CN117778249A - 一种丁酸梭菌菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域。本发明提供了一种抗逆性强且具有体外抗氧化力的丁酸梭菌菌株(Clostridiumbutyricum)HY‑17及其应用。所述丁酸梭菌菌株耐酸，耐高温，并具有体外抗氧化能力。本发明的丁酸梭菌菌株能够在高温下保持菌体的活性，提高了丁酸梭菌的存活率，确保丁酸梭菌菌剂的有效性和稳定性；也能在胃酸等酸性环境中更好地存活和繁殖，增强了丁酸梭菌菌剂在消化道内的存活能力，提高了产品的适应性和效果；同时减少了氧化应激对菌体的损伤，增强了丁酸梭菌菌剂的稳定性和保质期。

Description

一种丁酸梭菌菌株及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种丁酸梭菌菌株及其应用。

背景技术

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)属于梭状芽孢杆菌，又称酪酸梭菌，是芽孢杆菌科、梭菌属的一种产丁酸、严格厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌。丁酸梭菌是动物的正常肠道菌，广泛存在于动物粪便、土壤、干酪、自然酸奶中。菌体呈杆状，长3.0-7.0m，宽0.6-1.2m，周身鞭毛，能运动，偶见有丝状菌体，常含有偏心或次端生的卵圆形孢子。

抗氧化性作用涉及清除氧自由基，其中氧自由基主要类型为超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基、单线态氧等。体内氧自由基与机体的许多疾病的发生密切相关，氧自由基的增加，会引起机体氧化应激的增加。

目前丁酸梭菌已经做为饲料添加剂被允许在饲料中添加，抗腹泻类作用比许多促生长抗生素效果还要明显。但是由于其发酵水平较低严重影响着丁酸梭菌的应用，如何通过诱变育种筛选高产并且抗逆性强的丁酸梭菌菌株，是丁酸梭菌产品推广的主要途径。

但目前的研究没有将丁酸梭菌的抗逆性和抗氧化性作用结合在一起，作为特定的指标筛选符合要求的丁酸梭菌。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种抗逆性强且具有体外抗氧化力的丁酸梭菌菌株及其应用。

本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种丁酸梭菌菌株(Clostridiumbutyricum)HY-17，中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M20232605；所述丁酸梭菌菌株耐酸，耐高温，并具有体外抗氧化能力。

本发明还提供一种丁酸梭菌菌剂，所述丁酸梭菌菌剂包含所述丁酸梭菌。

优选地，所述的丁酸梭菌菌剂制备步骤包括：

S1.取所述丁酸梭菌菌株接种于RCM培养基，37±1℃温度下厌氧培养3-4d，进行发酵培养，得到丁酸梭菌发酵液；

S2.离心分离所述丁酸梭菌发酵液，再进行浓缩干燥，与常规辅料混合制成丁酸梭菌干粉。

进一步优选地，所述RCM培养基的组分包括：酵母粉3.5-4.5g/L，牛肉粉10-12g/L，蛋白胨10-12g/L，可溶性淀粉1-2g/L，葡萄糖5-10g/L氯化钠2.5-3g/L，醋酸钠2-3g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5-0.6g/L。

优选地，所述厌氧培养的方法包括：向所述RCM培养基充入氮气或二氧化碳，再加入液体石蜡覆盖。

优选地，所述发酵培养初始pH为6.8-7.2。

基于上述技术方案，本发明还提供所述的丁酸梭菌菌剂在益生菌菌剂、保健品或食品添加剂、兽药或饲料添加剂方面的应用。

本发明的丁酸梭菌菌株及其应用相对于现有技术具有以下有益效果：

(1)本发明提供的丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)HY-17具有良好的耐热性和耐酸性，同时具有体外抗氧化力，能够在高温下保持菌体的活性，提高了丁酸梭菌的存活率，确保丁酸梭菌菌剂的有效性和稳定性；也能在胃酸等酸性环境中更好地存活和繁殖，增强了丁酸梭菌菌剂在消化道内的存活能力，提高了产品的适应性和效果；同时减少了氧化应激对菌体的损伤，增强了丁酸梭菌菌剂的稳定性和保质期。

(2)本发明的丁酸梭菌HY-17具有对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除能力，在保护细胞免受氧化损伤，预防老化，或延长食品的保质期，减少食品的氧化变质等方面具有应用潜力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明菌株在固体培养基上的菌落形态；

图2为本发明实施例3的生长曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚，完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

实施例1

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)HY-17的获得

1、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)HY-17的分离和鉴定

从5只鸡的盲肠内容物取各1g，混匀，取其中l g加入9mL的PBS缓冲液中，置于80℃水浴热处理10分钟。取100μl样品置于RCM培养基中，向所述RCM培养基充入氮气，再加入液体石蜡覆盖。在37℃厌氧富集培养24h。将富集培养得到的样品分别稀释到10^-2，10^-4，10^-6，取100μl涂布于固定培养基平板上，37℃厌氧培养48h，挑选严格厌氧生长菌株进行镜检，对分离得到的具有梭菌属特征的菌株，待单一菌落在平板上形成后进行观察，如图1所示。菌株的生理生化鉴定按照《常见细菌系统鉴定手册》进行。

丁酸梭菌鉴定结果：菌落颜色奶油色，菌体呈梭杆状，端圆、直或弯曲，产芽孢的革兰氏阳性菌。MR试验、淀粉水解试验结果呈阳性，VP试验、硝酸盐还原试验和明胶水解试验结果呈阴性。

培养基配方如下：

RCM培养基：酵母粉3.5g/L，牛肉粉10g/L，蛋白胨10g/L，可溶性淀粉1g/L，葡萄糖5g/L氯化钠2.5g/L，醋酸钠2g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，蒸馏水1000ml，pH 6.8。

富集培养基：酵母粉5g/L，牛肉粉20g/L，蛋白胨20g/L，可溶性淀粉2g/L，葡萄糖10g/L氯化钠2.5g/L，醋酸钠2g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，蒸馏水1000ml，pH 7.0。

固体培养基：在富集培养基配方上再添加质量百分数1.5％的琼脂粉。

提取细菌总DNA，PCR扩增细菌16S rDNA，扩增产物经测序后与GenBank中已知16SrDNA序列进行比对分析，鉴定为丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)，菌种命名为HY-17，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M 20232605。

实施例2

丁酸梭菌菌剂的制备

S1.取所述丁酸梭菌菌株，接种于RCM培养基中，向所述RCM培养基充入二氧化碳，再加入液体石蜡覆盖。37℃温度下进行厌氧培养3天，进行发酵培养，得到丁酸梭菌发酵液。

S2.将将上述活菌数达到10⁹CFU/mL以上的丁酸梭菌发酵液丁酸梭菌发酵液进行离心分离，以分离出丁酸梭菌细胞及其代谢产物。

S3.将分离出的丁酸梭菌细胞进行浓缩干燥，制备出丁酸梭菌干粉。

S4.将丁酸梭菌干粉与钙盐、阿拉伯胶、麦芽糊精、二氧化硅混合，制成丁酸梭菌干粉制剂。

将制备完成的菌剂存储于15-18℃干燥环境下，定期检测菌剂存放稳定性，活菌数在24个月后为7.5×10⁸CFU/g，表明本发明所述的丁酸梭菌制备得到的固体菌剂稳定性良好。

实施例3

生长曲线测试

将丁酸梭菌菌粉用无菌生理盐水梯度稀释后涂布于固体培养平板上，待长出肉眼可见菌落后以无菌操作技术将丁酸梭菌单菌落接入A、B两组装有100ml无菌RCM培养基的三角瓶中，37℃，厌氧静置培养18h，分别获得A、B组的丁酸梭菌菌悬液。

A组的RCM培养基：酵母粉3.5g/L，牛肉粉10g/L，蛋白胨10g/L，可溶性淀粉1g/L，葡萄糖5g/L氯化钠2.5g/L，醋酸钠2g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，蒸馏水100ml，pH 6.8。

B组的RCM培养基：酵母粉4.5g/L，牛肉粉12g/L，蛋白胨12g/L，可溶性淀粉2g/L，葡萄糖10g/L氯化钠3g/L，醋酸钠3g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.6g/L，蒸馏水100ml，pH 7.2。

取48支分别装有10ml无菌RCM培养基的试管分别加入丁酸梭菌菌悬液200μl，另设一空白对照组(不加菌悬液)，厌氧静置培养。每隔2h用分光光度计进行吸光度的测定，在600nm波长，10mm光径的比色杯中依次进行OD₆₀₀的测定，实验结果如图2所示，表明在在两组RCM培养基中丁酸梭菌均生长情况良好。

实施例4

耐酸性测试

配置氯化钠3g/L溶液，并用盐酸(0.1M)调整至pH 2、pH 3和pH 4。充分溶解后用0.22m滤膜过滤除菌，使用前进行37℃预热。将1mL菌液37℃处理2h后取出稀释涂布，置于37℃厌氧培养48h。根据菌落数计算菌株在人工液中的存活率。三个重复样，计算平均存活率。

实施例5

耐热性测试

取菌液样品1mL到9mL(80％甘油)的试管中涡震荡充分混后分别置于60℃、70℃、80℃、90℃水浴中处理5min，置于冰水混合物中冷却，将经过热处理后的菌体3000rpm离心10分钟，PBS洗涤两次后重悬梯度稀释平板法测定其活菌数。三个重复样，计算平均存活率。

实施例6

体外抗氧化力测试

将培养好的丁酸梭菌进行离心，收集菌体，用PBS缓冲液洗涤干净，然后用超声波打碎细胞，离心沉淀，得到细胞提取液。

对羟基自由基(·OH)的清除活性测定：实验使用H₂O₂-FeSO₄体系研究胞外多糖对羟基自由基的清除作用。反应体系3.0mL，分别含有25mmol/L的FeSO₄，2mmol/L的水杨酸钠，6mmol/L的H₂O₂。将整个混合体系置于37℃恒温培养1h，在510nm测定吸光值。

对超氧阴离子自由基(O₂ ^-·)清除活性的测定超氧阴离子自由基(O₂ ^-·)，通过邻三酚在微碱条件下自氧化体系产生。反应体系3mL，50mmol/L的Tris-HC1缓冲液(pH 8.2)和10μl 45mmol/L的邻苯三酚。混合前Tris-HC1缓冲液在25℃保温20min。混合体系置于25℃的恒温水浴保温4min，在325nm测定吸光值分别以不含细胞提取液和同等浓度的Vc作为空白和阳性对照，每隔30s测1次吸光度，计算线性范围内每分钟的增值，即为邻苯三酚的自氧化速率。

对比例1-3

在对比例1-3中，使用菌株丁酸梭菌CBM01购自中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCAB 2017089。分别参照实施例4-6的实验步骤进行丁酸梭菌CBM01的耐酸性测试、耐热性测试以及体外抗氧化力测试。

表1实施例3和对比例1的耐酸性测试结果，存活率为3次重复样计算的平均值。

菌株耐酸性测试的实验结果如表1所示，表明本发明的丁酸梭菌HY-17表现出了良好的耐酸性，并且在pH2-4的范围，均比对照菌株CBM01的耐酸性更强。

表2实施例4与对比例2的耐热性测试结果，存活率为3次重复样计算的平均值。

菌株	60℃	70℃	80℃	90℃
					HY-17	100％	100％	100％	91.70％
CBM01	100％	100％	100％	89.20％

菌株耐热性的实验结果如表2所示，本发明的丁酸梭菌HY-17在高温80℃时，菌株的存活率仍然为100％，90℃时也还在90％以上，表明本发明所筛选得的丁酸梭菌HY-17耐热性能良好。并且对比CBM01菌株，在90℃表现出更好的存活率。说明本发明的丁酸梭菌HY-17耐热性能较CBM01菌株更好。

表3实施例5与对比例3的体外抗氧化力测试结果。

菌株	对·OH的清除率	对O2 -·的清除率
			HY-17	73.20％	92.50％
CBM01	23.10％	58.70％
			Vc(control)	62.10％	90.90％

菌株抗氧化力测试的实验结果如表3所示，可知，本发明的丁酸梭菌HY-17可有效清除·OH，能够在病理条件下防止由羟基自由基引起的损伤。作为活性自由基的前体，超氧阴离子以及产生其他活性氧物质在诱导脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤方面起到重要作用，本发明的丁酸梭菌HY-17也具有对O₂ ^-·的清除活性。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改，等同替换，改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种丁酸梭菌菌株，其特征在于，所述丁酸梭菌菌株为丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)HY-17，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20232605；所述丁酸梭菌菌株耐酸，耐高温，并具有体外抗氧化能力。

2.一种丁酸梭菌菌剂，其特征在于，所述丁酸梭菌菌剂包含如权利要求1所述的丁酸梭菌菌株。

3.如权利要求2所述的丁酸梭菌菌剂，其特征在于，制备步骤包括：

S1.取所述丁酸梭菌菌株接种于RCM培养基，37±1℃温度下厌氧培养3-4d，进行发酵培养，得到丁酸梭菌发酵液；

S2.离心分离所述丁酸梭菌发酵液，再进行浓缩干燥，与常规辅料混合制成丁酸梭菌干粉。

4.如权利要求3所述的丁酸梭菌菌剂，其特征在于，所述RCM培养基的组分包括：酵母粉3.5-4.5g/L，牛肉粉10-12g/L，蛋白胨10-12g/L，可溶性淀粉1-2g/L，葡萄糖5-10g/L氯化钠2.5-3g/L，醋酸钠2-3g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5-0.6g/L。

5.如权利要求3所述的丁酸梭菌菌剂，其特征在于，所述厌氧培养的方法包括：向所述RCM培养基充入氮气或二氧化碳，再加入液体石蜡覆盖。

6.如权利要求3所述的丁酸梭菌菌剂，其特征在于，所述发酵培养初始pH为6.8-7.2。

7.如权利要求2-6中任一项所述的丁酸梭菌菌剂在益生菌菌剂、保健品或食品添加剂、兽药或饲料添加剂方面的应用。