JP6491102B2 - プロバイオティクス、架橋性試薬、変性タンパク質、ポリオール可塑剤及びトレハロースを含む微小粒子 - Google Patents

Description

本発明は、微小粒子、微小粒子の製造方法、及び微小粒子前駆体組成物に関する。

健康な胃腸では、有益な細菌と病原性細菌の間のバランスがとれている。食事、ストレス、病気又は感染及び薬剤を含めた様々な要因が、このバランスを乱し、病原性細菌の過剰をもたらし得る。このアンバランスが、腹部膨満、ガス及び便秘を引き起こし得る。ここ数年、このアンバランスに対処するためのプロバイオティクス微生物（以降「プロバイオティクス」）の使用が著しく増加した。プロバイオティクスが、腸管内の病原性細菌の増殖及び／又は代謝を阻害するか又は影響を及ぼすと考えられる。また、プロバイオティクスは免疫機能も活性化し得る。こうした理由で、栄養補給剤又は栄養食品にプロバイオティクスを組み入れることに非常に大きな興味が寄せられる。

栄養補給剤又は栄養食品にプロバイオティクスを組み入れることには困難がある。主な難点の１つが、関連製品内に適当な数の生きた微生物を有している又は維持していることである。食品における、生きたプロバイオティクスの濃度があるしきい値を超えていない場合、プロバイオティクスの有益な効果は提供されない。温度や、酸素、水及び酸への曝露はプロバイオティクスの生存率に影響する。さらに、高速ブレンドや、乳化や、均質化処理などの特定の生産工程で生じる剪断力が、細胞破壊と生存率の損失をもたらし得る。この繊細さが、プロバイオティクスを製品に組み入れることや、他の活性物質とプロバイオティクスを組み合わせて、追加の有益な活性を有する製品を生産することを難しくする可能性がある。

消費者にとって、プロバイオティクスを含む製品は口当たりがよくなければならない。プロバイオティクスは、製品を摂取することを不快にさせる、ヒト又は動物によって知覚される風味を有する可能性がある。また、プロバイオティクスに関連して使用され得る活性物質も、好ましくないと知覚できる風味を有していてもよい。

プロバイオティクスを微小粒子内に提供することには興味深い点がいくつかあった。マイクロカプセル化とは、薄いフィルム、コーティング又は固体／ゲルマトリックスがプロバイオティクスなどの活性物質のより多くのうちの１つの小さい粒子又は液滴を取り囲む、包み込む及び／又は固定するプロセスである。得られた微小粒子は、通常形状が球状であり、且つ、連続した壁によって囲まれたか又は固体マトリックス若しくはゲルマトリックスで捕捉された活性物質を含む。マイクロカプセル化は、細かく分割された状況で１若しくは複数の活性物質を提供する。

カプセル化プロバイオティクスは、外部環境（例えば、熱、湿気、酸、空気、光）にそれが晒されることを制限することによって分解から保護されることができ、そして、所望されるように特定の条件下で管理された速度で放出されることもできる。しかしながら、カプセル化材料は多孔性であることが多い。そのため、カプセル化プロバイオティクスは、それでもやはり、分解性の外部環境に晒される可能性がある。また、プロバイオティクスは、多孔性の微小粒子から漏れ出すこともあり得るので、斯かるプロバイオティクスに関連するいずれかの風味が微小粒子から生じる可能性があり、そして、それを摂取したヒト又は動物によって知覚される可能性がある。

プロバイオティクスを追加の有益な活性を有する１若しくは複数の他の活性物質と組み合わせて、微小粒子を製造することは、望ましいことであり得る。これらの他の活性物質は、分解に対して感受性を有することもあるので、外部環境からの分解性要素への活性物質の露出を制限するのに好適なバリア性を微小粒子に提供することは、望ましいことであり得る。さらに、特定の活性物質は、好適なバリア性を有する微小粒子を提供することによって、カプセル化を通して安定にされてもよい。また、プロバイオティクスと同様に、他の活性物質も、好ましくないと消費者に知覚される風味を有していてもよい。よって、活性物質のあらゆる風味をマスクする好適なバリア性を有する微小粒子が提供されることも望ましい。前記のとおり、カプセル化材料は多孔性であることが多いので、カプセル化活性物質は、分解性の外部環境に晒されるか又は多孔性微小粒子から漏れ出す可能性がある。この漏出は、それを摂取したヒト又は動物に知覚される、活性物質に関連した風味につながる可能性がある。

微小粒子前駆体組成物を調製するとき、プロバイオティクスの繊細さが原因で、プロバイオティクスを他の活性物質と組み合わせることは難しい。その他の活性物質を、プロバイオティクスを含めた微小粒子前駆体組成物の残りの成分と混合することは、プロバイオティクスの細胞を破壊し、その生存率を低下させる剪断速度を伴う可能性がある。

そのため、プロバイオティクスを微小粒子内に組み入れ、そして、他の活性物質にプロバイオティクスを組み合わせることから成る既存の方法に関連する１若しくは複数の短所若しくは不利益に対処するか又は改善する機会、及び／又はそれに対して有用な代替手段を少なくとも提供する機会は、残されたままである。

本発明は、プロバイオティクス、架橋性試薬(cross-linkable reagent)、変性タンパク質、ポリオール可塑剤、トレハロース及び担体の混合物を含む微小粒子前駆体組成物を提供する。いくつかの実施形態において、前記混合物は、疎水性活性物質を含むエマルジョンをさらに含む。

また、本発明は、変性タンパク質、ポリオール可塑剤、トレハロース及び担体の混合物を含む保護マトリックス前駆体組成物も提供する。また、変性タンパク質、ポリオール可塑剤、トレハロース及び担体を一緒に混合することを含む、保護マトリックス前駆体組成物の製造方法も提供する。

加えて、本発明は、プロバイオティクス、保護マトリックス前駆体組成物及び架橋性試薬を一緒に混合することを含む、微小粒子前駆体組成物の製造方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記方法は：プロバイオティクスを保護マトリックス前駆体組成物と混合して、プロバイオティクス含有マトリックス前駆体を形成し；疎水性活性物質を含むエマルジョンを該プロバイオティクス含有マトリックス前駆体と混合して、プロバイオティクス含有エマルジョンを形成し；そして、該プロバイオティクス含有エマルジョンを架橋性試薬と混合することを含む。この方法に従って製造した微小粒子前駆体組成物もまた提供する。

本発明は：細かく分割された状態で本発明の微小粒子前駆体組成物を提供し；そして、細かく分割された微小粒子前駆体組成物を、該微小粒子前駆体組成物の架橋性試薬 (cross-linkable reagent)と反応する架橋試薬 (cross-linking reagent) に曝して微小粒子を形成することを含む、微小粒子の製造方法をさらに提供する。

また、本発明の方法に従って製造された微小粒子も提供する。

本発明による微小粒子を含む生成物を含めた、本発明のこれら態様及び他の態様が、以下により詳細に記載されている。

図１は、ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１及び魚油含有微小粒子を添加した液体甘味調合物における、プロバイオティクスの生存率と風味知覚試験の結果を示す。 図２は、ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１含有微小粒子を添加した希釈ベース飲物調合物における、プロバイオティクスの生存率試験の結果を示す。 図３は、ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１及び魚油含有微小粒子を添加した希釈ベース飲物調合物における、プロバイオティクスの生存率試験の結果を示す。 図４は、ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１含有微小粒子を添加した食事代替タンパク質粉末における、プロバイオティクスの生存率試験の結果を示す。 図５は、ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１含有微小粒子を添加した飲料における、プロバイオティクスの生存率試験の結果を示す。

詳細な説明
本発明は、その中に分散させたプロバイオティクスの生存率を上げるために使用され得る保護マトリックスを提供する。本発明による微小粒子前駆体組成物は、プロバイオティクス、架橋性試薬、変性タンパク質、ポリオール可塑剤、トレハロース及び担体の混合物を含む。前記微小粒子前駆体組成物が、通常変性タンパク質、ポリオール可塑剤、トレハロース及び担体の混合物を含む保護マトリックス前駆体組成物を含むことは理解される。すなわち、これらの成分（例えば、ポリオール可塑剤、トレハロース、変性タンパク質及び担体）は、適当に組み合わせられると相互作用し、そして、結合して、本発明の保護マトリックスを作り出す出発物質又は構成要素である。以下でより詳細に議論されるとおり、多くの相乗的相互作用が保護マトリックスの成分の間に起こって、望ましい特性をマトリックスに提供する。これらの相互作用には、有益な水素結合と疎水結合を形成する変性タンパク質の親水性及び疎水性の性質、該タンパク質及びプロバイオティクスを安定させるトレハロースの能力、並びに該保護マトリックス中に分散させたその他の活性物質を利用してもよい。

本発明は特に、ヒト、しかし、潜在的に他の動物によって摂取されることを意図した微小粒子に関する。従って、本発明の微小粒子の構成要素は、それらが目的に適するように選択されることは、当業者に理解される。すなわち、ヒトによって摂取されることを意図する微小粒子の場合、微小粒子の構成要素は、あらゆる必要な機関によってヒト消費に関して承認されている。同様に、動物消費を意図する製品に関して、構成要素はそのような使用のために承認されている。例として、本発明は一般に、ヒト消費を意図する微小粒子に関して記載されている。

一般に、ヒト消費に合致した成分は、可食又は食品グレードであると見なされてもよい。すなわち、前記成分は、消費されることを意図しているので、単にそれらの究極的、且つ、意図された目的の助けとなる無毒性形態であるだけではなない。

本発明は、微小粒子を含む製品を提供する。例えば、本発明に従って製造した微小粒子は、医薬製剤若しくは栄養製剤（例えば、栄養補助食品）、補助食品、機能性食品及び飲料製品 (beverage product)に使用されてもよい。よって、いくつかの実施形態において、本発明の微小粒子が補強された（栄養価を高められる）製品を提供する。いくつかの実施形態において、ヒト並びに動物のための飲食料品（例えば、ペットフード）は１若しくは複数の望ましい活性物質、すなわち：少なくとも１つのプロバイオティクス及び潜在的に１若しくは複数の活性物質、を含む本発明の微小粒子を使用することで補強されてもよい。飲料製品に関する適切な例としては、これだけに限定されるものではないが、水；乳；これだけに限定されるものではないが、ダイズ、コメ、オート麦及びアーモンド「ミルク」を含めた乳の代替品；水ベースの飲料 (beverage)；乳ベースの飲料；炭酸飲料；非炭酸飲料；ビール；ワイン；並びに果物及び／又は野菜ベースの飲料が挙げられる。

好適な果物及び／又は野菜ベースの飲料は、１若しくは複数の果実抽出物及び／又は植物抽出物を含んでいてもよい。抽出物としては、関連果物又は野菜の又はそれら由来のジュース、ネクター、ピューレ、及び／又はパルプが挙げられる。前記抽出物は、新鮮であっても、未加工であっても、加工済（例えば、低温殺菌）であっても又は還元されていてもよい。１若しくは複数の果実抽出物は、これだけに限定されるものではないが、

リンゴジュース、パイナップルジュース、１若しくは複数の柑橘類の果実ジュース（すなわち、オレンジ、マンダリン、グレープフルーツ、レモン、タンジェロー、キンカンなどの１若しくは複数のジュース）、クランベリー・ジュース、ノニジュース、アサイージュース、ゴジジュース、ブルーベリージュース、ブラックベリージュース、ラズベリージュースジュース、ザクロジュース、ブドウジュース、アプリコットジュース若しくはネクター、モモジュース若しくはネクター、西洋ナシジュース、マンゴージュース、パッションフルーツジュース及びグアバピューレを含めた群から選択され得る。１若しくは複数の植物抽出物は、これだけに限定されるものではないが、アロエベラジュース、ビートジュース、ニンジンジュース、セロリジュース、ケールジュース、ホウレンソウジュース、トマトジュース及びウィートグラスジュースを含めた群から選択され得る。さらに、植物抽出物としては、ショウガジュースなどのハーブ又はスパイスの抽出物を挙げることもできる。

プロバイオティクスを添加するために、製品１キログラム又は１リットルあたり、最大１０グラムの微小粒子が追加され得る。例えば、添加するために製品１キログラム又は１リットルあたり、約７グラム〜約９グラムの微小粒子が追加され得る。添加するために製品１キログラム又は１リットルあたり、約８グラムの微小粒子が追加され得る。いくつかの実施形態において、添加するために新鮮なオレンジジュースなどのジュース１リットルあたり、８グラムの微小粒子が追加され得る。

液状甘味調合物（liquid sweet formula）などのいくつかの添加製品では、製品中の微小粒子の量が、製品重量の最大１３％に相当することもある。
いくつかの実施形態において、微小粒子を添加した製品は粉末である。例えば、いくつかの実施形態において、前記製品は、食物代替タンパク質粉末である。これらの実施形態において、微小粒子は、重量によって、最大１：９の微小粒子：粉末（すなわち、他の製品成分）比で、粉末製品に追加され得る。例えば、いくつかの実施形態において、微小粒子は、１：４９の比で追加される。ある他の実施形態において、その比は約１：９である。

いくつかの実施形態において、製品の主成分は微小粒子である。そのようないくつかの実施形態において、微小粒子は、製品重量の５１％以上であってもよい。例えば、製品重量の最大７２％が微小粒子である製品が製造されてもよい。そのような製品は、医薬又は栄養製剤（例えば、栄養補助食品）であってもよい。

プロバイオティクスとは、粘膜及び全身性免疫を調節すること、並びに腸機能及び腸管内の微生物バランスを改善することによって、それを摂取したヒト又は動物に有益に作用する生きた微生物と定義される。プロバイオティクスは、次の限定されることのない特性：宿主にとっての非病原性又は無毒性である；好ましくは多数の、生存細胞として存在している；腸内環境で生存、代謝、及び存続できる（例えば、低ｐＨ、及び胃腸の酸や分泌物への抵抗性）；上皮細胞、特に胃腸管の上皮細胞への密着；病原性細菌に対する殺菌又は静菌活性又は効果；抗腫瘍効果；免疫調節活性、特に免疫の賦活；内在フローラに対する調節作用；尿生殖路の健康の促進；損傷若しくはその周囲の防腐活性及び創傷治癒の促進；下痢の軽減；アレルギー反応の軽減；新生児壊死性全腸炎の軽減；炎症性腸疾患の軽減；腸透過性の低減、のうちの１以上を呈する。

本発明で活性物質として使用されるプロバイオティクスは、これだけに限定されるものではないが、サッカロミセス属（Saccharomyces）、デバロミセス属（Debaromyces）、カンジダ属（Candida）、ピキア属（Pichia）及びトルロプシス属（Torulopsis）などの酵母、アスペルギルス属（Aspergillus）、リゾープス属（Rhizopus）、ムコール属（Mucor）、及びペニシリウム属（Penicillium）などのカビ、並びにビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、バクテロイド属（Bacteroides）、クロストリジウム属（Clostridium）、フソバクテリウム属（Fusobacterium）、メリッソコッカス属（Melissococcus）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、エンテロコッカス（Enterococcus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ペプトストレポコッカス属（Peptostrepococcus）、バチルス属（Bacillus）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、ミクロコッカス属（Micrococcus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ウェイッセラ属（Weissella）、アエロコッカス属（Aerococcus）、オエノコッカス属（Oenococcus）及びラクトバチルス属（Lactobacillus）などの細菌、並びにそれらの組み合わせから成る群から選択され得る。

好適なプロバイオティクスの例としては：サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cereviseae）（ボウラルジイ（boulardii））、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）、エンテロコッカス・ファエシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）、ラクトバチルス・カゼイ亜種カゼイ（Lactobacillus casei subsp. casei）、ラクトバシルス・カゼイ・シロタ（Lactobacillus casei Shirota）、ラクトバチルス・クルバツス（Lactobacillus curvatus）、ラクトバシルス・デルブリッキ亜種ラクチス（Lactobacillus delbruckii subsp. lactis）、ラクトバチルス・ファルシミヌス（Lactobacillus farciminus）、ラクロバチルス・ファメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・ガッセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）（ラクトバチルスＧＧ（Lactobacillus GG））、ラクトバチルス・サケ（Lactobacillus sake）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ペディオコッカス・アシジラクチシ（Pediococcus acidilactici）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）、ペディオコッカス・アシジラクチシ（Pediococcus acidilactici）、ペディオコッカス・ハロフィルス（Pediococcus halophilus）、ストレプトコッカス・フェーカリス（Streptococcus faecalis）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、及びサッカロミセス・ボウラルジイ（Saccharomyces boulardii）が挙げられる。より詳しく述べると、プロバイオティクスは、ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１、ラクトバシルス・ラムノサスＣＧＭＣＣ １．３７２４、ビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２、ビフィドバクテリウム・ラクティスＣＮＣＭ Ｉ−３４４６、ビフィドバクテリウム・ロングムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９、ラクトバシルス・パラカゼイＣＮＣＭ Ｉ−２１１６、ラクトバシルス・ジョンソニイＣＮＣＭ Ｉ−１２２５、ラクトバシルス・フェルメンツムＶＲＩ００３、ビフィドバクテリウム・ロングムＣＮＣＭ Ｉ−２１７０、ビフィドバクテリウム・ロングムＣＮＣＭ Ｉ−２６１８、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ラクトバシルス・パラカゼイＣＮＣＭ Ｉ−１２９２、ラクトバシルス・ラムノサスＡＴＣＣ５３１０３、エンテロコックス・ファエシウムＳＦ６８、ラクトバシルス・ロイテリＡＴＣＣ ５５７３０、ラクトバシルス・ロイテリＡＴＣＣ ＰＴＡ６４７５、ラクトバシルス・ロイテリＡＴＣＣ ＰＴＡ４６５９、ラクトバシルス・ロイテリＡＴＣＣ ＰＴＡ５２８９、ラクトバシルス・ロイテリＤＳＭ １７９３８及びその混合物を含めた群から選択され得る。いくつかの好ましい実施形態において、微小粒子は、ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１又はビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２を含み得る。

プロバイオティクスは、活動していて、再生又はコロニー形成が可能であれば、生存能力がある。微小粒子内の生きたプロバイオティクスの濃度が特定のしきい値を超えなければならず、そうでなければ、プロバイオティクスの有益効果は提供されない。プロバイオティクスの数量は、コロニー形成単位（ＣＦＵ）で通常評価される。通常、成人がプロバイオティクスの有益効果を受けるのには、約１００〜２００万ＣＦＵの用量が必要である。この種の用量が達成され得るためには、微小粒子中の生きたプロバイオティクスの添加量は、５０〜１００億ＣＦＵ／ｇ、例えば、微小粒子重量の約２．５％〜約５％程度であることが多い。いくつかの実施形態において、プロバイオティクスの添加量は、微小粒子重量の約２．５％である。ある他の実施形態において、プロバイオティクスの添加量は、微小粒子重量の約４％であってもよい。

いくつかの実施形態において、微小粒子は、プロバイオティクスに加えて、１若しくは複数の活性物質を含んでいてもよい。好適な追加の活性物質は、消費又は必要とされるであろう他の使用のためのマイクロカプセル化形態で慣習的に提供されるさまざまな機能的基質から選択されてもよい。そのような活性物質としては、次の：
動物飼料追加物；
魚油などの油、例えば、（ω−３）；
イブプロフェンやゲンタマイシンなどの医薬品；
リゾチームやインスリンなどの酵素；及び
ビタミンＡ、Ｅ、Ｄ、Ｋ１、Ｂ１２、Ｂ９、Ｂ１及びＢ６などのビタミン、
が挙げられる。

プロバイオティクスに加えて使用され得る特定の活性物質は、疎水性活性物質であってもよい。疎水性活性物質は、通常、水中に非混和性である活性化合物である。これらの活性物質は、脂質であるか、又は水非混和性溶媒との溶液の状態で提供される活性物質であり得る。この水非混和性溶媒は脂質であってもよい。

疎水性活性物質は、魚油などの栄養油（nutritional oil）を含めた脂質である。本明細書中に使用されるとき、「魚油」という用語は、魚及び／又は（単数若しくは複数の）他の海生生物に由来する油を意味する。例えば、魚油としては、オキアミ、イカ（calamari）（イカ（squid））、キャビア、アワビ、ホタテガイ、カタクチイワシ、ナマズ、二枚貝、タラ、ニシン、レイクトラウト、サバ、メンハーデン、オレンジラッフィー、サケ、イワシ、ピルチャード、海洋性のボラ、ウミタナゴ、サメ、小エビ、マス及びマグロ、並びにそれらの組み合わせに由来する油が挙げられる。

魚油はω−３脂肪酸の供給源である。ω−３脂肪酸の他の供給源としては、これだけに限定されるものではないが、クルミ油、亜麻仁種子（linseed）（亜麻仁種子（flaxseed））油、菜種（キャノーラ）油、チア（通常サルビア・ヒスパニカ）種子油及び麻種子油などのω−３脂肪酸が豊富な植物ベースの油である。よって、ω−３脂肪酸の供給源は、本発明の目的のための疎水性活性物質であってもよい。

ω−３脂肪酸の供給源が魚油又は植物ベースの油であるときに、その油は、原油、部分精製油、精製油、又は濃縮油であってもよい。

活性物質がω−３脂肪酸の供給源（例えば、魚油）であるときのような、いくつかの実施形態において、微小粒子中の疎水性活性物質の量は、微小粒子重量の最大２０％に相当し得る。いくつかの実施形態において、疎水性活性物質の量は、微小粒子重量の約１０％であってもよい。

「ω−３脂肪酸」という用語は、脂肪酸鎖のメチル末端から見て第三炭素と第四炭素の間に炭素−炭素二重結合を有する長鎖多不飽和脂肪酸を意味する。一般的なω−３脂肪酸としては、αリノレン酸（Ｃ１８：３；（９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）−オクタデカ−９，１２，１５−トリエン酸、「Ａｌａ」）、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５；（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ）−エイコサ−５，８，１１，１４，１７−ペンタエン酸、「ＥＰＡ」）、及びドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６；（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１３，１６，１９−ヘキサエン酸、「ＤＨＡ」）が挙げられる。他の一般的なω−３脂肪酸としては、これだけに限定されるものではないが、ステアリドン酸（Ｃ１８：４）、エイコサテトラエン酸（Ｃ２０：４）、及びドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５）が挙げられる。

本発明の目的のための疎水性活性物質である他の油としては、これだけに限定されるものではないが、アボカド油、杏仁油、アルガン油、マツヨイグサ油、ニンニク油、及びペパーミント油が挙げられる。

疎水性活性物質は、脂溶性ビタミンであってもよい。本願発明で使用され得る脂溶性ビタミンとしては、例えばビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、及びユビキノンが挙げられる。

ビタミンＡとしては、例えば、レチノール（ビタミンＡ₁アルコール）、レチナール（ビタミンＡ₁アルデヒド）、ビタミンＡ₁酸、３−デヒドロレチノール（ビタミンＡ₂アルコール）、及び３−デヒドロレチナール（ビタミンＡ₂アルデヒド）などのビタミンＡ、及びβ−カロチン（β，β−カロチン）、α−カロチン（β，ε−カロチン）及びγ−カロテン（β，ψ−カロテン）などのプロビタミンＡが挙げられる。β−カロチンなどのプロビタミンＡは、本発明の微小粒子中への取り込みのための特に好ましい活性物質であり得る。いくつかの実施形態において、β−カロチンは、プロバイオティクス及び魚油と組み合わせて使用されてもよい。

ビタミンＤとしては、例えばビタミンＤ₂、ビタミンＤ₃、ビタミンＤ₄、ビタミンＤ₅、ビタミンＤ₆、ビタミンＤ₇などのビタミンＤとそのプロビタミンが挙げられる。

ビタミンＥとしては、例えば、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、及びδ−トコフェロールなどのトコフェロール、並びにα−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノール、及びδ−トコトリエノールなどのトコトリエノールが挙げられる。

ビタミンＫとしては、例えばビタミンＫ₁及びビタミンＫ₂が挙げられる。

ユビキノンとしては、例えばユビキノン−１〜ユビキノール−１２（Ｑ−１〜Ｑ−１２）、並びにその酸化型及びそのアミノ塩素化合物が挙げられる。

脂溶性ビタミンなどの疎水性活性物質は、それらを本発明における使用に好適な形態にするために（水非混和性溶媒として働く）脂質中に通常溶解される。脂質は、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、モノグリセリド、及びトリグリセリドであってもよく、そしてそれは、飽和又は不飽和のいずれかである。いくつかの実施形態において、脂質の混合物が使用されてもよい。

一般に、疎水性活性物資を溶解するために選択された（単数若しくは複数の）脂質は、液体であろう。すなわち、脂質は、２５℃、好ましくは１０℃以下の融点を有する。いくつかの実施形態において、脂質は、微小粒子の保存温度より低い融点を有していることが好ましい。液体脂質は、それらが他の成分を容易に乳化して、疎水性活性物質を含むエマルジョンを形成するように選択されることが多い。固形脂質は、効果的に活性物質と組み合わせられるように、それらの融解温度を超えるまで加熱されるか又は（別の脂質であり得る）好適な溶剤中に溶解される必要があってもよい。通常、固形脂質が使用される場合には、それらは最初に、２５℃以下、好ましくは１０℃以下で液体である脂質混合物を製造するように、好適な溶剤（液体脂質など）と混合される。

また、液体脂質は、微小粒子を摂取するヒト又は動物によって、より容易に消化され得る。よって、液体脂質の選択は、脂質中に溶解されたあらゆる活性物質が、最適な期間に放出されるのを確実にするために有用であり得る。

本発明の実施形態に使用される脂質は、多くのさまざまな起源に由来する。いくつかの実施形態において、本発明の実施形態に使用される脂質としては、生体脂質を挙げることもできる。生体脂質としては、任意のタイプの植物（植物油など）又は動物によって産生される脂質（脂肪又は油）を挙げることができる。一実施形態において、使用される生体脂質としては、トリグリセリドが挙げられる。

植物由来の多くの異なった生体脂質が、使用されてもよく、そして、これらの植物は遺伝子組み換え作物であってもよい。一例として、植物ベースの脂質としては、ダイズ油、キャノーラ油、綿実油、グレープシード油、マスタードシード油、トウモロコシ油、亜麻仁油、ベニバナ油、ヒマワリ油、ケシ種子油、ピーカン油、クルミ油、ラッカセイ油、米ヌカ油、ツバキ油、オリーブ油、パーム油、パーム核油及びココナッツ油、又はそれらの組み合わせが挙げられる。

他の植物ベースの脂質は、アーモンド、アルガン、アボガド、ババス、ブナ、ベン（ワサビノキの種子由来）、ボルネオ脂ナッツ、ブラジルナッツ、カメリナ、カリオカル（ペキ）、カシューナッツ、ココア、コフネパーム、コリアンダ、ウリ科（例えば、バターナッツカボチャ種子油、カボチャ種子油、及びスイカ種子油）、アサ、ケナフ、マカダミア、ヌーグ・アビシニア、シソ、ピリナッツ、キノア、サッチャインチ、セジェ、ゴマ、シアナッツ、チャ種子及びパパイヤ種子から得ることができる。これらは、単独又は別の脂質と組み合わせて使用されてもよい。

また、動物由来の脂質は、例えば、白グリース、ラード（豚脂）、獣脂（牛脂）、無水乳脂肪、及び／又は家禽脂が使用されてもよい。しかしながら、先に述べたように、２５℃以下の融点を有する液体脂質が好まれる。

脂質は、次の式：
｛式中、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³は、同じであっても又は異なっていてもよく、７〜約２３個の炭素原子を含む脂肪族ヒドロカルビル基である。｝
の合成中性脂肪であってもよい。「ヒドロカルビル基」という用語は、本明細書中で使用される場合、分子の残りの部分に直接取り付けられた炭素原子を有するラジカルを意味する。

脂肪族ヒドロカルビル基としては、次のものが挙げられる：
（１）脂肪族炭化水素基；すなわち、ヘプチル、ノニル、ウンデシル、トリデシル、ヘプタデシルなどのアルキル基；ヘプテニル、ノネニル、ウンデセニル、トリデセニル、ヘプタデセニル、ヘニコセニルなどの１つの不飽和結合を含むアルケニル基；複数の不飽和結合を含むアルケニル基；及びそれらの全ての異性体。
（２）カルボアルコキシ基のヒドロキシなどの非炭化水素置換基を含む置換された脂肪族炭化水素基。
（３）ヘテロ基；すなわち、主に脂肪族炭化水素の特徴を有する一方で、他の部分が脂肪族炭素原子で構成された鎖又は環で存在する、酸素、窒素又は硫黄などの炭素以外の原子を含む基。

多くの生体脂質が、不純を取り除くためにそれらの天然源からの抽出に続いて、加工される必要がある。例えば、脂質は、リン脂質を取り除くために脱ゴムされ、該油に色を付け得るクロロフィルやカロチノイドなどの不純物及び微量成分を取り除くために漂白され、そして、精製油に望ましくない味及び／又はにおいを与える遊離脂肪酸を取り除くために分留されてもよい。「分留」及び関連用語は、本明細書中に使用される場合、通常植物由来生体脂質（油）中の遊離脂肪酸からのトリグリセリドの分離を含む、より少ない揮発成分がより多くの揮発性成分から分離されるプロセスを指す。

加工は、脂質の水素追加を含むこともできる。このプロセスでは、脂質は、該脂質内の不飽和結合を還元することによって水素追加される。これは通例、ニッケル触媒などの触媒の存在下で脂質を水素に晒すことによって達成された。水素追加は、完全であっても、又は部分的であってもよい。部分水素追加脂質は、非水素追加脂質と完全水素追加脂質の混合物を含んでいてもよい。

脂質の水素追加は、それが酸化に対する脂質の感受性を低減するので、有益であり得る。いくつかの脂質は、酸化に対して特に感受性を有しており、そして、それらを腐らせることにつながり、且つ、好ましくない風味を生じさせるので、これらの脂質の水素追加は有用であり得る。しかしながら、水素追加は脂質の融点を高める可能性があり、よって、液体脂質の固形脂質への形質転換は、該脂質が組成物中の他の成分と混合できることの容易さに影響し得る。従って、脂質が水素追加され得る程度は、融点のあらゆる上昇が、その後、該脂質が疎水性活性物質を溶解するのに容易に使用され得る影響を念頭に置きながら選択される。

好ましくは、脂質は、次の：アーモンド油、キャノーラ油、肝油、トウモロコシ油、綿実油、アマニ油、グレープシードオイル、ラッカセイ油、ベニバナ油、ゴマ油、ダイズ油、ヒマワリ油、クルミ油、ココナッツ油又はパーム核油から成る群から選択される植物ベースの脂質であってもよい。いくつかの実施形態において、疎水性活性物質（例えば、脂溶性ビタミン）が、疎水性活性物質を構成するそれ自体の脂質（例えば亜麻仁油などのω−３脂肪酸が豊富な油）中に溶解されてもよいことは、理解される。

本発明の微小粒子は、通常球状である。従って、それらは、１０μｍ〜５０μｍ程度の直径を有していることが多い。一般に、微小粒子は、少なくとも１つのサイズが１０００μｍ未満である。しかしながら、本発明の微小粒子は、通常小さく、少なくとも１つのサイズが５０μｍ未満である。

本発明による微小粒子は、架橋性微小粒子前駆体組成物を細かく分割された状況で準備し、架橋試薬とそれを接触させることによって製造され得る。本明細書中の「架橋 (cross-link)」という用語（及びその変異形）は、通常２個以上の原子の高分子鎖の間の化学結合を指す。本発明による架橋性微小粒子前駆体組成物は、架橋性試薬を含む。その架橋性試薬は、架橋処理され得る基又は残基を含む分子、通常繰返し単位を組み込んでいる重合体である。架橋は、分子をネットワークへと一つに結合して、より大きい分子の超構造を形成する。架橋とは、イオン結合、配位結合（dative）、複合体生成、及び配位結合（coordination linkages）、共有結合であってもよく、また、それは、水素結合相互作用を伴ってもよい。よって、そのためイオン架橋性重合体は一般に、微小粒子を形成するための、イオン架橋試薬との反応によって架橋の形成が可能である高分子である。イオン架橋は、可逆的であっても、又は不可逆的であってもよい。イオン架橋性試薬には、１若しくは複数のイオン化可能基がある。「イオン化可能基」という用語は、部分的に又は完全にイオン化ができる化学部分を指す。

架橋性試薬は、塩基性多価電解質（ポリ塩基）、塩基性イオノマー、酸性多価電解質（ポリ酸性）、又は酸性イオノマーであってもよい。いくつかの実施形態において、架橋性試薬は、１若しくは複数のアニオン性モノマー又はポリカチオンから選択される。本明細書中に使用される場合、「ポリカチオン」という用語、又は「カチオンポリマー」などの関連する用語は、陽性荷電巨大分子で構成された重合体を指す。いくつかの実施形態において、架橋性試薬は、１若しくは複数のアニオン性モノマー又はアニオン性高分子から選択される。

好適な架橋性重合体は、ハイドロコロイドを含めたヒドロゲルの類から選択されてもよい。ハイドロコロイドとは、野菜、動物、微生物又は合成起源の親水性重合体であり、そしてそれは通常、多くのヒドロキシル基を含んでいて、多価電解質であってもよい。イオン架橋性でないハイドロコロイドは、イオン架橋性である重合体と混合した状態で使用されてもよい。

本発明に使用され得る重合体としては、これだけに限定されるものではないが、ポリビニールアルコール、アルギン酸、カラギーン、ペクチン、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパラン、キトサン、カルボキシメチルキトサン、寒天、アラビアゴム、プルラン、ジェラン、キサンタン、トラガント、カルボキシメチルデンプン、カルボキシメチルデキストラン、コンドロイチン硫酸やデルマタンやカチオングアーを含めたコンドロイチン、イナゴマメ、コンニャク、ガッティゴム、キシログルカン、インドゴム、カチオンデンプン、並びにそれらの塩及びエステルから成る群から選択される重合体の１つ又は混合物が挙げられる。

代表的なアニオン性重合体としては、アルギン酸、ペクチン、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸のうちの１つ又は混合物が挙げられる。代表的なカチオン性重合体としては、キトサン、カチオングアー、及びカチオンデンプンが挙げられる。

本願発明の微小粒子がそれから製造され得るイオン架橋性重合体は、カルボキシル、スルファート、ホスファート、スルホンアミド、ホスホンアミド、ヒドロキシ、及びアミン官能基によって官能化されていてもよい。

架橋試薬は、無機塩の溶液として存在していてもよい。一般に、好適な架橋試薬は溶存イオンの溶液である。架橋性試薬を架橋するのに使用される架橋イオンは、その架橋性試薬がアニオン架橋性であるかカチオン架橋性であるかに依存してアニオン又はカチオンであり得る。適当な生物学的に適合している架橋イオンとしては、これだけに限定されるものではないが、カルシウム、マグネシウム、バリウム、ストロンチウム、亜鉛、ホウ素、ベリリウム、アルミニウム、鉄、銅、コバルト、ニッケル、鉛及び銀イオン、又はそれらの２個以上の混合物から成る群から選択されるカチオンが挙げられる。アニオンは、これだけに限定されるものではないが、カルボキシラート、ホスファート、スルファート、オキサラート、ビカルボナート、及びカルボナートイオンから成る群から選択され得る。より広くは、アニオンは、多塩基有機酸又は無機酸に由来する。好ましい架橋カチオンは、カルシウムイオンである。

本発明の好ましい実施形態において、微小粒子の形成は、ゾル−ゲル相転移によっておこなわれるので、この実施形態に使用される試薬は、それに応じて選択されなければならない。よって、原則として、微小粒子前駆体組成物及びの他の成分と混合される架橋性試薬と架橋試薬は、架橋性試薬に関連するゾル−ゲル相転移による微小粒子の形成をもたらすあらゆる好適な組み合わせから選択されてもよい。実は、微小粒子に組み込まれる前記試薬と（単数若しくは複数の）活性物質（すなわち、プロバイオティクスとその他の活性物質）との適合性や、微小粒子中に存在しているときの、そのような活性物質の放出特性もまた、考慮される必要がある。従って、試薬の選択もまた、意図された使用期間の（単数若しくは複数の）活性物質の安定性を最適化するために、微小粒子と、保護マトリックスの成分を含めた含有の可能性がある他の成分の最終的な使用に依存している。

本発明は、架橋性試薬としてのアルギン酸の使用を参照することで（限定されない）例示を目的として記載される。アルギン酸は、生理学的に許容され、且つ、好適なカチオンとの結合後に熱に安定なゲルを形成するので、本発明における使用のために特に好まれる。アルギン酸のイオン性ゲル化は、特定のイオンに対するそれらの親和性及び特定のイオンに結合するに基づいている。アルギン酸は、Ｃａ²⁺、Ｓｒ²⁺、Ｚｎ²⁺、Ｃｏ²⁺及びＢａ²⁺などの二価のカチオンと強くて、安定したゲルを形成する。また、Ｆｅ³⁺やＡｌ³⁺などの三価のカチオンもまた、ゲル化を生じさせ得る。一価のカチオンではゲル化しない。

本発明におけるアルギン酸ゲルの使用もまた、これらのゲルが望ましい活性物質放出特性を呈し得るので、有利である。例えば、アルギン酸ゲルは、縮小し、膨らんだり、崩壊したりしないので、低ｐＨ条件下で安定性を示す。そのため、活性物質の放出もまた低い。その一方、アルギン酸ゲルは、弱アルカリ条件下では急速に膨張し、そして溶解、及び／又は崩壊を示す。この特性は、アルギン酸ゲルがヒト小腸（ｐＨは６．７を超える）内にプロバイオティクス及び他の活性物質を送達するのに効果的に使用されるのを可能にしている。アルギン酸ゲルはまた、粘膜接着性でもあるので、長期の間、腸粘膜に付着する傾向がある。よって、アルギン酸ゲルの使用は、プロバイオティクスなどの特定の活性物質の送達に特に有利であり得る。

多くの要因がアルギン酸ゲル生成に影響し、そして、これらは、本発明を実装するときに考慮される必要がある。１つの要因は、マンヌロン酸（Ｍ）残基の出現率（prevalence）と長さに対するグルコン酸（Ｇ）残基の出現率と長さである。Ｍ／Ｇ比は、少なくともＣａ²⁺架橋と関連した重要な要因である。Ｍ／Ｇ比が低いほど、有効な架橋のためのＣａ²⁺イオン濃度の要件は高くなる。高Ｇ含有量でアルギン酸から形成されたゲルはまた、より硬く、より脆く、且つ、より多孔性であり、そして、より長期間に強度と完全な状態を維持する傾向がある。そのようなゲルは、架橋で大きく膨らまない。高いＭ含有量のアルギン酸は、高い収縮性を有するより軟質で、多孔性が低い弾性ゲルを形成する傾向がある。こうしたゲルは、より膨張し、より容易に溶解し、高Ｇ含有アルギン酸ゲルサイズの増加がより大きい。ゲル強度はまた、アルギン酸濃度が高いほど、そして、Ｇ含有量が高いほど増強される。

架橋試薬としてＣａＣｌ₂を使用することに関して、最大約０．２Ｍの濃度、例えば約０．１Ｍ〜０．２Ｍ、約０．１Ｍなどが使用されてもよい。

アルギン酸の使用に関連する１つの利益は、ゲルの温熱利用が安定し、温度（最大水の沸点まで）に依存しないことである。しかしながら、ゲル化剤の動態学は、必要であろう場合には、使われている温度を調整することによって調節され得る。

これらの要因と他の要因は、ゲル生成及びゲル特性に関して望ましい結果を獲得するために操作されてもよい。これらの類の要因はまた、他のタイプの架橋性試薬及び架橋試薬を使用するときにも考慮される必要がある。

本発明の特定の実施形態において、架橋性試薬は、アルギン酸とペクチンの混合物であってもよい。ペクチンは、植物細胞壁に通常見られる生分解性酸性の炭水化物重合体である。ペクチンは、α−（１→４）−連結ポリガラクツロン酸と、メチルやアセチル基などの中性糖側鎖と非糖成分で修飾され得るラムノース残基骨格から成る。α−（１→４）−連結ポリガラクツロン酸骨格に沿ったラムノース挿入と他の修飾の程度は、植物起源によって異なる。ガラクツロン酸含有量は、一般に７０％超であるが、ラムノース含有量は通常＜２％である。ラムノース残基は、骨格においてガラクツロン酸残基にα−（１→２）連結している。それらは、主鎖におけるＴ形キンクの形成を引き起こし、そして、ラムノース含有量を増大させて、よりしなやかな分子をもたらす。中性糖側鎖は、Ｏ−３又はＯ−４位において骨格のラムノース残基に取り付けられている。ラムノース残基は、骨格上に群がる傾向がある。

メチル化は、ガラクツロン酸残基のカルボキシル基に起こる。メチル化又はメチルエステル化の程度は、メタノールでエステル化されたカルボキシル基（ガラクツロン酸残基）のパーセンテージと定義される。メチル化又はメチルエステル化の程度に基づいて、ペクチンは、＜５０％のメチル化又はメチルエステル化の程度の低メトキシルペクチンと、＞５０％のメチル化又はメチルエステル化の程度の高メトキシルペクチンの２つのクラスに分類される。

高メトキシルと低メトキシルは両方とも、ゲルを形成する。しかしながら、これらのゲルは、異なった機構で形成される。高メトキシルペクチンは、低ｐＨにて、高濃度の共存溶質（スクロース）の存在下でゲルを形成する。低メトキシルペクチンは、特にＣａ²⁺、Ｓｒ²⁺、Ｚｎ²⁺、Ｃｏ²⁺、Ｃａ²⁺及びＢａ²⁺イオンなどの二価カチオンの存在下でゲルを形成する。二価カチオン−低メトキシルペクチンゲルのネットワークは、二価カチオンがポリガラクツロン酸鎖の２つの範囲の架橋を引き起こす「エッグボックス」ジャンクション領域と通常呼ばれる領域の形成によって作り出される。

高メトキシルペクチンは一般に、二価カチオンと反応しないので、そのため二価カチオンゲルを形成することができない。しかしながら、特定の高メトキシルペクチンは、カルシウム感受性であると報告されているので、カルシウムゲル生成が可能である。加えて、高メトキシルペクチンは、＞５０％のメチル化又はメチルエステル化の程度を有しているにもかかわらず、ブロックによる脱エステルプロセスによってカルシウム反応性にされることができる。

従って、低メトキシルペクチンは、アルギン酸とペクチンの混合物が架橋性試薬として使用される本発明の実施形態のために通常好まれる。こうして、同じ架橋試薬は、この組み合わせが使用されているとき、アルギン酸とペクチンの両方に使用される。例えば、架橋試薬は、ＣａＣｌ₂であってもよい。実際、低メトキシルペクチンは、カルシウムにより高い親和性を有しているので、低メトキシルペクチンとアルギン酸の組み合わせは、架橋アルギン酸のうちの１つ単独と比較すると、改善されたゲル強度を有する架橋マトリックスをもたらす。

カルシウム−低メトキシルペクチンゲル生成は、メチル化若しくはメチルエステル化の程度、イオン強度、ｐＨ、及び分子量を含めたいくつかの要因によって影響される。よりメチル化又はメチルエステル化の程度が低いほど、そして、分子量が高いほど、ゲル化はより効果的である。さらに、カルシウム−低メトキシルペクチンゲル化は、中性ｐＨの約７．０で約３．５より効果的である。最後に、一価のカチオンの追加（例えば、Ｎａ⁺を提供するためのＮａＣｌの追加）は、ゲル化を促進する、すなわち、ゲル生成により少ないカルシウムしか必要としない。

低メトキシルペクチンは、化学的脱エステルプロセスによって通常得られる。市販の低メトキシルペクチンは通常、２０〜５０％のメチル化又はメチルエステル化の程度を有する。完全に脱エステル化されたペクチンは、「ペクチン酸」又は「ポリガラクツロン酸」とも呼ばれ得る。酸型のペクチン酸は、不溶性であるが、塩型では可溶性である。ペクチン酸の一般的な塩型は、ナトリウム塩又はカリウム塩のいずれかである。

市販のペクチンは、主に柑橘類やリンゴに由来する。しかしながら、柑橘類とリンゴは別として、ペクチンはまた、アロエベラなどの多くの他の植物からも単離され得る。アロエベラは、外側の緑色の外皮と、パルプとも呼ばれる透明な内側のゲルの２つの部分から成る。アロエペクチンは、内側のゲル又は外側の外皮細胞壁繊維から抽出される。弱アルカリ性ｐＨにおけるキレート剤の使用が、最も効果的な抽出法であることがわかった。アロエベラペクチンは本来、通常＜３０％で、１０％＜くらい低いこともあるメチル化又はメチルエステル化の程度を有し、そして、二価カチオンゲル化ができる低メトキシルペクチンである。Ｎａ⁺、Ｋ⁺又はＬｉ⁺などの一価カチオンは、ゲルの形成を加速する。加えて、アロエベラペクチンには、特にゲル化に関連するいくつかの独特な化学特性がある。例えば、それは、＞１×１０⁶Ｄａの高分子量を有し、且つ、＞５５０ｍｌ／ｇの高い固有粘度を有する。また、それは、＞４％の高いラムノース含有量を有し、そしてそれは、柑橘類、リンゴ、甜菜、及びヒマワリなどの植物由来の他のペクチンの含有量の少なくとも２倍である。ラムノースはペクチン骨格の主要な糖であり、そして、その含有量が分子の柔軟性に影響する。また、アロエベラペクチンは、その他のペクチンでは記載のなかった希少糖、３−ＯＭｅラムノースを有している。アロエベラペクチンのガラクツロン酸含有量は、＞７０％であり、＞９０％くらい高いこともある。その特徴のため、アロエベラペクチンは、本発明のいくつかの実施形態の好ましいペクチンであり得る。

次の：キトサン＋トリポリホスファート、カルボキシメチルセルロース＋Ａｌ³⁺、ｋ−カラギーナン＋Ｋ⁺、ｋ−カラギーン＋アンモニウム、ペクチン＋Ｃａ²⁺、ゲランゴム＋Ｃａ²⁺、及びポリホスファゼン＋Ｃａ²⁺を含めた架橋性試薬と架橋試薬の他の組み合わせが本発明に使用されてもよい。

一般に、架橋性試薬は、水又は水溶液などの溶媒との溶液の状態で、アルギン酸又はペクチンなどの架橋性重合体を含む。通常、溶液中の架橋性重合体の濃度は、約５％ｗ／ｗ〜約１５％ｗ／ｗ、好ましくは約８％ｗ／ｗ〜約１２％ｗ／ｗ、好ましくは約１０％ｗ／ｗである。使用される架橋性試薬の量は、微小粒子前駆体組成物中の架橋性重合体の濃度が約２％ｗ／ｗ〜約８％ｗ／ｗ、好ましくは約３％ｗ／ｗ〜約６％ｗ／ｗ、好ましくは約３％ｗ／ｗ〜約４％ｗ／ｗになるようなものであってもよい。例えば、架橋性試薬がアルギン酸とペクチンの混合物である実施形態において、微小粒子前駆体組成物中のアルギン酸ナトリウムの濃度は、約２％ｗ／ｗであってもよく、そしてまた、ペクチンの濃度は約２％ｗ／ｗであってもよい。架橋性試薬がアルギン酸とペクチンの混合物である、ある他の実施形態において、微小粒子前駆体組成物中のアルギン酸ナトリウムの濃度は約２％ｗ／ｗであってもよく、そして、ペクチンの濃度は約１％ｗ／ｗであってもよい。いくつかの実施形態において、微小粒子前駆体組成物中のアルギン酸ナトリウムの濃度は約２％ｗ／ｗであってもよく、そして、ペクチンの濃度が約１％ｗ／ｗ〜２％ｗ／ｗであってもよい。

架橋ヒドロゲルマトリックスは多孔性であることが多い。本発明は、微小粒子の多孔性を低減するために保護マトリックスを含む微小粒子を提供する。微小粒子の多孔性を低減することによって、微小粒子中のプロバイオティクスの外部環境への曝露を阻止又は低減し、且つ、微小粒子からのプロバイオティクスの漏出を阻止又は低減することが可能になる可能性がある。

いくつかの実施形態において、保護マトリックス前駆体の全成分が混合される前に、微小粒子前駆体組成物の他の１若しくは複数の成分が、保護マトリックス前駆体組成物の成分に加えられてもよい。本明細書中に使用される場合、保護マトリックス前駆体組成物は、架橋性試薬と架橋試薬を除いて、微小粒子のあらゆる成分を含む混合物を包含する。よって、いくつかの実施形態において、微小粒子前駆体組成物は、保護マトリックス前駆体組成物と架橋性試薬の混合物であると見なすこともできる。

本発明で提供される保護マトリックスは、風味をマスクしても、及び／又は風味が発生するのを予防してもよい。従って、特定の実施形態において、微小粒子は、特に風味が好ましくないと消費者によって知覚される可能性があるとき、微小粒子中のプロバイオティクス又はその他の活性物質のあらゆる風味をマスクしてもよい。

本明細書中で使用される場合、「風味」は、微小粒子を摂取するヒト又は動物によって知覚され得る。これらの風味は、好ましくない風味であると消費者に知覚され得る。「好ましくない風味」は、本明細書中で使用される場合、微小粒子の消費者によって不快又は「不満足」であると知覚され得る味やにおいが含まれる。これらの風味は、苦くて、かび臭くて、粉っぽく、段ボールを連想させ、魚臭くて、硫黄臭く（すなわち、分解タンパク質に関連するにおい又は味）、金属臭く、錆臭く、及び／又は広く異臭であってもよい。風味は、いずれかの活性物質も含めた、保護マトリックス自体、及び／又は微小粒子の１若しくは複数の成分に固有であってもよい。或いは又はさらに、風味は、微小粒子の１若しくは複数の成分の部分的又は完全な分解から生じてもよい。

いくつかの実施形態において、微小粒子のプロバイオティクス又は別の活性物質は、それ自体の、好ましくないと見なされる風味を有していてはいけない。しかしながら、それにもかかわらず、微小粒子がその中に組み入れられ得る製品の品質を損なう可能性があるので、この活性物質の風味をマスクすることが望まれることもある。例えば、微小粒子は、補助食品、機能性食品、及び飲料製品中に組み入れられてもよく、そして、これらの商品では、活性物質の風味が商品の風味を損なわないのが望まれ得る。一例として、微小粒子がオレンジジュースに組み込まれて、追加（強化）ジュースを提供する場合、追加（強化）の結果、消費者がジュースの風味のいずれの変化もわからないように、活性物質の風味をマスクするのが望まれることがある。

特定の活性物質について、ヒト消費者による吸収を最大にするために、胃腸管を通して（単数若しくは複数の）活性物質を小腸のアルカリ環境に輸送することが望まれることがある。例えば、胃腸管の悪条件にさらすこと（例えば、胃の胃酸にさらすこと）は、プロバイオティクスの生存を脅かす可能性がある。一部の活性物質は胃に刺激作用を有することがあるので、活性物質が小腸に達するまで吸収に利用できないように、活性物質をカプセル化することが望ましい。魚油などの好ましくない風味を有する活性物質は、胃で放出される場合には、その好ましくない風味が食道に上ってくること、及び／又は消費者によって知覚される風味を引き起こす胃の逆流を引き起こす可能性がある。この影響は、食べ物の「逆流」として消費者に知られていることもある。

微小粒子前駆体組成物の成分は、望ましい活性物質放出特性を微小粒子に提供するために選択されてもよい。例えば、本発明に応じて、微小粒子は、腸溶性バリア特性を有するマトリックスを有するために調製されてもよい。例えばいくつかの実施形態において、架橋性試薬はアルギン酸であってもよく、アルギン酸ゲルは腸溶性バリア特性を示すことができる。先に記載したように、アルギン酸ゲルは、低ｐＨ条件下で安定性に示し、そのため、活性物質放出が低いが、弱アルカリ条件下では、急速に膨張し、そして、溶解及び／又は崩壊を示す。この特性は、アルギン酸ゲルがプロバイオティクスと他の活性物質をヒト小腸に送達するのに効果的に使用できるようにする。従って、いくつかの実施形態において、製造される微小粒子は、小腸のアルカリ性条件に達するまで、微小粒子中に含まれた（単数若しくは複数の）活性物質を放出することなく、胃の酸性条件を通り抜けることができる。

アルギン酸などの架橋性試薬から製造された架橋マトリックスは、多孔性であってもよい。本発明は、変性タンパク質、ポリオール可塑剤、トレハロース、及び担体の混合物を含む保護マトリックス前駆体組成物に関する。以下により詳細に記載されているとおり、前駆体によって形成された保護マトリックスは、酸素及び／又は湿気などの分解性化合物の侵入を予防又は低減するため、並びに微小粒子からの（単数若しくは複数の）活性物質の漏出又は拡散を予防又は低減するために、架橋性試薬と架橋試薬によって形成された架橋マトリックスの多孔性を補うこともできる。そうすることによって、保護マトリックスは、架橋性試薬と架橋試薬によって形成された架橋マトリックスの腸溶性バリア特性を強化、手助け、又は補足し得る。例えば、保護マトリックスは、保存中に酸素や湿気などの分解性環境要因が微小粒子内に拡散することや、微小粒子に侵入することを予防し得る。よって、保護マトリックスは、微小粒子が摂取され、そして、微小粒子の腸溶性特性が利用されるときまで、生きた活性物質を微小粒子内に残すことを確実にし得る。

いくつかの実施形態において、保護マトリックスは、保存中に（単数若しくは複数の）活性物質の風味が微小粒子から発生するのを予防し、且つ、架橋性試薬と架橋試薬によって形成された架橋マトリックスの腸溶性バリア特性は、消費後、微小粒子が胃の中にあるときに、風味が派生するのを予防する。このように、保護マトリックスは、架橋マトリックスの腸溶性バリア特性を補足し得る。

いくつかの実施形態において、保護マトリックスと架橋マトリックスの組み合わせは、低ｐＨ条件下でより高い安定性を示し、そして、それ自体は、胃酸に晒されたときには、架橋マトリックス単独に比べて、より高い安定性である。すなわち、保護マトリックスは、架橋マトリックスの腸溶性バリア特性を増強し得る。

本発明の保護マトリックス前駆体組成物には：ポリオール可塑剤、トレハロース及び変性タンパク質、の３つの主成分を担体中に有する。その担体は、少なくともトレハロースのための溶媒である。一般に、担体は、架橋性試薬と混合できる。前記担体は、架橋性重合体と一緒に使用されて、架橋性試薬を形成する溶媒で容易に混合できる。通常、担体には水である。

保護マトリックス前駆体組成物は、微小粒子前駆体組成物の重量の５％〜２０％に相当し得る。いくつかの実施形態において、保護マトリックス前駆体組成物は、微小粒子前駆体組成物の重量の７．５％〜１３％に相当する。例えば、保護マトリックス前駆体組成物は、微小粒子前駆体組成物の重量の約１０％に相当する。

本明細書中に使用される場合、「タンパク質」という用語は、チオール−ジスルフィド交換反応及び／又はチオール酸化反応を受けることができる残基を持っているタンパク質を指す。それらの自然状態では、タンパク質は一般に、繊維性タンパク質又は球状タンパク質のいずれかとして存在している。繊維性タンパク質は、水に不溶性であり、動物組織の主要な構造材料として機能する。球状タンパク質は、水又は酸、塩基若しくは塩の水溶液に可溶性であり、生命体において幅広く重要な役割を果たしている。繊維性タンパク質は、通常完全に伸展していて、そして、一般に水素結合によって並列構造で互いに密接に結びついて、繊維を形成している。球状タンパク質は、水素結合、イオン結合、疎水性結合、及び共有（ジスルフィド）結合の組み合わせによって、一つに折り畳まれた複雑な球状構造体に折り畳まれている。これらのタンパク質の化学的及び物理的特性は、構成アミノ酸残基の相対量と、タンパク質重合体連鎖に沿ったそれらの位置に依存する。

前記タンパク質は、自然由来のタンパク質であっても、又は合成ポリペプチドであってもよい。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は修飾タンパク質であってもよい。例えば、前記タンパク質は、セリン残基が酵素変換を使用してシステイン残基に変換されたものであってもよい。

本発明に使用されるタンパク質は、好ましくは球状タンパク質である。タンパク質が線維タンパク質である実施形態において、その線維タンパク質は、水に可溶性になるように通常修飾される。例えば、線維タンパク質がコラーゲンであるものでは、それをゼラチンに変換するために加水分解によって修飾されてもよい。

好ましい球状タンパク質は、乳、コムギ、ダイズ、卵、リョクトウ、エンドウマメ、コメ、及びトウモロコシから単離されるものである。乳に由来するタンパク質としては、ホエータンパク質とカゼインが挙げられる。特定の実施形態において、ホエータンパク質は保護マトリックスのための好ましいタンパク質である。ホエータンパク質は、カゼインがｐＨ４．６で沈殿した後に可溶性を維持するタンパク質である。天然では球状であり、且つ、熱不安定であるホエータンパク質は、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、ウシ血清アルブミン、免疫グロブリン、及びプロテオースペプトンを含めたいくつかの成分タンパク質から成る。

いくつかの実施形態において、植物起源からのタンパク質を選択することが望まれる。例えば、絶対菜食主義者によって消費されてもよい微小粒子を提供することが所望されることがある。

いくつかの実施形態において、低アレルゲン特性を有するタンパク質が、微小粒子の保護マトリックスにおける使用のために選択されてもよい。例えば、エンドウマメ又はコメタンパク質が使用され得るが、なぜなら、乳タンパク質やダイズタンパク質又はコムギグルテンと比較して、これらのタンパク質に対してアレルギー応答を有する人が少ないからである。加えて、エンドウマメタンパク質は、ある他のタンパク質より容易に消化できる。

タンパク質は、タンパク質濃縮物又はタンパク質分離物の形態で提供されてもよい。「タンパク質濃縮物」とは、液体とより小さい分子を取り除く限外濾過プロセスでタンパク質起源を処理することによって調製された高タンパク質生成物である。タンパク質濃縮物を調製するために使用される限外濾過プロセスは、ダイアフィルトレーションプロセスであることが多い。ホエータンパク質濃縮物などの工業的に製造されたタンパク質濃縮物には２５〜８０％のタンパク質含有量を有し得る。

「タンパク質分離物」という用語、本明細書中で使用される場合、タンパク質起源からのタンパク質物質の抽出と、その後の濃縮、そして、精製から生じた生成物を指す。タンパク質分離物は、例えばイオン交換プロセスを使用したタンパク質濃縮物の処理によって調製できる。分離物は、９０％程度のタンパク質含有量を有し得る。特定の実施形態において、前記タンパク質はホエータンパク質分離物である。

前記タンパク質は、通常溶媒中の溶液又は分散液の状態で提供される。前記タンパク質は、重量によって約５〜約１５％、好ましくは約８〜約１２重量％、より好ましくは約１０重量％の溶液又は分散液を構成し得る。

溶媒は、担体であることが多いが、液体の混合物が担体として使用されるとき、溶媒は担体の成分であってもよい。保護マトリックスを有する微小粒子を形成した後に、溶媒／担体がゲルのシネレシス中に取り除かれてもよい。水が好ましい溶媒／担体であることが多い。

通常、前記タンパク質を、保護マトリックス前駆体組成物中で使用される比で担体中で変性させる。すなわち、保護マトリックス前駆体組成物の担体の総量は、担体中の変性タンパク質の分散液又は溶液に由来することが多い。もっとも、いくつかの実施形態において、１若しくは複数の他の成分が変性タンパク質と混合されると一緒に後期で、又はその後に、担体の一部が追加されてもよい。保護マトリックス前駆体組成物の他の成分の量は、変性タンパク質と担体の総量に関して重量ベースで通常決定される。分かりやすくするために、変性タンパク質と担体の総量の組み合わせは、いくつかの実施形態において、担体の一部が、１若しくは複数の他の成分を変性タンパク質と混合するときに、又はその後に追加されてもよいにもかかわらず、本明細書中では変性タンパク質混合物とも呼ばれる。

変性プロセスは、タンパク質の四次、三次、及び二次構造を破壊する。前記タンパク質は、変性タンパク質がそれを変性させた場合に、より伸展した構造をとるように、溶媒又は担体の存在下で変性させる。伸展したタンパク質立体配座は、本発明による保護マトリックスの製造に有利である。伸展されるすぐに、タンパク質鎖は、水素結合、イオン結合、疎水結合、及び共有結合によって結合できる。タンパク質鎖の相互作用は、保護マトリックスの結合に貢献する。この点で、変性プロセスにとって、ジスルフィド形成が可能なように、システイン及び／又はシステイン残基によって提供されたチオール基を晒すことが特に望ましい。また、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン（すなわち、脂肪族置換基を有するそれらのアミノ酸）によって提供されたあらゆる疎水基もまた、タンパク質鎖の間の疎水性結合を可能にするために理想的には晒される。疎水基は、自然状態では球状タンパク質の中心に向かって配置されていることが多い。さらに、前記タンパク質は、セリン、トレオニン、アスパラギン、及びグルタミンを含んでもよく、そしてそれは、水素結合を形成することができる親水性置換基を有している。

本発明では、前記タンパク質を、該タンパク質のチオール基を晒して、ジスルフィド形成を可能にするように変性させる。ジスルフィド形成は、分子間又は分子内のいずれかに生じ得る新しい−Ｓ−Ｓ−結合の形成を指す。ジスルフィド形成は、遊離スルフヒドリル基のシステイン残基が酸化され、ジスルフィド結合を形成するチオール酸化反応を介して起こり得る。さらに、既存の分子内ジスルフィド結合がチオール基と反応して、それにより、新しいジスルフィド架橋を形成し、そして、別の遊離チオール基を放出する、チオールジスルフィド交換反応が起こり得る。例えば、ホエータンパク質β−ラクトグロブリンは、通常、ジスルフィド架橋を形成している２組のシステイン残基と、遊離チオール基を含む１つのシステイン残基を含むので、本発明に使用できる。

前記タンパク質を、該タンパク質のチオール基がジスルフィド架橋を形成するために必要な能力及び立体構造的な接近性を有するように、該タンパク質の四次、三次、及び二次構造を十分に破壊するように変性させる。理論によって縛られることなく、変性タンパク質分子は、架橋されて、溶媒／担体中に分散した集合体を形成すると思われる。

それによってチオールジスルフィド交換が影響を受ける処理は、熱処理、化学的処理又は酵素的処理であり得る。本発明では、変性処理は好ましくは熱処理である。熱処理が使用されるとき、タンパク質溶液又は分散液は、特定のタンパク質の変性温度より高い温度まで、ジスルフィド架橋反応が開始するのに十分な時間加熱される。所定のタンパク質についての正確な温度と時間は、経験的に決定できる。しかしながら、変性プロセスは、約６５℃〜１００℃、好ましくは約７０℃〜１００℃、より好ましくは約９０℃の温度を通常伴う。熱処理の持続時間は、最長３時間、好ましくは約１５〜４５分、より好ましくは約３０分であり得る。

変性タンパク質鎖の間の相互作用は、アミノ酸残基の鎖の伸展の程度、性質及び配列によって影響を受ける。いくつかの実施形態において、アミノ酸残基間のタンパク質鎖相互作用を最適化するために、さまざまな起源からのタンパク質の混合物を使用することが望ましいことがある。例えば、その低アレルゲン特性のため、エンドウマメタンパク質を使用して保護マトリックスを製造することが望ましいことがある。しかしながら、エンドウマメタンパク質には、少量のシステインしかなく、そしてそれが、ジスルフィド架橋を形成するこのタンパク質の能力を制限している可能性がある。対照的に、コメタンパク質には、高レベルのシステインがあり、そしてそれが、もろい保護マトリックスをもたらす過度の架橋につながる可能性がある。ジスルフィド架橋のレベルを最適化するために、エンドウマメタンパク質とコメタンパク質の組み合わせが使用されてもよい。

保護マトリックスの柔軟性を改善するために、本発明の保護マトリックス前駆体組成物はポリオール可塑剤を含む。ポリオールは、変性タンパク質と水素結合し、その結果、タンパク質鎖の間の分子間間隔を増やすことによって保護マトリックスの柔軟性を改善する。好適なポリオール可塑剤としては、グリセロール、ソルビトール及びポリエチレングリコール、並びにそれらの組み合わせなどのポリアルコールが挙げられる。グリセロールは、特定の実施形態において好ましい可塑剤である。

さらに、ポリオール可塑剤が一般にトレハロースのようなコスモトロープある場合、それらは保護マトリックスの保護性に貢献する。ポリオール可塑剤は、水／水の水素結合形成に優先して、水との水素結合を形成する。従って、微小粒子中の水は、構造を破壊し、そして、氷結晶格子の形成は中断する。このように、ポリオール可塑剤は、氷晶が形成され得る温度を低下させ、その結果、プロバイオティクスの凍結保護特性を有する。よって、ポリオール可塑剤は、低温での微小粒子の保存後、例えば、−２０℃での保存後のプロバイオティクス生存率を改善するのに貢献している。

ポリオール可塑剤は、変性タンパク質混合物と混合されてもよい。ポリオール可塑剤は、トレハロースが追加される前に、変性タンパク質と混合されることが多い。ポリオール可塑剤は、重量ベースで約３０：７０〜約５０：５０、好ましくは約３５：６５〜約４５：５５、より好ましくは約４０：６０のポリオール可塑剤：変性タンパク質混合物の比で加えられ得る。

本発明の保護マトリックスは、構成要素としてトレハロースをさらに含む。トレハロースは、２つのグルコース単位がα−１，１−グリコシド結合で一緒に結合した、ビスアセタール、非還元ホモジサッカライドである。米国食品医薬品局は、２０００年に安全であると広く認識されているトレハロースを認可した。トレハロースは、変性タンパク質を安定させ、保護マトリックスの保護性を改善する。

先に述べたように、トレハロースがコスモトロープであり、よって、トレハロース／水の間の相互作用は水／水相互作用よりはるかに強い。従って、トレハロースは、水ネットワークの構造を破壊し、そして、それ自体の周りで（コスモトロープとして）水分子の配置を引き起こす。理論に縛られることなく、水は担体であって、過剰に存在している場合、トレハロースドウは変性タンパク質と直接相互作用しないと考えられる。代わりに、水がタンパク質の周りから除かれて、トレハロースの周りに配置される。この理論によると、保護マトリックス中のトレハロースの濃度は、有効水分のためにトレハロースと変性タンパク質、並びにプロバイオティクス（及び潜在的にはその他の活性物質）が競合するように選択されてもよい。この競合は、水分子が変性タンパク質とプロバイオティクスの周りで構造を破壊し、トレハロースの周りで構造化するといったことを引き起こす。トレハロースは、変性タンパク質とプロバイオティクスが安定するように、それ自体の周りで水構造を操ると考えられる。トレハロースの周りの水分子の分散は一定ではないが、それらはトレハロースの周りで、あらゆる方向に水素結合を有する規則構造が形成される方向に向けられる可能性がある。

さらに、トレハロースは、タンパク質の周りで、水などの担体分子を置換すると考えられる。担体分子を、水素結合ネットワークを提供するトレハロース分子と置き換えることによって、保護マトリックスを含む微小粒子が乾燥した場合や、微小粒子が熱ストレスなどの他のストレスに晒された場合に、変性タンパク質の三次元構造が維持され得る。この同じ機構が、トレハロースがプロバイオティクスなどの特定の活性物質を保護することを可能できる。トレハロースには、凍結保護及び液性保護特性があり得る。特に、トレハロースは、−２０℃くらいの低温での冷蔵においてプロバイオティクスの生存を高めることがある。

微小粒子が乾燥した場合の、担体レベルの更なる低下により、トレハロースは、ガラス状糖マトリックス内にそれらを固定することによって、変性タンパク質及び微小粒子の他の成分をさらに安定させ得る。トレハロースは、その構造完全性を下げることなく、ある結晶形と別の結晶形の間を通過でき、そしてそれが、微小粒子の他の成分、特にマトリックス中のプロバイオティクスの周りの保護ガラス状トレハロースマトリックスの形成を容易にすると考えられる。

ガラス状マトリックスの形成は、変性タンパク質の三次元構造を保存し、且つ、非生物的ストレスからそれを保護することによって、架橋変性タンパク質により提供される、酸素、脂質、及び風味バリア特性を高めると考えられる。その際に、トレハロースは、変性タンパク質が微小粒子中のプロバイオティクスをより良好に保護し、且つ、保護マトリックスからのプロバイオティクス又はポリオール可塑剤のあらゆる拡散も固定することを可能にすることがある。トレハロースはまた、変性タンパク質が微小粒子中の疎水性活性物質などのその他の活性物質をより良好に保護し、且つ、保護マトリックスからのそれらの拡散を予防又は抑制するようにそれを固定することを可能にすることがある。

保護マトリックスからのポリオール可塑剤の拡散を予防又は低減することによって、タンパク質鎖の分子間間隔が維持されるので、架橋性試薬と架橋試薬の架橋後に製造されたゲルのシネレシス後であっても、マトリックスは柔軟性を維持する。従って、トレハロースが保護マトリックスの構造を維持するので、保護マトリックスは、長期間安定性と復元力を有している。また、トレハロースがタンパク質鎖の周りに置換された担体分子を有する場合、分子間間隔は、溶媒和タンパク質の分子間間隔より狭くなることがある。よって、トレハロースは、ポリオール可塑剤を補足して、しなやかなマトリックスを提供し得る。

さらに、ガラス状マトリックス自体は、保護マトリックスを通した酸素、脂質又は風味化合物の拡散を抑制し得る。そのため、変性タンパク質とトレハロースは、組み合わせられて、優れた酸素、脂質、及び風味バリア特性を有する隙間のないマトリックスを形成する。この隙間のないマトリックスは、微小粒子中に分散させたプロバイオティクス及びその他の活性物質を補助し、且つ、保護する。従って、保護マトリックスは、酸素などの分解性化合物の侵入を予防又は低減するか、或いは微小粒子からの活性の漏出又は拡散を低減するための架橋性試薬と架橋剤によって形成された架橋マトリックスの多孔性を補うこともできる。

ガラス状マトリックスは、一部非晶質ガラス状相と一部結晶性水和物相でトレハロースを含む。結晶性水和物相は、無定形相を脱水させるための作用物質として働き、その結果、非晶質ガラス状のガラス転移温度を上げる。本明細書中に使用される場合、ガラス又はガラス状という用語は、すべての化学反応がほぼ静止状態に遅くされ得るくらいの高粘度及び低含水量の液相を意味する。長期間安定の達成する際のガラス状マトリックスの利点は、ガラス状（ガラス固化（vitrified））材料での拡散が非常に遅い速度（例えば、ミクロン／年）で起こるという事実からもたらされる。トレハロースは、すべての二糖の中で最も高いガラス転移温度（Ｔ_g）を有する。長期保存のためのガラス固化、すなわち、ガラス状マトリックスによる他の成分の不動化の最適の利益は、Ｔ_gが保存温度より高い条件下で観察されることである。トレハロースは高いＴ_gを有しているので、保護マトリックス及び保護マトリックスを含む微小粒子は、幅広い保存温度にて安定であり得る。

加えて、水に対するトレハロースの親和性にもかかわらず、この二糖は湿気に対する微小粒子の復元力を高めることができる。先に述べたように、トレハロースは、すべての二糖のうちで最も高いＴ_gを有する。一般に、非晶質に対する水の付加は、その移動性を高め、そして、ガラス転移温度（Ｔ_g）の低下につながる。これはトレハロースの場合でも起こると予期されたが、そのＴ_gは、スクロース又はマルトースなどの他の二糖のものよりはるかに高いままであった。従って、湿気はＴ_gを低下されることがあったとしても、それは、微小粒子の保存温度に比べて、通常高く維持されるので、それは分解に対して抵抗性がある。

トレハロースは、スクロースのそれに対し４５％の相対甘味を有し、そして、一般に、保護マトリックス又は微小粒子中の他の成分に関連するあらゆる風味をマスクするのに有効である。例えば、変性タンパク質は、好ましくない風味を有することがある。ホエータンパク質などのタンパク質は、「段ボール」のような味があることが多く、その一方で、コメタンパク質は、粉っぽい風味があることがある。変性タンパク質の好ましくない風味は、トレハロースによって効果的にマスクされ得るので、それを摂取したヒト又は動物によって知覚されない。

トレハロースが、微小粒子中のプロバイオティクス又はその他の活性物質、又は実際は微小粒子のその他の成分に関連するあらゆる好ましくない風味を効果的にマスクすることが想起される。さらに、微小粒子中のプロバイオティクスを含めたあらゆる活性物質が、微小粒子の拡散又は漏出から効果的に予防されることができるので、そのため、活性物質に関連するあらゆる風味化合物も微小粒子から漏出又は拡散するのを予防されるはずである。

トレハロースは、保護マトリックス前駆体組成物を形成する最後の構成要素として通常追加され得る。しかしながら、それは、変性タンパク質混合物単体又は１若しくは複数の活性物質が加えられた後に混合されてもよい。トレハロースは、重量ベースで約４０：６０〜約６０：４０、好ましくは約４５：５５〜約５５：４５、より好ましくは約５０：５０のトレハロース：変性タンパク質混合物の比で加えられてもよい。

保護マトリックス前駆体組成物の全成分が一緒に混合された時点で、保護マトリックス前駆体組成物は通常滅菌される。保護マトリックス中に分散させた１若しくは複数の活性物質の熱安定性によっては、それをすべての活性物質と混合する前に、保護マトリックス前駆体組成物を滅菌することが望ましいことがある。例えば、プロバイオティクスの温度感受性のため、プロバイオティクスが保護マトリックス前駆体組成物と混合される前に、あらゆる滅菌がおこなわれる必要があることは、理解される。

保護マトリックス前駆体組成物は、好適な時間、それを８０℃超まで加熱することによって滅菌され得る。例えば、保護マトリックス前駆体組成物は、３０分間８５℃で滅菌されてもよい。保護マトリックス前駆体組成物中のトレハロースは、変性タンパク質鎖の間のさらなるジスルフィド架橋の形成を抑制する。よって、過度の架橋は保護マトリックスの脆化につながるので、トレハロースは、変性タンパク質が滅菌中に過度に架橋するのを予防する。

通常、プロバイオティクス含有マトリックス前駆体を架橋性試薬と混合して、微小粒子前駆体組成物を形成する前に、滅菌された保護マトリックス前駆体組成物がプロバイオティクスと混合されて、プロバイオティクス含有マトリックス前駆体を形成する。これは、保護マトリックス前駆体組成物とプロバイオティクスとの良好な接触を確保するためにおこなわれるので、該プロバイオティクスは、最終的な微小粒子中の保護マトリックス中に適当に分散させ、且つ、該保護マトリックスによって保護され得る。

また、その他の活性物質も、得られる混合物を架橋性試薬と混合して、微小粒子前駆体組成物を形成する前に、保護マトリックス前駆体組成物と通常混合される。保護マトリックス前駆体組成物が一般に水溶液として提供される場合、及び架橋性試薬が一般に水溶液中又は水溶液として提供される場合、微小粒子が任意の疎水性活性物質も含むとき、それらは、通常、保護マトリックス前駆体組成物及び架橋性試薬中に非混和性であり、そして、微小粒子中に疎水性活性物質とプロバイオティクスを組み込むことは簡単ではない。

疎水性活性物質、プロバイオティクス、保護マトリックス前駆体組成物、及び適宜、架橋性試薬を、これらのすべての成分を一緒に乳化によって組み合わせることは、乳化プロセスで生じる剪断力がプロバイオティクス細胞破壊とプロバイオティクス生存率の損失をもたらすので、望ましくないことがある。

疎水性活性物質が使用されるいくつかの実施形態において、疎水性活性物質は、使用される追加の乳化剤が潜在的にまったくなしに、変性タンパク質混合物ろ混合されて、疎水性活性物質を含むエマルジョンを形成する。次いで、このエマルジョンは、微小粒子前駆体組成物の残りの成分と組み合わせられ得る。

理論によって縛られることなく、疎水性活性物質が変性タンパク質混合物と混合されて、なめらかで、安定したエマルジョンを形成し得るのは、疎水性活性物質と、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンの脂肪族置換基などのタンパク質の疎水性基の間の相互作用によるものであると考えられる。すなわち、タンパク質中の親水基と疎水基の組み合わせは、それが疎水性活性物質と担体との混合を容易にする乳化剤として機能することを可能にするが、前記担体は水であることが多い。改めて、理論によって縛られることなく、変性タンパク質の集合体と疎水性活性物質の液滴は、構造化されたミセル、二層小胞又は複層を形成するので、疎水性活性物質は、溶媒／担体から「遮蔽されている」と考えられる。これらの構造は、微小粒子に入れた状態で運ばれてもよい。よって、微小粒子では、疎水性活性物質は、保護マトリックスの変性タンパク質中に部分的に又は完全にカプセル化されていてもよい。

保護マトリックス前駆体組成物の他の成分の追加前の、疎水性活性物質及び変性タンパク質と、担体の一部又はすべてとの一緒の混合は、疎水性活性物質とタンパク質が疎水性活性物質「遮蔽」構造物を形成するために、より効果的に相互作用することを可能にし得る。次いで、この構造物は、トレハロースとポリオール可塑剤の追加を通して安定化され得る。しかしながら、このように疎水性活性物質を保護マトリックス前駆体組成物と組み合わせるのは、必ずしも必要ではない。

或いは、プロバイオティクスの生存を過度に脅かすことなく、微小粒子中への疎水性活性物質の組み込みの問題に対処するために、本発明のいくつかの実施形態は、プロバイオティクス、架橋性試薬、保護マトリックス前駆体組成物、及び疎水性活性物質を含むエマルジョンの混合を含む微小粒子前駆体組成物を提供する。すなわち、疎水性活性物質を他の微小粒子成分、特にプロバイオティクスと混合する前に、疎水性活性物質は、エマルジョンを形成するのに使用される。

疎水性活性物質を含むエマルジョンは、保護マトリックス前駆体組成物及び架橋性試薬と容易に混合できるが、疎水性活性物質を容易に混合できない好適な液体に疎水性活性物質を組み合わせることによって形成されてもよい。通常、このエマルジョンが使用される保護マトリックス前駆体組成物及び架橋性試薬と容易に混合できる好適な乳化剤を使用して、疎水性活性物質は水と乳化される。しかしながら、いくつかの実施形態において、前記液体は架橋性試薬であってもよい。

疎水性活性物質と前記液体は、当業者に知られている従来の乳化技術を使用することで一緒に乳化され得る。いくつかの実施形態において、前記エマルジョンは、疎水性活性物質の液滴が適当に小さいサイズのものであるエマルジョンを達成するためにさらなる精製を必要とすることがある。例えば、複数の乳化又は均質化ステップが、適当に小さいサイズの疎水性活性物質の液滴を精製するのに必要であることがある。適当に小さい液滴サイズは、微小粒子の保護マトリックスを通じた疎水性活性物質のより均質な分散を容易にし得る。

いくつかの実施形態において、微小粒子を通じた疎水性活性物質液滴の分散は、実質的に一定であってもよい。さらに、液滴サイズの減少により、疎水性活性物質の表面積対体積の比は、増大する。従って、疎水性活性物質が微小粒子の他の成分を接触させるためには、より広い表面積が利用可能である。また、エマルジョン中の液滴サイズは、液滴間で利用可能な隙間空間の体積にも影響を与える。いくつかの実施形態において、プロバイオティクスは、隙間空間内に有利に配置され得ると考えられる。適当に小さな液滴サイズは０．５〜１μｍであり得る。

魚油などの特定の疎水性活性物質は、酸化に感受性を有する。酸化の予防及び／又は発生遅延のために、疎水性活性物質を含むエマルジョンは、酸素への曝露を低減又は予防するために窒素又はアルゴン雰囲気などの不活性雰囲気中で形成されてもよい。

エマルジョンが、疎水性活性物質を含むエマルジョンの安定性を高めるために使用される。先に述べたように、前記エマルジョンは、変性タンパク質がそれらの実施形態で使用され得るのに加えて、変性タンパク質混合物、及び乳化剤を用いて形成され得る。前記乳化剤は、あらゆる食品グレードの界面活性化成分、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤及び／又は両親媒性界面活性剤であってもよい。こうした乳化剤としては、これだけに限定されるものではないが、レシチン、修飾レシチン、キトサン、修飾デンプン（例えば、オクテニルスクシナート無水物デンプン）、ペクチン、ゴム（例えば、ローカストビーンガム、アラビアゴム、グアーガムなど）、アルギン酸、アルギナート及びその誘導体、セルロース及びその誘導体、蒸留モノグリセリド、モノ及びジグリセリド、モノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル（ＤＡＴＥＭ）、ポリソルベート６０又は８０（ＴＷＥＥＮ６０又は８０）、ステアリルラクチラートナトリウム、プロピレングリコールモノステアラート、スクシニル化モノ及びジグリセリド、アセチル化モノ及びジグリセリド、脂肪酸のプロピレングリコールモノ及びジエステル、脂肪酸のポリグリセロールエステル、脂肪酸のラクチル酸エステル、グリセリルモノステアラート、プロピレングリコールモノパルミタート、グリセロールラクトパルミタート、グリセロールラクトステアラート、及びその混合物のうちの１若しくは複数を挙げることができる。いくつかの実施形態において、レシチンが乳化剤として使用される。

乳化剤は、約１：５０〜約１：１５、好ましくは約１：４５〜約１：２５の乳化剤：液体の比で加えられてもよい。いくつかの実施形態において、使用される比は、重量ベースで約１：２９である。ある他の実施形態において、使用される比は、約１：３９である。

通常、その乳化剤混合物が疎水性活性物質と乳化される前に、乳化剤は液体の少なくとも一部と混合される。しかしながら、いくつかの実施形態において、乳化剤、液体及び疎水性活性物質は、同時に一緒に混合され得る。いくつかの実施形態において、その混合物を液体で乳化する前に、乳化剤は疎水性活性物質と混合される。

いくつかの実施形態において、乳化剤は、その乳化剤混合物を疎水性活性物質及び残りの液体と混合する前に、（重量に基づいて）約２０％〜５０％、例えば、約四分の一又は三分の１の液体と混合される。乳化剤は、重量ベースで約１：１１〜約１：７、好ましくは約１：１０〜約１：８、より好ましくは約１：９の乳化剤：液体部分の比で液体の第一部分に加えられ得る。

本発明がヒトに摂取されることを意図する微小粒子に関するという事実を考慮すると、いくつかの実施形態において、乳化剤と液体の混合物は、疎水性活性物質との乳化前に滅菌されてもよい。乳化剤と液体の混合物は、好適な時間、約８０℃超にそれを加熱することによって滅菌されてもよい。例えば、前記混合物は、３０分間８５℃にて滅菌されてもよい。滅菌混合物は、疎水性活性物質とそれが乳化される前に、冷やされることが多い。

疎水性活性物質、及び乳化剤と液体の混合物は、重量ベースで約１：５〜約５：１、好ましくは約１０：３５〜約１：１の疎水性活性物質：乳化剤と液体の混合物の比で一緒に乳化にされてもよい。いくつかの実施形態において、使用される比は、重量ベースで約２：３である。ある他の実施形態において、使用される比は、約１：３である。いくつかの実施形態において、使用される比は、約１：４である。

疎水性活性物質を含むエマルジョンが形成された時点で、プロバイオティクスは、疎水性活性物質を含むエマルジョンと混合されて、プロバイオティクス含有エマルジョンを形成し得る。通常、プロバイオティクスは、疎水性活性物質を含むエマルジョンと混合して、プロバイオティクス含有エマルジョンを形成する前に、保護マトリックス前駆体組成物と混合されて、プロバイオティクス含有マトリックス前駆体を形成する。このように、プロバイオティクスは、保護マトリックス前駆体組成物全体にわたって十分に分散するので、それと効果的に相互作用することができる。特に、プロバイオティクスは、トレハロースと効果的に相互作用し得る。

プロバイオティクスは剪断力感受性であり得る、すなわち、プロバイオティクスを高速剪断力に晒すことは、細胞破壊と生存率の損失をもたらし得る。これを考慮すると、プロバイオティクスは、該プロバイオティクスの生存率が過度に脅かされないような方法で、微小粒子のあらゆる成分と混合され、そして、その全体にわたって分散されなければならない。従って、プロバイオティクスを、疎水性活性物質を含むエマルジョン、又は実際は微小粒子のその他の成分と混合することは、該プロバイオティクスを適当に低い剪断混合にかけることを伴う。適当に低い剪断混合とは、顕著な細胞破壊とプロバイオティクス生存率の損失が発生する剪断速度未満でおこなわれる混合である。例えば、低剪断速度は、１００〜３００ｒｐｍなどの最大３００ｒｐｍ、しかし、好ましくは１００ｒｐｍ以下で作動する混合羽根車によって生み出される剪断速度のタイプであり得る。低剪断混合（Low shear blending）は、低剪断混ぜ合わせ（low shear mixing）を含む。よって、いくつかの実施形態において、プロバイオティクスと、疎水性活性物質を含むエマルジョンとの混合は、プロバイオティクスと、疎水性活性物質を含むエマルジョンとの混ぜ合わせを含み得る。

次いで、プロバイオティクス含有エマルジョンは、架橋性試薬と混合されて、微小粒子前駆体組成物を形成し得る。架橋性試薬との混合が、微小粒子前駆体組成物の形成中に、プロバイオティクスの生存率が過度に脅かされないことを確実にするために、適当に低い剪断混合であることが理解される。実際には、本発明では、すべての中間体プロバイオティクスを含む混合物を含む、微小粒子前駆体組成物を製造するのに使用されるすべてのプロバイオティクスを含む成分は、該プロバイオティクスの生存率が過度に脅かされないことを確実にするために、適当に低い剪断速度にかけられる必要がある。

疎水性活性物質は通常、該疎水性活性物質を含むエマルジョン状態の分散相である。架橋性試薬と容易に混和できる液体とのエマルジョンの形態で疎水性活性物質を提供することによって、該液体は、疎水性活性物質を運搬し、それが架橋性試薬中に効果的に分散するのを可能にする。よって、疎水性活性物質の不連続な液滴は通常、微小粒子前駆体組成物中に入った状態で運ばれる。さらに、疎水性活性物質が微小粒子前駆体組成物中に分散しているとき、該前駆体を使用することで生じる微小粒子は、架橋マトリックス中に分散させた疎水性活性物質を有することができる。

一般に、混ぜ合わせの効率のために、プロバイオティクス含有マトリックス前駆体は、プロバイオティクスと疎水性活性物質を含む混合の前に、疎水性活性物質を含むエマルジョンと混合される、すなわち、プロバイオティクス含有エマルジョンは架橋性試薬と混合される。いくつかの実施形態において、プロバイオティクス細胞は、エマルション滴と接触し、そして、それらの中に組み込まれるようになってもよい。これはプロバイオティクスの生存を促進し得る。プロバイオティクス中で混合する前に、疎水性活性物質を架橋性試薬と混合することで、該プロバイオティクスが効果的に該疎水性活性物質と接触する妨げとなる。

プロバイオティクスは一般に、プロバイオティクス含有エマルジョンの連続相中に位置する。同様に、プロバイオティクスは、微小粒子前駆体組成物の連続相中に通常位置する。プロバイオティクス細胞の大部分は、不連続な疎水性活性物質相の間の隙間空間に位置し得る。疎水性活性物質の不連続な液滴は、密に充填され得るので、隙間空間が外部環境から遮断される。理論によって縛られることなく、プロバイオティクスは隙間空間内で保護されているので、プロバイオティクス含有エマルジョン及び微小粒子前駆体組成物中でのその生存は改善されると考えられる。よって、本発明による微小粒子前駆体組成物中への疎水性活性物質の組み込みが、疎水性活性物質を含んでいない微小粒子前駆体組成物と比較して、前駆体組成物の保存中のプロバイオティクスの生存率に対する有益な効果をもつことがわかった。例えば、本発明の微小粒子前駆体組成物は、プロバイオティクスの生存率が９０〜９８％で維持されたまま２〜３カ月間、約４℃にてすぐに使用できる状態で保存され得る。

プロバイオティクスの生存率は、次の式１に従って計算される。

エマルジョンが疎水性活性物質よりむしろ脂質を使用して形成されるのであれば、微小粒子前駆体組成物のプロバイオティクスの生存率における有益な改善は、もっと達成され得る。従って、別の実施形態において、本発明は、プロバイオティクス、保護マトリックス前駆体組成物（すなわち、少なくとも変性タンパク質、ポリオール可塑剤、トレハロース、及び担体の混合物）、架橋性試薬及び脂質を含むエマルジョンの混合を含む微小粒子前駆体組成物を提供する。好適な脂質としては、本発明における使用に好適な形態でそれらを取り入れるために、疎水性活性物質を溶解するのに好適であると先に記載したものを挙げることができる。

本発明のこれらの実施形態は：プロバイオティクスを保護マトリックス前駆体組成物と混合して、プロバイオティクス含有マトリックス前駆体を形成し；脂質を含むエマルジョンをプロバイオティクス含有マトリックス前駆体と混合して、プロバイオティクス含有エマルジョンを形成し；そして、プロバイオティクス含有エマルジョンを架橋性試薬と混合すること、を含む微小粒子前駆体組成物の製造方法をさらに提供する。

本発明はまた、保護マトリックス中に分散させた脂質とプロバイオティクスを含む微小粒子を提供する。
微小粒子前駆体組成物中の疎水性活性物質（又は脂質）とプロバイオティクスの分散型配置は、最終的な微小粒子に入った状態で運搬され得る。よって、疎水性活性物質又は脂質は、不連続相としての微小粒子の保護マトリックス中に分散していてもよい。いくつかの実施形態において、疎水性活性物質又は脂質の液滴は、マトリックス全体にわたって実質的に均一な分散状態で分散する。ある他の実施形態において、前記分散は、他の部分より疎水性活性物質又は脂質の割合が高い保護マトリックス中の部分をもたらし得る。
さらに、プロバイオティクスは、微小粒子の架橋保護マトリックス中に分散し得るので、それは疎水性活性物質又は脂質液滴の間の隙間空間内に配置される。従って、プロバイオティクスは、微小粒子の疎水性活性物質又は脂質液滴の間の隙間空間内で保護され得る。保護マトリックス中のプロバイオティクスの分散は、マトリックス中で実質的に均一な分散であり得る。

本発明のこれらの実施形態の重要な点は、プロバイオティクスの生存率が実質的に維持されるので、生存能力があるプロバイオティクスを含む微小粒子が製造できるような方法で、微小粒子前駆体組成物中に疎水性活性物質とプロバイオティクスを組み合わせることである。これらの実施形態は、プロバイオティクスを細胞破壊と生存率の損失をもたらすストレス、すなわち、剪断力に晒すことなく微小粒子前駆体組成物を形成するために、疎水性活性物質をプロバイオティクス、保護マトリックス前駆体組成物及び架橋性試薬と混合可能なように、疎水性活性物質を含むエマルジョンを利用する。
そのうえ、本発明は、微小粒子前駆体組成物と最終的な微小粒子の両液滴の間の隙間空間内のプロバイオティクスの生存率を改善する疎水性活性物質又は脂質の液滴を形成する遮蔽構造を提供する。

先に記載したように、プロバイオティクスを疎水性活性物質と混合することは、微小粒子製造中のプロバイオティクスの生存率を改善する。プロバイオティクスの生存率の改善は、パーセンテージとして表され、そして、次の式２に従って計算される。

式２：

いくつかの実施形態において、プロバイオティクスの生存率における改善は、疎水性活性物質、プロバイオティクス、及び他の微小粒子成分が一緒に乳化にされるプロセスと比較して、約２０％〜約５０％であってもよい。例えば、プロバイオティクスの生存率は約３０％改善されてもよい。

疎水性活性物質と保護マトリックス前駆体組成物を一緒に含むエマルジョンの混合は、変性タンパク質の集合体が、疎水性活性物質を含むエマルジョンからの疎水性活性物質の液滴を囲んで、それよって疎水性活性物質を遮蔽しているトレハロースとポリオール可塑剤によって安定化された混合物を生じ得る。

疎水性活性物質の液滴が適当に小さいサイズのものであることを確実にすることによって、最終的にトレハロースとポリオール可塑剤によって安定化される変性タンパク質の集合体は、より容易に疎水性活性物質を囲んで「遮蔽」構造を形成し得る。

組成物の疎水性活性物質が変性タンパク質によって遮蔽される限り、疎水性活性物質は、該タンパク質のバリア特性からの利益を受ける。特に、変性タンパク質は、疎水性活性物質の酸化を制限又は予防するためのバリアとして酸素に作用し得る。このように、保護マトリックスは、疎水性活性物質で発生する風味、特に好ましくない風味を予防又は軽減し得る。

先に述べたように、保護マトリックスは、プロバイオティクスを含む微小粒子のあらゆる活性物質が拡散又は漏出するのを予防するか、或いは、該活性物質の拡散又は漏出を有意に低減又は緩和し得る。例えば、微小粒子が飲料に加えられたとき、保護マトリックスは、活性物質の有益な活性の喪失につながるであろう分解性環境に関連活性物質が晒されないように、活性物質が拡散又は漏出するのを予防し得る。保護マトリックスはまた、分解性環境が微小粒子自体の中で発生するのも予防し得る。例えば、マトリックスは、微小粒子中の関連活性物質の分解を予防するために、周囲環境からの酸素などの分解性化合物の侵入を予防又は制限し得る。よって、分解性環境は、微小粒子の中にあっても又は外部にあってもよく、関連活性物質を少なくとも１つの分解性化合物、及び／又は分解性条件に晒すことを伴う。本発明の保護マトリックスの使用は、関連活性物質を分解性環境に晒すのを予防又は低減し得る。

さらに、関連活性物質は、保護マトリックス中のトレハロースの風味マスク活性により、製品を摂取したヒト又は動物によって該活性物質からの風味が知覚されないように、保護マトリックス中に分散し得る。加えて、保護マトリックスの特性は、活性物質から生じることがある個々の風味化合物が微小粒子を通して拡散又は漏出するのを予防又は制限するようにすることであり得る。

保護マトリックスは、特にプロバイオティクスを保護するために有用であり得る。保護マトリックスの酸素バリア特性は、プロバイオティクスの生存を促進し得る。また、保護マトリックスのトレハロースは、プロバイオティクスの周りから水を置換し、そして、細菌細胞膜でガラス状マトリックスを形成して、プロバイオティクスを安定させ、且つ、プロバイオティクスの生存率を別の形で脅かす環境ストレスからプロバイオティクスを保護し得る。さらに、ポリオール可塑剤とトレハロースは、プロバイオティクスの生存率を高めるために相乗効果的に組み合わせられてもよい。

加えて、プロバイオティクスは、それらを摂取したヒト又は動物によって好ましくないと思われる風味を有する可能性があるので、保護マトリックスはこれらの風味をマスクし得る。また、保護マトリックスは、微小粒子からのプロバイオティクスの拡散を防止することによって、微小粒子からこれらの風味が発せられるのを予防し得る。

保護マトリックスは、長期間にわたり、活性物質の漏出又は分解性化合物の侵入から生じ得る、分解性環境へのプロバイオティクス、又はその他の活性物質の曝露を予防又は軽減し得る。或いは又はさらに、プロバイオティクス（又はその他の活性物質若しくはその活性物質の成分）の拡散又は漏出は、該微小粒子が好適な条件下で長期間保存された後でさえ、その微小粒子からの風味がそれを摂取したヒト又は動物によって知覚されないように、予防又は制限され得る。いくつかの実施形態において、保護マトリックスを含む微小粒子は、その有益な活性を失って、プロバイオティクス、又はその他の活性物質を含まずに保存され得るか、及び／又は好適な保存条件が使用された場合には、知覚できるようになるまで最長２カ月間、好ましくは最長４カ月間、好ましくは最長６カ月間、プロバイオティクス、又はその他の活性物質の風味なしに保存され得る。いくつかの実施形態において、微小粒子は、その有益な活性を失って、プロバイオティクス、又はその他の活性物質を含まずに保存され得るか、及び／又は好適な保存条件が使用された場合には、知覚できるようになるまで最長２カ月間、好ましくは最長４カ月間、好ましくは最長６カ月間、プロバイオティクス、又はその他の活性物質の風味なしに保存され得る。好適な保存条件は、約−２０℃の温度で微小粒子を保存することを含み得る。好適な保存条件は、ホイル内に微小粒子を真空包装することを含み得る。

いくつかの実施形態において、微小粒子は、飲料などの別の製品に加えられて、添加製品を形成し得る。保護マトリックスは、添加製品の典型的な保存期限の間、該保護マトリックス中に分散したプロバイオティクス又はその他の活性物質が、分解性環境に晒されるのを予防又は軽減する。すなわち、プロバイオティクス、又はその他の活性物質の有益な活性は、保護マトリックスの使用によって添加製品の保存期限全般にわたって保存され得る。或いは又はさらに、プロバイオティクス、又はその他の活性物質の拡散又は漏出は、該プロバイオティクス、又は他の関連活性物質からの風味が、該添加製品を摂取したヒト又は動物によって知覚されないように、予防又は制限され得る。従って、いくつかの実施形態において、添加されるべき製品の保存期限は、微小粒子の添加によって影響を受けない。添加製品は、約１５℃以下、好ましくは約１０℃以下、より好ましくは４℃以下で保存され得る。

一例として、本発明による微小粒子は、飲料に加えられて、プロバイオティクスが添加された飲料を形成し得る。微小粒子は、添加飲料が約４週間、好ましくは最長２カ月間、より好ましくは最長３カ月間保存できる十分な安定性を有し得る。例えば、飲料がフレッシュフルーツジュースなどのフルーツジュースであるとき、該ジュースは、有益な活性を失って、プロバイオティクスを含むことなく、及び／又はプロバイオティクスの好ましくない風味を知覚できるようになることなく約４週間保存され得る。

先に述べたように、特定の活性物質は、例えば、酸素にさらすことによって、分解に続いて、好ましくない風味を生じ得る。よって、分解性環境への露出の予防又は制限によって、本発明の保護マトリックスは、好ましくない風味が発生するのを予防するのに使用されてもよい。

本発明の保護マトリックスは、プロバイオティクスと組み合わせて使用され得る魚油又は他の疎水性活性物質などの酸化的分解反応に感受性を有する活性物質を保護するのに特に合っている。これらの活性物質は、本来、好ましくない風味があってもよい。しかしながら、これらの活性物質の風味は、活性物質が酸化されれば、より好ましくなくなることもある。そのため、保護マトリックスは、活性物質の酸化を予防又は抑制するのに有効な酸素バリアを提供し得るので、酸化的分解反応に感受性を有する活性物質を含む微小粒子の使用に有利であり得る。これらの活性物質が魚油などの脂質である場合には、保護マトリックスのトレハロースが、脂質と相互作用して、酸化を抑制するか、又は予防し得る。すなわち、トレハロースは、酸化に対して脂質の不飽和結合を安定させ得る。脂質の酸化が、好ましくない風味を有する揮発性アルデヒドの発生につながる場合、脂質活性物質の酸化を抑制するが、好ましくない風味の発生を予防するか、又はそれらの発生を抑制する。

好ましくない風味を有する他の活性物質としては、苦い風味を有するビタミンＢが挙げられる。ビタミンＢとしては、ビタミンＢ₁（チアミン）、ビタミンＢ₂（リボフラビン）、ビタミンＢ₃（ナイアシン又はニコチンアミド）、ビタミンＢ₅（パントテン酸）、ビタミンＢ₆（ピリドキシン、ピリドキサール、若しくはピリドキサミン、又は塩酸ピリドキシン）、ビタミンＢ₇（ビオチン）、ビタミンＢ₉（葉酸）、並びにビタミンＢ₁₂（シアノコバラミンなどの様々なコバラミン）が挙げられる。本発明の保護マトリックスは、マトリックス中で分散する１若しくは複数のビタミンＢの風味にマスクするのに使用されてもよい。

いくつかの実施形態において、変性タンパク質、ポリオール可塑剤、及びガラス状トレハロースマトリックスは、液体活性物質の分散液滴を取り囲んだ。活性物質のこれらの液滴は、変性タンパク質、ポリオール可塑剤、及びガラス状トレハロースマトリックスと比較して、低い引張弾性率を有する。よって、活性物質は、マトリックスの剛性を低減し、且つ、靭性を改善し得る。

プロバイオティクスと疎水性活性物質が使用される実施形態において、ガラス状トレハロースマトリックスは、不連続な疎水性活性物質相の間の隙間空間で濃縮され得る。よって、ガラス状トレハロースマトリックスは、疎水性活性物質によって提供され得るプロバイオティクスの保護を補強し得る。これらの実施形態において、この構造物の形成を容易にするために、微小粒子前駆体組成物が、疎水性活性物質を混合する前の、プロバイオティクスを保護マトリックス前駆体組成物と混合することによって、製造され得る。

プロバイオティクスと疎水性活性物質が保護マトリックス前駆体組成物と混合された時点で、架橋性試薬がこれらの成分と混合されて、微小粒子前駆体組成物を生じ得る。このように、プロバイオティクスは、それが架橋性試薬と混合される前に、一次保護構造としての、保護マトリックスを形成する材料内にうまく埋め込まれ、そして、二次保護構造としての、疎水性活性物質液滴の間の隙間空間内で遮蔽され得る。架橋性試薬と架橋試薬から形成される架橋マトリックスは、プロバイオティクスのための三次保護構造を構成する。

保護マトリックス前駆体組成物の成分は、それが混合される微小粒子前駆体組成物を安定させ得る。従って、本発明による微小粒子前駆体組成物は、それが析出することなしに長期間保存されることを可能にするのに十分な安定性を有し得る。例えば、本発明の微小粒子前駆体組成物は、約２カ月間、好ましくは約４カ月間、より好ましくは最長６カ月間、すぐに使用できる状態で保存され得る。疎水性活性物質が使用されるとき、トレハロースは、該活性物質が担体中でうまく分散されうるように、且つ、微小粒子前駆体組成物がなめらかさと、エマルジョン状態さえ維持するように、変性タンパク質と疎水性活性物質との相互作用を安定させ得る。よって、トレハロースは、最長２カ月間又は最長６カ月間などの長期間、析出することなく保存を可能にするのに十分な安定性を有するこれらの実施形態の微小粒子前駆体組成物を容易にし得る。

いくつかの実施形態において、例えば、保護マトリックスを含む微小粒子中のプロバイオティクスのＣＦＵ数は、プロバイオティクスの生存率が、好適な条件下での２カ月の保存後に最初のＣＦＵ数の９０％以上、例えば約９９％になるように、維持され得る。いくつかの実施形態において、ＣＦＵ数は、プロバイオティクスの生存率が、好適な条件下での６カ月の保存後に最初のＣＦＵ数の９０％以上、例えば約９９％になるように維持され得る。好適な保存条件は、約−２０℃の温度で微小粒子を保存することを含み得る。好適な保存条件は、ホイル内に微小粒子を真空包装することを含み得る。

いくつかの実施形態において、微小粒子中のプロバイオティクスの生存率は、ｌｏｇ₁₀（単位重量又は単位体積あたりの最終的なＣＦＵ数）の値が、≦１であり、ｌｏｇ₁₀（単位重量又は単位体積あたりの最初のＣＦＵ数）の値未満である、好ましくは前記値の差が０〜０．５、より好ましくは差が０．０２未満、よりいっそう好ましくは差が０．００４未満であるように維持され得る。

微小粒子前駆体組成物の１若しくは複数の成分は、酸化に感受性を有していてもよい。酸化に対して感受性を有する成分は、魚油などの活性物質であることが多い。その成分に関連する有益な活性物質の損失につながる可能性がある、感受性を有する成分の酸化分解を予防又は低減するために、微小粒子前駆体組成物の製造方法の特定のステップが、酸素への曝露を低減又は予防するために、窒素若しくはアルゴン雰囲気などの不活性雰囲気中でおこなわれ得る。いくつかの実施形態において、酸化感受性を有する成分、或いは、酸化感受性を有する成分を含む混ぜ合わせ物又は混合物が扱われるそれぞれ及びすべてのステップが、不活性雰囲気下でおこなわれてもよい。さらに、微小粒子前駆体組成物が酸化感受性を有する成分を含む実施形態において、微小粒子は、不活性雰囲気下で製造され得る。

微小粒子前駆体組成物の１若しくは複数の成分は、光分解感受性を有していてもよい。酸化感受性を有する成分と同様に、光分解感受性を有する成分は、魚油などの活性物質であることが多い。光分解を予防又は低減するために、微小粒子前駆体組成物の製造方法の特定のステップが、光への曝露を予防又は低減するために、覆われた、不透明なコンテナなどの暗い環境下でおこなわれてもよい。いくつかの実施形態において、光分解の感受性を有する成分、或いは、光分解感受性を有する成分を含む混ぜ合わせ物又は混合物が扱われるそれぞれ及びすべてのステップが、暗い環境下でおこなわれてもよい。加えて、微小粒子前駆体組成物が光分解感受性を有する成分を含む実施形態において、微小粒子は暗い環境下で製造され得る。

微小粒子前駆体組成物の１若しくは複数の成分は、熱感受性であってもよく、そして、関連成分が熱分解する温度に曝露されるのを避けるために、微小粒子前駆体組成物と微小粒子自体の製造中、適当な注意が払われ得る。

本発明は、微小粒子前駆体組成物を細かく分割された状況で提供し；そして、細かく分割された微小粒子前駆体組成物を架橋試薬に晒して、微小粒子を形成すること、を含む微小粒子の製造方法を提供する。すなわち、微小粒子前駆体組成物の架橋性試薬を、架橋マトリックスを形成するために架橋試薬と反応させる。

架橋性試薬と架橋試薬によって提供された架橋マトリックスは、架橋変性タンパク質を含む保護マトリックスと混ざり合う。混ざり合いは、架橋マトリックスがその架橋マトリックスの三次元ネットワーク内の保護マトリックスの領域を決めるようなものであってもよい。すなわち、架橋マトリックスは、微小粒子の一次構造を規定し、そして、保護マトリックスは、架橋マトリックスの基礎となる二次構造である。

適当に細かく分割された状況で微小粒子前駆体組成物を提供し、そして、架橋剤にそれを晒すのに使用され得る、当業者に知られている多くの技術がある。微小粒子前駆体組成物は、国際出願番号ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１６９５（公開番号ＷＯ２００９／０６２２５４）に記載の方法に従って微小粒子を製造するために使用されるのに特に合っている。前記文献の全内容を参照により本明細書中に援用する。この方法は、本発明に従って微小粒子を製造するのに適した方法である。

適当に細かく分割された状況で微小粒子前駆体組成物を提供する他の適切な方法としては、その中では、微小粒子前駆体組成物がシリンジポンプを通してエアーアトマイザーデバイス内に押出され、そして、架橋試薬浴にスプレーされる、エアーアトマイザーが挙げられる。静電アトマイザー（エレクトロスプレー又は電気流体力学アトマイザー（ＥＨＤＡ））もまた好適であり得る。この技術では、微小粒子前駆体組成物が、ノズル電極に供給され、そして、液滴を生じるように電化される。前記液滴は、架橋試薬中に滴下される。回転盤アトマイザー、Vortex-Bowl Disk Atomizer System及びミクロノズルアレイもまた、微小粒子前駆体組成物を適当に分割された状況で提供するのに好適であり得る。

形成された時点で、微小粒子は、活性、微小粒子サイズ及び比重に依存して、遠心分離機、除濁装置、膜濾過、及びフィルタープレスを含めた既知の技術及びデバイスを使用して分離され得る。プロバイオティクスの熱感受性に依存して、担体／溶媒／液体（通常水）の除去を容易にするためにゲルのシネレシスを引き起こすために、熱が適用されてもよい。

微小粒子は、必要に応じて、すぐに使用できる形態であっても、又は別の製品に加えられてもよい。一部の事情では、微量の試薬は、それらが使用される前に、微小粒子から洗浄される必要があることがある。例えば、アルギン酸（架橋性試薬）のゲル化を達成するためにＣａＣｌ₂が架橋試薬として使用されるとき、微小粒子は、未使用のＣａＣｌ₂を取り除くために洗浄される必要があることがある。

微小粒子は、必要に応じてロバスト性を提供するために、他の担体固形物（マルトデキストリン、糖など）の存在下又は不存在下、スプレードライ、真空乾燥、又は凍結乾燥され得る。保護マトリックス中のトレハロースとポリオール可塑剤の凍結保護特性は、凍結乾燥プロセスにおいて微小粒子のプロバイオティクスの活性を保存し得る。

ヒドロゲルを使用して形成された微小粒子は多孔性であってもよいので、そのバリア特性を改善するためにコーティングを微小粒子に適用するのに有利であることがある。本発明の微小粒子は、オーストラリア特許仮出願第２０１２９０５１６７号に記載のコーティング組成物、及び前述の仮出願に関して優先権を主張している「コーティング組成物(Coating composition)」と題された国際特許出願に記載のコーティング組成物を使用してコートされるのに特に合っている。これらの出願の内容を参照により本明細書中に援用する。このコーティング組成物は、本発明による微小粒子のための好ましいコーティング組成物である。

微小粒子は、さまざまな技術を使用してコートされ得る。好適なコーティング技術としては、これだけに限定されるものではないが、浸漬コーティング、部分浸漬コーティング、ディップ、ブラッシング、スピンコーティング、フロウコーティング、及びスプレーコーティングが挙げられる。例えば、ウェットヒドロゲル微小粒子は、コーティング組成物に部分的に浸され、均一なコーティングを確実にするために混合され、次に、包装され得る。

製品をコートするのに使用されるコーティング組成物の量は、コートされるべき微小粒子の重量の最大５０％と同等の量であり得る。いくつかの実施形態において、使用されるコーティングの量は、コートされるべき微小粒子の重量の２０〜４０％、好ましくは微小粒子の重量の約３０％と同等の量であり得る。

微小粒子は、４℃、好ましくは−２０℃にて保存され得る。いくつかの実施形態において、ホイル内にそれらを真空包装することによって微小粒子を保存するのが好まれ得る。

以下の制限されることのない実施例は、本発明の実施形態といくつかの比較例を例示している。

実施例１
ホエータンパク質分離物（ＷＰＩ）ベースの保護マトリックス前駆体組成物
ＷＰＩ混合物の調製

材料：
ホエータンパク質分離粉末−１０ｇ
水−９０ｇ
方法：
１０％のＷＰＩ溶液を、ＷＰＩ粉末と水を一緒に混合することによって調製した。その混合物を混合後に３０分間静置したので、ＷＰＩが再水和できた。静置後に、１０％のＷＰＩ溶液を３０分間９０℃にて熱処理した。得られた１０％のＷＰＩ混合物を、使用前に冷ました。

保護マトリックス前駆体組成物の調製
材料：
先に記載した１０％のＷＰＩ混合物−６０ｇ
グリセロール−４０ｇ
トレハロース粉末−３０ｇ
方法：
材料を、IKA-Works, Inc.によって提供されているIKAR T25Digital ULTRA TURRAX（登録商標）高速シングルステージ分散機を使用して、５分間高速で混合した。次いで、得られた組成物を、３０分間８５℃にて滅菌した。保護マトリックス前駆体組成物を、使用前に室温に冷ました。

実施例２
魚油エマルジョン
界面活性剤混合物の調製
材料：
レシチン−１０ｇ
脱イオン水−９０ｇ
方法：
すべてのレシチンが溶解されるまで、中速でミキサーを使用して、１：９の比でレシチンを脱イオン水中に溶解することによって、界面活性剤混合物を調製した。次いで、界面活性剤混合物を３０分間９０℃にて滅菌した。

魚油エマルジョンの調製
材料：
先に記載した界面活性剤混合物−１００ｇ
ω−３魚油−２００ｇ
水（無菌）−２００ｇ

方法：
１．最初の魚油エマルジョンを、滅菌容器内に成分を秤量することによって調製した。次いで、その混合物を、５分間中速でSilverson Heavy Duty Laboratoryミキサー／乳化装置によって均質化した。ミキサーは、使用前に無水アルコールと滅菌水で洗浄した。エマルジョンの表面に油滴は見られなかった。
２．最初の魚油エマルジョンを、エマルジョン液滴サイズを小さくするために二段式Twin Panda400（GEA Niro Soavi）ホモジナイザ（第一段階：２５０ｂａｒ、第二段階：５０ｂａｒ）に二度通して、最終的な魚油エマルジョンを製造した。均質化装置は、各使用前に殺菌及び無菌水で掃除した。

注意：魚油の酸化の発生を阻止及び遅延するために、魚油及びω−３魚油を含む最終的なエマルジョンを扱うときには、細心の注意を払う。ガスブランケットを作成する際には窒素ガスを使用して、魚油エマルジョンの調製中の酸素曝露を低減した。また、魚油エマルジョンをホイルで覆ったコンテナ内で混合して、光曝露も減少させた。

実施例３
架橋性試薬
架橋性試薬の調製
材料：
アルギン酸ナトリウム−２０ｇ
ペクチン−２０ｇ

脱イオン水−３６０ｇ
方法：
アルギン酸ナトリウム、ペクチン、及び脱イオン水を一緒に完全に混合した。次いで、それを使用する前日に、架橋性試薬を３０分間９０℃にて滅菌した。

実施例４
微小粒子前駆体組成物−ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１
微小粒子前駆体組成物−ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１の調製
材料：
実施例１の保護マトリックス前駆体組成物−１３０ｇ
ラクトバチルス・カゼイＬｃ４３１の凍結濃縮物−２５ｇ
実施例２の魚油エマルジョン−５００ｍＬ
実施例３の架橋性試薬−４００ｇ

方法：
ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１の凍結濃縮物を、室温にて滅菌容器内で解凍した。次いで、滅菌容器内で、次に列挙した無菌の調製組成物を次の順番で組み合わせることによって、微小粒子前駆体組成物を調製した：
１．実施例１の保護マトリックス前駆体組成物
２．ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１の解凍濃縮物
３．実施例２の魚油エマルジョン
４．実施例３の架橋性試薬
微小粒子前駆体組成物を、無菌スプーンを使用して手作業で一緒に混合する。

注意：魚油の酸化の発生を予防及び遅延するために、ω−３魚油を含む魚油エマルジョンと微小粒子前駆体組成物を扱うときには、細心の注意を払う。ガスブランケットを作成する際には、窒素ガスを使用して、微小粒子前駆体組成物の調製中の酸素曝露を低減した。また、微小粒子前駆体組成物を、空気（特に酸素）への曝露を減少させるために、窒素ガスでパージしたコンテナ内で、さらに、魚油の光への曝露も減少させるために、ホイルで覆って、混合した。

実施例５
微小粒子前駆体組成物−ビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２
微小粒子前駆体組成物−ビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２の調製
材料：
実施例１の保護マトリックス前駆体組成物−１３０ｇ
ビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２の凍結濃縮物−２５ｇ
実施例２の魚油エマルジョン−５００ｍＬ
実施例３の架橋性試薬−４００ｇ

方法：
ビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２の凍結濃縮物を、室温にて滅菌容器内で解凍した。次いで、滅菌容器内で、次に列挙した無菌の調製組成物を次の順番で、すべてを十分に組み合わせることによって、微小粒子前駆体組成物を調製した：
１．実施例１の保護マトリックス前駆体組成物
２．ビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２の解凍濃縮物
３．実施例２の魚油エマルジョン
４．実施例３の架橋性試薬
微小粒子前駆体組成物を、無菌スプーンを使用して手作業で一緒に混合する。

注意：魚油の酸化の発生を予防及び遅延するために、ω−３魚油を含む魚油エマルジョンと微小粒子前駆体組成物を扱うときには、細心の注意を払う。ガスブランケットを作成する際には、窒素ガスを使用して、微小粒子前駆体組成物の調製中の酸素曝露を低減した。また、微小粒子前駆体組成物を、空気（特に酸素）への曝露を減少させるために、窒素ガスでパージしたコンテナ内で、さらに、魚油の光への曝露も減少させるために、ホイルで覆って、混合した。

実施例６
ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１含有微小粒子
微小粒子の製造
材料：
実施例４の微小粒子前駆体組成物−〜１Ｌ
架橋試薬：無菌の０．１Ｍの塩化カルシウム溶液（１２１℃にてオートクレーブ処理）−〜２Ｌ

方法：
次の方法は、国際出願番号ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１６９５（公開番号ＷＯ２００９／０６２２５４）に記載の方法によるものである。
１．加圧タンクを微小粒子前駆体組成物で満たした。別の加圧タンクを架橋試薬で満たした。
２．圧縮窒素ガス供給源を、適当な接続部を介して加圧タンクに接続した。最初、各タンクの出口管は接続しなかった。
３．圧力計を、次の表１に示した所定の圧力に調整し、そして、弁は固定した。下部ノズルの液体は、架橋試薬用であり、上部ノズルの液体は、微小粒子前駆体組成物用である。

４．架橋試薬加圧タンクの液管を、反応チャンバーに接続し、そして、架橋試薬のミストを、少なくとも２分間、反応チャンバー内に充填させた。
５．２分後に、微小粒子前駆体組成物加圧タンクの圧力が、加圧タンクの液管を反応チャンバーに接続する前に最大５００ｋＰａであることを確認した。次いで、微小粒子前駆体組成物のエアゾールを作り出し、そして、架橋試薬のミストに晒した。
６．得られた微小粒子スラリーを、反応チャンバーの回収管からホイルで覆われた滅菌容器内に回収した。
７．微小粒子製造が完了した後に、圧力計を閉じて、装置を掃除した。
８．微小粒子スラリーを、無菌のワットマン濾紙（５Ｃ）を重ねた漏斗を通して濾過した。湿った微小粒子の濾液は、フイルターを通した無菌の脱イオン水で二度洗浄して、塩化カルシウム残留物を洗い落とした。

実施例７
ビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２含有微小粒子
微小粒子の製造
材料：
実施例４の微小粒子前駆体組成物−〜１Ｌ
架橋試薬：無菌の０．１Ｍの塩化カルシウム溶液（１２１℃にてオートクレーブ処理）−〜２Ｌ

方法：
次の方法は、国際出願番号ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１６９５（公開番号ＷＯ２００９／０６２２５４）に記載の方法によるものである。
１．加圧タンクを微小粒子前駆体組成物で満たした。別の加圧タンクを架橋試薬で満たした。
２．圧縮窒素ガス供給源を、適当な接続部を介して加圧タンクに接続した。最初、各タンクの出口管は接続しなかった。
３．圧力計を、次の表２に示した所定の圧力に調整し、そして、弁は固定した。下部ノズルの液体は、架橋試薬用であり、上部ノズルの液体は、微小粒子前駆体組成物用である。

４．架橋試薬加圧タンクの液管を、反応チャンバーに接続し、そして、架橋試薬のミストを、少なくとも２分間、反応チャンバー内に充填させた。
５．２分後に、微小粒子前駆体組成物加圧タンクの圧力が、加圧タンクの液管を反応チャンバーに接続する前に最大５００ｋＰａであることを確認した。次いで、微小粒子前駆体組成物のエアゾールを作り出し、そして、架橋試薬のミストに晒した。
６．得られた微小粒子スラリーを、反応チャンバーの回収管からホイルで覆われた滅菌容器内に回収した。
７．微小粒子製造が完了した後に、圧力計を閉じて、装置を掃除した。
８．微小粒子スラリーを、無菌のワットマン濾紙（５Ｃ）を重ねた漏斗を通して濾過した。湿った微小粒子の濾液は、フイルターを通した無菌の脱イオン水で二度洗浄して、塩化カルシウム残留物を洗い落とした。

実施例８
微小粒子内のビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２の生存率
ビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２の生存率の試験のために、実施例７に従って調製した微小粒子を、湿ったままであるが、乳中に加えた。乳に加えた微小粒子の量は、０．５ｇ／１００ｍＬであり、そして、乳を４℃にて保存した。プロバイオティクス添加量を、１ｍｌあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍＬ）として評価した。
ビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２の最初のレベルは、８．４６ ｌｏｇ₁₀ ＣＦＵ／ｍＬであった。７日後に、そのレベルは、８．４０ ｌｏｇ₁₀ ＣＦＵ／ｍＬに低下しており、それは、約９９％のプロバイオティクス生存率に相当する。

実施例９
魚油エマルジョン
界面活性剤混合物の調製
材料：
レシチン−１０ｇ
脱イオン水−９０ｇ

方法：
すべてのレシチンが溶解されるまで、中速でミキサーを使用して、１：９の比でレシチンを脱イオン水中に溶解することによって、界面活性剤混合物を調製した。次いで、界面活性剤混合物を３０分間９０℃にて滅菌した。

魚油エマルジョンの調製
材料：
先に記載した界面活性剤混合物−１００ｇ
ω−３魚油−１００ｇ
水（無菌）−２００ｇ

方法：
１．最初の魚油エマルジョンを、滅菌容器内に成分を秤量することによって調製した。次いで、その混合物を、５分間中速でSilverson Heavy Duty Laboratoryミキサー／乳化装置によって均質化した。ミキサーは、使用前に無水アルコールと滅菌水で洗浄した。エマルジョンの表面に油滴は見られなかった。
２．最初の魚油エマルジョンを、エマルジョン液滴サイズを小さくするために二段式Twin Panda400（GEA Niro Soavi）ホモジナイザ（第一段階：２５０ｂａｒ、第二段階：５０ｂａｒ）に二度通して、最終的な魚油エマルジョンを製造した。均質化装置は、各使用前に殺菌及び無菌水で掃除した。

注意：魚油の酸化の発生を阻止及び遅延するために、魚油及びω−３魚油を含む最終的なエマルジョンを扱うときには、細心の注意を払う。ガスブランケットを作成する際には窒素ガスを使用して、魚油エマルジョンの調製中の酸素曝露を低減した。また、魚油エマルジョンをホイルで覆ったコンテナ内で混合して、光曝露も減少させた。

実施例１０
架橋性試薬
架橋性試薬の調製
材料：
アルギン酸ナトリウム−２０ｇ
ペクチン−１０ｇ
脱イオン水−３７０ｇ
方法：
アルギン酸ナトリウム、ペクチン、及び脱イオン水を一緒に完全に混合した。次いで、それを使用する前日に、架橋性試薬を３０分間９０℃にて滅菌した。

実施例１０Ａ
架橋性試薬
架橋性試薬の調製
材料：
アルギン酸ナトリウム−２０ｇ
ペクチン−１０ｇ
脱イオン水−８７０ｇ
方法：
アルギン酸ナトリウム、ペクチン、及び脱イオン水を一緒に完全に混合した。次いで、それを使用する前日に、架橋性試薬を３０分間９０℃にて滅菌した。

実施例１１
微小粒子前駆体組成物−ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１及び魚油含有微小粒子
微小粒子前駆体組成物−ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１及び魚油含有微小粒子の調製
材料：
実施例１の保護マトリックス前駆体組成物−７５ｇ
ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１の凍結濃縮物−２５ｇ
実施例９の魚油エマルジョン−５００ｇ
実施例１０の架橋性試薬−４００ｇ

方法：
ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１の凍結濃縮物を、室温にて滅菌容器内で解凍した。次いで、滅菌容器内で、次に列挙した無菌の調製組成物を次の順番で組み合わせることによって、微小粒子前駆体組成物を調製した：
１．実施例１の保護マトリックス前駆体組成物
２．ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１の解凍濃縮物
３．実施例９の魚油エマルジョン
４．実施例１０の架橋性試薬
微小粒子前駆体組成物を、無菌スプーンを使用して手作業で一緒に混合する。

注意：魚油の酸化の発生を予防及び遅延するために、ω−３魚油を含む魚油エマルジョンと微小粒子前駆体組成物を扱うときには、細心の注意を払う。ガスブランケットを作成する際には、窒素ガスを使用して、微小粒子前駆体組成物の調製中の酸素曝露を低減した。また、微小粒子前駆体組成物を、空気（特に酸素）への曝露を減少させるために、窒素ガスでパージしたコンテナ内で、さらに、魚油の光への曝露も減少させるために、ホイルで覆って、混合した。

実施例１２
ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１及び魚油含有微小粒子
微小粒子の製造
材料：
実施例１１の微小粒子前駆体組成物−〜１ｋｇ
架橋試薬：無菌の０．１Ｍの塩化カルシウム溶液（１５分間１２１℃にてオートクレーブ処理、そして、室温に冷ました）−〜２Ｌ

方法：
次の方法は、国際出願番号ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１６９５（公開番号ＷＯ２００９／０６２２５４）に記載の方法によるものである。
１．加圧タンクを微小粒子前駆体組成物で満たした。別の加圧タンクを架橋試薬で満たした。
２．圧縮窒素ガス供給源を、適当な接続部を介して加圧タンクに接続した。最初、各タンクの出口管は接続しなかった。
３．圧力計を、次の表３に示した所定の圧力に調整し、そして、弁は固定した。下部ノズルの液体は、架橋試薬用であり、上部ノズルの液体は、微小粒子前駆体組成物用である。

４．架橋試薬加圧タンクの液管を、反応チャンバーに接続し、そして、架橋試薬のミストを、少なくとも２分間、反応チャンバー内に充填させた。
５．２分後に、微小粒子前駆体組成物加圧タンクの圧力が、加圧タンクの液管を反応チャンバーに接続する前に最大５００ｋＰａであることを確認した。次いで、微小粒子前駆体組成物のエアゾールを作り出し、そして、架橋試薬のミストに晒した。
６．得られた微小粒子スラリーを、反応チャンバーの回収管からホイルで覆われた滅菌容器内に回収した。
７．微小粒子製造が完了した後に、圧力計を閉じて、装置を掃除した。
８．微小粒子スラリーを、無菌のワットマン濾紙（５Ｃ）を重ねた漏斗を通して濾過した。湿った微小粒子の濾液は、フイルターを通した無菌の脱イオン水で二度洗浄して、塩化カルシウム残留物を洗い落とした。

実施例１３
微小粒子前駆体組成物−ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１含有微小粒子
微小粒子前駆体組成物−ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１の調製
材料：
実施例１の保護マトリックス前駆体組成物−７５ｇ
ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１の凍結濃縮物−２５ｇ
実施例１０Ａの架橋性試薬−９００ｇ

方法：
ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１の凍結濃縮物を、室温にて滅菌容器内で解凍した。次いで、滅菌容器内で、次に列挙した無菌の調製組成物を次の順番で組み合わせることによって、微小粒子前駆体組成物を調製した：
１．実施例１の保護マトリックス前駆体組成物
２．ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１の解凍濃縮物
３．実施例１０Ａの架橋性試薬
微小粒子前駆体組成物を、無菌スプーンを使用して手作業で一緒に混合する。

実施例１４
ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１含有微小粒子
微小粒子の製造
材料：
実施例１３の微小粒子前駆体組成物−〜１ｋｇ
架橋試薬：無菌の０．１Ｍの塩化カルシウム溶液（１５分間１２１℃にてオートクレーブ処理、そして、室温に冷ました）−〜２Ｌ

方法：
次の方法は、国際出願番号ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１６９５（公開番号ＷＯ２００９／０６２２５４）に記載の方法によるものである。
１．加圧タンクを微小粒子前駆体組成物で満たした。別の加圧タンクを架橋試薬で満たした。
２．圧縮窒素ガス供給源を、適当な接続部を介して加圧タンクに接続した。最初、各タンクの出口管は接続しなかった。
３．圧力計を、次の表４に示した所定の圧力に調整し、そして、弁は固定した。下部ノズルの液体は、架橋試薬用であり、上部ノズルの液体は、微小粒子前駆体組成物用である。

４．架橋試薬加圧タンクの液管を、反応チャンバーに接続し、そして、架橋試薬のミストを、少なくとも２分間、反応チャンバー内に充填させた。
５．２分後に、微小粒子前駆体組成物加圧タンクの圧力が、加圧タンクの液管を反応チャンバーに接続する前に最大５００ｋＰａであることを確認した。次いで、微小粒子前駆体組成物のエアゾールを作り出し、そして、架橋試薬のミストに晒した。
６．得られた微小粒子スラリーを、反応チャンバーの回収管からホイルで覆われた滅菌容器内に回収した。
７．微小粒子製造が完了した後に、圧力計を閉じて、装置を掃除した。
８．微小粒子スラリーを、無菌のワットマン濾紙（５Ｃ）を重ねた漏斗を通して濾過した。湿った微小粒子の濾液は、フイルターを通した無菌の脱イオン水で二度洗浄して、塩化カルシウム残留物を洗い落とした。

実施例１５
ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１及び魚油含有微小粒子を添加した液体甘味調合物
微小粒子を、実施例１２に従って調製した。次いで、これらの微小粒子を、変性ホエータンパク質分離物、キャノーラ油、グリセロール、トレハロース、及び水の混合物を含むコーティング組成物でコートした。重量ベースで１０：３の微小粒子：コーティング組成物比の微小粒子とコーティング組成物を手作業で一緒に混合することによって、微小粒子をコートした。

前記微小粒子を液体甘味調合物に追加して、重量ベースで：０．４５％のキサンタンガム、１．８％のカラギーナンゴム、２％のフルクトース、３４％のマンゴーシロップ、及び１３％の微小粒子を含み、そして、残りが水である添加調合物を製造した。微小粒子を添加した時点で、液体甘味調合物を包装して、１０ｍＬ給仕パウチを製造した。各パウチには、微小粒子の添加によって、３０億ＣＦＵのラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１及び１００ｍｇのＤＨＡ／ＥＰＡが含まれていた。
そのパウチを、初め、室温にて２週間保存し、次いで４℃にて保存した。サンプルを、６カ月の期間にわたって試験し、プロバイオティクスの生存率と、ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１と魚油の風味（すなわち、におい／味）が知覚可能であるかどうか評価した。
これらの試験の結果を、以下の表５と図１に示す。

実施例１６
ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１含有微小粒子を添加した希釈ベース飲物調合物（thin base drink formula）
微小粒子を、実施例１４に従って調製した。次いで、これらの微小粒子を、変性ホエータンパク質分離物、キャノーラ油、グリセロール、トレハロース、及び水の混合物を含むコーティング組成物でコートした。重量ベースで１０：３の微小粒子：コーティング組成物比の微小粒子とコーティング組成物を手作業で一緒に混合することによって、微小粒子をコートした。
その微小粒子を、希釈ベース飲物調合物に添加して、重量ベースで：３％のホエータンパク質分離物、DuPont（商標）Danisco（登録商標）製の２％ Litess II、National Starch製の１％ Prebiotic Hi-maize（登録商標）、４％のトレハロース、０．７５％のステビア、０．０５％のキサンタンガム、０．１％のソルビン酸カリウム、及び２％の微小粒子を含み、そして、残りが水である添加調合物を製造した。
添加済みの希釈ベース飲物調合物のサンプルを、４℃又は２５℃のいずれかで保存し、そして、６カ月の期間にわたって試験し、プロバイオティクスの生存率を評価した。これらの試験の結果を、以下の表６と図２に示す。

実施例１７
ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１及び魚油含有微小粒子を添加した希釈ベース飲物調合物
微小粒子を、実施例１２に従って調製した。次いで、これらの微小粒子を、変性ホエータンパク質分離物、キャノーラ油、グリセロール、トレハロース、及び水の混合物を含むコーティング組成物でコートした。重量ベースで１０：３の微小粒子：コーティング組成物比の微小粒子とコーティング組成物を手作業で一緒に混合することによって、微小粒子をコートした。

その微小粒子を、希釈ベース飲物調合物に添加して、重量ベースで：３％のホエータンパク質分離物、DuPont（商標）Danisco（登録商標）製の２％ Litess II、National Starch製の１％ Prebiotic Hi-maize（登録商標）、４％のトレハロース、０．７５％のステビア、０．０５％のキサンタンガム、０．１％のソルビン酸カリウム、及び２％の微小粒子を含み、そして、残りが水である添加調合物を製造した。
添加済みの希釈ベース飲物調合物のサンプルを、４℃又は２５℃のいずれかで保存し、そして、６カ月の期間にわたって試験し、プロバイオティクスの生存率を評価した。これらの試験の結果を、以下の表７と図３に示す。

実施例１８
ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１含有微小粒子を添加した食事代替タンパク質粉末（meal replacement protein powder）
微小粒子を、実施例１４に従って調製した。次いで、これらの微小粒子を、変性ホエータンパク質分離物、キャノーラ油、グリセロール、トレハロース、及び水の混合物を含むコーティング組成物でコートした。重量ベースで１０：３の微小粒子：コーティング組成物比の微小粒子とコーティング組成物を手作業で一緒に混合することによって、微小粒子をコートした。

その微小粒子を、重量で１：４９の比で市販の食事代替タンパク質粉末に加えた。
添加済み食事代替タンパク質粉末のサンプルを、密閉容器又はホイル内の真空包装のいずれかの状態で保存した。これらのサンプルを、４℃にて保存し、３カ月の期間にわたって試験して、プロバイオティクスの生存率を評価した。これらの試験の結果を、以下の表８と図４に示す。

実施例１９
ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１含有微小粒子を添加した飲料−低ｐＨにおけるカプセル化
微小粒子を、実施例１４に従って調製した。次いで、これらの微小粒子を、変性ホエータンパク質分離物、キャノーラ油、グリセロール、トレハロース、及び水の混合物を含むコーティング組成物でコートした。重量ベースで１０：３の微小粒子：コーティング組成物比の微小粒子とコーティング組成物を手作業で一緒に混合することによって、微小粒子をコートした。

パート１−ジュースベースの飲料 (juice-based beverage) への追加
微小粒子を、重量で２０％のリンゴジュース、５％のマンゴージュース、及び７５％の水を含むジュース飲物 (juice drink)に追加して、重量ベース１％の微小粒子を含む添加済みジュース飲料を製造した。添加済みジュースは、ｐＨ３．６であった。
添加済みジュース飲物のサンプルを、４℃にて保存し、そして、１０週間の期間にわたって試験して、プロバイオティクスの生存率を評価した。これらの試験の結果を、以下の表９と図５に示す。

パート２−水ベースの飲料への追加
微小粒子を、水ベースの飲料に加えて、重量ベースで：４％のトレハロース、DuPont（商標）Danisco（登録商標）製の２％ Litess II、２％のフルクトース、０．２％のキサンタンガム、０．０５％のソルビン酸カリウム、０．０２５％のアスコルビン酸、及び１％の微小粒子を含む添加済み飲料を製造した。添加済み飲料は、ｐＨ４．５であった。
添加済み飲料のサンプルを、１５℃にて保存し、そして、１０週間の期間にわたって試験して、プロバイオティクスの生存率を評価した。これらの試験の結果を、以下の表９と図５に示す。

実施例２０
高い保存温度におけるラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１含有微小粒子の安定性
微小粒子を、実施例１４に従って調製した。次いで、これらの微小粒子を、変性ホエータンパク質分離物、キャノーラ油、グリセロール、トレハロース、及び水の混合物を含むコーティング組成物でコートした。重量ベースで１０：３の微小粒子：コーティング組成物比の微小粒子とコーティング組成物を手作業で一緒に混合することによって、微小粒子をコートした。

微小粒子を、次の混合物に組み合わせた。
混合物１：微小粒子とPromOatを、重量で１：９の比で一緒に混合した。
混合物２：微小粒子、Hi-maize（登録商標）難消化性デンプン、及びイヌリンを、重量で１：５：４の比で一緒に混合した。
混合物３：微小粒子、Hi-maize（登録商標）難消化性デンプン、及びトレハロースを、重量で１：５：４の比で一緒に混合した。
比較を目的として、比較混合物を次のとおり調製した：
凍結ラクトバチルス・カゼイＬｃ４３１濃縮物を液体に解凍し、そして、５分間４０００ｒｐｍで遠心分離して、細胞塊を得た。次いで、この細胞塊を、以下の比較混合物を調製するのに使用した。

比較混合物１：ラクトバチルス・カゼイＬｃ４３１濃縮物（すなわち、非カプセル化プロバイオティクス）とPromOatを、重量で１：９の比で一緒に混合した。
比較混合物２：ラクトバチルス・カゼイＬｃ４３１濃縮物（すなわち、非カプセル化プロバイオティクス）、Hi-maize（登録商標）難消化性デンプン、及びイヌリンを、重量で１：５：４の比で一緒に混合した。
比較混合物３：ラクトバチルス・カゼイＬｃ４３１濃縮物（すなわち、非カプセル化プロバイオティクス）、Hi-maize（登録商標）難消化性デンプン、及びトレハロースを、重量で１：５：４の比で一緒に混合した。
混合物１、２及び３と比較混合物１、２及び３を、１週間３７℃にて保存し、そして、保存後のプロバイオティクスの生存率を評価するために試験した。これらの試験の結果を、以下の表１０に示す。

実施例２１
保存後のラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１の生存率−ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１及び魚油含有微小粒子
微小粒子を、実施例１２に従って調製した。次いで、これらの微小粒子を、変性ホエータンパク質分離物、キャノーラ油、グリセロール、トレハロース、及び水の混合物を含むコーティング組成物でコートした。重量ベースで１０：３の微小粒子：コーティング組成物比の微小粒子とコーティング組成物を手作業で一緒に混合することによって、微小粒子をコートした。

ラクトバチルス・カゼイＬｃ４３１の生存率に関する試験のために、湿った微小粒子サンプルを、密閉容器（すなわち、しっかりした蓋の付いた容器）内に４℃又は−２０℃のいずれかで保存した。３カ月の期間にわたり４℃にて保存したサンプルから得られたプロバイオティクスの生存率の測定値を以下の表１１に示し、さらに、４カ月の期間にわたり−２０℃にて保存したサンプルから得られたプロバイオティクスの生存率の測定値を以下の表１２に示す。

実施例２２
ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１含有微小粒子を添加した食事代替タンパク質粉末
微小粒子を、実施例１４に従って調製した。次いで、これらの微小粒子を、変性ホエータンパク質分離物、キャノーラ油、グリセロール、トレハロース、及び水の混合物を含むコーティング組成物でコートした。重量ベースで１０：３の微小粒子：コーティング組成物比の微小粒子とコーティング組成物を手作業で一緒に混合することによって、微小粒子をコートした。
その微小粒子を、重量で１：４９の比で市販の食事代替タンパク質粉末に加えた。
添加済み食事代替タンパク質粉末のサンプルを、ホイル内に真空包装し、４℃又は２５℃のいずれかで保存し、そして、１２週間の期間にわたって試験して、プロバイオティクスの生存率を評価した。これらの試験の結果を、以下の表１３に示す。

実施例２３
ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１含有微小粒子を添加した小麦粉ベースの粉末
微小粒子を、実施例１４に従って調製した。次いで、これらの微小粒子を、変性ホエータンパク質分離物、キャノーラ油、グリセロール、トレハロース、及び水の混合物を含むコーティング組成物でコートした。重量ベースで１０：３の微小粒子：コーティング組成物比の微小粒子とコーティング組成物を手作業で一緒に混合することによって、微小粒子をコートした。

その微小粒子を、重量で１：５：４の微小粒子：米粉：トレハロース比で、コメ粉及びトレハロースと混合して、添加済み小麦粉ベースの粉末を製造した。
添加済み小麦粉ベースの粉末のサンプルを、密閉容器（すなわち、しっかりとした蓋の付いた容器）内で３７℃にて保存し、そして、２週間の期間にわたって試験して、プロバイオティクスの生存率を評価した。これらの試験の結果を、以下の表１４に示す。

比較例１
比較微小粒子中のビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２の生存率
ビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２とトレハロースを含む微小粒子を、実施例７に従って調製した。しかしながら、この比較例のための微小粒子を調製するのに使用した微小粒子前駆体組成物は、４００ｇの組成物に対して、以下の組成物：２００ｇのビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２の解凍濃縮物、５％のトレハロース、１％のレシチン、２％のアルギン酸ナトリウム、及び０．２％のＴＷＥＥＮ８０を有し、該組成物の残りの部分は水である。

これらの微小粒子を、凍結乾燥し、次いで、ビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２生存率の試験のために、乳中に加えた。乳に加えた微小粒子の量は、３０ｍｇ／３００ｍＬであり、そして、該乳を４℃にて保存した。プロバイオティクス添加量を、１ｍｌあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍＬ）として評価した。
ビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２の最初のレベルは７．３５ｌｏｇ₁₀ ＣＦＵ／ｍＬであった。７日後に、レベルは、６．９６ｌｏｇ₁₀ ＣＦＵ／ｍＬに低下したが、それは、約９４．７％のプロバイオティクスの生存率に相当する。

比較例２
比較微小粒子中のビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２の生存率
ビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２とトレハロースを含む微小粒子を、実施例７に従って調製した。しかしながら、この比較例のための微小粒子を調製するのに使用した微小粒子前駆体組成物は、４００ｇの組成物に対して、以下の組成物：２００ｇのビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２の解凍濃縮物、５％のトレハロース、１％のレシチン、２％のアルギン酸ナトリウム、及び０．２％のＴＷＥＥＮ８０を有し、該組成物の残りの部分は水である。

次いで、湿った微小粒子を、重量ベースで以下の比：（湿った微小粒子：トレハロース：ＷＰＩ粉末）８０：２０：２０、に従って、トレハロース及びＷＰ粉末と混ぜ合わせた。次いで、微小粒子を、ビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２生存率試験の前に、２４時間４０℃にて真空乾燥させた。プロバイオティクス添加量を、１グラムあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｇ）として評価する。
真空乾燥後のビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２の最初のレベルは、１０．４６ｌｏｇ₁₀ ＣＦＵ／ｇであった。４℃の保存の５日間後に、そのレベルは、１０．３６ｌｏｇ₁₀ ＣＦＵ／ｇに低下したが、これは、約９９％のプロバイオティクスの生存率に相当する。

比較例３
比較微小粒子中のビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２の生存率
ビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２とトレハロースを含む微小粒子を、実施例７に従って調製した。しかしながら、この比較例のための微小粒子を調製するのに使用した微小粒子前駆体組成物は、４００ｇの組成物に対して、以下の組成物：２００ｇのビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２の解凍濃縮物、５％のトレハロース、１％のレシチン、２％のアルギン酸ナトリウム、及び０．２％のＴＷＥＥＮ８０を有し、該組成物の残りの部分は水である。

次いで、湿った微小粒子を、重量ベースで以下の比：（湿った微小粒子：トレハロース：Hi-maize（登録商標）難消化性デンプン）８０：２０：２０、に従って、トレハロース及びHi-maize（登録商標）難消化性デンプンと混ぜ合わせた。次いで、微小粒子を、ビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２生存率試験の前に、２４時間４０℃にて真空乾燥させた。プロバイオティクス添加量を、１グラムあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｇ）として評価する。
真空乾燥後のビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２の最初のレベルは、９．７４ｌｏｇ₁₀ ＣＦＵ／ｇであった。４℃の保存の５日間後に、そのレベルは、８．０９ｌｏｇ₁₀ ＣＦＵ／ｇに低下したが、これは、８３％のプロバイオティクス生存率に相当する。

比較例４
比較微小粒子中のビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２の生存率
ビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２とトレハロースを含む微小粒子を、実施例７に従って調製した。しかしながら、この比較例のための微小粒子を調製するのに使用した微小粒子前駆体組成物は、４００ｇの組成物に対して、以下の組成物：２００ｇのビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２の解凍濃縮物、５％のトレハロース、１％のレシチン、２％のアルギン酸ナトリウム、及び０．２％のＴＷＥＥＮ８０を有し、該組成物の残りの部分は水である。

次いで、湿った微小粒子を、重量ベースで以下の比：（湿った微小粒子：マルトデキストリン：Hi-maize（登録商標）難消化性デンプン）８０：２０：２０、に従って、マルトデキストリン及びHi-maize（登録商標）難消化性デンプンと混ぜ合わせた。次いで、微小粒子を、ビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２生存率試験の前に、２４時間４０℃にて真空乾燥させた。プロバイオティクス添加量を、１グラムあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｇ）として評価する。
真空乾燥後のビフィドバクテリウム・ラクティスＢＢ１２の最初のレベルは、９．９ｌｏｇ₁₀ ＣＦＵ／ｇであった。４℃の保存の５日間後に、そのレベルは、７．６０ｌｏｇ₁₀ ＣＦＵ／ｇに低下したが、これは、９０％のプロバイオティクス生存率に相当する。

比較例５
比較微小粒子中のラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１の生存率
ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１を含む微小粒子を、実施例６に従って調製した。しかしながら、この比較例のための微小粒子を調製するのに使用した微小粒子前駆体組成物は、４００ｇの組成物に対して、以下の組成物：２００ｇのラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１の解凍濃縮物、２％のアルギン酸ナトリウム、及び０．２％のＴＷＥＥＮ８０を有し、該組成物の残りの部分は水である。
これらの湿った微小粒子を、ラクトバチルス・カゼイＬｃ４３１の生存率試験のために４℃にて保存した。ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１の最初のレベルは、１２．６２ｌｏｇ₁₀ ＣＦＵ／ｇであった。４℃にて１３日間の保存後に、そのレベルは、５．４２ｌｏｇ₁₀ ＣＦＵ／ｇ〜７．２ｌｏｇ₁₀ ＣＦＵ／ｇに低下した。これは、約５７％のプロバイオティクス生存率に相当する。

比較例６
比較微小粒子中のラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１の生存率
ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１及びトレハロースを含む微小粒子を、実施例６に従って調製した。しかしながら、この比較例のための微小粒子を調製するのに使用した微小粒子前駆体組成物は、４００ｇの組成物に対して、以下の組成物：２００ｇのラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１の解凍濃縮物、２％のアルギン酸ナトリウム、５％のトレハロース、及び０．２％のＴＷＥＥＮ８０を有し、該組成物の残りの部分は水である。

これらの湿った微小粒子を、ラクトバチルス・カゼイＬｃ４３１の生存率試験のために４℃にて保存した。ラクトバシルス・カゼイＬｃ４３１の最初のレベルは、９．４４ｌｏｇ₁₀ ＣＦＵ／ｇであった。４℃にて１カ月の保存後に、そのレベルは、２．７４ｌｏｇ₁₀ ＣＦＵ／ｇ〜６．７０ｌｏｇ₁₀ ＣＦＵ／ｇに低下した。これは、約７０％のプロバイオティクス生存率に相当する。
比較例５のそれらと比較したとき、比較例６のプロバイオティクス生存率の割合は、プロバイオティクスの生存率に対するトレハロースの効果を示している。

本願明細書及び以下の請求項を通じて、別段の内容が求められない限り、「comprise」という語、及び「comprises」や「comprising」などの変化形は、整数値若しくはステップの包含、又は整数値群若しくはステップ群の包含を意図しているが、その他の整数値若しくはステップ、又は整数値群若しくはステップ群の除外を含意していないことは理解される。

任意の先行公開（若しくはそれに由来する情報）、又は既知の任意の事項に対する本願明細書における参照は、その先行公開（又はそれに由来する情報）又は既知の事項がこの明細書が関係する試みの分野における共通の一般知識の一部を形成する任意の形態の自認、許可又は暗示として受け取られず、且つ、そう受け取られるべきではない。

本発明の範囲から逸脱することなしに、多くの修飾が当業者に明らかになる。

Claims (16)

1. プロバイオティクス、架橋性試薬、変性タンパク質、ポリオール可塑剤、トレハロース及び担体の混合物を含む、微小粒子前駆体組成物。
2. 前記変性タンパク質が、変性ホエータンパク質分離物を含む、請求項１に記載の微小粒子前駆体組成物。
3. 前記変性タンパク質が、変性エンドウマメタンパク質を含む、請求項１又は２に記載の微小粒子前駆体組成物。
4. 前記ポリオール可塑剤が、グリセロールである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の微小粒子前駆体組成物。
5. 前記混合物が、疎水性活性物質を含むエマルジョンをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の微小粒子前駆体組成物。
6. 変性タンパク質、ポリオール可塑剤、トレハロース及び担体の混合物を含む、保護マトリックス前駆体組成物。
7. 前記変性タンパク質が、変性ホエータンパク質分離物を含む、請求項６に記載の保護マトリックス前駆体組成物。
8. 前記変性タンパク質が、変性エンドウマメタンパク質を含む、請求項６又は７に記載の保護マトリックス前駆体組成物。
9. 前記ポリオール可塑剤が、グリセロールである、請求項６〜８のいずれか１項に記載の保護マトリックス前駆体組成物。
10. 変性タンパク質、ポリオール可塑剤、トレハロース及び担体を混合することを含む、保護マトリックス前駆体組成物の製造方法。
11. プロバイオティクス、請求項６〜９のいずれか１項に記載の保護マトリックス前駆体組成物及び架橋性試薬を混合することを含む、微小粒子前駆体組成物の製造方法。
12. プロバイオティクスを保護マトリックス前駆体組成物と混合して、プロバイオティクス含有マトリックス前駆体を形成し；
    疎水性活性物質を含むエマルジョンを前記プロバイオティクス含有マトリックス前駆体と混合して、プロバイオティクス含有エマルジョンを形成し；そして、
    前記プロバイオティクス含有エマルジョンを架橋性試薬と混合すること、
    を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 細かく分割された状態の請求項１〜５のいずれか１項に記載の微小粒子前駆体組成物を提供し；そして、
    前記細かく分割された微小粒子前駆体組成物を、前記微小粒子前駆体組成物中の架橋性試薬と反応する架橋試薬に曝して、微小粒子を形成すること、
    を含む、微小粒子の製造方法。
14. 架橋試薬を架橋性試薬と反応させることによって形成される架橋マトリックスを含む、微小粒子であって、前記架橋マトリックスは、請求項６〜９のいずれか１項に記載の保護マトリックス前駆体組成物から形成される保護マトリックスと混ざり合っている、微小粒子。
15. 請求項６〜９のいずれか１項に記載の保護マトリックス前駆体組成物から形成された保護マトリックスを含む、微小粒子。
16. 請求項１４又は１５に記載の微小粒子を含む、製品。