구성요소를 포함하는 다른 구성요소가 포함될 수 있다.
본 발명은 가교성 반응물로서 알지네이트의 사용을 참조하여 (비-제한적인) 예시의 목적을 위해 기술될 것이다. 알지네이트는 본 발명에 사용하기 위해 특히 바람직한데 이는 이들이 생리학적으로 허용가능하며 적절한 양이온과 결합한 후 열적으로 안정한 겔을 형성하기 때문이다. 알지네이트의 이온성 겔화는 특정 이온에 대한 친화력 및 결합 능력을 기초로 한다. 알지네이트는 Ca2 +, Sr2 +, Zn2 +, Co2 + 및 Ba2 +와 같은 2가 양이온과 강하고 안정한 겔을 형성한다. Fe3 + 및 Al3 +와 같은 3가 양이온은 겔화에 영향을 미칠 수 있다. 1가 양이온과는 겔화가 없다.
본 발명에서 알지네이트 겔의 사용이 또한 유리한데 이는 이런 겔은 바람직한 활성제 방출 특성을 나타낼 수 있기 때문이다. 예를 들어, 알지네이트 겔은 수축되기 때문에 낮은 pH 조건에서 안정성을 나타내며 팽창하고 분해되지 않는다. 따라서 활성제 방출은 낮다. 한편, 알지네이트 겔은 약 알칼리성 조건에서 빠르게 팽창하고 용해 및/또는 분해를 나타낸다. 이런 특성은 알지네이트 겔이 프로바이오틱스 및 다른 활성제를 사람 장(6.7 이상의 pH)에 전달하는데 효과적으로 사용되게 한다. 알지네이트 겔은 또한 점막-부착성이며 연장된 기간 동안 장 점막에 부착하는 경향이 있다. 따라서, 알지네이트 겔의 사용은 프로바이오틱스와 같은 특정 활성제의 전달에 특히 유리할 수 있다.
여러 인자가 알지네이트 겔 형성에 영향을 미치며 이들은 본 발명을 실시할 때 고려될 필요가 있다. 한 인자는 만누로네이트(M) 잔기의 우세 및 길이에 대한 글루코네이트(G) 잔기의 우세 및 길이이다. M/G 비는 적어도 Ca2 + 가교에 관하여 중요한 인자이다. M/G 비가 감소함에 따라, Ca2 + 이온 농도에 대한 요구는 효과적인 가교를 위해 증가한다. 높은 G 함유량을 가진 알지네이트로 형성된 겔은 또한 더 딱딱하며, 더 깨지기 쉽고 더 다공성이며 더 긴 시간 동안 강도 및 무결성을 유지하는 경향이 있다. 이런 겔은 가교 시에 과도하게 팽창하지 않는다. 높은 M 함량을 가진 알지네이트는 높은 수축을 가진 더 부드럽고, 덜 다공성인 탄성 겔을 형성하는 경향이 있다. 이런 겔은 높은 G 함유량 알지네이트 겔보다 더욱 잘 팽창하고, 더욱 쉽게 용해하고 더욱 크기가 증가한다. 겔 강도는 또한 알지네이트 농도의 증가 및 더 높은 G 함유량과 함께 증가한다.
가교제로서 CaCl2를 사용하는 것을 참조하여, 최대 약 0.2M, 예를 들어 약 0.1M 내지 0.2, 예를 들어, 약 0.1M의 농도가 사용될 수 있다.
알지네이트의 사용과 관련된 한 이점은 겔의 열 사용이 안정하고 온도(최대 물의 끓는점)에 영향을 받지 않는다는 것이다. 그러나, 겔화의 운동에너지는 필요에 따라 지배적인 온도를 조절함으로써 변형될 수 있다.
이런 인자 및 기타는 겔 형성 및 겔 특성에 대해 원하는 결과를 성취하도록 조작될 수 있다. 이런 종류의 인자는 또한 다른 형태의 가교성 반응물 및 가교제를 사용할 때 고려될 것이다.
본 발명의 특정 실시태양에서, 가교성 반응물은 알지네이트와 펙틴의 혼합물일 수 있다. 펙틴은 식물 세포 벽에서 일반적으로 발견된 생분해성 산성 탄화수소 폴리머이다. 펙틴은 중성 당 잔기 및 메틸기와 아세틸기와 같은 비-당 구성요소로 변형될 수 있는 α-(1→4)-연결 폴리갈락투론산 및 람노스 잔기 주쇄로 이루어질 수 있다. α-(1→4)-연결 폴리갈락투론산 주쇄를 따르는 람노스 삽입 및 다른 변형의 정도는 식물 원료에 따라 변한다. 갈락투론산 함유량은 일반적으로 70% 초과인 반면 람노스 함유량은 통상적으로 <2%이다. 람노스 잔기는 주쇄에서 갈락투론산 잔기에 연결된 α-(1→2)이다. 이들은 주쇄 사슬에 T-형태 얽힘의 형성을 일으키며 람노스 함유량의 증가는 더욱 유연한 분자를 유도한다. 중성 당 측쇄는 O-3 또는 O-4 위치에서 주쇄에 있는 람노스 잔기에 연결된다. 람노스 잔기는 주쇄 상에서 함께 덩어리를 형성하는 경향이 있다.
메틸화는 갈락투론산 잔기의 카복실기에서 일어난다. 메틸화 또는 메틸-에스테르화의 정도는 메탄올과 에스테르화된 카복실기(갈락투론산 잔기)의 백분율로 정의된다. 메틸화 또는 메틸-에스테르화의 정도를 기초로, 펙틴은 <50%의 메틸화 또는 메틸-에스테르화의 등급을 가진 저 메톡실 펙틴 및 >50%의 메틸화 또는 메틸-에스테르화의 등급을 가진 고 메톡실 펙틴, 두 종류로 나뉜다.
고 및 저 메톡실 펙틴 모두는 겔을 형성한다. 그러나, 이런 겔은 다른 메커니즘을 통해 형성된다. 고 메톡실 펙틴은 낮은 pH에서 고농도의 공동-용해물(수크로오스)의 존재하에서 겔을 형성한다. 저 메톡실 펙틴은 Ca2 +, Sr2 +, Zn2 +, Co2 + 및 Ba2+, Ca2 + 이온과 같은 2가 양이온의 존재하에서 겔을 형성한다. 2가 양이온-저 메톡실 펙틴 겔 네트워크는 일반적으로 2가 양이온이 2개의 일련의 폴리갈락투론산 사슬의 가교를 일으키는 "에그-박스(egg-box)" 연결 지역으로 불리는 것의 형성에 의해 만들어진다.
고 메톡실 펙틴은 일반적으로 2가 양이온과 반응성이 없으며, 따라서 2가 양이온 겔을 형성할 수 없다. 그러나, 특정 고 메톡실 펙틴은 칼슘 민감성이며 칼슘 겔을 형성할 수 있는 것으로 보고되었다. 또한, 고 메톡실 펙틴은 블럭 형태 탈-에스테르화 고정에 의해 >50%의 메틸화 또는 메틸-에스테르화 등급을 가지면서 칼슘-반응성이 된다.
따라서, 저 메톡실 펙틴은 일반적으로 알지네이트와 펙틴의 혼합물이 가교성 반응물로서 사용되는 본 발명의 실시태양에 바람직하다. 이런 방식으로, 이런 조합이 사용될 때, 동일한 가교제가 알지네이트와 펙틴 모두에 대해 사용될 수 있다. 예를 들어, 가교제는 CaCl2일 수 있다. 사실은, 저 메톡실 펙틴은 칼슘에 대해 더 높은 친화력을 가질 수 있어서, 저 메톡실 펙틴과 알지네이트의 조합은 가교 알지네이트 단독의 것과 비교하여 개선된 겔 강도를 가진 가교 기질을 생산할 수 있다.
칼슘-저 메톡실 펙틴 겔 형성은 메틸화 또는 메틸-에스테르화의 등급, 이온 강도, pH 및 분자량을 포함하는 여러 인자에 의해 영향을 받는다. 메틸화 또는 메틸-에스테르화의 등급이 낮고 분자량의 높을수록, 겔화는 더 효과적이다. 게다가, 칼슘-저 메톡실 펙틴 겔화는 약 3.5보다 약 7.0의 중성 pH에서 더욱 효과적이다. 마지막으로, 1가 양이온의 첨가(예를 들어, Na+를 제공하는 NaCl의 첨가)는 겔화를 강화시키는데, 즉 더 적은 칼슘이 겔 형성에 필요하다.
저 메톡실 펙틴은 통상적으로 화학적 탈-에스테르화 공정을 통해 얻어진다. 상업용 저 메톡실 펙틴은 통상적으로 20-50%의 메틸화 또는 메틸-에스테르화의 등급을 가진다. 완전히 탈-에스테르화된 펙틴은 "펙틴산" 또는 "폴리갈락투론산"으로 불릴 수 있다. 산 형태의 펙틴산은 불용성이나 염 형태로는 가용성이다. 펙틴산의 일반적인 염 형태는 나트륨염 또는 칼륨염이다.
상업용 펙틴은 주로 귤과 사과로부터 유래된다. 그러나, 귤과 사과 이외에, 펙틴은 알로에 베라와 같은 여러 다른 식물로부터 분리될 수 있다. 알로에 베라 잎은 외부 녹색 껍질과 펄프라고도 불리는 깨끗한 내부 겔, 두 부분으로 이루어진다. 알로에 펙틴은 내부 겔 또는 외부 껍질 세포벽 섬유로부터 추출된다. 약 알칼리성 pH에서 킬레이트제의 사용이 가장 효과적인 추출 방법인 것으로 발견되었다. 알로에 베라 펙틴은 <10% 정도로 낮을 수 있는 일반적으로 <30% 메틸화 또는 메틸-에스테르화의 등급을 가진 자연적으로 저 메톡실 펙틴이며 2가 양이온 겔화가 가능하다. Na+, K+ 또는 Li+와 같은 1가 양이온은 겔의 형성을 촉진한다. 또한, 알로에 베라 펙틴은 특히 겔화와 관련된 여러 독특한 화학적 성질을 가진다. 예를 들어, 알로에 베라는 >1x106 Da의 높은 분자량 및 >550ml/g의 높은 고유 점도를 가진다. 또한, 귤, 사과, 당 비트 및 해바라기와 같은 식물로부터 유래된 다른 펙틴의 함유량의 적어도 2배인 >4%의 높은 람노스 함유량을 가진다. 람노스는 펙틴 주쇄에서 중 당이며 이의 함유량은 분자의 유연성에 영향을 미친다. 알로에 베라 펙틴은 또한 임의의 다른 펙틴에서 기술되지 않은 희귀 당, 3-OMe-람노스를 가진다. 알로에 베라 펙틴의 갈락투론산 함유량은 >70%이며 >90% 정도로 높을 수 있다. 특성 때문에, 알로에 베라는 본 발명의 일부 실시태양에 대해 바람직한 펙틴일 수 있다.
키토산 + 트라이폴리포스페이트, 카복시메틸셀룰로오스 + Al3 +, k-카라기난 + K+, k-카라기난 + NH4 +, 펙틴 + Ca2 +, 젤란 검 + Ca2 + 및 폴리포스파젠 + Ca2 +를 포함하는 가교성 반응물 및 가교제의 다른 조합이 본 발명에 사용될 수 있다.
가교성 반응물은 일반적으로 물 또는 수용액과 같은 용매를 가진 용액에 알지네이트 또는 펙틴과 같은 가교성 폴리머를 포함한다. 통상적으로, 용액에서 가교 폴리머의 농도는 약 5% w/w 내지 약 15% w/w, 바람직하게는 약 8% w/w 내지 약 12% w/w, 바람직하게는 약 10% w/w일 것이다. 사용된 가교성 반응물의 양은 미세입자 전구체 조성물에서 가교성 폴리머의 농도가 약 2% w/w 내지 약 8% w/w, 바람직하게는 약 3% w/w 내지 약 6% w/w, 바람직하게는 약 3% w/w 내지 약 4% w/w일 수 있는 양일 수 있다. 예를 들어, 가교성 반응물이 알지네이트와 펙틴의 혼합물인 실시태양에서, 미세입자 전구체 조성물에서 소듐 알지네이트의 농도는 약 2% w/w일 수 있고 펙틴의 농도 또한 약 2% w/w일 수 있다. 가교성 반응물이 알지네이트와 펙틴의 혼합물인 일부 다른 실시태양에서, 미세입자 전구체 조성물에서 소듐 알지네이트의 농도는 약 2% w/w일 수 있고 펙틴의 농도 또한 약 1% w/w일 수 있다. 일부 실시태양에서, 미세입자 전구체 조성물에서 소듐 알지네이트의 농도는 약 2% w/w일 수 있고 펙틴의 농도 또한 약 1% w/w 내지 약 2% w/w일 수 있다.
가교 하이드로겔 기질은 주로 다공성이다. 본 발명은 미세입자 다공성을 감소시키기 위해 보호 기질을 포함하는 미세입자를 제공한다. 미세입자 다공성을 감소시킴으로서, 미세입자에 있는 프로바이오틱의 외부 환경에 대한 노출을 예방하거나 감소시킬 수 있고 미세입자로부터 프로바이오틱의 누출을 예방하거나 감소시킬 수 있다.
일부 실시태양에서, 미세입자 전구체 조성물의 하나 이상의 다른 구성요소는 보호 기질 전구체의 모든 구성요소가 함께 혼합되기 전에 보호 기질 전구체 조성물의 구성요소에 첨가될 수 있다. 본 발명에 사용된 대로, 보호 기질 전구체 조성물은 가교성 반응물 및 가교제를 제외하고, 미세입자의 임의의 구성요소를 포함하는 혼합물을 포함한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 미세입자 전구체 조성물은 보호 기질 전구체 조성물 및 가교성 반응물의 혼합물로 생각될 수 있다.
본 발명에 의해 제공된 보호 기질은 풍미를 차단 및/또는 풍미가 발생하는 것을 막을 수 있다. 따라서, 특정 실시태양에서, 미세입자는 특히 풍미가 소비자에게 불유쾌한 것으로 인식될 수 있을 때, 미세입자에서 있는 프로바오틱 또는 임의의 다른 활성제의 임의의 풍미를 차단할 수 있다.
본 발명에 사용된 "풍미"는 미세입자를 섭취하는 사람 또는 동물에 의해 인식될 수 있는 맛 또는 냄새를 포함한다. 이런 풍미는 소비자에 의해 불유쾌한 풍미로 인식될 수 있다. 본 발명에 사용된 "불유쾌한 풍미"는 미세입자의 소비자에 의해 불쾌하거나 "상한" 것으로 인식될 수 있는 맛 또는 냄새를 포함한다. 이런 풍미는 떫고, 쓰고, 곰팡내 나고, 덤덤하고, 연상시키거나 진부하고, 비린내 나는, 유황(즉, 분해하는 단백질과 관련된 냄새 또는 맛), 금속성, 썩은 내 나는 및/또는 일반적으로 이국적일 수 있다. 풍미는 보호 기질 자체 및/또는 임의의 활성제를 포함하는 미세입자의 하나 이상의 구성요소에 고유할 수 있다. 선택적으로 또는 추가로, 풍미는 부분적으로 또는 완전히 분해하는 미세입자의 하나 이상의 구성요소로부터 얻을 수 있다.
일부 실시태양에서, 미세입자에 있는 프로바이오틱 또는 다른 활성제는 자연히 불유쾌한 것으로 생각되는 풍미를 갖지 않을 수 있다. 그러나, 그럼에도 불구하고 이런 활성제의 풍미를 차단하는 것이 바람직할 수 있는데 이는 풍미가 미세입자가 혼합될 수 있는 제품의 품질을 손상시킬 수 있기 때문이다. 예를 들어, 미세입자는 식이 보충제, 기능성 식품 및 음료 제품 속에 혼합될 수 있고 이런 상품에서 활성제의 풍미가 상품의 풍미를 손상시키지 않는 것이 바람직할 수 있다. 예로서, 미세입자가 보충된(강화된) 주스를 제공하도록 오렌지 주스에 혼합되는 경우, 소비자가 보충(강화)의 결과로서 주스의 풍미에 어떠한 변화를 인식하지 않도록 활성제의 풍미를 차단하는 것이 바람직할 수 있다.
특정 활성제의 경우, 사람 소비자에 의한 흡수를 최대화하기 위해, 활성제(들)을 위장관을 통해 소장의 알칼리성 환경에 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 위장관의 나쁜 조건에 대한 노출(예를 들어, 위에서 위산에 대한 노출)은 프로바이오틱 생존을 떨어뜨릴 수 있다. 일부 활성제는 위에 자극적인 효과를 가질 수 있어서, 활성제를 캡슐화하여 소장에 도달할 때까지 흡수되지 않는 것이 바람직하다. 생선 오일과 같이 불유쾌한 풍미를 가진 활성제는, 위에서 배출되는 경우, 불유쾌한 풍미가 식도에서 발산하고 및/또는 위 역류 반응을 일으켜서 풍미가 소비자에게 인식되게 할 수 있다. 이런 효과는 때때로 소비자에 대한 푸드 "리피팅(food "repeating")으로 알려져 있다.
미세입자 전구체 조성물의 구성요소는 미세입자에 바람직한 활성제 배출 특성을 제공하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 미세입자는 장벽 특성을 가진 기질을 갖도록 본 발명에 따라 생산될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 가교성 반응물은 장벽 특성을 나타낼 수 있는 알지네이트 및 알지네이트 겔일 수 있다. 상기한 대로, 알지네이트 겔은 활성제 배출이 느리나, 팽창이 빠르고 약 알칼리성 조건에서 용해 및/또는 분해를 나타내도록 낮은 pH 조건에서 안정성을 나타낸다. 이런 특성은 사용될 알지네이트 겔이 프로바이오틱스 및 다른 활성제를 사람 소장에 효과적으로 전달하게 한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 생산된 미세입자는 소장의 알칼리성 조건이 도달할 때까지 미세입자에 함유된 임의의 활성제(들)가 배출되지 않고 위의 산성 조건을 통과할 수 있을 것이다.
알지네이트와 같은 가교성 반응물로부터 생산된 가교 기질은 다공성일 수 있다. 본 발명은 변성 단백질, 폴리올 가소제, 트레할로스 및 담체의 혼합물을 포함하는 보호 기질 전구체 조성물에 관한 것이다. 이하에서 더욱 상세하게 기술될 것과 같이, 전구체에 의해 형성된 보호 기질은 산소 및/또는 수분과 같은 분해 화합물의 내입을 막거나 감소시키고 미세입자로부터 활성제(들)의 누출 또는 확산을 막거나 감소시키기 위해 가교성 반응물과 가교제에 의해 형성된 가교 기질의 다공성을 보상할 수 있다. 이렇게 함으로써, 보호 기질은 가교성 반응물과 가교제 의해 형성된 가교 기질의 장벽 특성을 강화, 촉진 또는 보충할 수 있다. 예를 들어, 보호 기질은 산소 및 수분과 같은 분해 환경 인자가 미세입자 속으로 확산하고 저장 동안 미세입자를 손상시키는 것을 예방할 수 있다. 따라서, 보호 기질은 생존가능한 활성제가 미세입자가 소비되고 미세입자의 장 특성이 사용되는 이런 시간까지 미세입자 내에 잔존하는 것을 보장할 수 있다.
일부 실시태양에서, 보호 기질은 활성제(들)의 풍미가 저장시에 미세입자로부터 발산하는 것을 막으며 가교성 반응물과 가교제에 의해 형성된 가교 기질의 장벽 특성은 미세입자가 소비 후 위 내에 있을 때 풍미 발산을 막는다. 이런 방식으로, 보호 기질은 가교 기질의 장벽 특성을 보충할 수 있다.
일부 실시태양에서, 보호 기질 및 가교 기질의 조합은 낮은 pH 조건에서 더 큰 안정성을 나타낼 수 있고 위산에 노출될 때 가교 기질 단독보다 더 큰 안정성을 나타낼 수 있다. 즉, 보호 기질은 가교 기질의 장벽 특성을 강화시킬 수 있다.
본 발명의 보호 기질 전구체 조성물은 담체에 3개의 주요 성분: 폴리올 가소제, 트레할로스 및 변성 단백질을 가진다. 담체는 적어도 트레할로스를 위한 용매이다. 일반적으로, 담체는 가교성 반응물과 혼합가능할 것이다. 담체는 가교성 폴리머와 함께 사용되어 가교성 반응물을 형성하는 용매와 쉽게 혼합될 수 있다. 통상적으로, 담체는 물일 것이다.
보호 기질 전구체 조성물은 미세입자 전구체 조성물의 5중량% 내지 20중량%를 차지할 수 있다. 일부 실시태양에서, 보호 기질 전구체 조성물은 미세입자 전구체 조성물의 7.5중량% 내지 13중량%를 차지한다. 예를 들어, 보호 기질 전구체 조성물은 미세입자 전구체 조성물의 약 10중량%를 차지한다.
본 발명에 사용된 용어 "단백질"은 티올-이황화물 상호교환 반응 및/또는 티올 산화 반응을 진행할 수 있는 잔기를 가진 단백질을 의미한다. 천연 상태에서, 단백질은 일반적으로 섬유 단백질 또는 구형 단백질로서 존재한다. 섬유성 단백질은 수 불용성이며 동물 조직의 주요 구조 재료로서 작용한다. 구형 단백질은 수용성이거나 산, 염기 또는 염의 수용액이며 살아있는 시스템에서 매우 중요한 역할을 한다. 섬유 단백질은 통상적으로 완전히 연장되고, 일반적으로 수소 결합을 통해 평행한 구조로 서로 가깝게 결합되어 섬유를 형성한다. 구형 단백질은 수소, 이온, 소수성 및 공유(이황화물) 결합의 조합에 의해 함께 고정된 복잡한 구형 구조로 접힌다. 이런 단백질의 화학적 및 물리적 특성은 구성요소 아미노산 잔기의 상대적 양 및 단백질 폴리머 사슬을 따라가는 이들의 배치에 의존한다.
단백질은 천연 또는 합성 폴리펩타이드로부터 유래된 단백질일 수 있다. 일부 실시태양에서, 단백질은 변성 단백질일 수 있다. 예를 들어, 단백질은 세린 잔기가 효소 전환을 사용하여 시스테인 잔기로 전환된 것일 수 있다.
본 발명의 단백질은 바람직하게는 구형 단백질이다. 단백질이 섬유 단백질인 실시태양에서, 섬유 단백질은 통상적으로 수용성이 되도록 변형된다. 예를 들어, 섬유 단백질이 콜라겐인 경우 가수분해에 의해 변형되어 젤라틴으로 전환될 수 있다.
바람직한 구형 단백질은 우유, 밀, 대두, 달걀, 녹두, 완두, 쌀 및 옥수수로부터 분리된 것이다. 우유로부터 유래된 단백질은 유장 단백질 및 카제인을 포함한다. 특정 실시태양에서, 유장 단백질은 보호 기질에 바람직한 단백질이다. 유장 단백질은 카제인이 pH 4.6에서 침지된 후 가용성으로 존재하는 단백질이다. 구형이며 열 변화성 성질인 유장 단백질은 α-락트알부민, β-락토글로불린, 소 혈청 알부민, 면역글로불린 및 프로테오스펩톤을 포함하는 여러 구성요소로 이루어진다.
일부 실시태양에서, 식물 원료로부터의 단백질을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 채식주의자에 이해 소비될 수 있는 미세입자를 제공하는 것이 바람직할 수 있다.
일부 실시태양에서, 낮은 알레르기성 특성을 가진 단백질은 미세입자의 보호 기질에 사용하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 완두 또는 쌀 단백질이 사용될 수 있는데 이는 우유 및 대두 단백질 또는 밀 글루텐과 비교하여 더 적은 사람이 이런 단백질에 알레르기 반응을 갖기 때문이다. 또한, 완두 단백질은 일부 다른 단백질보다 더욱 쉽게 소화될 수 있다.
단백질은 단백질 농축물 또는 단백질 분리물의 형태로 제공될 수 있다. "단백질 농축물"은 단백 원료를 액체와 소형 분자를 제거하는 초-여과 공정에서 처리함으로써 제조된 단백질-풍부 생성물이다. 주로 단백질 농축물을 제조하는데 사용된 초-여과 공정은 희석여과 공정이다. 유장 단백질 농축물과 같은 산업적으로 생산된 단백질 농축물은 25 내지 80%의 단백질 함유량을 가질 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "단백질 분리물"은 단백질성 원료로부터 단백질성 재료의 추출, 후속 농축 및 정제로부터 얻은 생성물을 의미한다. 단백질 분리물은, 예를 들어, 이온 교환 공정을 사용하여 단백질 농축물을 처리함으로써 제조될 수 있다. 분리물은 약 90%의 단백질 함유량을 가질 수 있다. 특정 실시태양에서, 단백질은 유장 단백질 분리물이다.
단백질은 통상적으로 용액 또는 용매 속 분산액으로 제공된다. 단백질은 약 5 내지 약 15중량%, 바람직하게는 약 8 내지 약 12중량%, 더욱 바람직하게는 약 10중량%의 용액 또는 분산액을 구성할 수 있다.
용매는 주로 담체일 것이나, 액체의 혼합물이 담체로서 사용될 때 담체의 구성요소일 수 있다. 보호 기질을 가진 미세입자를 형성한 후, 용매/담체는 겔의 합성 동안 제거될 수 있다. 물은 주로 바람직한 용매/담체이다.
통상적으로, 단백질은 보호 기질 전구체 조성물 전체에서 사용될 비율로 담체에서 변형된다. 즉, 보호 기질 전구체 조성물에서 담체의 총량은 주로 담체 속 변성 단백질의 분산액 또는 용액으로부터 발생한다. 일부 실시태양에서, 담체의 일부는 다른 구성요소의 하나 이상과 함께 나중 단계에서 또는 다른 구성요소의 하나 이상이 변성 단백질과 혼합된 이후 나중 단계에서 첨가될 수 있다. 보호 기질 전구체 조성물의 다른 구성요소의 양은 통상적으로 변성 단백질 및 담체의 총량의 면에서 중량 기준으로 결정된다. 간편하도록, 비록 일부 실시태양에서 담체의 일부가 다른 구성요소의 하나 이상이 변성 단백질과 혼합될 때 또는 혼합된 후에 첨가될 수 있으나 변성 단백질 및 담체의 총량의 조합은 변형 단백질 혼합물로서 언급된다.
변성 과정은 단백질의 4차, 3차 및 2차 구조를 파괴한다. 단백질은 용매 또는 담체의 존재하에서 변성될 것이어서 변성 단백질은 변성됨에 따라 더욱 연장된 구조를 채택할 수 있다. 연장된 단백질 형태는 본 발명에 따른 보호 기질의 생산에 유리하다. 일단 연장되면, 단백질 사슬은 수소, 이온, 소수성 및 공유 결합을 통해 결합될 수 있다. 단백질 사슬 상호작용은 보호 기질의 응집력에 기여한다. 이와 관련하여, 이황화물 형성을 가능하게 하도록 변성 과정이 시스테인 및/또는 시스틴 잔기에 의해 제공된 티올-그룹을 노출하는 것이 특히 바람직하다. 또한, 글리신, 알라닌, 발린, 루신 및 아이소루신(즉, 지방족 치환체를 가진 이런 아미노산)에 의해 제공된 임의의 소수성 그룹은 단백질 사슬 사이의 소수성 결합을 허용하도록 이상적으로 노출된다. 소수성 그룹은 주로 자연 상태에서 구형 단백질의 중앙에 대해 위치된다. 게다가, 단백질은 수소 결합을 형성할 수 있는 친수성 치환체를 가진 세린, 트레오닌, 아스파라긴 및 글루타민을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 단백질은 단백질의 티올 그룹을 노출시키고 이황화물 형성을 가능하게 하도록 변성된다. 이황화물 형성은 분자 내 또는 분자 간에 일어날 수 있는 새로운 -S-S 결합의 형성을 의미한다. 이황화물 형성은 시스테인 잔기의 유리 설프하이드릴 그룹이 산화되어 이황화물 결합을 형성하는 티올 산화 반응을 통해 일어날 수 있다. 또한, 현존하는 분자 간 이황화물 결합이 티올 그룹과 반응하여 새로운 이황화물 다리를 형성하고 다른 유리 티올 그룹을 배출하는 티올-이황화물 교환 반응이 일어날 수 있다. 예를 들어, 유장 단백질 β-락토글로불린은 보통 이황화물 다리를 형성하는 시스테인 잔기의 두 쌍 및 유리 티올 그룹을 함유하는 하나의 시스테인 잔기를 함유하기 때문에 본 발명에 사용될 수 있다.
단백질은 단백질의 4차, 3차 및 2차 구조를 충분하게 파괴하도록 변성되어서 단백질의 티올 그룹은 이황화물 다리를 형성하는데 필요한 능력 및 형태 접근성을 가진다. 이론에 한정되지 않고, 변성 단백질 분자는 가교되어 용매/담체 내에 분산된 덩어리를 형성할 수 있다고 생각된다.
티올-이황화물 교환이 일어나는 처리는 열 처리, 화학적 처리 또는 효소 처리일 수 있다. 본 발명에서, 변성 처리는 바람직하게는 열 처리이다. 열 처리가 사용될 때, 단백질 용액 또는 분산액은 이황화물 가교 반응을 개시하는데 충분한 기간 동안 특정 단백질의 변성 온도 이상의 온도로 가열될 것이다. 소정의 단백질을 위한 정확한 온도 및 시간의 길이는 실험적으로 정해질 수 있다. 그러나, 변성 과정은 통상적으로 약 65℃ 내지 100℃, 바람직하게는 약 70℃ 내지 100℃, 더욱 바람직하게는 약 90℃의 온도를 필요로 할 것이 예상된다. 열 처리의 지속은 최대 3시간, 바람직하게는 약 15 내지 45분, 가장 바람직하게는 약 30분일 수 있다.
변성 단백질 사슬 사이의 상호작용은 사슬 연장의 등급 및 아미노산 잔기의 성질 및 서열에 의해 영향을 받는다. 일부 실시태양에서, 아미노산 잔기 사이의 단백질 사슬 상호작용을 최적화하도록 다른 원료로부터의 단백질의 혼합물을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 저자극성 때문에 완두 단백질을 사용하여 보호 기질을 생산하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 완두 단백질은 소량의 시스테인을 가지며, 이것이 이황화물 가교를 형성하는 이런 단백질의 능력을 제한할 수 있다. 반대로, 쌀 단백질은 높은 수준의 시스테인을 가지며, 이는 과도한 가교를 유도하여 깨지기 쉬운 보호 기질을 생성할 수 있다. 이황화물 가교에 대한 수준을 최적화하기 위해, 완두 및 쌀 단백질의 조합이 사용될 수 있다.
보호 기질의 유연성을 개선하기 위해서, 본 발명의 보호 기질 전구체 조성물은 폴리올 가소제를 포함한다. 폴리올은 변성 단백질과 수소 결합에 의해 보호 기질의 유연성을 개선하여, 단백질 사슬 사이의 분자 내 공간을 증가시킨다. 적절한 폴리올 가소제는 글리세롤, 소르비톨 및 폴리에틸렌 글리콜뿐만 아니라 이의 조합과 같은 폴리알코올을 포함한다. 글리세롤은 특정 실시태양에서 바람직한 가소제이다.
게다가, 폴리올 가소제는 트레할로스와 같은 코스모트로프(kosmotropes)이기 때문에, 이들은 보호 기질의 보호성에 영향을 미친다. 폴리올 가소제는 물/물 수소 결합에 우선하여 물과 수소 결합을 형성할 것이다. 따라서, 미세입자에서 물은 "탈구조화"되고 얼음 결정 격자의 형성이 붕괴된다. 이런 방식으로, 폴리올 가소제는 얼음 결정이 형성될 수 있는 온도를 감소시키며, 그 결과, 프로바이오틱을 위한 동결방지 특성을 가진다. 따라서, 폴리올 가소제는 저온에서 미세입자의 저장 이후, 예를 들어 -20℃에서의 저장 이후 프로바이오틱 생존의 개선에 영향을 미친다.
폴리올 가소제는 변성 단백질 혼합물과 혼합될 수 있다. 주로 폴리올 가소제는 트레할로스가 첨가되기 전에 변성 단백질과 혼합된다. 폴리올 가소제는 중량 기초로 약 30:70 내지 약 50:50, 바람직하게는 약 35:65 내지 약 45:55, 더욱 바람직하게는 40:60의 폴리올 가소제:변성 단백질 혼합물의 비로 첨가될 수 있다.
본 발명의 보호 기질은 성분으로서 트레할로스를 더 포함한다. 트레할로스는 2개의 글루코오스 단위가 α-1,1-글리코시드 결합으로 함께 연결된 비스아세탈, 비-환원성 호모다이사카라이드이다. 미국 식약청은 2000년에 트레할로스는 일반적으로 안정한 상태로 인정하였다. 트레할로스는 변성 단백질을 안정화하고 보호 기질의 보호성을 개선한다.
상기한 대로, 트레할로스는 코스모트로프이며, 따라서 트레할로스/물 사이의 상호작용은 물/물 상호작용보다 훨씬 더 강하다. 따라서, 트레할로스는 물 네트워크의 "탈구조화" 및 (코스모트로프로서) 자체 주위에 물 분자의 정렬을 일으킨다. 이론에 한정되지 않고, 물이 담체이며 과량으로 존재하는 경우, 트레할로스는 변성 단백질과 직접 상호작용하지 않는다고 생각된다. 대신에, 물이 단백질 주위로부터 차단되고 트레할로스 주위에 정렬된다. 이 이론에 따라, 보호 기질에서 트레할로스의 농도는 이용가능한 물을 위해, 트레할로스와 변성 단백질뿐만 아니라 프로바이오틱(및 잠재적으로 임의의 다른 활성제) 사이에 경쟁이 존재하도록 선택될 수 있다. 이런 경쟁이 물 분자가 변성 단백질과 프로바이오틱 주위에서 탈구조화 되고 하고 트레할로스 주위에서 "구조화" 되게 한다. 트레할로스는 자체 주위에 물 구조를 조직하여, 변성 단백질과 프로바이오틱이 안정화되게 한다고 생각된다. 트레할로스 주위에 물 분자의 분포가 균일하지 않을 것이지만, 물 분자는 수소가 모든 방향으로 결합하는 정렬된 구조가 형성되는 방식으로 트레할로스 주위에 배열될 수 있다.
게다가, 트레할로스는 단백질 주위에 물과 같은 담체 분자를 대체하는 것으로 생각된다. 담체 분자를 수소 결합 네트워크를 제공하는 트레할로스 분자로 대체함으로써, 변성 단백질의 3차 구조는 보호 기질을 함유하는 미세입자가 건조되고 미세입자가 열적 스트레스와 같은 다른 스트레스에 영향을 받음에 따라 유지될 수 있다. 이런 동일한 메커니즘이 트레할로스가 프로바이오틱스와 같은 특정 활성제를 보호하게 할 수 있다. 트레할로스는 동결방지 특성 및 동결건조방지 특성을 가질 수 있다. 특히, 트레할로스는 -20℃ 정도의 낮은 온도의 냉동 저장시 프로바이오틱의 생존을 강화시킬 수 있다.
미세입자가 건조함에 따라 담체 수준의 추가 감소에 의해, 트레할로스는 유리질 당 기질 내부에 고정함으로써 변성 단백질 및 미세입자의 다른 구성요소를 추가로 안정화시킬 수 있다. 트레할로스는, 구조적 완결성을 감소시키지 않으면서, 하나의 결정 형태와 다른 형태 사이에서 변화할 수 있고, 이것이 미세입자의 다른 구성요소, 특히 기질 내에 분포된 프로바이오틱스 주위에 보호성의 유리질 트레할로스 기질의 형성을 촉진하는 것으로 생각된다.
유리질 기질의 형성이 변성 단백질의 3차원 구조를 보존하고 이를 비생물적인 스트레스로부터 보호함으로써 가교 변성 단백질에 의해 제공된 산소, 지질 및 풍미 장벽 특성을 강화시키는 것으로 생각된다. 이렇게 함으로써, 트레할로스는 변성 단백질이 미세입자에 있는 프로바이오틱을 더 잘 보호하게 하고 보호 기질로부터 프로바이오틱 또는 폴리올 가소제의 임의의 확산을 고정하게 할 수 있다. 트레할로스는 또한 변성 단백질이 미세입자에 있는 소수성 활성제와 같은 임의의 다른 활성제를 더 잘 보호하게 하며 보호 기질로부터 이의 확산을 막거나 억제하도록 이를 고정하게 할 수 있다.
보호 기질로부터 폴리올 가소제의 확산을 막거나 감소시킴으로써, 단백질 사슬의 분자 내 공간은 유지되어 기질은 가교성 반응물과 가교제의 가교 이후 생산된 겔의 합성 이후에도 유연하게 유지된다. 따라서, 트레할로스는 보호 기질의 구조를 유지하여 장기간 안정성과 복원력을 가진다. 또한, 트레할로스는 단백질 사슬 주위의 담체 분자를 대체함으로써, 분자 내 공간은 용매화된 단백질의 공간과 더 유사할 수 있다. 따라서, 트레할로스는 유연한 기질을 제공하기 위해 폴리올 가소제를 보충할 수 있다.
게다가, 유리질 기질 자체는 보호 기질을 통한 산소, 지질 또는 풍미 화합물의 확산을 억제할 수 있다. 따라서, 변성 단백질과 트레할로스는 우수한 산소, 지질 및 풍미 장벽 특성을 가진 촘촘한 기질을 형성하도록 결합할 수 있다. 이런 촘촘한 기질은 미세입자 내에 분포된 프로바이오틱 및 임의의 다른 활성제를 지지하고 보호한다. 따라서, 보호 기질은 산소와 같은 분해 화합물의 내입을 막거나 감소시키고 미세입자로부터 활성제의 누출 또는 확산을 막거나 감소시키기 위해 가교성 반응물 및 가교제에 의해 형성된 가교 기질의 다공성을 보상할 수 있다.
유리질 기질은 부분적으로 비결정 유리질 상이고 부분적으로 결정성 수화물 상인 트레할로스를 포함한다. 결정성 수화물 상은 비결정 상을 탈수하는 물질로 작용하여, 비결정 유리질 상태의 유리 전이 온도를 증가시킨다. 본 발명에 사용된 대로, 용어 유리 또는 유리질 상태는 모든 화학적 반응이 거의 정지상태까지 느려질 수 있는 높은 점성 및 낮은 물 함량의 액체 상을 의미한다. 장기간 안정성을 성취하는데 유리질 기질의 이점은 유리질(유리질화) 재료에서 확산은 매우 낮은 속도(예를 들어, 마이크노/년)로 일어난다는 사실로부터 기인한다. 트레할로스는 모든 다이사카라이드의 최고 유리 전이 온도(T g)를 가진다. 유리질화, 즉 장기간 저장을 위한 유리질 기질에 의한 다른 구성요소의 고정화의 최상의 이점은 T g가 저장 온도보다 높은 조건하에서 관찰된다. 트레할로스는 높은 T g를 갖기 때문에, 보호 기질 및 보호 기질을 포함하는 미세입자는 넓은 범위의 저장 온도에 걸쳐 안정화될 수 있다.
또한, 물에 대한 트레할로스의 친화력에도 불구하고, 이런 다이사카라이드는 수분에 대한 미세입자의 복원력을 강화시킬 수 있다. 상기한 대로, 트레할로스는 모든 다이사카라이드의 최고 유리 전이 온도 T g를 가진다. 일반적으로, 비결정 물질에 대한 물의 첨가는 이동성을 증가시켜 유리 전이 온도(T g)의 감소를 일으킨다. 비록 이런 예측된 감소가 트레할로스의 경우에 일어나지만, 이의 T g는 수크로오스 또는 말토오스와 같은 다른 다이사카라이드의 T g보다 훨씬 더 높다. 따라서, 수분이 T g를 감소시킬 수 있으나 트레할로스는 통상적으로 미세입자의 저장 온도보다 높게 유지될 것이며 그 결과 분해를 견딜 것이다.
트레할로스는 수크로오스의 단맛의 45%인 상대 단맛을 가지며 일반적으로 보호 기질 또는 미세입자의 다른 구성요소와 관련될 수 있는 임의의 풍미를 차단하는데 효과적이다. 예를 들어, 변성 단백질은 불유쾌한 풍미를 가질 수 있다. 유장 단백질과 같은 단백질은 주로 "판지" 같은 맛을 갖는 반면 쌀 단백질은 덤덤한 풍미를 가질 수 있다. 변성 단백질의 불유쾌한 풍미는 트레할로스에 의해 효과적으로 차단될 수 있어서 이를 섭취하는 사람 또는 동물에 의해 인식되지 않는다.
트레할로스는 미세입자에 있는 프로바이오틱 또는 임의의 다른 활성제 또는 미세입자의 임의의 다른 구성요소와 관련된 임의의 불유쾌한 풍미를 효과적으로 차단할 것으로 생각된다.. 게다가, 미세입자에 있는 프로바이오틱을 포함하는 임의의 활성제가 미세입자로부터 확산되거나 누출되는 것을 효과적으로 막을 수 있어서 활성제와 관련된 임의의 풍미 화합물이 미세입자로부터 확산되거나 누출되는 것을 막는다.
트레할로스는 통상적으로 최종 성분으로 첨가되어 보호 기질 전구체 조성물을 형성한다. 그러나, 트레할로스는 변성 단백질 혼합물 단독과 혼합될 수 있거나 하나 이상의 활성제가 첨가된 후 변성 단백질 혼합물과 혼합될 수 있다. 트레할로스는 중량 기초로 약 40:60 내지 약 60:40, 바람직하게는 약 45:55 내지 약 55:45, 더욱 바람직하게는 50:50의 트레할로스:변성 단백질 혼합물의 비로 첨가될 수 있다.
일단 보호 기질 전구체 조성물의 모든 구성요소가 함께 혼합되면, 보호 기질 전구체 조성물은 통상적으로 살균된다. 보호 기질 내에 분산될 하나 이상의 활성제의 열 안정성에 따라, 보호 기질 전구체 조성물을 임의의 활성제와 혼합하기 전에 보호 기질 전구체 조성물을 살균하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 프로바이오틱의 온도 민감성 때문에 프로바이오틱이 보호 기질 전구체 조성물과 혼합되기 전에 임의의 살균이 실행되어야 한다는 것을 알 것이다.
보호 기질 전구체 조성물은 적절한 시간 동안 80℃ 이상으로 가열함으로써 살균될 수 있다. 예를 들어, 보호 기질 전구체 조성물은 30분 동안 85℃에서 살균될 수 있다. 보호 기질 전구체 조성물에 있는 트레할로스는 변성 단백질 사슬 사이의 추가 이황화물 가교의 형성을 억제한다. 따라서, 과도한 가교는 보호성 기질의 약함을 유도할 수 있기 때문에, 트레할로스는 살균 공정 동안 변성 단백질이 과도하게 가교되는 것을 막는다.
통상적으로, 살균된 보호성 기질 전구체 조성물이 프로바이오틱과 혼합되어 프로바이오틱-함유 기질 전구체를 형성한 후 프로바이오틱-함유 기질 전구체를 가교성 반응물과 혼합하여 미세입자 전구체 조성물을 형성한다. 이것은 보호 기질 전구체 조성물과 프로바이오틱 사이에 좋은 접촉이 있게 하여 프로바이오틱이 최종 미세입자에 있는 보호 기질 내에 적절하게 분산되고 보호될 수 있는 것을 보장하도록 실행된다.
또한, 임의의 다른 활성제가 통상적으로 보호 기질 전구체 조성물과 혼합된 후 최종 혼합물을 가교성 반응물과 혼합하여 미세입자 전구체 조성물을 형성한다. 보호 기질 전구체 조성물은 일반적으로 수용액으로 제공되고 가교성 반응물은 일반적으로 수용액 내에 또는 수용액으로 제공되기 때문에, 미세입자가 임의의 소수성 활성제를 포함할 때, 소수성 활성제는 통상적으로 보호 기질 전구체 조성물과 가교성 반응물에 혼합되기 않을 것이며 소수성 활성제 및 프로바이오틱을 미세입자 속에 혼합하는 것은 어려울 수 있다.
에멀젼화 공정에서 발생된 전단력이 프로바이오틱 세포 파괴 및 프로바이오틱 생존능력의 손실을 초래할 수 있기 때문에 소수성 활성제, 프로바이오틱, 보호 기질 전구체 조성물 및 선택적으로 가교성 반응물 모두를 함께 에멀젼화함으로써 혼합하는 것은 바람직하지 않을 수 있다.
소수성 활성제가 사용된 일부 실시태양에서, 소수성 활성제는 변성 단백질 혼합물과, 잠재적으로 임의의 추가 유화제를 사용하지 않고, 혼합되어 소수성 활성제를 포함하는 에멀젼을 형성할 수 있다. 이런 에멀젼은 미세입자 전구체 조성물의 잔존 구성요소와 혼합될 수 있다.
이론에 한정되지 않고, 소수성 활성제와 글리신, 알라닌, 발린, 루신 및 아이소루신의 지방족 치환체와 같은 단백질의 소수성 그룹 사이에 상호작용 때문에 소수성 활성제는 변성 단백질 혼합물과 혼합되어 부드럽고 안정한 에멀젼을 형성할 수 있다고 생각된다. 즉, 단백질에서 친수성 및 소수성 그룹의 조합이 주로 물인 담체와 소수성 활성제의 혼합을 촉진하는 유화제로서 작용하는 것을 가능하게 한다. 다시 한 번 이론에 한정되지 않고, 변성 단백질의 덩어리 및 소수성 활성제의 방울은 구조를 이루는 미셀, 이중층 소낭 또는 이중층을 형성할 수 있어서 소수성 활성제가 용매/담체로부터 "보호된다"고 생각된다. 이런 구조는 미세입자 속으로 운반될 수 있다. 따라서, 미세입자에서, 소수성 활성제는 보호성 기질의 변성 단백질 내에 부분적으로 또는 완전히 캡슐화될 수 있다.
보호 기질 전구체 조성물의 다른 구성요소를 첨가하기 이전, 담체의 일부 또는 전부와 함께 소수성 활성제 및 변성 단백질을 혼합하면 소수성 활성제 및 단백질이 더욱 효과적으로 상호작용하게 하여 소수성 활성제 "보호" 구조를 형성할 수 있다. 이런 구조는 트레할로스 및 폴리올 가소제의 첨가를 통해 안정화될 수 있다. 그러나, 이런 방식으로 소수성 활성제와 보호 기질 전구체 조성물을 혼합하는 것이 필수는 아니다.
선택적으로, 프로바이오틱 생존을 과도하게 손상시키지 않으면서 소수성 활성제를 미세입자 속에 혼합하는 문제를 해결하기 위해서, 본 발명의 일부 실시태양은 프로바이오틱, 가교성 반응물, 보호 기질 전구체 조성물 및 소수성 활성제를 포함하는 에멀젼의 혼합물을 포함하는 미세입자 전구체 조성물을 제공한다. 즉, 소수성 활성제를 다른 미세입자 구성요소, 특히 프로바이오틱와 혼합하기 이전에, 소수성 활성제가 사용되어 에멀젼을 형성한다.
소수성 활성제를 포함하는 에멀젼은 보호 기질 전구체 조성물과 가교성 반응물과 쉽게 혼합되나, 소수성 활성제와 쉽게 혼합되지 않는 적절한 액체를 소수성 활성제와 혼합함으로써 형성될 수 있다. 통상적으로, 소수성 활성제는 적절한 유화제를 사용하여 물로 에멀젼화되고, 이런 에멀젼은 사용된 보호 기질 전구체 조성물 및 가교성 반응물과 쉽게 혼합된다. 그러나, 일부 실시태양에서, 액체는 가교성 반응물일 수 있다.
소수성 활성제와 액체는 당업자에게 공지될 통상적인 에멀젼화 기술을 사용하여 함께 에멀젼화될 수 있다. 일부 실시태양에서, 에멀젼은 소수성 활성제의 방울이 적절하게 작은 크기인 에멀젼을 얻기 위해 추가 정제를 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 여러 에멀젼화 또는 균질화 단계가 소수성 활성제의 방울을 적절하게 작은 크기로 정제하는데 필요로 할 수 있다. 적절하게 작은 방울 크기는 미세입자의 보호 기질 전체에서 소수성 활성제의 더욱 균일한 분포를 촉진할 수 있다. 일부 실시태양에서, 미세입자 전체에서 소수성 활성제 방울의 분포는 실질적으로 균일할 수 있다. 게다가, 방울 크기가 감소함에 따라, 소수성 활성제의 표면적 대 부피비는 증가한다. 따라서, 소수성 활성제가 미세입자의 다른 구성요소와 접촉하기 위해 이용가능한 더 많은 표면적이 존재한다. 에멀젼의 방울 크기는 방울들 사이에 이용가능한 틈새 공간의 부피에 영향을 줄 것이다. 프로바이오틱은 일부 실시태양에서 틈새 공간 내에 유리하게 위치될 수 있다고 생각된다. 적절한 작은 방울 크기는 0.5 내지 1㎛일 수 있다.
생선 오일과 같은 특정 소수성 활성제는 산화에 쉽게 영향을 받는다. 산화의 개시를 예방 및/또는 지연하기 위해서, 소수성 활성제를 포함하는 에멀젼은 질소 또는 아르곤 분위기와 같은 불활성 분위기에서 형성되어 산소에 대한 노출을 감소 또는 막을 수 있다.
유화제가 사용되어 소수성 활성제를 포함하는 에멀젼의 안정성을 강화시킨다. 상기한 대로, 에멀젼은 변성 단백질 혼합물로 형성될 수 있고 변성 단백질 이외에 유화제가 이런 실시태양에 사용될 수 있다. 유화제는 임의의 식품-등급 표면 활성제 성분, 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제 및/또는 양쪽성 계면활성제일 수 있다. 이런 유화제는 레시틴, 변형 레시틴, 키토산, 변형 전분(예를 들어, 옥텐일숙시네이트 무수물 전분), 펙틴, 검(예를 들어, 로커스트 빈 검, 검 아라빅, 구아 검 등), 알긴산, 알지네이트 및 이의 유도체, 셀룰로오스 및 이의 유도체, 증류 모노글리세라이드, 모노- 및 다이글리세라이드, 모노- 및 다이글리세라이드의 다이아세틸 타르타르산 에스터(DATEM), 폴리소르베이트 60 또는 80(TWEEN 60 또는 80), 소듐 스테아릴 락티레이트, 프로필렌 글리콜 모노스테아레이트, 숙신일레이트 모노- 및 다이글리세라이드, 아세틸레이트 모노- 및 다이글리세라이드, 지방산의 프로필렌 글리콜 모노- 및 다이에스터, 지방산의 폴리글리세롤 에스터, 지방산의 락트일 에스터, 글리세릴 모노스테아레이트, 프로필렌 글리콜 모노팔미테이트, 글리세롤 락토팔미테이트 및 글리세롤 락토스테아레이트 및 이의 혼합물의 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지 않을 수 있다. 일부 실시태양에서, 레시틴은 유화제로서 사용된다.
유화제는 약 1:50 내지 약 1:15, 바람직하게는 약 1:45 내지 약 1:25의 유화제:액체의 비로 첨가될 수 있다. 일부 실시태양에서, 사용된 비는 중량 기초로 약 1:29이다. 일부 다른 실시태양에서, 사용된 비는 약 1:39이다.
통상적으로, 유화제는 유화제 혼합물이 소수성 활성제로 에멀젼화되기 전에 액체의 적어도 일부와 혼합된다. 그러나, 일부 실시태양에서, 유화제, 액체 및 소수성 활성제는 동시에 함께 혼합될 수 있다. 일부 실시태양에서, 유화제는 그 혼합물이 액체와 에멀젼화되기 전에 소수성 활성제와 혼합된다.
일부 실시태양에서, 유화제는 유화제 혼합물이 소수성 활성제와 잔존 액체와 혼합되기 전에 약 20% 내지 50%(중량), 예를 들어, 약 1/4 또는 1/3의 액체와 혼합된다. 유화제는 중량 기초로 약 1:11 내지 약 1:7, 바람직하게는 약 1:10 내지 약 1:8, 더욱 바람직하게는 약 1:9의 유화제:액체 부분의 비로 액체의 제 1 부분에 첨가될 수 있다.
본 발명은 사람이 섭취하게 될 미세입자에 관한 것이라는 사실의 관점에서, 일부 실시태양에서, 유화제와 액체의 혼합물은 소수성 활성제에 의한 에멀젼화 전에 살균될 수 있다. 유화제와 액체의 혼합물은 적절한 시간 동안 80℃ 이상으로 가열함으로써 살균될 수 있다. 예를 들어, 혼합물은 30분 동안 85℃에서 살균될 수 있다. 주로 살균된 혼합물은 소수성 활성제로 에멀젼화하기 전에 냉각된다.
소수성 활성제 및 유화제와 액체의 혼합물은 중량 기초로 약 1:5 내지 약 5:1, 바람직하게는 약 10:35 내지 약 1:1의 소수성 활성제:유화제와 액체의 혼합물의 비로 함께 에멀젼화될 수 있다. 일부 실시태양에서, 사용된 비는 중량 기초로 약 2:3이다. 일부 실시태양에서, 사용된 비는 약 1:3이다. 일부 실시태양에서, 사용된 비는 약 1:4이다.
일단 소수성 활성제를 포함하는 에멀젼이 형성되면, 프로바이오틱은 소수성 활성제를 포함하는 에멀젼과 혼합되어 프로바이오틱-함유 에멀젼을 형성할 수 있다. 통상적으로, 프로바이오틱이 보호 기질 전구체 조성물과 혼합되어 프로바이오틱-함유 기질 전구체를 형성한 후 소수성 활성제를 포함하는 에멀젼과 혼합하여 프로바이오틱-에멀젼을 형성한다. 이런 방식으로, 프로바이오틱은 보호 기질 전구체 조성물 전체에서 잘 분산되며 보호 기질 전구체 조성물과 효과적으로 상호작용할 수 있다. 특히, 프로바이오틱은 트레할로스와 효과적으로 상호작용할 수 있다.
프로바이오틱에 높은 전단력을 가하면 세포 파괴 및 생존능력 손실을 초래할 수 있다는 점에서 프로바이오틱은 전단-민감성일 수 있다. 이런 관점에서, 프로바이오틱은 미세입자의 임의의 구성요소와 혼합되고 전체에서 분산되어야 하며 이런 방식으로 프로바이오틱의 생존능력은 과도하게 손상되지 않는다. 따라서, 프로바이오틱을 소수성 활성제 또는 미세입자의 임의의 다른 구성요소를 포함하는 에멀젼과 혼합하는 것은 프로바이오틱이 적절하게 낮은 전단 혼합에 영향을 받게 하는 것을 필요로 한다. 적절하게 낮은 전단 혼합은 현저한 세포 파괴 및 프로바이오틱 생존능력의 손실이 일어나는 전단율 이하에서 실행되는 혼합이다. 예를 들어, 낮은 전단율은 100 내지 300rpm, 바람직하게는 100rpm 이하와 같은 최대 300rpm에서 작동하는 혼합 임펠러에 의해 생성된 전단율의 형태일 수 있다. 낮은 전단 혼합은 낮은 전단 믹싱을 포함한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 프로바이오틱을 소수성 활성제를 포함하는 에멀젼과 혼합하는 것은 프로바이오틱을 소수성 활성제를 포함하는 에멀젼과 혼합하는 것을 포함할 수 있다.
프로바이오틱-함유 에멀젼은 가교성 반응물과 혼합되어 미세입자 전구체 조성물을 형성할 수 있다. 가교성 반응물과의 혼합은 또한 프로바이오틱의 생존능력이 미세입자 전구체 조성물의 형성 동안 과도하게 손상되지 않는 것을 보장하는 적절하게 낮은 전단 혼합이라는 것을 알 것이다. 사실, 본 발명에서, 임의의 중간 프로바이오틱-함유 기질을 포함하는 미세입자 전구체 조성물을 생산하는데 사용된 임의의 프로바이오틱-함유 구성요소는 프로바이오틱의 생존능력이 과도하게 손상되지 않는 것을 보장하는 적절하게 낮은 전단율에 영향을 받아야 한다.
소수성 활성제는 소수성 활성제를 포함하는 에멀젼에서 통상적으로 불연속 상이다. 에멀젼 형태의 소수성 활성제에 가교성 반응물과 쉽게 혼합되는 액체를 제공함으로써, 액체는 소수성 활성제를 운반하며 이를 가교성 반응물 내에 효과적으로 분산되게 한다. 따라서, 소수성 활성제의 불연속 방울은 통상적으로 미세입자 전구체 조성물 속으로 운반된다. 게다가, 소수성 활성제가 미세입자 전구체 조성물 내에 분산될 때, 전구체를 사용하여 생산된 미세입자는 가교 기질 내에 분산된 소수성 활성제를 가질 수 있다.
일반적으로, 혼합의 효율을 위해서, 프로바이오틱-함유 기질 전구체는 프로바이오틱 및 소수성 활성제를 포함하는 혼합물, 즉 프로바이오틱-함유 에멀젼이 가교성 반응물과 혼합되기 전에 소수성 활성제를 포함하는 에멀젼과 혼합된다. 일부 실시태양에서, 프로바이오틱 세포는 에멀젼 방울과 접촉할 수 있고 그 속에 혼합된다. 이것이 프로바이오틱 생존을 강화시킬 수 있다. 프로바이오틱에 혼합하기 전 가교성 반응물과 소수성 활성제를 혼합하면 프로바이오틱이 소수성 활성제와 효과적으로 접촉하는 것을 방해한다.
프로바이오틱은 일반적으로 프로바이오틱-함유 에멀젼의 연속 상에 위치될 것이다. 마찬가지로, 프로바이오틱은 통상적으로 미세입자 전구체 조성물의 연속 상에 위치될 것이다. 프로바이오틱 세포의 대부분은 불연속 소수성 활성제 상 사이의 틈새 간격에 위치될 수 있다. 소수성 활성제의 불연속 방울은 촘촘히 쌓여서 틈새 간격이 외부 환경으로부터 보호될 수 있다. 이론에 한정되지 않고, 프로바이오틱은 틈새 간격 내에서 보호되어 프로바이오틱-함유 에멀젼과 미세입자 전구체 조성물에서 이의 생존이 개선된다고 생각된다. 따라서, 소수성 활성제를 본 발명에 따른 미세입자 전구체 조성물 속에 혼합하는 것은 소수성 활성제를 함유하지 않는 미세입자 전구체 조성물과 비교하여, 전구체 조성물의 저장 동안 프로바이오틱 생존에 유익한 효과를 가진다는 것이 발견되었다. 예를 들어, 본 발명의 미세입자 전구체 조성물은 2개월 내지 3개월 동안 약 4℃에서 즉시 사용하도록 저장될 수 있고 프로바이오틱 생존은 90 내지 98%에서 유지된다.
프로바이오틱 생존은 아래 식 1에 따라 계산된다.
식 1:
Figure 112015063039584-pct00002
미세입자 전구체 조성물에서 프로바이오틱 생존의 유익한 개선은 에멀젼이 소수성 활성제보다는 액체를 사용하여 형성되는 경우에 여전히 얻을 수 있다. 따라서, 다른 실시태양에서, 본 발명은 프로바이오틱, 보호 기질 전구체 조성물(즉, 적어도 변성 단배질, 폴리올 가소제, 트레할로스 및 담체의 혼합물), 가교성 반응물 및 지질을 포함하는 에멀젼의 혼합물을 포함하는 미세입자 전구체 조성물을 제공한다. 적절한 지질은 본 발명에 사용하기에 적절한 형태로 만들도록 소수성 활성제를 용해하는데 적합한 것으로 기술된 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 이런 실시태양은 프로바이오틱을 보호 기질 전구체 조성물과 혼합하여 프로바이오틱-함유 기질 전구체를 형성하는 단계; 지질을 포함하는 에멀젼을 프로바이오틱-함유 기질 전구체와 혼합하여 프로바이오틱-함유 에멀젼을 형성하는 단계; 및 프로바이오틱-함유 에멀젼을 가교성 반응물과 혼합하는 단계를 포함하여 미세입자 전구체 조성물을 생산하는 방법을 더 제공한다.
본 발명은 또한 보호 기질 내에 분산된 지질 및 프로바이오틱을 포함하는 미세입자를 제공한다.
미세입자 전구체 조성물에서 소수성 활성제(또는 지질) 및 프로바이오틱의 분산된 배열은 최종 미세입자까지 지니고 있을 수 있다. 따라서, 소수성 활성제 또는 지질은 불연속 상으로서 미세입자의 보호 기질 내에 분산될 수 있다. 일부 실시태양에서, 소수성 활성제 또는 지질의 방울은 기질 전체에서 실질적으로 균일한 분포로 분산된다. 일부 다른 실시태양에서, 분포는 다른 부분보다 더 높은 비율의 소수성 활성제 또는 지질을 가진 보호 기질 내의 부분으로 유도될 수 있다.
게다가, 프로바이오틱은 미세입자의 가교 보호 기질 내에 분산될 수 있어서 소수성 활성제 또는 지질 방울 사이의 틈새 공간 내에 위치된다. 따라서, 프로바이오틱은 미세입자에 있는 소수성 활성제 또는 지질 방울 사이의 틈새 공간 내에서 보호될 수 있다. 보호성 기질 내에서 프로바이오틱의 분포는 기질 전처에서 실질적으로 균일한 분포일 수 있다.
본 발명의 이런 실시태양의 핵심은 미세입자 전구체 조성물 속에 소수성 활성제와 프로바이오틱을 혼합하는 것이며 이런 방식으로 프로바이오틱의 생존능력은 실질적으로 유지되어 생존가능한 프로바이오틱을 가진 미세입자가 제조될 수 있다. 이런 실시태양은 소수성 활성제가 프로바이오틱, 보호 기질 전구체 조성물 및 가교성 반응물과 혼합되게 하도록 소수성 활성제를 포함하는 에멀젼을 사용하여 프로바이오틱을 세포 파괴 및 생존능력 손실을 초래할 수 있는 스트레스, 즉 전단력에 영향받지 않게 하면서 미세입자 전구체 조성물을 형성한다.
또한, 본 발명은 미세입자 전구체 조성물과 최종 미세입자 모두의 방울 사이의 틈새 공간 내에 프로바이오틱의 생존을 개선하는 소수성 활성제 또는 지질의 방울로 형성된 보호 구조를 제공한다.
상기한 대로 프로바이오틱과 소수성 활성제를 혼합하면 미세입자 생산 동안 프로바이오틱 생존을 개선할 수 있다. 프로바이오틱 생존의 개선은 아래 식 2에 따라 백분율로 표현되고 계산된다.
식 2:
Figure 112015063039584-pct00003
일부 실시태양에서, 프로바이오틱 생존의 개선은 소수성 활성제, 프로바이오틱 및 다른 미세이자 구성요소가 함께 에멀젼화되는 공정과 비교할 때 약 20% 내지 약 50%일 수 있다. 예를 들어, 프로바이오틱 생존은 약 30% 개선될 수 있다.
소수성 활성제를 포함하는 에멀젼 및 보호 기질 전구체 조성물을 함께 혼합하면 혼합물을 생산할 수 있으며, 이 혼합물은 트레할로스에 의해 안정화된 변성 단백질 및 폴리올 가소제의 덩어리가 소수성 활성제를 포함하는 에멀젼으로부터 소수성 활성제의 방울을 둘러싸서, 소수성 활성제를 보호한다. 소수성 활성제의 방울이 적절하게 작은 크기인 것을 보장함으로써, 최종적으로 트레할로스에 의해 안정화된 변성 단백질 및 폴리올 가소제의 덩어리는 소수성 활성제를 더욱 쉽게 둘러싸서 "보호" 구조를 형성할 수 있다.
조성물의 소수성 활성제가 변성 단백질에 의해 보호되는 한, 소수성 활성제는 단백질의 장벽 특성으로부터 이득을 얻는다. 특히, 변성 단백질은 산소에 대한 장벽으로 작용하여 소수성 활성제의 산화를 제한 또는 예방할 수 있다. 이런 방식으로, 보호 기질은 소수성 활성제에서 발생하는 풍미, 특히 불유쾌한 풍미를 막거나 감소시킬 수 있다.
상기한 대로, 보호 기질은 프로바이오틱을 포함하는 미세입자의 임의의 활성제가 확산하거나 누출되는 것을 막을 수 있고 또는 활성제의 확산 또는 노출을 현저하게 감소 또는 완화할 수 있다. 예를 들어, 미세입자가 음료에 첨가되었을 때, 보호 기질은 활성제가 확산하거나 누출되는 것을 막아서 관련 활성제는 활성제의 유익한 활성이 사라지는 것을 유도할 수 있는 분해 환경에 노출되지 않게 할 수 있다. 보호 기질은 또한 분해 환경이 미세입자 자체 내에서 발생하는 것을 막을 수 있다. 예를 들어, 기질은 산소와 같은 분해 화합물의 내입을 막거나 제한하여 미세입자 내에서 관련 활성제의 분해를 막을 수 있다. 따라서, 분해 환경은 미세입자 내부 또는 외부일 수 있고 관련 활성제를 적어도 하나의 분해 화합물 및/또는 분해 조건에 노출하는 것을 수반하는 것이다. 본 발명의 보호 기질의 사용은 분해 환경에 대한 관련 활성제의 노출을 막거나 감소시킬 수 있다.
게다가, 관련 활성제는 보호 기질 내에 분포될 수 있어서 활성제의 풍미가 제품을 섭취하는 사람 또는 동물에 의해 인식되지 않는데 이는 보호 기질에서 트레할로스의 풍미 차단 활동 때문이다. 또한, 보호 기질의 특성은 활성제로부터 유래될 수 있는 개별 풍미 화합물이 미세입자를 통해 확산하거나 누출되는 것을 막거나 제한되는 것일 수 있다.
보호 기질은 프로바이오틱스를 보호하는데 특히 유용할 수 있다. 보호 기질의 산소 장벽 특성은 프로바이오틱의 생존을 향상시킬 수 있다. 또한, 보호 기질의 트레할로스는 프로바이오틱 주위로부터의 물을 대체할 수 있고 박테리아 세포 막에 유리질 기질을 형성하여 프로바이오틱을 안정화하고 프로바이오틱 생존능력을 손상시킬 수 있는 환경 스트레스로부터 보호할 수 있다. 게다가, 폴리올 가소제 및 트레할로스는 상승적으로 혼합되어 프로바이오틱의 생존을 강화시킬 수 있다.
또한, 프로바이오틱스는 이를 섭취하는 사람 또는 동물에 의해 불유쾌한 것으로 인식될 수 있는 풍미를 가질 수 있고 보호 기질은 이런 풍미를 차단할 수 있다. 보호 기질은 또한 미세입자로부터 프로바이오틱의 확산을 막음으로써 이런 풍미가 미세입자로부터 발산하는 것을 막을 수 있다.
보호 기질은 활성제 누출 또는 분해 화합물의 내입으로부터 초래될 수 있는 분해 환경에 대한 프로바이오틱 또는 임의의 다른 활성제의 노출을 장기간 동안 막거나 감소시킬 수 있다. 선택적으로 또는 부가적으로, 프로바이오틱(임의의 다른 활성제 또는 그 활성제의 구성요소)의 확산 또는 누출을 막거나 감소될 수 있어서 프로바이오틱으로부터의 풍미가 미세입자가 적절한 조건하에서 장기간 동안 저장된 후에도 미세입자를 섭취하는 사람 또는 동물에 의해 인식되지 않는다. 일부 실시태양에서, 보호 기질을 포함하는 미세 입자는, 적절한 저장 조건이 사용될 때, 최대 2개월, 바람직하게는 최대 4개월, 더욱 바람직하게는 최대 6개월 동안 프로바이오틱 또는 임의의 다른 활성제가 이의 유익한 작용을 상실하지 않고 저장 및/또는 프로바이오틱 또는 임의의 다른 활성제의 풍미가 인식가능하게 되지 않고 저장될 수 있다. 일부 실시태양에서, 미세 입자는, 적절한 저장 조건이 사용될 때, 최대 2개월, 바람직하게는 최대 4개월, 더욱 바람직하게는 최대 6개월 동안 프로바이오틱 또는 임의의 다른 활성제가 이의 유익한 작용을 상실하지 않고 저장 및/또는 프로바이오틱 또는 임의의 다른 활성제의 풍미가 인식가능하게 되지 않고 저장될 수 있다. 적절한 저장 조건은 약 -20℃ 온도에서 미세입자를 저장하는 것을 포함할 수 있다. 적절한 저장 조건은 호일에 미세입자를 진공 포장하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 미세입자는 음료와 같은 다른 제품에 첨가되어, 보충된 제품을 형성할 수 있다. 보호 기질은 보호 기질 내에 분산된 프로바이오틱 또는 임의의 다른 활성제의 분해 환경에 대한 노출을 보충된 제품의 통상적인 저장 수명 동안 막거나 감소시킬 수 있다. 즉, 프로바이오틱 또는 임의의 다른 활성제의 유익한 작용은 보호 기질의 사용을 통해 보충된 제품의 전체 저장 수명 동안 보존될 수 있다. 선택적으로 또는 부가적으로, 프로바이오틱 또는 임의의 다른 활성제의 확산 또는 누출은 막거나 제한될 수 있어서 프로바이오틱 또는 관련 다른 활성제로부터의 풍미가 보충된 제품을 섭취하는 사람 또는 동물에 의해 인식되지 않는다. 따라서, 일부 실시태양에서, 보충될 제품의 저장 수명은 미세입자에 의한 보충에 의해 영향을 받지 않는다. 보충된 제품은 약 15℃ 이하, 바람직하게는 약 10℃ 이하, 더욱 바람직하게는 4℃ 이하로 저장될 수 있다.
한 예로서, 본 발명에 따른 미세입자는 음료에 첨가되어 프로바이오틱으로 보충된 음료를 형성할 수 있다. 미세입자는 충분한 안정성을 가져서 보충된 음료는 약 4주, 바람직하게는 최대 2달, 더욱 바람직하게는 최대 3달 동안 저장될 수 있다. 예를 들어, 음료가 신선한 과일 주스와 같은 과일 주스인 경우, 주스는 약 4주 동안 프로바이오틱스가 이의 유익한 작용을 잃지 않고 저장 및/또는 프로바이오틱의 풍미가 인식가능하게 되지 않고 저장될 수 있다.
상기한 대로, 특정 활성제는, 예를 들어, 산소에 대한 노출을 통한 분해 이후 불유쾌한 풍미를 일으킬 수 있다. 따라서, 분해 환경에 노출을 막거나 제한함으로써, 본 발명의 보호 기질은 불유쾌한 풍미가 발생하는 것을 막는데 사용될 수 있다.
본 발명의 보호 기질은 프로바이오틱과 조합하여 사용될 수 있는 생선 오일 또는 다른 소수성 활성제와 같은 산화성 분해에 영향을 받기 쉬운 활성제를 보호하는데 특히 적합할 수 있다. 이런 활성제는 본질적으로 불유쾌한 풍미를 가질 수 있다. 그러나, 이런 활성제의 풍미는 활성제가 산화하는 경우 더욱 불유쾌하게 될 수 있다. 따라서, 보호 기질은 활성제의 산화를 막거나 억제하는 효과적인 산소 장벽을 제공할 수 있기 때문에 산화성 분해에 영향을 받기 쉬운 활성제를 함유하는 미세입자에 사용하는데 유리할 수 있다. 이런 활성제가 생선 오일과 같은 지질인 경우, 보호 기질의 트레할로스는 지질과 상호작용하여 산화를 억제 또는 막을 수 있다. 즉, 트레할로스는 산화에 대항하여 지질에서 불포화 결합을 안정화할 수 있다. 지질의 산화가 불유쾌한 풍미를 가진 휘발성 알데하이드의 생성을 유도할 수 있기 때문에, 지질 활성제의 산화를 억제하는 것은 불유쾌한 풍미가 발생하는 것을 막거나 이들의 발생을 감소시킨다.
불유쾌한 풍미를 가진 다른 활성제는 쓴 풍미를 가질 수 있는 비타민 B를 포함한다. 비타민 B는 비타민 B1(티아민), 비타민 B2(리보플라빈), 비타민 B3(니아신 또는 니아신아마이드), 비타민 B5(판토텐산), 비타민 B6(피리독신, 피리독살 또는 피리독사민 또는 피리독신 하이드로클로라이드), 비타민 B7(비오틴), 비타민 B9 (엽산) 및 비타민 B12(사이아노코발라민과 같은 다양한 코발라민)을 포함한다. 본 발명의 보호 기질은 기질 내에 분산된 하나 이상의 비타민 B의 풍미를 차단하는데 사용될 수 있다.
일부 실시태양에서, 변성 단백질, 폴리올 가소제 및 유리질 트레할로스 기질은 액체 활성제의 분산된 방울을 둘러싼다. 활성제의 이런 방울은 변성 단백질, 폴리올 가소제 및 유리질 트레할로스 기질과 비교하여 더 낮은 인장 모듈을 가질 것이다. 따라서, 활성제는 기질의 딱딱함을 감소시키고 단단함을 향상시킬 수 있다.
프로바이오틱 및 소수성 활성제가 사용된 일부 실시태양에서, 유리질 트레할로스 기질은 불연속 소수성 활성제 상 사이의 틈새 공간에 농축될 수 있다. 따라서, 유리질 트레할로스 기질은 소수성 활성제에 의해 제공될 수 있는 프로바이오틱의 보호를 강화할 수 있다. 이런 실시태양에서, 이런 구조의 형성을 촉진하기 위해, 미세입자 전구체 조성물은 소수성 활성제에 혼합되기 전에 보호 기질 전구체 조성물과 프로바이오틱을 혼합함으로써 생산될 수 있다.
일단 프로바이오틱 및 소수성 활성제가 보호 기질 전구체 조성물과 혼합된 후, 가교성 반응물이 이런 구성요소와 혼합되어 미세입자 전구체 조성물을 생산할 수 있다. 이런 방식으로, 프로바이오틱은, 가교성 반응물과 혼합되기 전에, 1차 보호 구조로서, 보호 기질을 형성할 재료 내에 잘 삽입될 수 있고 2차 보호 구조로서 소수성 활성제 방울 사이의 틈새 공간 내에 보호될 수 있다. 가교성 반응물로부터 형성된 가교 기질 및 가교성 반응물은 프로바이오틱을 위한 3차 보호 구조를 구성할 것이다.
보호 기질 전구체 조성물의 구성요소는 속에 혼합되는 미세입자 전구체 조성물을 안정화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 미세입자 전구체 조성물은 충분한 안정성을 가져서 분리되기 않고 장기간 동안 저장되는 것이 가능하다. 예를 들어, 본 발명의 미세입자 전구체 조성물은 약 2달, 바람직하게는 약 4달, 더욱 바람직하게는 최대 6달 동안 즉시 사용하도록 저장될 수 있다. 소수성 활성제가 사용될 때, 트레할로스는 변성 단백질과 소수성 활성제 사이의 상호작용을 안정화시킬 수 있어서 활성제는 담체 전체에 잘 분산될 수 있고 미세입자 전구체는 부드럽고 고른 에멀젼으로 유지된다. 따라서, 트레할로스는 충분한 안정성을 가진 이런 실시태양의 미세입자 전구체 조성물이, 분리 없이 최대 2개월 또는 최대 6개월의 장기간 동안 저장되게 하는 것을 도울 수 있다.
일부 실시태양에서, 보호 기질을 가진 미세입자에서 프로바이오틱의 CFU의 숫자는 프로바이오틱 생존능력이 적절한 조건하에서 2개월 저장 후 CFU의 최초 숫자의 90% 이상, 예를 들어, 99%이도록 유지될 수 있다. 일부 실시태양에서, CFU의 숫자는 프로바이오틱 생존능력이 적절한 조건하에서 6개월 저장 후 CFU의 최초 숫자의 90% 이상, 예를 들어, 99%이도록 유지될 수 있다. 적절한 저장 조건은 약 -20℃의 온도에서 미세입자를 저장하는 것을 포함할 수 있다. 적절한 저장 조건은 호일에 미세입자를 진공 포장하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 미세입자에서 프로바이오틱의 생존능력은 log10의 값(단위 중량 또는 단위 부피당 CFU의 최종 숫자)이 log10(단위 중량 또는 단위 부피당 CFU의 최초 숫자)의 ≤1 미만 값이도록 유지되며, 바람직하게는 값 사이의 차이는 0 내지 0.5이며, 더욱 바람직하게는 차이는 0.02 미만이며, 더욱더 바람직하게는 차이는 0.004 미만이다.
미세입자 전구체 조성물의 하나 이상의 구성요소는 산화에 영향을 받기 쉬울 수 있다. 주로 산화 취약성 구성요소는 생선 오일과 같은 활성제이다. 구성요소와 관련된 유익한 작용의 손실을 유도할 수 있는 취약성 구성요소의 산화 분해를 막거나 감소시키기 위해, 미세입자 전구체 조성물을 생산하는 방법의 특정 단계가 질소 또는 아르곤 분위기와 같은 불활성 분위기하에서 실행되어 산소에 대한 노출을 감소시키거나 막을 수 있다. 일부 실시태양에서, 산화 취약성 구성요소 또는 산화 취약성 구성요소를 함유하는 혼합물 또는 블렌드가 처리되는 매 단계는 불활성 분위기하에서 실행될 수 있다. 게다가, 미세입자 전구체 조성물이 산화 취약성 구성요소를 함유하는 실시태양에서, 미세입자는 불활성 분위기하에서 생산될 수 있다.
미세입자 전구체 조성물의 하나 이상의 구성요소는 광분해에 영향을 받기 쉬울 수 있다. 산화 취약성 구성요소와 유사하게, 광분해 취약성 구성요소는 생선 오일과 같은 활성제이다. 광분해를 막거나 감소시키기 위해, 미세입자 전구체 조성물을 생산하는 방법의 특정 단계가 덮이거나 불투명한 용기와 같은 어두운 환경에서 실행되어 빛에 대한 노출을 감소시키거나 막을 수 있다. 일부 실시태양에서, 광분해 취약성 구성요소 또는 광분해 취약성 구성요소를 함유하는 혼합물 또는 블렌드가 처리되는 매 단계는 어두운 환경에서 실행될 수 있다. 또한, 미세입자 전구체 조성물이 광분해 취약성 구성요소를 함유하는 실시태양에서, 미세입자는 어두운 환경에서 생산될 수 있다.
미세입자 전구체 조성물의 하나 이상의 구성요소는 열에 민감할 수 있고 관련 구성요소를 열 분해할 온도에 대한 노출을 피하기 위해 미세입자 전구체 조성물 및 미세입자 자체의 생산 동안 적절한 사전조치가 취해질 수 있다.
본 발명은 미세입자 전구체 조성물을 미세하게 나뉜 상태로 제공하는 단계; 및 미세하게 나뉜 미세입자 전구체 조성물을 가교제에 노출시켜 미세입자를 형성하는 단계를 포함하여 미세입자를 생산하는 방법을 제공한다. 즉, 미세입자 전구체 조성물의 가교성 반응물은 가교제와 반응하여 가교 기질을 형성한다.
가교성 반응물과 가교제에 의해 제공된 가교 기질은 가교 변성 단백질을 포함하는 보호 기질과 상호혼합될 것이다. 상호혼합은 가교 기질이 가교 기질의 3차원 네트워크 내에 보호 기질의 영역을 형성하게 되는 것이다. 즉, 가교 기질은 미세입자의 1차 구조를 형성할 수 있고 보호 기질은 가교 기질을 보강하는 2차 구조이다.
당업자에게 공지될 여러 기술이 존재하며, 적절하게 미세하게 나뉜 상태의 미세입자 전구체 조성물을 제공하고 이를 가교제에 노출하는데 사용될 수 있다. 미세입자 전구체 조성물은 특히 이의 전체 내용이 참조로 본 발명에 포함된 국제출원 No. PCT/AU2008/001695(공개번호 WO 2009/062254)에 기술된 방법에 따라 미세입자를 생산하기 위해 사용되는데 특히 적합하다. 이 방법은 본 발명에 다른 미세입자를 생산하는 바람직한 방법이다.
적절하게 미세하게 나뉜 상태의 미세입자 전구체 조성물을 제공하는 다른 적절한 방법은 미세입자 전구체 조성물이 주사기 펌프를 통해 공기 분무 장치 속에 배출되어 가교제 바스 속에 분사되는 공기 분무를 포함한다. 정전기 분무(전기분무 또는 전기수력학적 분무(EHDA))가 또한 적합할 수 있다. 이런 기술에서, 미세입자 전구체 조성물은 노즐 전극에 공급되고 대전되어 방울을 생산한다. 방울은 가교제 속에 적하된다. 회전 디스크 분무, 보르텍스-바울 디스크 분무 시스템 및 미세노즐 어레이가 또한 적절하게 나뉜 상태로 미세입자 전구체 조성물을 제공하는데 적합할 수 있다.
일단 형성되면, 미세입자는 활성제, 미세입자 크기 및 비중에 따라 원심 분리기, 정화기, 막 여과 및 필터 프레스를 포함하는 공지된 기술과 장치를 사용하여 분리될 수 있다. 프로바이오틱의 열 민감성에 따라, 열이 공급되어 겔의 이액현상(syneresis)을 일으켜 담체/용매/액체(통상적으로 물)의 제거를 촉진할 수 있다.
미세입자는 즉시 사용 형태일 수 있거나 필요에 따라 다른 제품에 첨가될 수 있다. 일부 상황에서, 소량의 물질이 사용되기 전에 미세입자로부터 세척될 필요가 있다. 예를 들어, CaCl2가 가교제로서 사용되어 알지네이트(가교성 반응물)의 겔화를 일으킬 때, 미세입자는 사용되지 않은 CaCl2를 제거하도록 세척될 필요가 있을 수 있다.
미세입자는 필요에 따라 다른 담체 고체(예를 들어, 말토덱스트린, 당)의 존재하에서 또는 부존재하에서 분사 건조, 진공 건조 또는 동결 건조되어 튼튼함을 제공할 수 있다. 보호 기질에서 트레할로스 및 폴리올 가소제의 동결방지 특성은 동결건조 공정에서 미세입자에 있는 프로바이오틱의 작용을 보존할 수 있다.
하이드로겔을 사용하여 형성된 미세입자는 다공성일 수 있어서, 미세입자에 코팅제를 도포하여 이의 장벽 특성을 개선하는 것이 유리할 수 있다. 본 발명의 미세입자는 호주 특허 가출원 No. 2012905167 및 이 가출원으로부터 우선권을 주장하는 "코팅 조성물"이란 제목의 국제 특허 출원에 기술된 코팅 조성물을 사용하여 코팅되는데 특히 적합하며 이 출원의 내용은 본 발명에 참조로 포함된다. 이런 코팅 조성물은 본 발명에 따른 미세입자를 위한 바람직한 코팅 조성물이다.
미세입자는 다양한 기술을 사용하여 코팅될 수 있다. 적절한 코팅 기술은 침지 코팅, 부분 침지 코팅, 담그기, 칠하기, 스핀 코팅, 흐름 코팅 및 분사 코팅을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 습식 하이드로겔 미세입자는 고른 코팅을 보장하도록 혼합된 코팅 조성물에 부분 침지된 후 포장될 수 있다.
제품을 코팅하는데 사용된 코팅 조성물의 양은 코팅될 미세입자의 최대 50중량%와 동일할 수 있다. 일부 실시태양에서, 사용된 코팅제의 양은 코팅될 미세입자의 20중량% 내지 40중량%와 동일할 수 있고, 바람직하게는 미세입자의 약 30중량%일 수 있다.
미세입자는 4℃, 바람직하게는 -20℃로 저장될 수 있다. 일부 실시태양에서, 호일에 진공 포장함으로써 미세입자를 저장하는 것이 바람직할 수 있다.
다음 비-제한적인 실시예는 본 발명의 실시태양 및 일부 비교예를 설명한다.
실시예 1
유장 단백질 분리물 ( WPI ) 기초 보호 기질 전구체 조성물
WPI 혼합물 제조
재료:
유장 단백질 분리물 분말 - 10g
물 - 90g
방법:
10% WPI 용액을 WPI 분말과 물을 함께 혼합하여 제조하였다. 혼합 후 혼합물을 30분 동안 방치하여 WPI를 탈수하였다. 방치 후, 10% WPI 용액을 30분 동안 90℃에서 열 처리하였다. 최종 10% WPI 혼합물을 사용 전에 냉각하였다.
보호 기질 전구체 조성물 제조
재료:
상기한 10% WPI 혼합물 - 60g
글리세롤 - 40g
트레할로스 분말 - 30g
방법:
재료를 IKA-웍스사에 의해 공급된 IKA® T25 디지털 ULTRA TURRAX® 고성능 단일-단계 분산 장치를 사용하여 고속으로 5분 동안 함께 혼합하였다. 그런 후에 최종 조성물을 30분 동안 85℃에서 살균하였다. 보호 기질 전구체 조성물을 사용 전에 실온으로 냉각하였다.
실시예 2
생선 오일 에멀젼
계면 활성제 혼합물 제조
재료:
레시틴 - 10g
탈이온수 - 90g
방법:
중간 속도로 혼합기를 사용하여, 모든 레시틴이 용해될 때까지 1:9의 비로 탈이온수에 레시틴을 용해하여 계면활성제 혼합물을 제조하였다. 그런 후에 계면활성제 혼합물을 30분 동안 90℃에서 살균하였다.
생선 오일 에멀젼 제조
재료:
상기한 계면활성제 혼합물 - 100g
오메가-3 생선 오일 - 200g
물(살균) - 200g
방법:
1. 구성요소를 살균 용기 속에 계량하여 1차 생선 오일 에멀젼을 제조하였다. 그런 후에 혼합물을 5분 동안 중간 속도로 Silverson Heavy Duty Laboratory 혼합기/에멀젼화기로 균질화하였다. 혼합기를 사용 전에 무수 알코올과 살균수에 세척하였다. 에멀젼의 표면에 오일 방울이 보이지 않았다.
2. 1차 생선 오일 에멀젼을 2단계 트윈 판다 400(GEA Niro Soavi) 균질기(1단계: 250bars, 2단계: 50bar)를 2회 통과시켜 에멀젼 방울 크기를 추가로 감소시켜 최종 생선 오일 에멀젼을 생산하였다. 균질화 장비를 매번 사용 전에 소독약과 살균수로 세척하였다.
주의: 생선 오일 산화의 개시를 막고 지연하기 위해서, 생선 오일 및 오메가-3 생선 오일을 함유하는 최종 에멀젼을 처리할 때 특별한 주위를 기울였다. 질소 기체를 사용하여 기체 블랭킷을 생성하고 생선 오일 에멀젼의 제조 동안 산소 노출을 감소시켰다. 또한 생선 오일 에멀젼을 빛 노출을 감소시키기 위해 호일로 덮인 용기에 혼합하였다.
실시예 3
가교성 반응물
가교성 반응물 제조
재료:
소듐 알지네이트 - 20g
펙틴 - 20g
탈이온수 - 360g
방법:
소듐 알지네이트, 펙틴 및 탈이온수를 함께 완전히 혼합하였다. 그런 후에 가교성 반응물을 사용하기 전날 30분 동안 90℃에서 살균하였다.
실시예 4
미세입자 전구체 조성물 - 락토바실러스 카제이 Lc431
미세입자 전구체 조성물 - 락토바실러스 카제이 Lc431 제조
재료:
실시예 1의 보호 기질 전구체 조성물 - 130g
락토바실러스 카제이 Lc431의 동결 농축물 - 25g
실시예 2의 생선 오일 에멀젼 - 500mL
실시예 3의 가교성 반응물 - 400g
방법:
락토바실러스 카제이 Lc431의 동결 농축물을 실온에서 살균 용기에 용해하였다. 그런 후에, 다음 순서로 살균 용기에 아래 나열한 살균 제조 조성물을 혼합하여 미세입자 전구체 조성물을 제조하였다:
1. 실시예 1의 보호 기질 전구체 조성물
2. 락토바실러스 카제이 Lc431의 용해 농축물
3. 실시예 2의 생선 오일 에멀젼
4. 실시예 3의 가교성 반응물
미세입자 전구체 조성물을 살균 스푼을 사용하여 손으로 함께 혼합하였다.
주의: 생선 오일 산화의 개시를 막고 지연하기 위해서, 생선 오일 및 오메가-3 생선 오일을 함유하는 최종 에멀젼을 처리할 때 특별한 주위를 기울였다. 질소 기체를 사용하여 기체 블랭킷을 생성하고 생선 오일 에멀젼의 제조 동안 산소 노출을 감소시켰다. 미세입자 전구체 조성물을 또한 질소 기체로 정화된 용기에 혼합하여 공기(특히 산소)에 대한 노출을 감소시켰고 호일로 덮어 빛에 대한 생선 오일의 노출을 감소시켰다.
실시예 5
미세입자 전구체 조성물 - 비피도박테리움 락티스 BB12
미세입자 전구체 조성물 - 비피도박테리움 락티스 BB12 제조
재료:
실시예 1의 보호 기질 전구체 조성물 - 130g
비피도박테리움 락티스 BB12의 동결 농축물 - 25g
실시예 2의 생선 오일 에멀젼 - 500mL
실시예 3의 가교성 반응물 - 400g
방법:
비피도박테리움 락티스 BB12의 동결 농축물을 실온에서 살균 용기에 용해하였다. 그런 후에, 다음 순서로 살균 용기에 아래 나열한 살균 제조 조성물을 혼합하여 미세입자 전구체 조성물을 제조하였다:
1. 실시예 1의 보호 기질 전구체 조성물
2. 비피도박테리움 락티스 BB12의 용해 농축물
3. 실시예 2의 생선 오일 에멀젼
4. 실시예 3의 가교성 반응물
미세입자 전구체 조성물을 살균 스푼을 사용하여 손으로 함께 혼합하였다.
주의: 생선 오일 산화의 개시를 막고 지연하기 위해서, 생선 오일 및 오메가-3 생선 오일을 함유하는 최종 에멀젼을 처리할 때 특별한 주위를 기울였다. 질소 기체를 사용하여 기체 블랭킷을 생성하고 생선 오일 에멀젼의 제조 동안 산소 노출을 감소시켰다. 미세입자 전구체 조성물을 또한 질소 기체로 정화된 용기에 혼합하여 공기(특히 산소)에 대한 노출을 감소시켰고 호일로 덮어 빛에 대한 생선 오일의 노출을 감소시켰다.
실시예 6
락토바실러스 카제이 Lc431 함유 미세입자
미세입자 제조
재료:
실시예 4의 미세입자 전구체 조성물 - ~1L
가교제: 0.1M 살균 염화 칼슘 용액(121℃에서 가압 살균) - ~2L
방법:
다음 방법은 국제출원 PCT/AU2008/001695(공개공보 No. WO 2009/062254)에 기술된 방법에 따른 것이다.
1. 압력 탱크에 미세입자 전구체 조성물을 채웠다. 다른 압력 탱크에 가교제를 채웠다.
2. 가압 질소 기체 공급원을 적절한 연결을 통해 압력 탱크에 연결하였다. 각 탱크 상의 출구 배관은 처음에 연결되지 않았다.
3. 압력 게이지를 조절하여 아래 표 1에 도시된 소정의 압력으로 조절하고 밸브를 잠갔다. 하부 노즐 액체는 가교제를 위한 것이며 상부 노즐 액체는 미세입자 전구체 조성물을 위한 것이다.
압력(kPa)
하부 노즐 질소 기체 200
하부 노즐 액체 150
상부 노즐 질소 기체 500
상부 노즐 액체 500
4. 가교제 압력 탱크의 액체 배관을 반응 챔버에 연결하고 가교제 옅은 안개가 적어도 2분 동안 반응 챔버를 채우게 하였다.
5. 2분 후, 미세입자 전구체 조성물 압력 탱크에서 압력은 압력 탱크의 액체 배관을 반응 챔버에 연결하기 전에 최대 500kPa인 것으로 확인되었다. 그런 후에 미세입자 전구체 조성물의 에어로졸을 생산하고 가교제 옅은 안개에 노출하였다.
6. 최종 미세입자 슬러리를 반응 챔버의 수집 배관으로부터 호일로 덮인 살균 용기 속에 수집하였다.
7. 미세입자 생산의 완료 후, 압력 게이지를 잠그고 장치를 세척하였다.
8. 미세입자 슬러리를 살균 와트만 필터 종이(5C)로 층을 이룬 깔때기를 통해 여과되었다. 습식 미세입자의 여과액을 필터를 통해 살균 탈이온수로 2회 세척하여 염화 칼슘 잔기를 세척하였다.
실시예 7
비피도박테리움 락티스 BB12 함유 미세입자
미세입자 제조
재료:
실시예 5의 미세입자 전구체 조성물 - ~1L
가교제: 0.1M 살균 염화 칼슘 용액(121℃에서 가압 살균) - ~2L
방법:
다음 방법은 국제출원 PCT/AU2008/001695(공개공보 No. WO 2009/062254)에 기술된 방법에 따른 것이다.
1. 압력 탱크에 미세입자 전구체 조성물을 채웠다. 다른 압력 탱크에 가교제를 채웠다.
2. 가압 질소 기체 공급원을 적절한 연결을 통해 압력 탱크에 연결하였다. 각 탱크 상의 출구 배관은 처음에 연결되지 않았다.
3. 압력 게이지를 조절하여 아래 표 2에 도시된 소정의 압력으로 조절하고 밸브를 잠갔다. 하부 노즐 액체는 가교제를 위한 것이며 상부 노즐 액체는 미세입자 전구체 조성물을 위한 것이다.
압력(kPa)
하부 노즐 질소 기체 200
하부 노즐 액체 150
상부 노즐 질소 기체 500
상부 노즐 액체 500
4. 가교제 압력 탱크의 액체 배관을 반응 챔버에 연결하고 가교제 옅은 안개가 적어도 2분 동안 반응 챔버를 채우게 하였다.
5. 2분 후, 미세입자 전구체 조성물 압력 탱크에서 압력은 압력 탱크의 액체 배관을 반응 챔버에 연결하기 전에 최대 500kPa인 것으로 확인되었다. 그런 후에 미세입자 전구체 조성물의 에어로졸을 생산하고 가교제 옅은 안개에 노출하였다.
6. 최종 미세입자 슬러리를 반응 챔버의 수집 배관으로부터 호일로 덮인 살균 용기 속에 수집하였다.
7. 미세입자 생산의 완료 후, 압력 게이지를 잠그고 장치를 세척하였다.
8. 미세입자 슬러리를 살균 와트만 필터 종이(5C)로 층을 이룬 깔때기를 통해 여과되었다. 습식 미세입자의 여과액을 필터를 통해 살균 탈이온수로 2회 세척하여 염화 칼슘 잔기를 세척하였다.
실시예 8
미세입자에서 비피도박테리움 락티스 BB12 의 생존
실시예 7에 따라 제조된 미세입자를 젖은 상태로 비피도박테리움 락티스 BB12의 생존의 연구를 위해 우유 속에 첨가하였다. 우유에 첨가된 미세입자의 양은 0.5g/100mL이었고 우유를 4℃로 저장하였다. 프로바이오틱 적재량을 밀리리터당 콜로니 형성 단위(CFU/mL)로 측정하였다.
비피도박테리움 락티스 BB12의 최초 수준은 8.46log10 CFU/mL이었다. 7일 후, 수준은 8.40log10 CFU/mL로 감소하였고, 이는 약 99% 프로바이오틱 생존에 해당한다.
실시예 9
생선 오일 에멀젼
계면 활성제 혼합물 제조
재료:
레시틴 - 10g
탈이온수 - 90g
방법:
중간 속도로 혼합기를 사용하여, 모든 레시틴이 용해될 때까지 1:9의 비로 탈이온수에 레시틴을 용해하여 계면활성제 혼합물을 제조하였다. 그런 후에 계면활성제 혼합물을 30분 동안 90℃에서 살균하였다.
생선 오일 에멀젼 제조
재료:
상기한 계면활성제 혼합물 - 100g
오메가-3 생선 오일 - 100g
물(살균) - 200g
방법:
1. 구성요소를 살균 용기 속에 계량하여 1차 생선 오일 에멀젼을 제조하였다. 그런 후에 혼합물을 5분 동안 중간 속도로 Silverson Heavy Duty Laboratory 혼합기/에멀젼화기로 균질화하였다. 혼합기를 사용 전에 무수 알코올과 살균수에 세척하였다. 에멀젼의 표면에 오일 방울이 보이지 않았다.
2. 1차 생선 오일 에멀젼을 2단계 트윈 판다 400(GEA Niro Soavi) 균질기(1단계: 250bars, 2단계: 50bar)를 2회 통과시켜 에멀젼 방울 크기를 추가로 감소시켜 최종 생선 오일 에멀젼을 생산하였다. 균질화 장비를 매번 사용 전에 소독약과 살균수로 세척하였다.
주의: 생선 오일 산화의 개시를 막고 지연하기 위해서, 생선 오일 및 오메가-3 생선 오일을 함유하는 최종 에멀젼을 처리할 때 특별한 주위를 기울였다. 질소 기체를 사용하여 기체 블랭킷을 생성하고 생선 오일 에멀젼의 제조 동안 산소 노출을 감소시켰다. 또한 생선 오일 에멀젼을 빛 노출을 감소시키기 위해 호일로 덮인 용기에 혼합하였다.
실시예 10
가교성 반응물
가교성 반응물 제조
재료:
소듐 알지네이트 - 20g
펙틴 - 10g
탈이온수 - 370g
방법:
소듐 알지네이트, 펙틴 및 탈이온수를 함께 완전히 혼합하였다. 그런 후에 가교성 반응물을 사용하기 전날 30분 동안 90℃에서 살균하였다.
실시예 10A
가교성 반응물
가교성 반응물 제조
재료:
소듐 알지네이트 - 20g
펙틴 - 10g
탈이온수 - 870g
방법:
소듐 알지네이트, 펙틴 및 탈이온수를 함께 완전히 혼합하였다. 그런 후에 가교성 반응물을 사용하기 전날 30분 동안 90℃에서 살균하였다.
실시예 11
미세입자 전구체 조성물 - 락토바실러스 카제이 Lc431 및 생선 오일 함유 미세입자
미세입자 전구체 조성물 - 락토바실러스 카제이 Lc431 및 생선오일 제조
재료:
실시예 1의 보호 기질 전구체 조성물 - 75g
락토바실러스 카제이 Lc431의 동결 농축물 - 25g
실시예 9의 생선 오일 에멀젼 - 500g
실시예 3의 가교성 반응물 - 400g
방법:
락토바실러스 카제이 Lc431의 동결 농축물을 실온에서 살균 용기에 용해하였다. 그런 후에, 다음 순서로 살균 용기에 아래 나열한 살균 제조 조성물을 혼합하여 미세입자 전구체 조성물을 제조하였다:
1. 실시예 1의 보호 기질 전구체 조성물
2. 락토바실러스 카제이 Lc431의 용해 농축물
3. 실시예 9의 생선 오일 에멀젼
4. 실시예 10의 가교성 반응물
미세입자 전구체 조성물을 살균 스푼을 사용하여 손으로 함께 혼합하였다.
주의: 생선 오일 산화의 개시를 막고 지연하기 위해서, 생선 오일 및 오메가-3 생선 오일을 함유하는 최종 에멀젼을 처리할 때 특별한 주위를 기울였다. 질소 기체를 사용하여 기체 블랭킷을 생성하고 생선 오일 에멀젼의 제조 동안 산소 노출을 감소시켰다. 미세입자 전구체 조성물을 또한 질소 기체로 정화된 용기에 혼합하여 공기(특히 산소)에 대한 노출을 감소시켰고 호일로 덮어 빛에 대한 생선 오일의 노출을 감소시켰다.
실시예 12
락토바실러스 카제이 Lc431 및 생선 오일 함유 미세입자
미세입자 제조
재료:
실시예 11의 미세입자 전구체 조성물 - ~1kg
가교제: 0.1M 살균 염화 칼슘 용액(15분 동안 121℃에서 가압 살균하고 실온으로 냉각) - ~2L
방법:
다음 방법은 국제출원 PCT/AU2008/001695(공개공보 No. WO 2009/062254)에 기술된 방법에 따른 것이다.
1. 압력 탱크에 미세입자 전구체 조성물을 채웠다. 다른 압력 탱크에 가교제를 채웠다.
2. 가압 질소 기체 공급원을 적절한 연결을 통해 압력 탱크에 연결하였다. 각 탱크 상의 출구 배관은 처음에 연결되지 않았다.
3. 압력 게이지를 조절하여 아래 표 3에 도시된 소정의 압력으로 조절하고 밸브를 잠갔다. 하부 노즐 액체는 가교제를 위한 것이며 상부 노즐 액체는 미세입자 전구체 조성물을 위한 것이다.
압력(kPa)
하부 노즐 질소 기체 200
하부 노즐 액체 150
상부 노즐 질소 기체 500
상부 노즐 액체 500
4. 가교제 압력 탱크의 액체 배관을 반응 챔버에 연결하고 가교제 옅은 안개가 적어도 2분 동안 반응 챔버를 채우게 하였다.
5. 2분 후, 미세입자 전구체 조성물 압력 탱크에서 압력은 압력 탱크의 액체 배관을 반응 챔버에 연결하기 전에 최대 500kPa인 것으로 확인되었다. 그런 후에 미세입자 전구체 조성물의 에어로졸을 생산하고 가교제 옅은 안개에 노출하였다.
6. 최종 미세입자 슬러리를 반응 챔버의 수집 배관으로부터 호일로 덮인 살균 용기 속에 수집하였다.
7. 미세입자 생산의 완료 후, 압력 게이지를 잠그고 장치를 세척하였다.
8. 미세입자 슬러리를 살균 와트만 필터 종이(5C)로 층을 이룬 깔때기를 통해 여과되었다. 습식 미세입자의 여과액을 필터를 통해 살균 탈이온수로 2회 세척하여 염화 칼슘 잔기를 세척하였다.
실시예 13
미세입자 전구체 조성물 - 락토바실러스 카제이 Lc431 함유 미세입자
미세입자 전구체 조성물 - 락토바실러스 카제이 Lc431 제조
재료:
실시예 1의 보호 기질 전구체 조성물 - 75g
락토바실러스 카제이 Lc431의 동결 농축물 - 25g
실시예 10A의 가교성 반응물 - 900g
방법:
락토바실러스 카제이 Lc431의 동결 농축물을 실온에서 살균 용기에 용해하였다. 그런 후에, 다음 순서로 살균 용기에 아래 나열한 살균 제조 조성물을 혼합하여 미세입자 전구체 조성물을 제조하였다:
1. 실시예 1의 보호 기질 전구체 조성물
2. 락토바실러스 카제이 Lc431의 용해 농축물
3. 실시예 10A의 가교성 반응물
미세입자 전구체 조성물을 살균 스푼을 사용하여 손으로 함께 혼합하였다.
실시예 14
락토바실러스 카제이 Lc431 함유 미세입자
미세입자 제조
재료:
실시예 13의 미세입자 전구체 조성물 - ~1kg
가교제: 0.1M 살균 염화 칼슘 용액(15분 동안 121℃에서 가압 살균하고 실온으로 냉각) - ~2L
방법:
다음 방법은 국제출원 PCT/AU2008/001695(공개공보 No. WO 2009/062254)에 기술된 방법에 따른 것이다.
1. 압력 탱크에 미세입자 전구체 조성물을 채웠다. 다른 압력 탱크에 가교제를 채웠다.
2. 가압 질소 기체 공급원을 적절한 연결을 통해 압력 탱크에 연결하였다. 각 탱크 상의 출구 배관은 처음에 연결되지 않았다.
3. 압력 게이지를 조절하여 아래 표 4에 도시된 소정의 압력으로 조절하고 밸브를 잠갔다. 하부 노즐 액체는 가교제를 위한 것이며 상부 노즐 액체는 미세입자 전구체 조성물을 위한 것이다.
압력(kPa)
하부 노즐 질소 기체 200
하부 노즐 액체 150
상부 노즐 질소 기체 500
상부 노즐 액체 500
4. 가교제 압력 탱크의 액체 배관을 반응 챔버에 연결하고 가교제 옅은 안개가 적어도 2분 동안 반응 챔버를 채우게 하였다.
5. 2분 후, 미세입자 전구체 조성물 압력 탱크에서 압력은 압력 탱크의 액체 배관을 반응 챔버에 연결하기 전에 최대 500kPa인 것으로 확인되었다. 그런 후에 미세입자 전구체 조성물의 에어로졸을 생산하고 가교제 옅은 안개에 노출하였다.
6. 최종 미세입자 슬러리를 반응 챔버의 수집 배관으로부터 호일로 덮인 살균 용기 속에 수집하였다.
7. 미세입자 생산의 완료 후, 압력 게이지를 잠그고 장치를 세척하였다.
8. 미세입자 슬러리를 살균 와트만 필터 종이(5C)로 층을 이룬 깔때기를 통해 여과되었다. 습식 미세입자의 여과액을 필터를 통해 살균 탈이온수로 2회 세척하여 염화 칼슘 잔기를 세척하였다.
실시예 15
락토바실러스 카제이 Lc431 및 생선 오일 함유 미세입자에 의해 보충된 액체 단맛 포뮬라
미세입자를 실시예 12에 따라 제조하였다. 이런 미세입자를 변성 유장 단백질 분리물, 캐놀라 오일, 글리세롤, 트레할로스 및 물의 혼합물을 포함하는 코팅 조성물로 코팅하였다. 미세입자를 중량 기초로 10:3의 미세입자:코팅 조성물 비로 미세입자 및 코팅 조성물을 함께 손으로 혼합하여 코팅하였다.
미세입자를 액체 단맛 포뮬라에 첨가하여 중량 기초로 0.45% 잔탄검, 1.8% 카라기난 검, 2% 프룩토오스, 34% 망고 시럽 및 13% 미세입자를 포함하며 나머지는 물인 보충된 포뮬라를 생산하였다. 미세입자로 보충한 후, 액체 단맛 포뮬라를 포장하여 10mL 제공 파우치를 생산하였다. 각 파우치는 미세입자에 의한 보충 때문에 30억 CFU의 락토바실러스 카제이 Lc431 및 100mg DHA/EPA를 함유하였다.
파우치를 실온에서 2주 동안 먼저 저장한 후 4℃로 저장하였다. 샘플을 6개월 동안 테스트하여 프로바이오틱 생존 및 락토바실러스 카제이 Lc431 및 생선 오일의 풍미(즉 냄새/맛)가 인식되었는지를 평가하였다. 이런 테스트의 결과는 아래 표 5 및 도 1에 도시된다.
프로바이오틱 생존능력 및 풍미 인식 테스트 결과
측정 날짜 세포 생존능력( Log 10 CFU /mL) **감각 평가
2주* 7.85 0
3주 7.7 0
4주 7.26 0
5주 7.68 0
6주 7.17 0
7주 7.58 0
8주 7.38 0
9주 7.38 0
10주 7.05 0
11주 7.16 0
12주 7.15 0
6개월 6.50 0
NB: * 안정성 테스트를 실온에서 저장 2주 후 시작하였다.
** 감각 평가를 0 = 탐지되지 않은 활성제(들)의 풍미(즉 냄새/맛)로부터 10 = 매우 쉽게 탐지된 활성제(들)의 풍미까지 매겼다.
실시예 16
락토바실러스 카제이 Lc431 함유 미세입자에 의해 보충된 얇은 베이스 드링크 포뮬라
미세입자를 실시예 14에 따라 제조하였다. 이런 미세입자를 변성 유장 단백질 분리물, 캐놀라 오일, 글리세롤, 트레할로스 및 물의 혼합물을 포함하는 코팅 조성물로 코팅하였다. 미세입자를 중량 기초로 10:3의 미세입자:코팅 조성물 비로 미세입자 및 코팅 조성물을 함께 손으로 혼합하여 코팅하였다.
미세입자를 얇은 베이스 드링크 포뮬라에 첨가하여 중량 기초로 3% 유장 단백질 분리물, DuPontTMDanisco®로부터의 2% 라이테스 II(Litess II), National Starch로부터의 1% 프로바이오틱 Hi-maize®, 4% 트레할로스, 0.75% 스테비아, 0.05% 잔탄검, 0.1% 포타슘 소르베이트 및 2% 미세입자를 포함하며 나머지는 물인 보충된 포뮬라를 생산하였다. 보충된 얇은 베이스 드링크 포뮬라의 샘플을 4℃ 또는 25℃로 저장하였고 6개월 동안 테스트하여 프로바이오틱 생존을 평가하였다. 이런 테스트의 결과는 아래 표 6 및 도 2에 도시된다.
프로바이오틱 생존능력 테스트 결과
측정 날짜 4℃에서 저장된 샘플에 대한 세포 생존능력
( Log 10 CFU /mL) 		25℃에서 저장된 샘플에 대한 세포 생존능력
( Log 10 CFU /mL)
1일 7.87 7.87
2주 7.4 7.75
4주 7.6 7.45
6주 7.67 7.52
8주 7.89 7.90
10주 7.90 7.65
12주 7.87 7.25
4개월 7.75 5.7
6개월 7.50
실시예 17
락토바실러스 카제이 Lc431 및 생선 오일 함유 미세입자에 의해 보충된 얇은 베이스 드링크 포뮬라
미세입자를 실시예 12에 따라 제조하였다. 이런 미세입자를 변성 유장 단백질 분리물, 캐놀라 오일, 글리세롤, 트레할로스 및 물의 혼합물을 포함하는 코팅 조성물로 코팅하였다. 미세입자를 중량 기초로 10:3의 미세입자:코팅 조성물 비로 미세입자 및 코팅 조성물을 함께 손으로 혼합하여 코팅하였다.
미세입자를 얇은 베이스 드링크 포뮬라에 첨가하여 중량 기초로 3% 유장 단백질 분리물, DuPontTMDanisco®로부터의 2% 라이테스 II(Litess II), National Starch로부터의 1% 프로바이오틱 Hi-maize®, 4% 트레할로스, 0.75% 스테비아, 0.05% 잔탄검, 0.1% 포타슘 소르베이트 및 2% 미세입자를 포함하며 나머지는 물인 보충된 포뮬라를 생산하였다. 보충된 얇은 베이스 드링크 포뮬라의 샘플을 4℃ 또는 25℃로 저장하였고 6개월 동안 테스트하여 프로바이오틱 생존을 평가하였다. 이런 테스트의 결과는 아래 표 7 및 도 3에 도시된다.
프로바이오틱 생존능력 테스트 결과
측정 날짜 4℃에서 저장된 샘플에 대한 세포 생존능력
( Log 10 CFU /mL) 		25℃에서 저장된 샘플에 대한 세포 생존능력
( Log 10 CFU /mL)
1일 7.00 7.00
2주 6.95 6.92
4주 7.39 7.33
6주 7.61 7.50
8주 7.95 7.24
10주 7.94 7.44
12주 7.92 7.33
4개월 8.04 5.00
6개월 7.61
실시예 18
락토바실러스 카제이 Lc431 함유 미세입자에 의해 보충된 식사 대체 단백질 분말
미세입자를 실시예 14에 따라 제조하였다. 이런 미세입자를 변성 유장 단백질 분리물, 캐놀라 오일, 글리세롤, 트레할로스 및 물의 혼합물을 포함하는 코팅 조성물로 코팅하였다. 미세입자를 중량 기초로 10:3의 미세입자:코팅 조성물 비로 미세입자 및 코팅 조성물을 함께 손으로 혼합하여 코팅하였다.
미세입자를 1:49 중량비로 구입가능한 식사 대체 단백질 분말에 첨가하였다.
보충된 식사 대체 단백질 분말의 샘플을 밀봉 용기 또는 호일에 포장된 진공에 저장하였다. 이런 샘플을 4℃로 저장하였고 3개월 동안 테스트하여 프로바이오틱 생존을 평가하였다. 이런 테스트의 결과는 아래 표 8 및 도 4에 도시된다.
샘플 4℃에서 저장 0일 후 세포 생존능력
( Log 10 CFU /mL) 		4℃에서 저장 1개월 후 세포 생 존능 력
( Log 10 CFU /mL) 		4℃에서 저장 2개월 후 세포 생존능력
( Log 10 CFU /mL) 		4℃에서 저장 3개월 후 세포 생존능력
( Log 10 CFU /mL)
용기 속 마른 혼합물 8.01 7.57 7.58 7.22
진공 호일 팩 속 마른 혼합물 8.01 7.47 7.67 7.73
실시예 19
락토바실러스 카제이 Lc431 함유 미세입자에 의해 보충된 음료
- 낮은 pH에서 캡슐화의 안정성
미세입자를 실시예 14에 따라 제조하였다. 이런 미세입자를 변성 유장 단백질 분리물, 캐놀라 오일, 글리세롤, 트레할로스 및 물의 혼합물을 포함하는 코팅 조성물로 코팅하였다. 미세입자를 중량 기초로 10:3의 미세입자:코팅 조성물 비로 미세입자 및 코팅 조성물을 함께 손으로 혼합하여 코팅하였다.
파트 1 - 주스-기초 음료에 대한 첨가
미세입자를 20중량% 사과 주스, 5중량% 망고 주스 및 75% 물을 포함하는 주스 드링크에 첨가하여 중량 기초로 1% 미세입자를 포함하는 보충된 주스 드링크를 생산하였다. 보충된 주스는 pH 3.6이었다.
보충된 주스 드링크의 샘플을 4℃로 저장하였고 10주 동안 테스트하여 프로바이오틱 생존을 평가하였다. 이런 테스트의 결과는 아래 표 9 및 도 5에 도시된다.
파트 2 - 물-기초 음료에 대한 첨가
미세입자를 물-기초 음료에 첨가하여 중량 기초로 4% 트레할로스, DuPontTMDanisco®로부터의 2% 라이테스 II, 2% 프록토오스, 0.2% 잔탄 검, 0.05% 포타슘 소르베이트, 0.025% 아스코르브산, 1% 미세입자를 포함하는 보충된 음료를 생산하였다. 보충된 음료는 pH 4.5이었다.
보충된 음료의 샘플을 15℃로 저장하였고 10주 동안 테스트하여 프로바이오틱 생존을 평가하였다. 이런 테스트의 결과는 아래 표 9 및 도 5에 도시된다.
프로바이오틱 생존능력 테스트 결과
측정 날짜 세포 생존능력
( Log 10 CFU /mL)
4℃로 저장된 주스 드링크의 샘플 15 o C 로 저장된 물-기초 음료의 샘플
1일 6.2 6.77
1주 6.4 6.54
2주 6.43 6.73
3주 6.34 6.74
4주 6.37 6.65
5주 6.40 6.60
6주 6.18 6.62
7주 6.34 6.50
8주 6.30 6.01
9주 6.22 5.37
10주 6.07 4.82
실시예 20
높은 저장 온도에서 락토바실러스 카제이 Lc431 함유 미세입자의 안정성
미세입자를 실시예 14에 따라 제조하였다. 이런 미세입자를 변성 유장 단백질 분리물, 캐놀라 오일, 글리세롤, 트레할로스 및 물의 혼합물을 포함하는 코팅 조성물로 코팅하였다. 미세입자를 중량 기초로 10:3의 미세입자:코팅 조성물 비로 미세입자 및 코팅 조성물을 함께 손으로 혼합하여 코팅하였다.
미세입자를 다음 혼합물로 결합하였다.
혼합물 1: 1:9의 중량비로 함께 혼합된 미세입자 및 PromOatTM.
혼합물 2: 1:5:4의 중량비로 혼합된 미세입자, Hi-maize® 저항 전분 및 인슐린.
혼합물 3: 1:5:4의 중량비로 혼합된 미세입자, Hi-maize® 저항 전분 및 트레할로스.
비교를 위해서, 비교 혼합물을 다음과 같이 제조하였다:
동결된 락토바실러스 카제이 Lc431 농축물을 액체로 해동하고 5분 동안 4000rpm으로 원심분리하여 세포 덩어리를 얻었다. 이 세포 덩어리를 사용하여 다음 비교 혼합물을 제조하였다.
비교 혼합물 1: 1:9의 중량비로 함께 혼합된 락토바실러스 카제이 Lc431 농축물(즉, 비-캡슐화된 프로바이오틱) 및 PromOatTM.
비교 혼합물 2: 1:5:4의 중량비로 함께 혼합된 락토바실러스 카제이 Lc431 농축물(즉, 비-캡슐화된 프로바이오틱), Hi-maize® 저항 전분 및 인슐린.
비교 혼합물 3: 1:5:4의 중량비로 함께 혼합된 락토바실러스 카제이 Lc431 농축물(즉, 비-캡슐화된 프로바이오틱), Hi-maize® 저항 전분 및 트레할로스.
혼합물 1, 2 및 3 및 비교 혼합물 1, 2 및 3을 1주 동안 37℃로 저장하고 저장 이후 프로바이오틱 생존에 대해 평가하도록 테스트하였다. 이런 테스트의 결과는 아래 표 10에 도시된다.
프로바이오틱 생존능력 테스트 결과
샘플 세포 생존능력
( Log 10 CFU /mL)
0일 1주
혼합물 1 8.26 8.72
비교 혼합물 1 9.48 5
혼합물 2 8.09 7.67
비교 혼합물 2 9.35 5
혼합물 3 8.18 7.54
비교 혼합물 3 9.00 5
실시예 21
저장 이후 락토바실러스 카제이 Lc431 의 생존 - 락토바실러스 카제이 Lc431 및 생선 오일 함유 미세입자
미세입자를 실시예 12에 따라 제조하였다. 이런 미세입자를 변성 유장 단백질 분리물, 캐놀라 오일, 글리세롤, 트레할로스 및 물의 혼합물을 포함하는 코팅 조성물로 코팅하였다. 미세입자를 중량 기초로 10:3의 미세입자:코팅 조성물 비로 미세입자 및 코팅 조성물을 함께 손으로 혼합하여 코팅하였다.
락토바실러스 카제이 Lc431 생존의 연구를 위해 젖은 미세입자의 샘플을 밀봉 용기(즉, 단단한 뚜껑을 가진 용기)에 4℃ 또는 -20℃로 저장하였다. 3달 동안 4℃로 저장한 샘플로부터 얻은 프로바이오틱 생존능력 측정값은 아래 표 11에 도시되고, 4달 동안 -20℃로 저장한 샘플로부터 얻은 프로바이오틱 생존능력 측정값은 아래 표 12에 도시된다.
4℃로 저장한 샘플에 대한 프로바이오틱 생존능력 테스트 결과
측정 날짜 배치 160812
세포 생존능력
( Log 10 CFU /g) 		배치 060912
세포 생존능력
( Log 10 CFU /g) 		배치 111112 세포 생존능력
( Log 10 CFU /g)
0일 9.75 9.92 9.95
1달 9.78 9.73 n/a
2달 9.74 9.78 9.48
3달 9.4 8.78 7.45
-20℃로 저장한 샘플에 대한 프로바이오틱 생존능력 테스트 결과
측정 날짜 배치 160812
세포 생존능력
( Log 10 CFU /g) 		배치 060912
세포 생존능력
( Log 10 CFU /g) 		배치 111112 세포 생존능력
( Log 10 CFU /g)
0일 9.75 9.92 9.95
1달 n/a n/a n/a
2달 9.79 9.87 9.18
3달 9.62 9.62 9.18
4달 9.34 9.58 n/a
실시예 22
락토바실러스 카제이 Lc431 함유 미세입자에 의해 보충된 식사 대체 단백질 분말
미세입자를 실시예 14에 따라 제조하였다. 이런 미세입자를 변성 유장 단백질 분리물, 캐놀라 오일, 글리세롤, 트레할로스 및 물의 혼합물을 포함하는 코팅 조성물로 코팅하였다. 미세입자를 중량 기초로 10:3의 미세입자:코팅 조성물 비로 미세입자 및 코팅 조성물을 함께 손으로 혼합하여 코팅하였다.
미세입자를 1:49 중량비로 구입가능한 식사 대체 단백질 분말에 첨가하였다.
보충된 식사 대체 단백질 분말의 샘플을 4℃ 또는 25℃로 저장된 호일에 진공 포장하였고 12주 동안 테스트하여 프로바이오틱 생존을 평가하였다. 이런 테스트의 결과는 아래 표 13에 도시된다.
프로바이오틱 생존능력 테스트 결과
측정 날짜 4℃에서 저장된 샘플에 대한 생존능력( Log 10 CFU/g) 25℃에서 저장된 샘플에 대한 생존능력( Log 10 CFU/g)
0일 7.99 7.99
2주 7.43 7.10
4주 7.57 6.67
8주 7.70 n/a
12주 7.85 n/a
실시예 23
락토바실러스 카제이 Lc431 함유 미세입자에 의해 보충된 밀가루 기초 분말
미세입자를 실시예 14에 따라 제조하였다. 이런 미세입자를 변성 유장 단백질 분리물, 캐놀라 오일, 글리세롤, 트레할로스 및 물의 혼합물을 포함하는 코팅 조성물로 코팅하였다. 미세입자를 중량 기초로 10:3의 미세입자:코팅 조성물 비로 미세입자 및 코팅 조성물을 함께 손으로 혼합하여 코팅하였다.
미세입자를 1:5:4의 미세입자:쌀:밀가루:트레할로스 중량비로 쌀가루 및 트레할로스와 혼합하여 보충된 밀가루 기초 분말을 형성하였다.
보충된 밀가루-기초 분말의 샘플을 37℃에서 밀봉 용기(즉, 단단한 뚜껑을 가진 용기)에 저장하였고 2주 동안 테스트하여 프로바이오틱 생존을 평가하였다. 이런 테스트의 결과는 아래 표 14에 도시된다.
프로바이오틱 생존능력 테스트 결과
측정 날짜 37℃에서 저장된 샘플에 대한 생존능력( Log 10 CFU/g)
0일 8.52
1주 8.62
2주 7.01
비교예 1
비교 미세입자에서 비피도박테리움 락티스 BB12 의 생존
비피도박테리움 락티스 BB12 및 트레할로스를 함유하는 미세입자를 실시예 7에 따라 제조하였다. 그러나, 이 비교예를 위한 미세입자를 제조하는데 사용된 미세입자 전구체 조성물은 다음 조성을 가졌다, 400g의 조성물의 경우: 비피도박테리 움 락티스 BB12의 200g 용해 농축물, 5% 트레할로스, 1% 레시틴, 2% 소듐 알지네이트 및 0.2% TWEEN 80, 조성물의 나머지는 물이다.
이런 미세입자를 동결건조한 후 비피도박테리움 락티스 BB12 생존 연구를 위해 우유 속에 첨가하였다. 우유 속에 첨가된 미세입자의 양은 30mg/300mL이었고 우유는 4℃로 저장하였다. 프로바이오틱 적재량은 밀리리터당 콜로니 형성 단위(CFU/mL)로 측정하였다.
비피도박테리움 락티스 BB12의 최초 수준은 7.35log10 CFU/mL이었다. 7일 후, 수준은 6.96log10 CFU/mL로 감소하였고, 이는 약 94.7% 프로바이오틱 생존에 해당한다.
비교예 2
비교 미세입자에서 비피도박테리움 락티스 BB12 의 생존
비피도박테리움 락티스 BB12 및 트레할로스를 함유하는 미세입자를 실시예 7에 따라 제조하였다. 그러나, 이 비교예를 위한 미세입자를 제조하는데 사용된 미세입자 전구체 조성물은 다음 조성을 가졌다, 400g의 조성물의 경우: 비피도박테리움 락티스 BB12의 200g 용해 농축물, 5% 트레할로스, 1% 레시틴, 2% 소듐 알지네이트 및 0.2% TWEEN 80, 조성물의 나머지는 물이다.
젖은 미세입자를 다음 중량비(젖은 미세입자:트레할로스:WPI 분말) 80:20:20에 따라 트레할로스 및 WPI 분말과 혼합하였다. 그런 후에 미세입자를 비피도박테리움 락티스 BB12 생존 연구 이전에 24시간 동안 40℃에서 진공 건조하였다. 프로바이오틱 적재량은 밀리리터당 콜로니 형성 단위(CFU/g)로 측정하였다.
진공 건조 후 비피도박테리움 락티스 BB12의 최초 수준은 10.46log10 CFU/g이었다. 4℃에서 5일 저장 후, 수준은 10.36log10 CFU/g로 감소하였고, 이는 약 99% 프로바이오틱 생존에 해당한다.
비교예 3
비교 미세입자에서 비피도박테리움 락티스 BB12 의 생존
비피도박테리움 락티스 BB12 및 트레할로스를 함유하는 미세입자를 실시예 7에 따라 제조하였다. 그러나, 이 비교예를 위한 미세입자를 제조하는데 사용된 미세입자 전구체 조성물은 다음 조성을 가졌다, 400g의 조성물의 경우: 비피도박테리 움 락티스 BB12의 200g 용해 농축물, 5% 트레할로스, 1% 레시틴, 2% 소듐 알지네이트 및 0.2% TWEEN 80, 조성물의 나머지는 물이다.
젖은 미세입자를 다음 중량비(젖은 미세입자:트레할로스:Hi-maize® 저항 전분) 80:20:20에 따라 트레할로스 및 Hi-maize® 저항 전분과 혼합하였다. 그런 후에 미세입자를 비피도박테리움 락티스 BB12 생존 연구 이전에 24시간 동안 40℃에서 진공 건조하였다. 프로바이오틱 적재량은 밀리리터당 콜로니 형성 단위(CFU/g)로 측정하였다.
진공 건조 후 비피도박테리움 락티스 BB12의 최초 수준은 9.74log10 CFU/g이었다. 4℃에서 5일 저장 후, 수준은 8.09log10 CFU/g로 감소하였고, 이는 약 83% 프로바이오틱 생존에 해당한다.
비교예 4
비교 미세입자에서 비피도박테리움 락티스 BB12 의 생존
비피도박테리움 락티스 BB12 및 트레할로스를 함유하는 미세입자를 실시예 7에 따라 제조하였다. 그러나, 이 비교예를 위한 미세입자를 제조하는데 사용된 미세입자 전구체 조성물은 다음 조성을 가졌다, 400g의 조성물의 경우: 비피도박테리움 락티스 BB12의 200g 용해 농축물, 5% 트레할로스, 1% 레시틴, 2% 소듐 알지네이트 및 0.2% TWEEN 80, 조성물의 나머지는 물이다.
젖은 미세입자를 다음 중량비(젖은 미세입자:말토덱스트린:Hi-maize® 저항 전분) 80:20:20에 따라 말토덱스트린 및 Hi-maize® 저항 전분과 혼합하였다. 그런 후에 미세입자를 비피도박테리움 락티스 BB12 생존 연구 이전에 24시간 동안 40℃에서 진공 건조하였다. 프로바이오틱 적재량은 밀리리터당 콜로니 형성 단위(CFU/g)로 측정하였다.
진공 건조 후 비피도박테리움 락티스 BB12의 최초 수준은 9.9log10 CFU/g이었다. 4℃에서 5일 저장 후, 수준은 7.60log10 CFU/g로 감소하였고, 이는 약 90% 프로바이오틱 생존에 해당한다.
비교예 5
비교 미세입자에서 락토바실러스 카제이 Lc431 의 생존
락토바실러스 카제이 Lc431를 함유하는 미세입자를 실시예 6에 따라 제조하였다. 그러나, 이 비교예를 위한 미세입자를 제조하는데 사용된 미세입자 전구체 조성물은 다음 조성을 가졌다, 400g의 조성물의 경우: 락토바실러스 카제이 Lc431의 200g 용해 농축물, 2% 소듐 알지네이트 및 0.2% TWEEN 80, 조성물의 나머지는 물이다.
이런 젖은 미세입자를 락토바실러스 카제이 Lc431 생존 연구를 위해 4℃로 저장하였다. 락토바실러스 카제이 Lc431의 최초 수준은 12.62log10 CFU/g이었다. 4℃에서 13일 저장 후, 수준은 5.42log10 CFU/g 내지 7.2log10 CFU/g로 감소하였다. 이것은 약 57% 프로바이오틱 생존에 해당한다.
비교예 6
비교 미세입자에서 락토바실러스 카제이 Lc431 의 생존
락토바실러스 카제이 Lc431를 함유하는 미세입자를 실시예 6에 따라 제조하였다. 그러나, 이 비교예를 위한 미세입자를 제조하는데 사용된 미세입자 전구체 조성물은 다음 조성을 가졌다, 400g의 조성물의 경우: 락토바실러스 카제이 Lc431의 200g 용해 농축물, 2% 소듐 알지네이트, 5% 트레할로스 및 0.2% TWEEN 80, 조성물의 나머지는 물이다.
이런 젖은 미세입자를 락토바실러스 카제이 Lc431 생존 연구를 위해 4℃로 저장하였다. 락토바실러스 카제이 Lc431의 최초 수준은 9.44log10 CFU/g이었다. 4℃에서 1달 저장 후, 수준은 2.74log10 CFU/g 내지 6.70log10 CFU/g로 감소하였다. 이것은 약 70% 프로바이오틱 생존에 해당한다.
비교예 5에 대한 것과 비교할 때, 비교예 6에 대한 프로바이오틱 생존 비율이 프로바이오틱 생존에 대한 트레할로스의 효과를 예시한다.
본 명세서 및 다음 청구항 전체에서, 내용이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함한다(comprise)" 및 이의 변형(comprises 및 comprising)은 상기한 완전체 또는 단계 또는 완전체 또는 단계의 그룹을 포함을 암시하나 임의의 다른 완전체 또는 단계 또는 완전체 또는 단계의 그룹의 배제를 암시하지 않는다.
본 명세서에서 임의의 종래 공개공보(또는 이로부터 유래된 정보) 또는 공지된 임의의 내용에 대한 언급은 종래 공개공보(또는 이로부터 유래된 정보) 또는 공지된 내용이 본 발명이 속하는 분야에서 공통된 일반적인 지식의 일부를 형성한다는 것의 인정 또는 허용으로 해석되지 않으며 않아야 한다.
여러 변형이 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 당업자에게 명백할 것이다.

Claims (18)

  1. 프로바이오틱, 가교성 반응물, 변성 단백질, 폴리올 가소제, 트레할로스 및 담체의 혼합물을 포함하는 미세입자 전구체 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    변성 단백질은 유장 단백질 분리물을 포함하는 것인 미세입자 전구체 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    변성 단백질은 완두 단백질을 포함하는 것인 미세입자 전구체 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    폴리올 가소제는 글리세롤인 미세입자 전구체 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    혼합물은 소수성 활성제를 포함하는 에멀젼을 더 포함하는 것인 미세입자 전구체 조성물.
  6. 변성 단백질, 폴리올 가소제, 트레할로스 및 담체의 혼합물을 포함하는 보호 기질 전구체 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    변성 단백질은 유장 단백질 분리물을 포함하는 것인 보호 기질 전구체 조성물.
  8. 제 6 항에 있어서,
    변성 단백질은 완두 단백질을 포함하는 것인 보호 기질 전구체 조성물.
  9. 제 6 항에 있어서,
    폴리올 가소제는 글리세롤인 보호 기질 전구체 조성물.
  10. 변성 단백질, 폴리올 가소제, 트레할로스 및 담체를 함께 혼합하는 단계를 포함하여 보호 기질 전구체 조성물을 생산하는 방법.
  11. 프로바이오틱, 제 6 항에 따른 보호 기질 전구체 조성물 및 가교성 반응물을 함께 혼합하는 단계를 포함하여 미세입자 전구체 조성물을 생산하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    프로바이오틱을 보호 기질 전구체 조성물과 혼합하여 프로바이오틱-함유 기질 전구체를 형성하는 단계; 소수성 활성제를 포함하는 에멀젼을 프로바이오틱-함유 기질 전구체와 혼합하여 프로바이오틱-함유 에멀젼을 형성하는 단계; 및 프로바이오틱-함유 에멀젼을 가교성 반응물과 혼합하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  13. 제 11 항의 방법에 따라 생산된 미세입자 전구체 조성물.
  14. 제 1 항 내지 제 5 항 및 제 13 항 중 어느 한 항의 미세입자 전구체 조성물을 미세하게 나뉜 상태로 제공하는 단계; 및 미세하게 나뉜 미세입자 전구체 조성물을 미세 입자 전구체 조성물의 가교성 반응물과 반응하는 가교제에 노출시켜 미세입자를 형성하는 단계를 포함하여 미세입자를 생산하는 방법.
  15. 제 14 항의 방법에 따라 생산된 미세입자.
  16. 제 6 항에 따른 보호 기질 전구체 조성물로 형성된 보호 기질을 포함하는 미세입자.
  17. 제 15 항에 따른 미세입자를 포함하는 제품.
  18. 제 16 항에 따른 미세입자를 포함하는 제품.
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