CN113881600A - 两种不同杆菌同时进行培养的液体培养基及其培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了两种不同杆菌同时进行培养的液体培养基及其培养方法，所述液体培养基包括酵母膏12‑18g、葡萄糖10‑15g、KH2PO41.6‑4.2g、NaCl2.5‑4.5g、硫酸镁1‑3g、硫酸锰0.2‑0.4g、吐温‑800.5‑2.5ml、蛋白胨10‑15g、脱脂牛奶80‑120ml或者脱脂奶粉10‑15g、牛肉膏0.8‑1.5g、胡萝卜汁8‑15ml、番茄汁10‑15ml、蒸馏水加至1000ml，pH调节至7.0—7.2。本发明可以节约培养时间，节省培养罐设备，同时还可以使菌株生长旺盛，提高产量。
Description
技术领域
本发明涉及复合益生菌剂的培养方法，具体涉及两种不同杆菌同时进行培养的液体培养基及其培养方法。
背景技术
在日常的微生物培养中，通常每种培养基只能对一种菌进行培养，不能同时培养两种以上的菌。植物乳杆菌是厌氧型菌株，在无氧条件下生长良好。而枯草芽孢杆菌则是好氧型菌株，在氧气充足的条件下生长良好，从理论上分析，两种菌是不可能共同生长的。但是按照常规的培养方法，生产两种不同类的菌需要在两种培养基和两个培养容器中分别进行培养，这样不仅浪费设备，浪费人力，浪费资源，而且还费工费时，浪费时间。
发明内容
本发明的目的在于提供两种不同杆菌同时进行培养的液体培养基及其培养方法，其可以节约培养时间，节省培养罐设备，同时还可以使菌株生长旺盛，提高产量。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
两种不同杆菌同时进行培养的液体培养基，所述液体培养基包括酵母膏12-18g、葡萄糖10-15g、KH2PO41.6-4.2g、NaCl 2.5-4.5g、硫酸镁1-3g、硫酸锰0.2-0.4g、吐温-800.5-2.5ml、蛋白胨10-15g、脱脂牛奶80-120ml或者脱脂奶粉10-15g、牛肉膏0.8-1.5g、胡萝卜汁8-15ml、番茄汁10-15ml、蒸馏水加至1000ml，pH调节至7.0—7.2。
优选地，所述液体培养基配制好后，放入玻璃瓶中，在高压锅中压121℃灭菌20min，冷却至室温待接种。
优选地，所述胡萝卜汁制作方法如下，取胡萝卜100克，切丁，入榨汁机加水20ml，榨成汁。
两种不同杆菌同时进行培养的培养方法，包括以下步骤：
(1)植物乳杆菌试管斜面菌种培养：选择复苏后活力旺盛的植物乳杆菌菌种，接种至试管MRS琼脂斜面培养基，37℃培养48-72h，为斜面菌种；
(2)植物乳杆菌一级种子液培养：在1000ml三角瓶中加入400ml MRS琼脂斜面培养基，121℃灭菌15min，待培养基降至37℃，用10ml灭菌生理盐水分3次将试管斜面中的菌苔洗到400ml MRS琼脂斜面培养基的瓶中，在120r/min、37℃条件下培养24h，得到植物乳杆菌一级种子液；
(3)枯草芽孢杆菌试管斜面菌种培养：选择复苏后活力旺盛的枯草芽孢杆菌菌种，接种至试管NA琼脂斜面培养基，34-36℃培养18-24h，为斜面菌种；
(4)枯草芽孢杆菌一级种子液培养：在1000ml三角瓶中加入400ml NB培养基，121℃灭菌20min，待培养基降至37℃，用10ml灭菌生理盐水分3次将试管斜面中的菌苔洗到400ml NB培养基的瓶中，在搅拌转速120-150r/min、34-36℃条件下培养18-24h，得到枯草芽孢杆菌一级种子液；
(5)二级种子液培养：将上述的两种不同杆菌同时进行培养的液体培养基作为二级种子培养基，配制6000ml二级种子培养基，121℃灭菌20min，待培养基降至37℃，分别将植物乳杆菌一级种子液和枯草芽孢杆菌一级种子液接种至二级种子培养基中，在搅拌转速120-150r/min、35-37℃条件下培养22-24h，得到二级种子培养液；
(6)扩大培养：配制植物乳酸杆菌与枯草芽孢杆菌混合菌混合培养扩大培养基100L，121℃灭菌20min，待扩大培养基降至37℃，将二级种子培养液接种到扩大培养基中，在搅拌转速120-150r/min、34-37℃条件下培养22-4h，得到扩大混合培养液。
优选地，所述步骤(1)中，植物乳酸杆菌每400ml MRS培养液接种试管琼脂斜面菌苔1管，所述步骤(2)中，枯草芽孢杆菌每400ml NA培养液接种试管琼脂斜面菌苔1管。
优选地，所述步骤(1)、(3)中，培养量为400ml的MRS液和400mlNA的培养液，分别接种植物乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌斜面菌苔1试管；所述步骤(4)中，二级种子培养液中枯草芽孢杆菌一级种子培养液和植物乳酸杆菌一级种子培养液接种量的体积百分比均为5-8％；所述步骤(6)中，扩大培养基中二级种子培养液接种量的体积百分比均为为5-8％。
优选地，所述步骤(6)中，扩大培养基包括酵母膏1200-1800g、脱脂牛奶4000-5200ml或者脱脂奶粉500-650g、番茄汁1000ml、硫酸镁2.6-4.2g、葡萄糖1000-1500g、硫酸锰3g、磷酸二氢钾200g、氯化钠100g、豆粕粉1.5-2.5kg，加水至100L，pH调节至7.0—7.2，培养基121℃灭菌20min冷却至室温。
优选地，所述番茄汁的制作方法如下，取新鲜番茄1100克去皮，切块，用捣碎机或榨汁机榨成糊状，补水至1100ml，搅匀。
优选地，所述步骤(6)中，全程将pH值控制在6.0—6.5，pH低于6.0时加氢氧化铵调节酸度至pH 6.5，18小时后不再调节pH值。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)植物乳酸杆菌在生长代谢过程中是厌氧发酵，而枯草芽孢杆菌在生长过程中则是好氧发酵，能迅速消耗共同培养基中的游离氧，形成低氧环境，而促进乳杆菌的生长。利用这一特点，将2种菌共同培养繁殖，通过枯草芽孢杆菌的需氧繁殖不断地消耗培养基中的溶解氧，为植物乳杆菌的生长提供了缺氧的生长条件，有利于植物乳杆菌的生长繁育。植物乳杆菌具有厌氧和兼性好氧的特性，在有氧的环境下也可产生乳酸等有机酸，而抑制有害菌的生长。枯草芽孢杆菌具有好氧和兼性厌氧的特点，即使是在少氧或过氧的条件下也可生长繁育，产生枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质及蛋白酶、淀粉酶、纤维酶等活性很高的生物消化酶，可以促进动物机体对营养物质的吸收利用，提高饲料利用，从而促进动物生长发育。
(2)乳杆菌在发酵过程中可产生大量的乳酸，使培养基的pH下降很快，而抑制其它菌群的生长，而枯草芽孢杆菌的的芽孢则具有很强的耐受能力，在pH 2.2-8.0的环境中也可具有较高的存活率。代谢产物则产生一定的碱性，可适当的维持培养基中的酸度，避免pH值下降过快。乳杆菌发酵最佳pH范围为5.0-7.0，而枯草芽孢杆菌发酵最佳pH也为5.0-7.0。两种菌组合，一个产酸，一个产碱，实现了的生长环境互补。但乳杆菌产酸的速度大大超过了枯草芽孢杆菌的产碱速度。故视酸度的变化还需及时加碱调节培养基中的pH值。
(3)本发明培养24h的活菌数量比单独培养的数量高出一个数量级，枯草芽孢杆菌和植物乳酸杆菌的活菌数分别达到4×1012cfu/ml和1×1013cfu/ml，菌株生长旺盛，提高了产量。
(4)本发明可以节约培养时间，节省培养罐设备。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
两种不同杆菌同时进行培养的液体培养基，所述液体培养基包括酵母膏15g、葡萄糖15g、KH2PO43 g、NaCl 3g、硫酸镁2g、硫酸锰0.4g、吐温-800.5ml、蛋白胨10g、脱脂牛奶120ml或者脱脂奶粉15g、牛肉膏1g、胡萝卜汁10ml、番茄汁15ml、蒸馏水加至1000ml，pH调节至7.0—7.2。液体培养基配制好后，放入玻璃瓶中，在高压锅中压121℃灭菌20min，冷却至室温待接种。所述胡萝卜汁制作方法如下，取新鲜胡萝卜100克，切丁，入榨汁机加水20ml，榨成汁。
两种不同杆菌同时进行培养的培养方法，包括以下步骤：
(1)植物乳杆菌试管种子及一级种子液培养：选择复苏后活力旺盛的植物乳杆菌菌种，用划线法将菌苔接种至MRS琼脂试管斜面培养基，37℃培养48h，为植物乳杆菌斜面菌种；在1000ml三角瓶中加入400ml MRS琼脂斜面培养基，121℃灭菌15min，待培养基降至37℃，400mlMRS液体培养基接种试管菌苔1管。用10ml灭菌生理盐水分3次将试管斜面中的菌苔洗到400ml MRS琼脂斜面培养基的瓶中，在120r/min、37℃条件下培养24h，得到植物乳杆菌一级种子液；
(2)枯草芽孢杆菌试管种子及一级种子液培养：选择复苏后活力旺盛的枯草芽孢杆菌菌种，用划线法将菌苔接种至试管NA琼脂斜面培养基，36℃培养22h，为斜面菌种；在1000ml三角瓶中加入400ml NB培养基，121℃灭菌20min，待培养基降至37℃，枯草芽孢杆菌每400ml NB培养液接种试管菌苔1管。用10ml灭菌生理盐水分3次将试管斜面中的菌苔洗到400mlNA培养液的瓶中，在搅拌转速150r/min、36℃条件下培养20h，得到枯草芽孢杆菌一级种子液；
(3)二级种子液培养：将上述的两种不同杆菌同时进行培养的液体培养基作为二级种子培养基，配制6000ml二级种子培养基，121℃灭菌20min，待培养基降至37℃，分别将植物乳杆菌一级种子液400ml和枯草芽孢杆菌一级种子液400ml接种至二级种子培养基中，在搅拌转速120r/min、36℃条件下培养24h，得到二级种子培养液，其中，二级种子培养基中枯草芽孢杆菌一级种子液和植物乳酸杆菌枯草芽孢杆菌一级种子液接种量均为5-7％(体积百分比)；
(4)扩大培养：配制植物乳酸杆菌与枯草芽孢杆菌混合菌混合培养扩大培养基100L，121℃灭菌20min，待扩大培养基降至37℃，将二级种子培养液6400ml接种到扩大培养基中，在搅拌转速120r/min、36℃条件下培养24h，得到扩大培养液，其中，扩大培养基中枯草芽孢杆菌二级种子液和植物乳酸杆菌二级种子液接种量均为5-8％(体积百分比)。
扩大培养基包括酵母膏1500g、脱脂牛奶5000ml或者脱脂奶粉625g、番茄汁1000ml、硫酸镁4g、葡萄糖1500g、硫酸锰3g、磷酸二氢钾200g、氯化钠100g、豆粕粉2kg，加水至100L，pH调节至7.0—7.2，培养基121℃灭菌20min冷却至室温。
两种不同杆菌同时进行培养的液体培养基和扩大培养基中的番茄汁的制作方法如下，取新鲜番茄1100克去皮，切块，用捣碎机或榨汁机榨成糊状，补水至1100ml，搅匀。
步骤(4)全程将pH值控制在6.0—6.5，pH低于6.0时加氢氧化铵调节酸度至pH6.5，18小时后不再调节pH值。且全过程需无菌操作。
对比例1
1、植物乳杆菌单独培养方法：
(1)MRS试管斜面菌种
选择复苏后活力旺盛的植物乳杆菌菌种，用划线法接种至试管MRS琼脂斜面培养基，植物乳酸杆菌每试管100ml MRS琼脂斜面培养基接种斜面菌苔5接种环，37℃培养48-72h，得到试管斜面菌种；
(2)植物乳杆菌一级种子液培养
配制400mlMRS培养液为一级种子培养基，121℃灭菌20min，待培养基降至37℃，用10ml灭菌生理盐水分3次将试管斜面中的菌苔洗到400ml MRS培养基的瓶中，在搅拌转速120r/min、37℃条件下培养24h，得到一级种子培养液；
(3)二级种子液培养
配制6000mlMRS培养液为二级种子培养基，121℃灭菌20min，待培养基降至37℃，将植物400ml乳杆菌一级种子液接种至二级种子培养基中，在搅拌转速120r/min、36℃条件下培养24h，得到二级种子培养液；
(4)扩大培养：
配制MRS培养液100L为植物乳杆菌培养基，121℃灭菌20min，待扩大培养基降至37℃，将6000ml二级种子培养液接种到扩大培养基中，在搅拌转速120r/min、36℃条件下培养24h，得到扩大培养液。
2、枯草芽孢杆菌单独培养方法：
(1)NA试管斜面菌种
选择复苏后活力旺盛的枯草芽孢杆菌菌种，用划线法接种至试管NA琼脂斜面培养基，枯草芽孢杆菌每试管100ml NA琼脂斜面培养基接种斜面菌苔5接种环，36℃培养22h，得到试管斜面菌种；
(2)枯草芽孢杆菌一级种子液培养
在1000ml三角瓶中加入400ml NB培养基，121℃灭菌20min，待培养基降至37℃，用10ml灭菌生理盐水分3次将试管斜面中的菌苔洗到400ml NB培养基的瓶中，在搅拌转速150r/min、36℃条件下培养20h，得到枯草芽孢杆菌一级种子液；
(3)枯草芽孢杆菌二级种子液
在1000ml三角瓶中加入400ml MRS培养基，121℃灭菌15min，用10ml灭菌生理盐水分3次将试管斜面中的菌苔洗到400ml NB培养基的瓶中，在120r/min、37℃条件下培养24h，得到枯草芽孢杆菌二级种子液；
(4)枯草芽孢杆菌扩大培养液
配制MRS培养液100L为植物乳杆菌培养基，121℃灭菌20min，待扩大培养基降至37℃，将6000ml二级种子培养液接种到扩大培养基中，在搅拌转速120-150r/min、35-37℃条件下培养22h，得到扩大培养液。
将实施例1和对比例1分别按培养100L计算，培养成本比较如下：
对比例1：
种子基培养基成本：(种子培养基用成品培养基)
枯草芽孢杆菌种子基种子培养基(NB)成本每1000ml成本2.16元，枯草芽孢杆菌种子培养基共6400ml，合13.82元，斜面培养基1元。合计14.82元；植物乳杆菌培养基(MRS)成本每1000ml成本7.56元，植物乳杆菌种子培养基共6400ml，合48.38元，斜面培养基1元。种子培养基加斜面培养基成本合计49.38元。种子培养试管、摇瓶等2套30元，水电费2.0元。种子培养基合计：96.20元。
扩大培养基成本：(用工业级原料自配)
100L NB培养液84.8元，100L MRS培养液成本189.32元，水电费20元，合计294.12元；
种子培养加扩大培养共390.32元
扩大培养设备2套，按2万元计。
培养耗时：按平均每种菌46h计算，2种菌共耗时92h。
实施例1：
一级种子种子培养基成本400ml MRS培养液成本为3.02元，400ml NB成本为0.86元；斜面2元，二级种子6000ml混合培养液成本18.32元，种子培养试管、摇瓶等2套30元，水电费2.0元。种子培养基合计：56.20元。
扩大培养成本：100L混合培养液成本168.58元，水电费10元，合计178.58元。
种子培养加扩大培养共234.78元。
扩大培养设备1套，按1万元计。
培养耗时：种子培养耗时36h，扩大培养耗时24h，共计耗时72h。
实施例1与对比例1相比生产100L混合菌液可节省155.54元，节约成本39.85％。如果上大罐培养更节省培养设备1套，按100L的培养罐计算可节省设备费1万元左右。同时节省时间20小时，还节约了相应的劳力，使2套设备2组培养成为1套设备1组培养。
实施例1混合培养和对比例1单独培养活菌生长情况如下：
1.植物乳杆菌单独培养生长情况(扩大培养最终结果)
接种2小时后开始快速生长，4小时进入对数生长期，酸度开始急骤下降，最低可达到4.4pH，培养24小时活菌总数可达到1×1011-12CFU/ml。
2.枯草芽孢杆菌单独培养生长情况(扩大培养最终结果)
接种2小时后开始快速生长，4小时进入对数生长期，酸度较稳定，但有小幅上升，可达到pH8.5左右，培养24小时活菌总数可达到1×1010-11CFU/ml。
3.双菌混合培养(扩大培养最终结果)
在混合培养基中，2小时左右开始生长，4小时进入对数生长期，酸度下降明显，需每小时调节pH值1次。一直到18小时生长迅速，18小时后进入衰退期，生长速度变慢，pH下降缓慢。培养24小时植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌分别达到1×1012-13和2×1011-12。双菌培养的活菌数明显高于单独培养的活菌数。
以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.两种不同杆菌同时进行培养的液体培养基，其特征在于：所述液体培养基包括酵母膏12-18g、葡萄糖10-15g、KH2PO4 1.6-4.2g、NaCl 2.5-4.5g、硫酸镁1-3g、硫酸锰0.2-0.4g、吐温-80 0.5-2.5ml、蛋白胨10-15g、脱脂牛奶80-120ml或者脱脂奶粉10-15g、牛肉膏0.8-1.5g、胡萝卜汁8-15ml、番茄汁10-15ml、蒸馏水加至1000ml，pH调节至7.0-7.2。
2.根据权利要求1所述的两种不同杆菌同时进行培养的液体培养基，其特征在于：所述液体培养基配制好后，放入玻璃瓶中，在高压锅中压121℃灭菌20min，冷却至室温待接种。
3.根据权利要求1所述的两种不同杆菌同时进行培养的液体培养基，其特征在于：所述胡萝卜汁制作方法如下，取胡萝卜100克，切丁，入榨汁机加水20ml，榨成汁。
4.两种不同杆菌同时进行培养的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)植物乳杆菌试管斜面菌种培养：选择复苏后活力旺盛的植物乳杆菌菌种，接种至试管MRS琼脂斜面培养基，37℃培养48-72h，为斜面菌种；
(2)植物乳杆菌一级种子液培养：在1000ml三角瓶中加入400mlMRS培养基，121℃灭菌15min，待培养基降至37℃，用10ml灭菌生理盐水分3次将试管斜面中的菌苔洗到400ml MRS琼脂斜面培养基的瓶中，在120r/min、37℃条件下培养24h，得到植物乳杆菌一级种子液；
(3)枯草芽孢杆菌试管斜面菌种培养：选择复苏后活力旺盛的枯草芽孢杆菌菌种，接种至试管NA琼脂斜面培养基，34-36℃培养18-24h，为斜面菌种；
(4)枯草芽孢杆菌一级种子液培养：在1000ml三角瓶中加入400mlNB培养基，121℃灭菌20min，待培养基降至37℃，用10ml灭菌生理盐水分3次将试管斜面中的菌苔洗到400ml NB培养基的瓶中，在搅拌转速120-150r/min、34-36℃条件下培养18-24h，得到枯草芽孢杆菌一级种子液；
(5)二级种子液培养：将权利要求1所述的两种不同杆菌同时进行培养的液体培养基作为二级种子培养基，配制6000ml二级种子培养基，121℃灭菌20min，待培养基降至37℃，分别将植物乳杆菌一级种子液和枯草芽孢杆菌一级种子液接种至二级种子培养基中，在搅拌转速120-150r/min、35-37℃条件下培养22-24h，得到二级种子培养液；
(6)扩大培养：配制植物乳酸杆菌与枯草芽孢杆菌混合菌培养扩大培养基100L，121℃灭菌20min，待扩大培养基降至37℃，将二级种子培养液接种到扩大培养基中，在搅拌转速120-150r/min、34-37℃条件下培养22-24h，得到扩大混合培养液。
5.根据权利要求4所述的两种不同杆菌同时进行培养的培养方法，其特征在于：所述步骤(1)中，植物乳酸杆菌每400ml MRS培养液接种试管琼脂斜面菌苔1管，所述步骤(2)中，枯草芽孢杆菌每400ml NA培养液接种试管琼脂斜面菌苔1管。
6.根据权利要求4所述的两种不同杆菌同时进行培养的培养方法，其特征在于：所述步骤(1)、(3)中，培养量为400ml的MRS液和400mlNA的培养液，分别接种植物乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌斜面菌苔1试管；所述步骤(4)中，二级种子培养液中枯草芽孢杆菌一级种子培养液和植物乳酸杆菌一级种子培养液接种量的体积百分比均为5-8％；所述步骤(6)中，扩大培养基中二级种子培养液接种量的体积百分比均为为5-8％。
7.根据权利要求4所述的两种不同杆菌同时进行培养的培养方法，其特征在于：所述步骤(6)中，扩大培养基包括酵母膏1200-1800g、脱脂牛奶4000-5200ml或者脱脂奶粉500-650g、番茄汁1000ml、硫酸镁2.6-4.2g、葡萄糖1000-1500g、硫酸锰3g、磷酸二氢钾200g、氯化钠100g、豆粕粉1.5-2.5kg，加水至100L，pH调节至7.0-7.2，培养基121℃灭菌20min冷却至室温。
8.根据权利要求5所述的两种不同杆菌同时进行培养的培养方法，其特征在于：所述番茄汁的制作方法如下，取新鲜番茄1100克去皮，切块，用捣碎机或榨汁机榨成糊状，补水至1100ml，搅匀。
9.根据权利要求4所述的两种不同杆菌同时进行培养的培养方法，其特征在于：所述步骤(6)中，全程将pH值控制在6.0-6.5，pH低于6.0时加氢氧化铵调节酸度至pH 6.5，18小时后不再调节pH值。
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Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101703528A (zh) * | 2009-11-25 | 2010-05-12 | 王立平 | 一种治疗糖尿病的复合微生物制剂及其制备方法和应用 |
| CN102067941A (zh) * | 2010-12-09 | 2011-05-25 | 四川省食品发酵工业研究设计院 | 一种饲用复合微生物制剂的生产方法 |
| CN103013890A (zh) * | 2012-12-27 | 2013-04-03 | 山东大学 | 一种乳酸杆菌和芽孢杆菌混合培养的方法 |
| CN103451132A (zh) * | 2013-08-23 | 2013-12-18 | 福建大用生态农业综合发展有限公司 | 一种用于养殖饲料发酵处理的复合微生态制剂 |
| CN104293694A (zh) * | 2014-09-03 | 2015-01-21 | 广西博世科环保科技股份有限公司 | 一种污泥好氧堆肥复合菌剂的制备方法 |
| WO2016153267A1 (ko) * | 2015-03-24 | 2016-09-29 | (주)씨드바이오 | 복합 미생물 종균을 이용하여 제조된 사료 첨가제 및 그 제조 방법 |
| CN107760616A (zh) * | 2017-07-25 | 2018-03-06 | 青岛海芬健康产业科技有限公司 | 一种降解厨余垃圾的微生物菌剂及其制备方法 |
| CN108277178A (zh) * | 2018-02-02 | 2018-07-13 | 山东凤凰生物有限公司 | 一种双歧杆菌和乳酸杆菌的工业化高密度混合发酵培养基、发酵培养方法以及菌粉包埋方法 |
| CN111187739A (zh) * | 2020-02-14 | 2020-05-22 | 广东中科无抗养殖科技有限公司 | 一种复合微生物制剂及其培养方法与应用 |
| CN112280707A (zh) * | 2020-10-22 | 2021-01-29 | 黑龙江益菌生物科技有限公司 | 一种饲料用益生菌的制备方法 |
| CN113462620A (zh) * | 2021-08-26 | 2021-10-01 | 福建傲农生物科技集团股份有限公司 | 一种饲用复合菌剂的制备方法及其应用 |
-
2021
- 2021-10-29 CN CN202111267461.1A patent/CN113881600A/zh active Pending
Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101703528A (zh) * | 2009-11-25 | 2010-05-12 | 王立平 | 一种治疗糖尿病的复合微生物制剂及其制备方法和应用 |
| CN102067941A (zh) * | 2010-12-09 | 2011-05-25 | 四川省食品发酵工业研究设计院 | 一种饲用复合微生物制剂的生产方法 |
| CN103013890A (zh) * | 2012-12-27 | 2013-04-03 | 山东大学 | 一种乳酸杆菌和芽孢杆菌混合培养的方法 |
| CN103451132A (zh) * | 2013-08-23 | 2013-12-18 | 福建大用生态农业综合发展有限公司 | 一种用于养殖饲料发酵处理的复合微生态制剂 |
| CN104293694A (zh) * | 2014-09-03 | 2015-01-21 | 广西博世科环保科技股份有限公司 | 一种污泥好氧堆肥复合菌剂的制备方法 |
| WO2016153267A1 (ko) * | 2015-03-24 | 2016-09-29 | (주)씨드바이오 | 복합 미생물 종균을 이용하여 제조된 사료 첨가제 및 그 제조 방법 |
| CN107760616A (zh) * | 2017-07-25 | 2018-03-06 | 青岛海芬健康产业科技有限公司 | 一种降解厨余垃圾的微生物菌剂及其制备方法 |
| CN108277178A (zh) * | 2018-02-02 | 2018-07-13 | 山东凤凰生物有限公司 | 一种双歧杆菌和乳酸杆菌的工业化高密度混合发酵培养基、发酵培养方法以及菌粉包埋方法 |
| CN111187739A (zh) * | 2020-02-14 | 2020-05-22 | 广东中科无抗养殖科技有限公司 | 一种复合微生物制剂及其培养方法与应用 |
| CN112280707A (zh) * | 2020-10-22 | 2021-01-29 | 黑龙江益菌生物科技有限公司 | 一种饲料用益生菌的制备方法 |
| CN113462620A (zh) * | 2021-08-26 | 2021-10-01 | 福建傲农生物科技集团股份有限公司 | 一种饲用复合菌剂的制备方法及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 刘慧: "《现代食品微生物学》", 中国轻工业出版社, pages: 113 * |
| 梁含;马召稳;于思颖;李旺;: "呕吐毒素降解菌的筛选、鉴定及应用", 中国畜牧杂志, no. 12, pages 120 - 124 * |
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