CN101683604A - 一种乳酸菌微胶囊的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种乳酸菌微胶囊的制备方法，它涉及一种微胶囊的制备方法。它解决了目前乳酸菌微胶囊制备方法难以获得干燥乳酸菌微胶囊粉末，乳酸菌分散不均匀、制备过程中乳酸菌死亡率高，使用的交联剂具有一定毒性，以及乳酸菌微胶囊的得率低的缺陷。制备方法：一、芯材和壁材混合；二、制备初级乳状液；三、制备微胶囊油液；四、制备多重乳状液；五、凝聚、固化、真空冷冻干燥。本发明方法采用真空冷冻干燥手段可以得到干燥的乳酸菌微胶囊粉末，避免了乳酸菌分散不均匀、死亡率高的缺陷；本发明方法中不使用交联剂，对乳酸菌没有毒害作用；而且外水相与内水相不易混溶；本发明方法制备的乳酸菌微胶囊的得率高达84.6％，冻干存活率达60.107％以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种微胶囊的制备方法。
背景技术
目前主要采用界面聚合法、相分离法、挤压法、双重乳状液法和喷雾干燥法制备乳酸菌微胶囊。
相分离法又称凝聚法，是将含有乳酸菌的芯材料乳化或分散在溶有壁材的连续相中，然后将壁材溶解度降低并从连续相中分离出来，形成黏稠的液相(不是沉淀)，包裹在芯材料上形成乳酸菌微胶囊。根据包囊材料在水中溶解度的不同，可将相分离法分为水相相分离法和油相相分离法。但是，现有的相分离法存在操作复杂，难以大规模工业化生产，工艺难以控制，且无法获得干燥乳酸菌微胶囊粉末产品的问题。
挤压法是最传统、最普通的方法，以海藻酸钠作为材料的固定化应用最多。周剑忠等将乳酸菌与浓度为0.6％的海藻酸钠溶液混合后滴到浓度为1％的CaCl2溶液中固化；由于乳酸菌菌体分散于凝胶中，打断了凝胶网络的均匀结构，小分子物质容易通过壁材，因此不能很好地阻隔胃液，不具有耐胃酸性。刘丽英等人以海藻酸钠(浓度为2％或3％)为壁材、CaCl2(浓度为2％或3％)为固化液制备微胶囊；同时部分学者将乳酸菌菌液与海藻酸钠在固化液中固化，并在制得的胶粒中加入聚赖氨酸或壳聚糖与海藻酸钠络合成膜，都可以有效的提高乳酸菌微胶囊的耐胃酸性，但都难以获得干燥乳酸菌微胶囊粉末产品。
喷雾干燥法用单一工序将溶液、乳液、悬浮液或浆状液加工成粉状干燥制品，微胶囊化材料主要有液体石蜡、醋酸纤维素、柠檬油和羟基化糊精，其中柠檬油和羟基化糊精最常见。虽然采用喷雾干燥法可以获得干燥的乳酸菌微胶囊粉末，但是存在乳酸菌分散不均匀及制备过程中乳酸菌死亡率高的问题。
界面聚合法是通过适宜的乳化剂形成油包水(或水包油)乳液，使水溶性(或油溶性)反应物的水溶液(或油溶液)分散进入油相(或水相)，在油包水(或水包油)乳液中加入非水溶性(或水溶性)反应物以引发聚合，在液滴表面形成聚合物膜，这样含水微胶囊(或含油微胶囊)就会从水相(或油相)中分离。藤原正弘等人对此进行了改进，将乳酸菌液与添加了聚甘油脂肪酸酯的氢化油脂混合形成W/O型乳状液，再将其分散于含增稠稳定剂黄原胶的乳酸钙溶液中，最终形成W/O/W型双重乳状液，然后将此乳状液逐滴加到低甲氧基果胶之类的成模液中，制成内部流动的乳酸菌微胶囊产品，该方法被称为双重乳状液法。由于目前的界面聚合法和双重乳状液法都要使用具有一定毒性的交联剂，会对乳酸菌的活性造成损害，所以很难得到广泛的认可；而且双重乳状液形成过程中外水相与内水相极易混溶，因此乳酸菌微胶囊的得率低。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前乳酸菌微胶囊制备方法难以获得干燥乳酸菌微胶囊粉末，乳酸菌分散不均匀、制备过程中乳酸菌死亡率高，使用的交联剂具有一定毒性，以及乳酸菌微胶囊的得率低的缺陷，而提供的一种乳酸菌微胶囊的制备方法。
本发明乳酸菌微胶囊按以下步骤进行制备：一、将微胶囊芯材和微胶囊壁材按照1∶2的体积比混合均匀，得到混合液，其中微胶囊芯材为加入保护剂和益生元的乳酸菌菌液，微胶囊壁材为添加了乳化剂的海藻酸钠溶液，微胶囊壁材中海藻酸钠的质量浓度为1.8％～2.2％，微胶囊壁材中乳化剂为Tween-20、乳化剂的质量浓度为0.09％～0.11％；二、将步骤一得到的混合液滴加到含有硬脂酸和乳化剂Span-80的色拉油中，并在37℃、转速为1080～1140r/min的条件下乳化14～16min，形成初级乳状液，其中混合液的滴加量与色拉油的体积比为1∶2，色拉油中硬脂酸的质量浓度为0.9％～1.1％，色拉油中乳化剂Span-80的质量浓度为1.9％～2.1％；三、在搅拌转速为180～220r/min条件下将质量浓度为4.5％～5.5％的氯化钙溶液加入初级乳状液中，初级乳状液与氯化钙溶液的体积比为1∶2，再继续搅拌15min，然后固化1h、过滤、滤液静置，取上层微胶囊油液；四、微胶囊油液与含有明胶的海藻酸钠溶液按1∶2的体积比、在转速为100r/min的条件下混合乳化8.5～9.5min，形成多重乳状液，其中海藻酸钠溶液中海藻酸钠的质量浓度为2％，海藻酸钠溶液中明胶的质量浓度为2.4％～2.6％；五、在搅拌转速为200r/min条件下将质量浓度为5％的氯化钙溶液加入多重乳状液中，多重乳状液与氯化钙溶液的体积比为1∶2，再继续搅拌凝聚14～16min，然后固化1h，再用生理盐水洗涤3～4次，之后进行真空冷冻干燥，即得到乳酸菌微胶囊；其中步骤一中保护剂由葡萄糖、蛋白胨和抗坏血酸组成，微胶囊芯材中葡萄糖的质量浓度为5.8％～6.2％，微胶囊芯材中蛋白胨的质量浓度为6.8％～7.2％、微胶囊芯材中抗坏血酸的质量浓度为7.8％～8.2％；益生元为低聚果糖或大豆低聚糖。
本发明方法采用真空冷冻干燥手段可以得到干燥的乳酸菌微胶囊粉末，避免了乳酸菌分散不均匀、死亡率高的缺陷；本发明方法中不使用交联剂，对乳酸菌没有毒害作用；而且外水相与内水相不易混溶；本发明方法乳酸菌微胶囊的得率高达84.6％。
本发明方法制备的乳酸菌微胶囊菌体的冻干存活率达60.107％以上。
本发明方法制备的乳酸菌微胶囊粒径已经达到微米级的水平，粒径集中分布在42.00～342.00μm之间(用激光粒度分布仪对本发明制备的乳酸菌微胶囊的粒度进行测定，平均粒径计算公式：Dn＝∑n1×d1/∑n1式中：Dn为平均粒径，n1为微胶囊数目，d1为单个微胶囊的直径)，外形为椭圆形，表面虽凸凹不平，但不影响乳酸菌微胶囊的各种特性。
海藻酸钠是由海带中提取的天然多糖碳水化合物，其中的钠离子很容易与二价阳离子如Ca2+发生置换反应，形成不溶于水的海藻酸钙，从而将微胶囊芯材包裹于其中；而且海藻酸钠被视为天然纤维素，可减缓脂肪糖和胆盐的吸收，具有降低血清胆固醇、血中甘油三酯和血糖的作用，可预防高血压、糖尿病、肥胖症等现代病，海藻酸钠在肠道中能抑制有害金属如锶、镉、铅等在体内的积累。明胶是一种从动物结缔或表皮组织中胶原部分水解出来的蛋白质，是一种无脂肪、无胆固醇，蕴含人体所需18种氨基酸的食品和药物原料。因为本发明所选用的微胶囊壁材都为天然无毒、无害的物质，所以本发明制备乳酸菌微胶囊食用安全性高。
附图说明
图1是具体实施方式七制备的乳酸菌微胶囊表面结构图，图2是微胶囊壁材中海藻酸钠的质量浓度为1％时初级乳状液显微镜观察图，图3是微胶囊壁材中海藻酸钠的质量浓度为2％时初级乳状液显微镜观察图，图4是微胶囊壁材中海藻酸钠的质量浓度为3％时初级乳状液显微镜观察图，图5是色拉油中硬脂酸的质量浓度为0.5％时初级乳状液显微镜观察图，图6是色拉油中硬脂酸的质量浓度为1.0％时初级乳状液显微镜观察图，图7是色拉油中硬脂酸的质量浓度为1.5％时初级乳状液显微镜观察图，图8是色拉油中Span-80的质量浓度为1.5％时初级乳状液显微镜观察图，图9是色拉油中Span-80的质量浓度为2％时初级乳状液显微镜观察图，图10是色拉油中Span-80的质量浓度为2.5％时初级乳状液显微镜观察图，图11是微胶囊壁材中乳化剂Tween-20的质量浓度为0.05％时初级乳状液显微镜观察图，图12是微胶囊壁材中乳化剂Tween-20的质量浓度为0.1％时初级乳状液显微镜观察图，图13是微胶囊壁材中乳化剂Tween-20的质量浓度为0.15％时初级乳状液显微镜观察图，图14是微胶囊芯材与微胶囊壁材体积比为1∶1时初级乳状液显微镜观察图，图15是微胶囊芯材与微胶囊壁材体积比为1∶2时初级乳状液显微镜观察图，图16是微胶囊芯材与微胶囊壁材体积比为1∶3时初级乳状液显微镜观察图，图17是步骤二中乳化时间为10min时初级乳状液显微镜观察图，图18是步骤二中乳化时间为15min时初级乳状液显微镜观察图，图19是步骤二中乳化时间为20min时初级乳状液显微镜观察图，图20是步骤二中乳化温度为36℃时初级乳状液显微镜观察图，图21是步骤二中乳化温度为37℃时初级乳状液显微镜观察图，图22是步骤二中乳化温度为38℃时初级乳状液显微镜观察图，图23是步骤二中乳化搅拌转速为900r/min时初级乳状液显微镜观察图，图24是步骤二中乳化搅拌转速为1100r/min时初级乳状液显微镜观察图，图25是步骤二中乳化搅拌转速为1300r/min时初级乳状液显微镜观察图，图26是步骤三中氯化钙溶液的质量浓度为3％时微胶囊油液显微镜观察图，图27是步骤三中氯化钙溶液的质量浓度为5％时微胶囊油液显微镜观察图，图28是步骤三中氯化钙溶液的质量浓度为7％时微胶囊油液显微镜观察图，图29是步骤三中初级乳状液与氯化钙溶液的体积比为1∶1时微胶囊油液显微镜观察图，图30是步骤三中初级乳状液与氯化钙溶液的体积比为1∶2时微胶囊油液显微镜观察图，图31是步骤三中初级乳状液与氯化钙溶液的体积比为1∶3时微胶囊油液显微镜观察图，图32是步骤三中搅拌速度为0r/min时微胶囊油液显微镜观察图，图33是步骤三中搅拌速度为100r/min时微胶囊油液显微镜观察图，图34是步骤三中搅拌速度为200r/min时微胶囊油液显微镜观察图，图35是步骤三中搅拌速度为300r/min时微胶囊油液显微镜观察图，图36是步骤三中继续搅拌时间为5min时微胶囊油液显微镜观察图，图37是步骤三中继续搅拌时间为10min时微胶囊油液显微镜观察图，图38是步骤三中继续搅拌时间为15min时微胶囊油液显微镜观察图，图39是步骤三中继续搅拌时间为20min时微胶囊油液显微镜观察图，图40是步骤三中海藻酸钠溶液中明胶的质量浓度为1.5％时微胶囊油液显微镜观察图，图41是步骤三中海藻酸钠溶液中明胶的质量浓度为2.5％时微胶囊油液显微镜观察图，图42是步骤三中海藻酸钠溶液中明胶的质量浓度为3.5％时微胶囊油液显微镜观察图，图43是步骤四中混合乳化时间为5min时多重乳状液显微镜观察图，图44是步骤四中混合乳化时间为7min时多重乳状液显微镜观察图，图45是步骤四中混合乳化时间为9min时多重乳状液显微镜观察图，图46是步骤四中混合乳化时间为11min时多重乳状液显微镜观察图，图47是具体实施方式八中Lb.paracasei HD 1.7内部结构透射电镜观察图，图48是具体实施方式八中制备的乳酸菌微胶囊内部结构透射电镜观察图，图49是具体实施方式七中制备的乳酸菌微胶囊的红外光谱图，图50是具体实施方式七中制备的乳酸菌微胶囊的微胶囊芯材与微胶囊壁材混合物的红外光谱图，图51是具体实施方式七中制备的乳酸菌微胶囊的微胶囊芯材的红外光谱图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式乳酸菌微胶囊按以下步骤进行制备：一、将微胶囊芯材和微胶囊壁材按照1∶2的体积比混合均匀，得到混合液，其中微胶囊芯材为加入保护剂和益生元的乳酸菌菌液，微胶囊壁材为添加了乳化剂的海藻酸钠溶液，微胶囊壁材中海藻酸钠的质量浓度为1.8％～2.2％，微胶囊壁材中乳化剂为Tween-20、乳化剂的质量浓度为0.09％～0.11％；二、将步骤一得到的混合液滴加到含有硬脂酸和乳化剂Span-80的色拉油中，并在37℃、转速为1080～1140r/min的条件下乳化14～16min，形成初级乳状液，其中混合液的滴加量与色拉油的体积比为1∶2，色拉油中硬脂酸的质量浓度为0.9％～1.1％，色拉油中乳化剂Span-80的质量浓度为1.9％～2.1％；三、在搅拌转速为180～220r/min条件下将质量浓度为4.5％～5.5％的氯化钙溶液加入初级乳状液中，初级乳状液与氯化钙溶液的体积比为1∶2，再继续搅拌15min，然后固化1h、过滤、滤液静置，取上层微胶囊油液；四、微胶囊油液与含有明胶的海藻酸钠溶液按1∶2的体积比、在转速为100r/min的条件下混合乳化8.5～9.5min，形成多重乳状液，其中海藻酸钠溶液中海藻酸钠的质量浓度为2％，海藻酸钠溶液中明胶的质量浓度为2.4％～2.6％；五、在搅拌转速为200r/min条件下将质量浓度为5％的氯化钙溶液加入多重乳状液中，多重乳状液与氯化钙溶液的体积比为1∶2，再继续搅拌凝聚14～16min，然后固化1h，再用生理盐水洗涤3～4次，之后进行真空冷冻干燥，即得到乳酸菌微胶囊；其中步骤一中保护剂由葡萄糖、蛋白胨和抗坏血酸组成，微胶囊芯材中葡萄糖的质量浓度为5.8％～6.2％，微胶囊芯材中蛋白胨的质量浓度为6.8％～7.2％、微胶囊芯材中抗坏血酸的质量浓度为7.8％～8.2％；益生元为低聚果糖或大豆低聚糖。
本实施方式采用真空冷冻干燥技术可以得到干燥的乳酸菌微胶囊粉末，而且具有以下优点：
(1)真空冷冻干燥可以避免干燥过程中酶类和微生物的污染，保持乳酸菌微胶囊原有的物理及化学性质，保留了较高的生物活性。
(2)乳酸菌微胶囊真空冷冻干燥前后体积基本无变化，保持了原有的乳酸菌微胶囊结构。
(3)真空冷冻干燥后的乳酸菌微胶囊由于微小的冰晶体的升华而呈现多孔结构，即海绵状，提高了复水性能。
(4)由于真空冷冻干燥减少了与氧气的接触机会，保护了乳酸菌微胶囊中易被氧化的物质，增强了乳酸菌微胶囊的稳定性。
(5)干燥更为彻底，乳酸菌微胶囊中水分含量大幅降低。
在真空冷冻干燥过程中微生物细胞内外形成的冰晶会对乳酸菌造成“机械损伤”，而这种“机械损伤”会增加细胞膜透性、使蛋白质变性失活，甚至导致细胞代谢紊乱。本实施方式在微胶囊芯材中加入保护剂可以抑制真空冷冻干燥时胞内胞外冰晶的生成、减缓冰晶生长，减少真空冷冻干燥时冰晶对细胞的损伤和减少活菌的损失，还可以使真空冷冻干燥过程中乳酸菌细胞的水份不至于急剧下降，而使细胞蛋白质结构免遭破坏，保证了蛋白质的稳定性。
因保护剂的加入，不但会缩短真空冷冻干燥的时间，而且还能使乳酸菌微胶囊中的活性物质在真空冷冻干燥过程和保存期间维持较高的活性。由于同一种保护剂对不同的微生物所起到的保护效果是不同的，不同保护剂对同一种微生物所起到的保护效果也是不同的；所以，针对所要保护的微生物不同而重新设计保护剂。单独使用葡萄糖作为保护剂，乳酸菌的最高冻干存活率仅为20.02％；单独使用蛋白胨作为保护剂，乳酸菌的最高冻干存活率仅为5.76％；单独使用抗坏血酸作为保护剂，乳酸菌的最高冻干存活率仅为23.87％；说明单一保护剂的保护效果不理想，乳酸菌的冻干存活率太低，即使将其保护效果叠加之和也仅为49.65％，而本实施方式乳酸菌微胶囊菌体的冻干存活率经检测达60.107％以上，说明本实施方式保护剂中的三种组分间相互协同和促进，提高了对乳酸菌的冻干保护作用。
益生元不易消化但对机体有益，可选择性刺激结肠内有益菌的生长或增强其活性，而不被有害菌所利用，能够促进乳酸菌在肠道内的生长。本实施方式中选用能够被乳酸菌水解、利用的益生元，能促进乳酸菌增殖和调节肠道微生物区系，调节矿物质吸收，调节脂代谢并减少疾病发生率。
本实施方式方法不损伤乳酸菌，并可以有效提高乳酸菌在人体肠道中的活性。
初级乳状液离心保留率：取一定体积的初级乳状液将其装入离心管中，在转速为3000r/min的条件下离心15min，离心后中间乳层的体积与初级乳状液总体积的比值，即为初级乳状液的离心保留率。本实施方式方法所制备的初级乳状液离心保留率为54％～55％。
具体实施方式二：本实施方式乳酸菌微胶囊按以下步骤进行制备：一、将微胶囊芯材和微胶囊壁材按照1∶2的体积比混合均匀，得到混合液，其中微胶囊芯材为加入保护剂和益生元的乳酸菌菌液，微胶囊壁材为添加了乳化剂的海藻酸钠溶液，微胶囊壁材中海藻酸钠的质量浓度为2％，微胶囊壁材中乳化剂为Tween-20、乳化剂的质量浓度为0.1％；二、将步骤一得到的混合液滴加到含有硬脂酸和乳化剂Span-80的色拉油中，并在37℃、转速为1100r/min的条件下乳化15min，形成初级乳状液，其中混合液的滴加量与色拉油的体积比为1∶2，色拉油中硬脂酸的质量浓度为1％，色拉油中乳化剂Span-80的质量浓度为2％；三、在搅拌转速为200r/min条件下将质量浓度为5％的氯化钙溶液加入初级乳状液中，初级乳状液与氯化钙溶液的体积比为1∶2，再继续搅拌15min，然后固化1h、过滤、滤液静置，取上层微胶囊油液；四、微胶囊油液与含有明胶的海藻酸钠溶液按1∶2的体积比、在转速为100r/min的条件下混合乳化9min，形成多重乳状液，其中海藻酸钠溶液中海藻酸钠的质量浓度为2％，海藻酸钠溶液中明胶的质量浓度为2.5％；五、在搅拌转速为200r/min条件下将质量浓度为5％的氯化钙溶液加入多重乳状液中，多重乳状液与氯化钙溶液的体积比为1∶2，再继续搅拌凝聚15min，然后固化1h，再用生理盐水洗涤3～4次，之后进行真空冷冻干燥，即得到乳酸菌微胶囊；其中步骤一中保护剂由葡萄糖、蛋白胨和抗坏血酸组成，微胶囊芯材中葡萄糖的质量浓度为6％，微胶囊芯材中蛋白胨的质量浓度为7％、微胶囊芯材中抗坏血酸的质量浓度为8％；益生元为低聚果糖或大豆低聚糖。
初级乳状液离心保留率：取一定体积的初级乳状液将其装入离心管中，在转速为3000r/min的条件下离心15min，离心后中间乳层的体积与初级乳状液总体积的比值，即为初级乳状液的离心保留率。本实施方式方法所制备的初级乳状液离心保留率为54.2％。
对比试验：(除实验参数外其它步骤及参数与本实施方式相同)
对比试验1、微胶囊壁材中海藻酸钠的质量浓度：
步骤一中若微胶囊壁材中海藻酸钠的质量浓度为1％(如图2所示)，乳状液粒径分布不均，个别乳滴较大，显微镜下可以看到已形成W/O乳状液，但部分乳酸菌散落在油相之外，只有部分菌进入水相(原因：当低浓度的海藻酸钠溶液经高压蒸汽灭菌后，粘度会下降，在乳化过程中，收缩应力不够，在形成乳滴之前搅拌的剪切力很快将其拉长，不容易形成球型度较好的乳滴)。步骤一中若微胶囊壁材中海藻酸钠的质量浓度为2％(如图3所示)，形成了较稳定的W/O乳状液，乳滴大小分布均匀，显微镜下可以看到大部分乳酸菌已进入水相。步骤一中若微胶囊壁材中海藻酸钠的质量浓度为3％(如图4所示)，形成乳滴的大小较2％的海藻酸钠溶液所形成的乳滴尺寸有所增大，且乳滴彼此之间存在粘连现象(原因：当海藻酸钠溶液的浓度升高时，分子之间彼此相互接触，因而链段缠结，溶液的粘度也随之增大，这样在搅拌过程中产生了阻力，虽然在相同的搅拌速度下进行，但由于浓度增大，使形成的乳滴直径变大，会出现上述的粘连现象)。
对比试验2、步骤二色拉油中硬脂酸的质量浓度：
步骤二中若色拉油中硬脂酸的质量浓度为0.5％(如图5所示)，所形成的乳状液粒径分布不均，而且个别乳滴相对较大，并且这些较大的乳滴在显微镜下观察时相邻两乳滴会融合成大乳滴，所形成的初乳不稳定。步骤二中若色拉油中硬脂酸的质量浓度为1.0％(如图6所示)，形成的乳状液粒径分布均匀，显微镜下可看到已形成稳定的W/O乳状液，可见乳酸菌进入水相(原因：硬脂酸的熔点较高，水浴加热后硬脂酸溶解于色拉油中，待降温后，由于添加硬脂酸的色拉油粘度提高，减少了分子之间彼此碰撞的机会，增强了乳状液的稳定性)。步骤二中若色拉油中硬脂酸的质量浓度为1.5％(如图7所示)，随着浓度的增大油液的熔点增高，在常温下硬脂酸析出，显微镜下可以看到硬脂酸结块，同时由于添加硬脂酸的色拉油在降温后粘度提高，在搅拌过程中可能会存在一定的阻力，乳滴的尺寸又有变大的趋势。
对比试验3、步骤二色拉油中Span-80的质量浓度：
步骤二中若色拉油中Span-80的质量浓度为1.5％(如图8所示)，形成的乳状液粒径分布不均，显微镜下可见形成了O/W乳状液，所制备的乳状液在室温下较短时间内会分层，制备的乳状液并不稳定(原因：在乳化过程中，海藻酸钠溶液中添加的Tween-20与色拉油中添加的Span-80形成了复合乳化剂体系，粒子界面上的吸附量较少，虽然形成了界面膜，但强度较低，因此乳状液的稳定性较差)。步骤二中若色拉油中Span-80的质量浓度为2％(如图9所示)，乳状液的粒径分布均匀，显微镜下可以看到大部分菌进入水相，形成了稳定的W/O乳状液(原因：由于表面活性剂的浓度增大，粒子界面上的吸附量较多，使界面膜中的分子排列更紧密，使界面膜的强度加大)，因此形成的初级乳状液更稳定。步骤二中若色拉油中Span-80的质量浓度为2.5％(如图10所示)，形成的初级乳状液在常温下短时间内会分层不稳定，不适合进行后期的二次乳化。
对比试验4、步骤一微胶囊壁材中乳化剂Tween-20的质量浓度：
步骤一中若微胶囊壁材中乳化剂Tween-20的质量浓度为0.05％(如图11所示)，若微胶囊壁材中乳化剂Tween-20的质量浓度为0.1％(如图12所示)，若微胶囊壁材中乳化剂Tween-20的质量浓度为0.15％(如图13所示)；虽然图11和图12中初级乳状液在粒径分布上都较均匀，且乳滴大小相差不大，但在显微镜下观察可知图11中初级乳状液在水相中分布的乳酸菌较少，而图12中初级乳状液在水相中分布的乳酸菌较多。若微胶囊壁材中乳化剂Tween-20的质量浓度为0.15％，所制备的初级乳状液不稳定，常温下静置，短时间内会分层，在显微镜下观察可知乳状液发生了相转变(原因：Tween-20是可以溶于水的表面活性剂，与水发生强烈的相互作用，当其被添加到乳酸菌液中后，被乳酸菌所吸附，从而提高了乳酸菌的亲水性，降低了乳酸菌的亲油性。随着Tween-20浓度由0.05％增大到0.1％这个过程，进入水相的乳酸菌也会增多，但当Tween-20浓度为0.15％时，部分表面活性剂分布在油水界面上，会破坏保护膜，使形成的乳状液不稳定)。
对比试验5、步骤一微胶囊芯材与微胶囊壁材体积比：
步骤一中若微胶囊芯材与微胶囊壁材体积比为1∶1(如图14所示)，形成初级乳状液的粒径分布不均，而且乳滴偏大，显微镜下观察有菌进入水相，且形成了W/O乳状液。步骤一中若微胶囊芯材与微胶囊壁材体积比为1∶2(如图15所示)，乳状液的粒径分布均匀，且所形成乳滴的大小要比1∶1(微胶囊芯材与微胶囊壁材体积比)所形成的乳滴小，显微镜下可以看到有菌进入到水相中，且形成了稳定的W/O乳状液。步骤一中若微胶囊芯材与微胶囊壁材体积比为1∶3(如图16所示)，乳状液的粒径分布较均匀，乳滴偏小，显微镜下可见菌进入水相，且形成了W/O乳状液(原因：当微胶囊芯材与微胶囊壁材体积比减小时，单位体积壁材海藻酸钠溶液中所包埋的微胶囊芯材少，当滴加到色拉油中进行乳化时，在相同条件下搅拌，所形成的乳滴变小)。
对比试验6、步骤二中乳化时间：
步骤二中若乳化时间为10min(如图17所示)，形成的乳滴较大，显微镜下可以看到大部分乳酸菌没有进入水相，乳化效果不好，初级乳状液的离心保留率为45.7％。步骤二中若乳化时间为15min(如图18所示)，形成的初级乳状液粒径分布均匀，显微镜下可以看到乳酸菌进入水相，已经形成了稳定的W/O乳状液，初级乳状液的离心保留率为54.2％。步骤二中若乳化时间为20min(如图19所示)，形成的初级乳状液乳滴大小与乳化时间为15min时所形成的乳滴大小相差不大，且粒径分布比较均匀，显微镜下可以看到乳酸菌进入水相，初级乳状液的离心保留率为47.5％。
对比试验7、步骤二中乳化温度：
步骤二中若乳化温度为36℃(如图20所示)，制备的初级乳状液离心保留率为48.3％。步骤二中若乳化温度为37℃(如图21所示)，制备的初级乳状液离心保留率为54.2％。步骤二中若乳化温度为38℃(如图22所示)，制备的初级乳状液离心保留率为48.2％。
对比试验8、步骤二中乳化搅拌转速：
步骤二中若乳化搅拌转速为900r/min(如图23所示)，乳状液粒径分布不均，所形成的乳滴过大，且乳滴分散性不好，显微镜下可见形成了W/O乳状液，初级乳状液的离心保留率为55％。步骤二中若乳化搅拌转速为1100r/min(如图24所示)，乳状液的粒径分布均匀，乳滴变小，且乳滴分散性好；显微镜下可以看到形成了较稳定的W/O乳状液，部分乳酸菌已经进入水相，初级乳状液的离心保留率为54.2％。步骤二中若乳化搅拌转速为1300r/min(如图25所示)，乳状液粒径分布较均匀，部分乳滴较小，显微镜下可以看到乳酸菌进入水相，初级乳状液的离心保留率为44％。当搅拌速度低时由于剪切力小，使乳滴不能很好的分散开，形成的乳滴过大；当搅拌速度高时因为有足够的剪切力，使乳滴能够较好的分散开，乳状液的粒径分布均匀；但当搅拌速度超过最佳搅拌速度时，剪切力会对乳酸菌菌体细胞造成损伤，降低了乳酸菌的活性，同时过高的搅拌速度带来的剪切力又会导致破乳，影响到初级乳状液的稳定性。当搅拌速度为900r/min时乳状液离心保留率虽然最大，但由于所形成的乳滴过大，且分散性不好，会直接影响到后期二次乳化及微胶囊的制备；而当搅拌速度为1300r/min时过高的剪切力又会对乳酸菌菌体细胞造成损伤。因此，本实施方式参数设计最为合理。
对比试验9、步骤三中氯化钙溶液的质量浓度：
海藻酸钠与Ca2+能发生置换反应，生成不可逆凝胶。步骤三中若氯化钙溶液的质量浓度为3％(如图26所示)，凝聚反应不够完全，形成的凝胶颗粒较小(原因：由于溶液中可与海藻酸钠发生置换反应的Ca2+少，所以形成的凝胶颗粒结构疏松、强度差，不利于后期的二次乳化与再次包埋)。步骤三中若氯化钙溶液的质量浓度为5％(如图27所示)、若氯化钙溶液的质量浓度为7％(如图28所示)，凝胶颗粒粒径分布均匀，且在这两个浓度下所形成的凝胶颗粒大小相差不大，几乎大小保持恒定(原因：当氯化钙的浓度增加时，由于溶液中可与海藻酸钠发生置换反应的Ca2+多，所形成的凝胶颗粒结构致密，但当氯化钙的浓度达到一定值后，由于氯化钙达到饱和，使凝胶颗粒粒径恒定)。但氯化钙的浓度过高会影响乳酸菌的渗透压，降低乳酸菌的生物活性。
对比试验10、步骤三中初级乳状液与氯化钙溶液的体积比：
步骤三中若初级乳状液与氯化钙溶液的体积比为1∶1(如图29所示)，发生了单凝聚反应，显微镜下可以看到，所形成的凝胶颗粒较少，且有个别乳滴没有被凝聚。步骤三中若初级乳状液与氯化钙溶液的体积比为1∶2(如图30所示)，凝聚完全，而且所形成的凝胶颗粒粒径分布均匀，显微镜下可以看到，所形成的凝胶颗粒较多，乳状液几乎被完全凝聚。步骤三中若初级乳状液与氯化钙溶液的体积比为1∶3(如图31所示)，由于氯化钙的体积过大，显微镜下可以看到，有氯化钙硬块。
对比试验11、步骤三中搅拌速度：
步骤三中若搅拌速度为0r/min(如图32所示)，凝聚效果不好，所滴加的氯化钙与初级乳状液不能混合均匀，海藻酸钠与氯化钙接触的面积小，在没有搅拌的情况下，海藻酸钠遇到Ca2+很快发生置换反应，海藻酸钠溶液有部分变成海藻酸钙沉淀下来，从而被浪费掉，降低了微胶囊的产率，显微镜下观察到的依然是未被凝聚的乳状液。步骤三中若搅拌速度为100r/min(如图33所示)，部分已经被凝聚形成初级微胶囊，部分没有被凝聚。步骤三中若搅拌速度为200r/min(如图34所示)，加速了凝聚成囊的过程，乳状液已被完全凝聚，凝胶颗粒粒径分布均匀。步骤三中若搅拌速度为300r/min(如图35所示)，虽然凝胶颗粒粒径分布较均匀，但颗粒直径有变小的趋势，主要是因为转速过快导致了颗粒变小；同时，搅拌速度过快所产生的剪切力过大，会对乳酸菌菌体造成一定的损伤，影响乳酸菌的活性。由于在测包囊效率采用的是活菌计数，因此过大的搅拌速度会降低微胶囊的包囊效率。
对比试验12、步骤三中继续搅拌时间：
步骤三中继续搅拌时间为5min(如图36所示)，步骤三中继续搅拌时间为10min(如图37所示)，步骤三中继续搅拌时间为15min(如图38所示)，步骤三中继续搅拌时间为20min(如图39所示)。显微镜下观察：凝聚从5min开始到15min这一过程，所形成的凝胶颗粒量有所增加。说明：随着时间的延长，海藻酸钠不断被氯化钙凝聚，时间越长，凝聚越完全，所形成的凝胶颗粒越多。在同一搅拌速度下，时间越长，搅拌越均匀，海藻酸钠与氯化钙的接触面积越大，所形成的凝胶颗粒粒径越均匀，提高了微胶囊的质量与产量。继续搅拌时间也不宜过长，否则会影响凝胶颗粒的质量。
对比试验13、步骤三中海藻酸钠溶液中明胶的质量浓度：
明胶不仅可以与海藻酸钠混合用做制备微胶囊的壁材，同时明胶也是一种很好的乳化剂。步骤三中若海藻酸钠溶液中明胶的质量浓度为1.5％(如图40所示)，二次乳化效果不好，所形成的多重乳状液粒径分布不均，多重乳状液滴较大，最终制得的微胶囊的包囊效率为30.7％。步骤三中若海藻酸钠溶液中明胶的质量浓度为2.5％(如图41所示)，二次乳化效果好，所形成的多重乳状液粒径分布较均匀，显微镜下可以看到已经形成了较稳定的W/O/W多重乳状液，最终制得的微胶囊的包囊效率为84.6％。步骤三中若海藻酸钠溶液中明胶的质量浓度为3.5％(如图42所示)，乳化效果不好，形成的多重乳状液滴彼此之间粘连在一起，影响到后期再次凝聚的效果和微胶囊的粒径大小，最终制得的微胶囊的包囊效率为42.2％。随着明胶浓度的增大，含有明胶的海藻酸钠溶液粘度增大，过滤所得的微胶囊油液不能很好的分散其中，影响到最终的乳化效果。
对比试验14、步骤四中混合乳化时间：
步骤四中若混合乳化时间为5min(如图43所示)，多重乳状液滴彼此之间分散效果不好，而且多重乳状液滴大小分布不均，最终制得的乳酸菌微胶囊的包囊效率为65.1％。步骤四中若混合乳化时间为7min(如图44所示)，多重乳状液滴大小分布不均，乳化效果不好，最终制得的乳酸菌微胶囊的包囊效率为38.4％。步骤四中若混合乳化时间为9min(如图45所示)，乳化效果较好，多重乳状液滴大小分布较均匀，最终制得的乳酸菌微胶囊的包囊效率为84.6％。步骤四中若混合乳化时间为11min(如图46所示)，虽然乳状液的乳滴分散性较好，但大小不均匀。乳化时间太短，微胶囊油液与含有明胶的海藻酸钠溶液混合搅拌不够充分，达不到较好的乳化效果；但随着时间的延长，微胶囊油液与含有明胶的海藻酸钠溶液能够充分接触，接触面积变大，加速了乳化作用的过程，能够获得较好的乳化效果，但乳化时间也不宜过长。
说明本实施方式参数设计最为合理。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二的不同点是：步骤一中的乳酸菌菌液是浓度为0.46×109cfu/mL的Lb.paracasei HD1.7菌液。其它步骤及参数与实施方式一或二相同。
本实施方式副干酪乳杆菌HD1.7(Lb.paracasei HD1.7)已经在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC M205015，并且在中国发明专利“肽类天然微生物防腐剂产生菌及应用和防腐剂的制备方法”(公开号CN1670184A，公开日2005年9月21日)中公布。副干酪乳杆菌HD1.7(Lb.paracasei HD1.7)由黑龙江大学生命科学学院微生物重点实验室于2002年在L-乳酸菌腌制酸菜发酵液中分离获得。
Lb.paracasei HD1.7属于干酪乳杆菌，能够降低人体中的血浆胆固醇。Lb.paracasei HD1.7能够增强机体对病原菌的抵抗能力；当人体肠道内菌群失调时Lb.paracasei HD1.7能够进行调节，保持菌群的生态平衡；同时Lb.paracasei HD1.7还可以增强机体免疫力；Lb.paracasei HD1.7代谢产生的GABA(γ-氨基丁酸)可促进胰岛素的分泌，从而可减少患糖尿病的风险。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一或二的不同点是：步骤五中的真空冷冻干燥参数冷阱筒壁温度：＜-40℃、冷阱空载真空度：＜2Pa。其它步骤及参数与实施方式一或二相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一、二、三或四的不同点是：步骤一中益生元为低聚果糖，微胶囊芯材中低聚果糖的质量浓度为4.3％～4.6％。其它步骤及参数与实施方式一、二、三或四相同。
本实施方式低聚果糖可提高Lb.paracasei HD 1.7活菌2个数量级。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一、二、三或四的不同点是：步骤一中益生元为大豆低聚糖，微胶囊芯材中大豆低聚糖的质量浓度为2.4％～2.6％。其它步骤及参数与实施方式一、二、三或四相同。
本实施方式大豆低聚糖可提高Lb.paracasei HD1.7活菌1个数量级。
具体实施方式七：本实施方式乳酸菌微胶囊按以下步骤进行制备：一、将微胶囊芯材和微胶囊壁材按照1∶2的体积比混合均匀，得到混合液，其中微胶囊芯材为加入保护剂和益生元的乳酸菌菌液，微胶囊壁材为添加了乳化剂的海藻酸钠溶液，微胶囊壁材中海藻酸钠的质量浓度为2％，微胶囊壁材中乳化剂为Tween-20、乳化剂的质量浓度为2％；二、将步骤一得到的混合液滴加到含有硬脂酸和乳化剂Span-80(失水山梨醇单油酸酯)的色拉油中，并在37℃、转速为1100r/min的条件下乳化15min，形成初级乳状液，其中混合液的滴加量与色拉油的体积比为1∶2，色拉油中硬脂酸的质量浓度为1％，色拉油中乳化剂Span-80的质量浓度为2％；三、在搅拌转速为200r/min条件下将质量浓度为5％的氯化钙溶液加入初级乳状液中，初级乳状液与氯化钙溶液的体积比为1∶2，再继续搅拌15min，然后固化1h、过滤、滤液静置，取上层微胶囊油液；四、微胶囊油液与含有明胶的海藻酸钠溶液按1∶2的体积比、在转速为100r/min的条件下混合乳化9min，形成多重乳状液，其中海藻酸钠溶液中海藻酸钠的质量浓度为2％，海藻酸钠溶液中明胶的质量浓度为2.5％；五、在搅拌转速为200r/min条件下将质量浓度为5％的氯化钙溶液加入多重乳状液中，多重乳状液与氯化钙溶液的体积比为1∶2，再继续搅拌凝聚15min，然后固化1h，再用生理盐水洗涤4次，之后进行真空冷冻干燥，即得到乳酸菌微胶囊；其中步骤一中保护剂由葡萄糖、蛋白胨和抗坏血酸组成，微胶囊芯材中葡萄糖的质量浓度为6％，微胶囊芯材中蛋白胨的质量浓度为7％、微胶囊芯材中抗坏血酸的质量浓度为8％；步骤一中益生元为低聚果糖，微胶囊芯材中低聚果糖的质量浓度为4.5％；步骤一中的乳酸菌菌液是浓度为0.46×109cfu/mL的Lb.paracasei HD1.7菌液。
本实施方式中保护剂采用复合组分，保护剂中的小分子物质能透过细胞膜渗入细胞内抑制冰晶生成、减缓冰晶生长，可减少冷冻过程中冰晶对细胞的损伤，保护剂中的大分子物质不能穿透细胞膜渗入细胞，其具有强亲水特性和氢键形成能力，可形成稳定的水分子层阻碍膜内结合水向外转移，从而保护乳酸菌细胞结构。
取1g本实施方式制备的乳酸菌微胶囊置于9mL人工肠液(pH为6.8)中，在37℃水浴、搅拌速度为190r/min条件下搅拌45min(乳酸菌微胶囊完全崩解)，然后测定其活乳酸菌菌数(该数据B2包括了乳酸菌微胶囊内部和附着在微胶囊表面的活菌，为活乳酸菌菌数总数)。
取1g本实施方式制备的乳酸菌微胶囊置于9mL缓冲液(pH为4.0)中，在37℃水浴、振荡条件下处理45min(乳酸菌微胶囊囊膜没有崩解)，然后测定其活乳酸菌菌数(该数据B1为附着在微胶囊表面的活乳酸菌菌数)。
根据公式：包囊效率＝(B2-B1)/B2×100％，可计算出本实施方式制备的乳酸菌微胶囊包囊效率为84.6％。
取1g本实施方式制备的乳酸菌微胶囊分别置于10mL、pH值为2.0、3.0和4.0的无菌生理盐水中(对照组将1g乳酸菌真空冷冻干粉也分别置于10mL、pH值为2.0、3.0和4.0的无菌生理盐水中)37℃水浴4h，然后离心(转速为4000r/min，离心时间为15min)收集菌体，将收集到的菌体与pH值为7.4的PBS缓冲液混合，在37℃水浴至微胶囊彻底崩解，再离心(转速为4000r/min，离心时间为15min)制成菌悬液，并以3％的接种量接种到液体M6培养基中，在37℃环境中培养24h后测定活菌数。pH值为3.0，本实施方式制备的乳酸菌微胶囊的活菌数为2.85×103cfu/mL，而对照组菌株的活菌数为0cfu/mL；pH为4.0，本实施方式制备的乳酸菌微胶囊的活菌数为1.64×103cfu/mL，而对照组菌株的活菌数为0cfu/mL；pH值为2.0，本实施方式制备的乳酸菌微胶囊的活菌数为1.83×103cfu/mL，而对照组菌株的活菌数为0cfu/mL；本实施方式制备的乳酸菌微胶囊与对照组相比提高了三个数量级，二者存在显著差异，说明本实施方式制备的乳酸菌微胶囊可抵抗酸性环境。
将浓度为10g/L、12g/L和14g/L的胃蛋白酶分别添加到pH值为4.0的0.85％的无菌生理盐水中，然后取1g本实施方式制备的乳酸菌微胶囊分别置于10mL上述3种胃蛋白酶液中(对照组将1g乳酸菌真空冷冻干粉也分别置于10mL上述3种胃蛋白酶液中)37℃条件下水浴2h，然后离心(转速为4000r/min，离心时间为15min)收集菌体，将收集到的菌体与pH值为7.4的PBS缓冲液混合，在37℃条件下水浴至微胶囊彻底崩解，再离心(转速为4000r/min，离心时间为15min)制成菌悬液，并以3％的接种量接种到液体M6培养基中，在37℃环境中培养24h后测定活菌数。在胃蛋白酶浓度分别为10g/L、12g/L、14g/L的环境中，本实施方式制备的乳酸菌微胶囊的活菌数分别为2.65×108cfu/mL、6.31×108cfu/mL、1.52×108cfu/mL，而对照组菌株的活菌数均为0cfu/mL；说明本实施方式制备的乳酸菌微胶囊能够抵抗胃蛋白酶，保护微胶囊中的乳酸菌。
将浓度为1g/L、2g/L和3g/L的胰蛋白酶分别添加到pH值为8.5的0.85％的无菌生理盐水中，然后取1g本实施方式制备的乳酸菌微胶囊分别置于10mL上述3种胰蛋白酶液中(对照组将1g乳酸菌真空冷冻干粉也分别置于10mL上述3种胰蛋白酶液中)37℃条件下水浴24h，然后离心(转速为4000r/min，离心时间为15min)收集菌体，将收集到的菌体与pH值为7.4的PBS缓冲液混合，在37℃条件下水浴至微胶囊彻底崩解，再离心(转速为4000r/min，离心时间为15min)制成菌悬液，并以3％的接种量接种到液体M6培养基中，在37℃环境中培养24h后测定活菌数。在胰蛋白酶浓度分别为1g/L、2g/L和3g/L的环境中，本实施方式制备的乳酸菌微胶囊的活菌数分别为2.5×108cfu/mL、5.2×107cfu/mL、4.1×107cfu/mL，而对照组菌株的活菌数分别为4.7×107cfu/mL、1.5×106cfu/mL、6.8×105cfu/mL；说明本实施方式制备的乳酸菌微胶囊能够抵抗胰蛋白酶，保护微胶囊中的乳酸菌。
取1g本实施方式制备的乳酸菌微胶囊分别置于10mL胆酸钠浓度为0.2％、0.3％和0.4％的溶液中(对照组将1g乳酸菌真空冷冻干粉也分别置于10mL胆酸钠浓度为0.2％、0.3％和0.4％的溶液中)37℃水浴12h，然后离心(转速为4000r/min，离心时间为15min)收集菌体，将收集到的菌体与pH值为7.4的PBS缓冲液混合，在37℃水浴至微胶囊彻底崩解，再离心(转速为4000r/min，离心时间为15min)制成菌悬液，并以3％的接种量接种到液体M6培养基中，在37℃环境中培养24h后测定活菌数。胆酸钠的浓度为0.20％，本实施方式制备的乳酸菌微胶囊的活菌数为2.13×107cfu/mL，而对照组菌株的活菌数为3.1×106cfu/mL；胆酸钠的浓度为0.3％，本实施方式制备的乳酸菌微胶囊的活菌数为1.6×106cfu/mL，而对照组菌株的活菌数为2.4×105cfu/mL；胆酸钠浓度为0.40％，本实施方式制备的乳酸菌微胶囊的活菌数为5.7×104cfu/mL，而对照组菌株的活菌数为1.76×104cfu/mL；本实施方式制备的乳酸菌微胶囊与对照组相比二者存在显著差异，说明本实施方式制备的乳酸菌微胶囊可更好的抵抗胆盐环境。
将HCL浓度为1.64mol/L的盐酸溶液的pH值调到1.2，然后121℃灭菌20min、冷却后常温下添加胃蛋白酶10g混匀，制成人工胃液，取1g本实施方式制备的乳酸菌微胶囊37℃条件下分别置于人工胃液水浴1h、2h和3h，然后离心(转速为4000r/min，离心时间为15min)收集菌体，将收集到的菌体与pH值为7.4的PBS缓冲液混合，在37℃水浴至微胶囊彻底崩解，再离心(转速为4000r/min，离心时间为15min)制成菌悬液，并以3％的接种量接种到液体M6培养基中，在37℃环境中培养24h后测定活菌数，本实施方式制备的乳酸菌微胶囊在pH1.2的胃液环境中至少保持2h壁材不被破坏。
取1g本实施方式制备的乳酸菌微胶囊置于10mL人工肠液中，在37℃水浴条件下振荡(190r/min)，每隔15min测一次吸光值(波长为600nm)。处理10min OD600nm值为0.241，处理15min OD600nm值为0.356，处理30min OD600nm值为0.556，处理45min OD600nm值为0.603，处理60min OD600nm值为0.604，可知处理45min后OD600nm值趋于稳定，说明本实施方式制备的乳酸菌微胶囊在人工肠液中完全崩解的时间为45min。
将本实施方式制备的乳酸菌微胶囊粉末撒于贴了双面胶的样品台上，并吹去多余的粉末，喷金后用扫描电子显微镜观察本实施方式制备的乳酸菌微胶囊的表面结构，加速电压为5KV，本实施方式制备的乳酸菌微胶囊表面结构如图1所示。
用溴化钾压片法进行红外光谱检测，本实施方式制备的乳酸菌微胶囊与溴化钾按2∶200的质量比混合、压片，在WQF-310红外光谱仪上测定透谱。本实施方式制备的乳酸菌微胶囊的红外光谱图如图49所示，本实施方式制备的乳酸菌微胶囊的微胶囊芯材与微胶囊壁材混合物的红外光谱图如图50所示，本实施方式制备的乳酸菌微胶囊的微胶囊芯材的红外光谱图如图51所示。比较图49和图50可以看出两图明显不同，因此，判断乳酸菌微胶囊的壁材对芯材已经发生了包埋作用。从图51可以看出，在2078.70cm-1左右是蛋白胨和脱脂粉中的氨基酸(NH3 +)的伸缩振动吸收峰，而在图49中在2078.70cm-1左右没有吸收峰，这说明蛋白胨和脱脂粉中氨基酸(NH3 +)的吸收峰没有出现在微胶囊的红外光谱图中，因此认为蛋白胨和脱脂粉已经被壁材海藻酸钠和明胶所包埋。图51中在1638.04cm-1左右是抗坏血酸中的酮(-CO-CH2-CO或-CO-C＝C-OH)C＝O的较强伸缩振动吸收峰，而在图49中在1638.04cm-1左右没有吸收峰，这说明抗坏血酸中酮(C＝O)的吸收峰没有出现在微胶囊的红外光谱图中，因此认为抗坏血酸已经被壁材海藻酸钠和明胶所包埋。图51中在3435.30cm-1左右是葡萄糖和低聚果糖中羟基(-OH)的伸缩振动吸收峰，而在图49中在3427.62cm-1左右也有羟基(-OH)的伸缩振动吸收峰，但是图51中的羟基(-OH)吸收峰要比图49中羟基(-OH)的吸收峰大，因此认为大部份葡萄糖和低聚果糖已经被壁材包埋，而对于图51中其它的杂峰，认为是其它杂物质所产生的吸收峰。证明芯材已经被壁材所包埋。
将本实施方式制备的乳酸菌微胶囊放置在冰箱(4℃)中保存，分别在7、14、21、28天取出，用平板菌落计数法测定Lb.paracasei HD1.7的活菌数。并根据公式
计算出本实施方式Lb.paracasei HD1.7的存活率达91.6％；再根据公式ln(cn0/cn)＝kdt[dcn/dt＝kdcn，其中cn为活细胞浓度(cfu/mL)；t为时间(天)；kd为比死亡速率常数(天-1)，其中t＝0时，Cn＝Cn0，从而积分可以得到ln(cn0/cn)＝kdt]；乳酸菌菌体的存活率Cn/Cn0数据计算出乳酸菌微胶囊菌株的比死亡速率常数为：kd＝4.4×10-3[天-1]，再根据公式t0.9(1/kd)ln(cn0/cn)计算出本实施方式微胶囊保持较高活菌数的最长期限达24天。本实施方式方法制备的乳酸菌微胶囊菌体的冻干存活率达62.753％。
具体实施方式八：本实施方式乳酸菌微胶囊按以下步骤进行制备：一、将微胶囊芯材和微胶囊壁材按照1∶2的体积比混合均匀，得到混合液，其中微胶囊芯材为加入保护剂和益生元的乳酸菌菌液，微胶囊壁材为添加了乳化剂的海藻酸钠溶液，微胶囊壁材中海藻酸钠的质量浓度为2％，微胶囊壁材中乳化剂为Tween-20、乳化剂的质量浓度为2％；二、将步骤一得到的混合液滴加到含有硬脂酸和乳化剂Span-80的色拉油中，并在37℃、转速为1100r/min的条件下乳化15min，形成初级乳状液，其中混合液的滴加量与色拉油的体积比为1∶2，色拉油中硬脂酸的质量浓度为1％，色拉油中乳化剂Span-80的质量浓度为2％；三、在搅拌转速为200r/min条件下将质量浓度为5％的氯化钙溶液加入初级乳状液中，初级乳状液与氯化钙溶液的体积比为1∶2，再继续搅拌15min，然后固化1h、过滤、滤液静置，取上层微胶囊油液；四、微胶囊油液与含有明胶的海藻酸钠溶液按1∶2的体积比、在转速为100r/min的条件下混合乳化9min，形成多重乳状液，其中海藻酸钠溶液中海藻酸钠的质量浓度为2％，海藻酸钠溶液中明胶的质量浓度为2.5％；五、在搅拌转速为200r/min条件下将质量浓度为5％的氯化钙溶液加入多重乳状液中，多重乳状液与氯化钙溶液的体积比为1∶2，再继续搅拌凝聚15min，然后固化1h，再用生理盐水洗涤4次，之后进行真空冷冻干燥，即得到乳酸菌微胶囊；其中步骤一中保护剂由葡萄糖、蛋白胨和抗坏血酸组成，微胶囊芯材中葡萄糖的质量浓度为6％，微胶囊芯材中蛋白胨的质量浓度为7％、微胶囊芯材中抗坏血酸的质量浓度为8％；步骤一中益生元为大豆低聚糖，微胶囊芯材中大豆低聚糖的质量浓度为2.5％；步骤一中的乳酸菌菌液是浓度为0.46×109cfu/mL的Lb.paracasei HD1.7菌液。
本实施方式中保护剂采用复合组分，保护剂中的小分子物质能透过细胞膜渗入细胞内抑制冰晶生成、减缓冰晶生长，可减少冷冻过程中冰晶对细胞的损伤，保护剂中的大分子物质不能穿透细胞膜渗入细胞，其具有强亲水特性和氢键形成能力，可形成稳定的水分子层阻碍膜内结合水向外转移，从而保护乳酸菌细胞结构。
取1g本实施方式制备的乳酸菌微胶囊置于9mL人工肠液(pH为6.8)中，在37℃水浴、搅拌速度为190r/min条件下搅拌45min(乳酸菌微胶囊完全崩解)，然后测定其活乳酸菌菌数(该数据B2包括了乳酸菌微胶囊内部和附着在微胶囊表面的活菌，为活乳酸菌菌数总数)。
取1g本实施方式制备的乳酸菌微胶囊置于9mL缓冲液(pH为4.0)中，在37℃水浴、振荡条件下处理45min(乳酸菌微胶囊囊膜没有崩解)，然后测定其活乳酸菌菌数(该数据B1为附着在微胶囊表面的活乳酸菌菌数)。
根据公式：包囊效率＝(B2-B1)/B2×100％，可计算出本实施方式制备的乳酸菌微胶囊包囊效率为84.6％。
取1g本实施方式制备的乳酸菌微胶囊分别置于10mL、pH值为2.0、3.0和4.0的无菌生理盐水中(对照组将1g乳酸菌真空冷冻干粉也分别置于10mL、pH值为2.0、3.0和4.0的无菌生理盐水中)37℃水浴4h，然后离心(转速为4000r/min，离心时间为15min)收集菌体，将收集到的菌体与pH值为7.4的PBS缓冲液混合，在37℃水浴至微胶囊彻底崩解，再离心(转速为4000r/min，离心时间为15min)制成菌悬液，并以3％的接种量接种到液体M6培养基中，在37℃环境中培养24h后测定活菌数。pH值为3.0，本实施方式制备的乳酸菌微胶囊的活菌数为2.84×103cfu/mL，而对照组菌株的活菌数为0cfu/mL；pH为4.0，本实施方式制备的乳酸菌微胶囊的活菌数为1.62×103cfu/mL，而对照组菌株的活菌数为0cfu/mL；pH值为2.0，本实施方式制备的乳酸菌微胶囊的活菌数为1.81×103cfu/mL，而对照组菌株的活菌数为0cfu/mL；本实施方式制备的乳酸菌微胶囊与对照组相比提高了三个数量级，二者存在显著差异，说明本实施方式制备的乳酸菌微胶囊可抵抗酸性环境。
将浓度为10g/L、12g/L和14g/L的胃蛋白酶分别添加到pH值为4.0的0.85％的无菌生理盐水中，然后取1g本实施方式制备的乳酸菌微胶囊分别置于10mL上述3种胃蛋白酶液中(对照组将1g乳酸菌真空冷冻干粉也分别置于10mL上述3种胃蛋白酶液中)37℃条件下水浴2h，然后离心(转速为4000r/min，离心时间为15min)收集菌体，将收集到的菌体与pH值为7.4的PBS缓冲液混合，在37℃条件下水浴至微胶囊彻底崩解，再离心(转速为4000r/min，离心时间为15min)制成菌悬液，并以3％的接种量接种到液体M6培养基中，在37℃环境中培养24h后测定活菌数。在胃蛋白酶浓度分别为10g/L、12g/L、14g/L的环境中，本实施方式制备的乳酸菌微胶囊的活菌数分别为2.66×108cfu/mL、6.30×108cfu/mL、1.51×108cfu/mL，而对照组菌株的活菌数均为0cfu/mL；说明本实施方式制备的乳酸菌微胶囊能够抵抗胃蛋白酶，保护微胶囊中的乳酸菌。
将浓度为1g/L、2g/L和3g/L的胰蛋白酶分别添加到pH值为8.5的0.85％无菌生理盐水中，然后取1g本实施方式制备的乳酸菌微胶囊分别置于10mL上述3种胰蛋白酶液中(对照组将1g乳酸菌真空冷冻干粉也分别置于10mL上述3种胰蛋白酶液中)37℃条件下水浴24h，然后离心(转速为4000r/min，离心时间为15min)收集菌体，将收集到的菌体与pH值为7.4的PBS缓冲液混合，在37℃条件下水浴至微胶囊彻底崩解，再离心(转速为4000r/min，离心时间为15min)制成菌悬液，并以3％的接种量接种到液体M6培养基中，在37℃环境中培养24h后测定活菌数。在胰蛋白酶浓度分别为1g/L、2g/L和3g/L的环境中，本实施方式制备的乳酸菌微胶囊的活菌数分别为2.4×108cfu/mL、5.1×107cfu/mL、4.2×107cfu/mL，而对照组菌株的活菌数分别为4.7×107cfu/mL、1.5×106cfu/mL、6.8×105cfu/mL；说明本实施方式制备的乳酸菌微胶囊能够抵抗胰蛋白酶，保护微胶囊中的乳酸菌。
取1g本实施方式制备的乳酸菌微胶囊分别置于10mL、胆酸钠浓度为0.2％、0.3％和0.4％的溶液中(对照组将1g乳酸菌真空冷冻干粉也分别置于10mL、胆酸钠浓度为0.2％、0.3％和0.4％的溶液中)37℃水浴12h，然后离心(转速为4000r/min，离心时间为15min)收集菌体，将收集到的菌体与pH值为7.4的PBS缓冲液混合，在37℃水浴至微胶囊彻底崩解，再离心(转速为4000r/min，离心时间为15min)制成菌悬液，并以3％的接种量接种到液体M6培养基中，在37℃环境中培养24h后测定活菌数。胆酸钠的浓度为0.20％，本实施方式制备的乳酸菌微胶囊的活菌数为2.11×107cfu/mL，而对照组菌株的活菌数为3.1×106cfu/mL；胆酸钠的浓度为0.3％，本实施方式制备的乳酸菌微胶囊的活菌数为1.7×106cfu/mL，而对照组菌株的活菌数为2.4×105cfu/mL；胆酸钠浓度为0.40％，本实施方式制备的乳酸菌微胶囊的活菌数为5.9×104cfu/mL，而对照组菌株的活菌数为1.76×104cfu/mL本实施方式制备的乳酸菌微胶囊与对照组相比二者存在显著差异，说明本实施方式制备的乳酸菌微胶囊可更好的抵抗胆盐环境。
将HCL浓度为1.64mol/L的盐酸溶液的pH值调到1.2，然后121℃灭菌20min、冷却后常温下添加胃蛋白酶10g混匀，制成人工胃液，取1g本实施方式制备的乳酸菌微胶囊37℃条件下分别置于人工胃液水浴1h、2h和3h，然后离心(转速为4000r/min，离心时间为15min)收集菌体，将收集到的菌体与pH值为7.4的PBS缓冲液混合，在37℃水浴至微胶囊彻底崩解，再离心(转速为4000r/min，离心时间为15min)制成菌悬液，并以3％的接种量接种到液体M6培养基中，在37℃环境中培养24h后测定活菌数，本实施方式制备的乳酸菌微胶囊在pH1.2的胃液环境中至少保持2h壁材不被破坏。
取1g本实施方式制备的乳酸菌微胶囊置于10mL人工肠液中，在37℃水浴条件下振荡(190r/min)，每隔15min测一次吸光值(波长为600nm)。处理10min OD600nm值为0.242，处理15min OD600nm值为0.357，处理30min OD600nm值为0.555，处理45min OD600nm值为0.602，处理60min OD600nm值为0.604，可知处理45min后OD600nm值趋于稳定，说明本实施方式制备的乳酸菌微胶囊在人工肠液中完全崩解的时间为45min。
将本实施方式制备的乳酸菌微胶囊粉末撒于贴了双面胶的样品台上，并吹去多余的粉末，喷金后用扫描电子显微镜观察本实施方式制备的乳酸菌微胶囊的表面结构，加速电压为5KV。
采用透射电镜对本实施方式制备的乳酸菌微胶囊和Lb.paracasei HD1.7分别进行了内部结构的观察。透射电镜观察前期处理步骤如下：
①用戊二醛分别将本实施方式制备的乳酸菌微胶囊和Lb.paracasei HD1.7固定2h；
②用0.1mol/mL、pH值为7.2的PBS缓冲溶液冲洗步骤①固定样品三次，每次15min；
③用质量浓度为1％的锇酸固定1.3h；
④用0.1mol/mL、pH值为7.2的PBS缓冲溶液冲洗步骤③固定样品三次，每次10min；
⑤分别用体积浓度为50％、70％、90％、100％的乙醇脱水，每次脱水时间为10min，然后用体积浓度为100％的乙醇再脱水10min，再加入乙醇和丙醇的混合液(乙醇和丙醇浓度均为100％，体积比为1∶1)保持10min，之后再加浓度为100％的丙酮保持5min；
⑥浸泡固定：浓度为100％丙酮和812环氧树脂按1∶1.5的体积比混合后浸泡固定步骤⑤得到的样品1h，再加入812环氧树脂过夜；
⑦包埋；
⑧用透射电镜进行内部结构的观察。
Lb.paracasei HD1.7内部结构如图47所示，本实施方式制备的乳酸菌微胶囊内部结构如图48所示。
将本实施方式制备的乳酸菌微胶囊放置在冰箱(4℃)中保存，分别在7、14、21、28天取出，用平板菌落计数法测定Lb.paracasei HD1.7的活菌数。并根据公式
计算出本实施方式Lb.paracasei HD1.7的存活率达91.6％；再根据公式ln(cn0/cn)＝kdt[dcn/dt＝kdcn，其中cn为活细胞浓度(cfu/mL)；t为时间(天)；kd为比死亡速率常数(天-1)，其中t＝0时，Cn＝Cn0，从而积分可以得到1n(cn0/cn)＝kdt]；乳酸菌菌体的存活率Cn/Cn0数据计算出乳酸菌微胶囊菌株的比死亡速率常数为：kd＝4.4×10-3[天-1]，再根据公式t0.9＝(1/kd)ln(cn0/cn)计算出本实施方式微胶囊保持较高活菌数的最长期限达24天。
本实施方式方法制备的乳酸菌微胶囊菌体的冻干存活率达62.753％。
Claims (5)
1、一种乳酸菌微胶囊的制备方法，其特征在于乳酸菌微胶囊按以下步骤进行制备：一、将微胶囊芯材和微胶囊壁材按照1∶2的体积比混合均匀，得到混合液，其中微胶囊芯材为加入保护剂和益生元的乳酸菌菌液，微胶囊壁材为添加了乳化剂的海藻酸钠溶液，微胶囊壁材中海藻酸钠的质量浓度为1.8％～2.2％，微胶囊壁材中乳化剂为Tween-20、乳化剂的质量浓度为0.09％～0.11％；二、将步骤一得到的混合液滴加到含有硬脂酸和乳化剂Span-80的色拉油中，并在37℃、转速为1080～1140r/min的条件下乳化14～16min，形成初级乳状液，其中混合液的滴加量与色拉油的体积比为1∶2，色拉油中硬脂酸的质量浓度为0.9％～1.1％，色拉油中乳化剂Span-80的质量浓度为1.9％～2.1％；三、在搅拌转速为180～220r/min条件下将质量浓度为4.5％～5.5％的氯化钙溶液加入初级乳状液中，初级乳状液与氯化钙溶液的体积比为1∶2，再继续搅拌15min，然后固化1h、过滤、滤液静置，取上层微胶囊油液；四、微胶囊油液与含有明胶的海藻酸钠溶液按1∶2的体积比、在转速为100r/min的条件下混合乳化8.5～9.5min，形成多重乳状液，其中海藻酸钠溶液中海藻酸钠的质量浓度为2％，海藻酸钠溶液中明胶的质量浓度为2.4％～2.6％；五、在搅拌转速为200r/min条件下将质量浓度为5％的氯化钙溶液加入多重乳状液中，多重乳状液与氯化钙溶液的体积比为1∶2，再继续搅拌凝聚14～16min，然后固化1h，再用生理盐水洗涤3～4次，之后进行真空冷冻干燥，即得到乳酸菌微胶囊；其中步骤一中保护剂由葡萄糖、蛋白胨和抗坏血酸组成，微胶囊芯材中葡萄糖的质量浓度为5.8％～6.2％，微胶囊芯材中蛋白胨的质量浓度为6.8％～7.2％、微胶囊芯材中抗坏血酸的质量浓度为7.8％～8.2％；益生元为低聚果糖或大豆低聚糖。
2、根据权利要求1所述的一种乳酸菌微胶囊的制备方法，其特征在于步骤一中的乳酸菌菌液是浓度为0.46×109cfu/mL的Lb.paracasei HD1.7菌液。
3、根据权利要求1所述的一种乳酸菌微胶囊的制备方法，其特征在于步骤五中的真空冷冻干燥参数冷阱筒壁温度：＜-40℃、冷阱空载真空度：＜2Pa。
4、根据权利要求1、2或3所述的一种乳酸菌微胶囊的制备方法，其特征在于步骤一中益生元为低聚果糖，微胶囊芯材中低聚果糖的质量浓度为4.3％～4.6％。
5、根据权利要求1、2或3所述的一种乳酸菌微胶囊的制备方法，其特征在于步骤一中益生元为大豆低聚糖，微胶囊芯材中大豆低聚糖的质量浓度为2.4％～2.6％。
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