CN118147005A - 一种鼠李糖乳杆菌及其选育方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鼠李糖乳杆菌及其选育方法和应用，涉及微生物领域。该鼠李糖乳杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63929。该鼠李糖乳杆能有效清除并抑制肠炎产气荚膜梭菌的增殖，可在畜禽养殖中用于抗产气荚膜梭菌感染。

Description

一种鼠李糖乳杆菌及其选育方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种鼠李糖乳杆菌及其选育方法和应用。

背景技术

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,Cp)是一种革兰阳性厌氧菌，又名为魏氏梭菌，能够产生孢子，它广泛存在于土壤、污水、沉积物以及人和动物的消化道中，可以在环境中水平传播。Cp通过产生的毒素造成畜禽的疾病。Cp所分泌的外毒素已经达到20余种，基于其产生的主要致死性毒素的差异，将Cp分成A、B、C、D和E等毒素型。其中，A型产气荚膜梭菌主要引起人类的食物中毒、气性坏疽、胃肠道疾病、婴幼儿猝死综合症，以及动物毒血症和禽类的坏死性肠炎等；B、C、D和E型产气荚膜梭菌主要引起畜禽的肠道疾病，同时C型产气荚膜梭菌还能引起人类的坏死性肠炎。近年来，Cp感染所引起的畜禽发病数量在我国逐年增多，流行特点也由点状散发发展为片状散发，给我国养殖业造成了巨大经济损失。长期以来，针对Cp的有效治疗仍需应用抗生素，然而抗生素因早期被广泛地添加于动物饲料、饮水中，使得Cp多重耐药性加剧。这不仅对临床治疗造成了极大困难，还严重威胁公共安全和人类健康，因此针对畜禽养殖业Cp进行抗生素敏感性检测以为相关疾病的治疗和合理使用抗生素具有重要意义，更重要的是寻找更合理的预防和治疗方法。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种鼠李糖乳杆菌，该鼠李糖乳杆能有效清除并抑制肠炎产气荚膜梭菌的增殖，可在畜禽养殖中用于抗产气荚膜梭菌感染。

为了达到上述目的，本发明提供一种鼠李糖乳杆菌，该鼠李糖乳杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63929。

本发明还提供了所述鼠李糖乳杆菌的选育方法，该选育方法包括以下步骤：将虾肠道内容物稀释，涂布于培养基，进行培养，得到菌落，挑取黄色的单菌落，纯化。

本发明还提供了一种发酵液，该发酵液由所述鼠李糖乳杆菌发酵得到。

本发明还提供了所述发酵液的制备方法，包括以下步骤：将所述鼠李糖乳杆菌接种于培养基，进行发酵，发酵至pH≤3.5时，停止发酵，得到发酵液。

在其中一个实施例中，所述发酵的温度为25-50℃。

本发明还提供了一种代谢产物，该代谢产物由所述发酵液浓缩得到。

本发明还提供了所述代谢产物的制备方法，包括以下步骤：将所述发酵液煮沸，离心，取上清液，得到代谢产物。

在其中一个实施例中，所述煮沸的时间为1-20min，所述离心的转速为5000-12000rpm，离心的时间为1-20min。

本发明还提供了一种药物，包括药学上可接受的辅料和药物活性成分，所述药物活性成分包括所述代谢产物。

在其中一个实施例中，所述辅料包括溶剂，崩解剂，矫味剂，着色剂，润滑剂，抗氧剂，防腐剂，黏合剂，填充剂，或增稠剂中的至少1种。

在其中一个实施例中，所述药物为抗产气荚膜梭菌的药物。

在其中一个实施例中，所述药物为治疗和/或预防肠炎的药物，所述肠炎由产气荚膜梭菌感染导致。

本发明还提供了所述鼠李糖乳杆菌、所述发酵液和/或所述代谢产物在制备抗产气荚膜梭菌药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种鼠李糖乳杆菌及其选育方法和应用，该鼠李糖乳杆能有效清除并抑制肠炎产气荚膜梭菌的增殖，可在畜禽养殖中用于抗产气荚膜梭菌感染。

附图说明

图1为实施例1中的鼠李糖乳杆菌菌落图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

来源：

本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规实验方法。

保藏说明：

细菌名称：Lacticaseibacillus rhamnosus LR-HXHG01

保藏机构：广东省微生物菌种保藏中心

保藏机构简称：GDMCC

地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼

保藏日期：2023年10月25日

保藏中心登记入册编号：GDMCC No：63929

实施例1

鼠李糖乳杆菌的分离培养。

一、鼠李糖乳杆菌的分离、培养。

取对虾肠道内容物进行10倍比稀释，采用涂布法，取100μL的液体涂布于含体积浓度为0.01％溴甲酚紫的MRS培养基，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱，培养48h，得到菌落。

二、鼠李糖乳杆菌的筛选和鉴定。

挑取在体积浓度为0.01％溴甲酚紫的MRS培养基上变黄的单菌落，采用平板划线，在MRS培养基上挑取单菌落，在MRS培养基上三区划线，挑取单菌落重复进行3-5次纯化，挑取生长48h的菌落进行16S rDNA鉴定。提取分离菌株的基因组DNA，对其进行扩增和测序，得到该菌株的16S rDNA片段。将16SrDNA基因序列提交NCBI进行在线比对，结合菌株的形态学特征、生理生化鉴定，筛选得到鼠李糖乳杆菌，如图1所示，将其命名为LR-HXHG01。

实施例2

发酵液及代谢产物的制备。

一、采用如下方法制备发酵液：

鼠李糖乳杆菌(实施例1制得)划线平板，平板为MRS固体培养基，划线的平板在30℃下生长48h；

MRS固体培养基中挑取鼠李糖乳杆菌单菌落于5mL的MRS液体培养基中，在30℃下静置生长24h；

以体积比5％的接种量接种到MRS液体培养基中进行培养；

于30℃下静置发酵，每1h-2h振荡一次；发酵至8h或者监测到pH值低于3.5时即可停止发酵，获得鼠李糖乳杆菌发酵液。

二、采用如下方法制备代谢产物：

发酵结束后，加热煮沸5min；将煮沸的发酵液10000rpm离心5min，取上清，获得鼠李糖乳杆菌代谢产物。

实施例3

鼠李糖乳杆菌的代谢产物对产气荚膜梭菌生长的抑制作用。

将复苏的产气荚膜梭菌接种至液体培养基，在37℃厌氧培养24h，得到产气荚膜梭菌液，用液体培养基稀释至1×10⁸CFU/mL。

采用盐酸调节产气荚膜梭菌液体培养基至pH2.5，作为稀释液，用稀释液将液体鼠李糖乳杆菌代谢产物(由实施例2制备得到)进行5倍、10倍、20倍稀释。

取无菌试管，分别为空白对照组、鼠李糖乳杆菌代谢产物原液组、1:5组、1:10组、1:20组，每根管中加入5mL稀释至1×10⁸CFU/mL的产气荚膜梭菌液，随后分别加入5mL稀释至不同倍数的鼠李糖乳杆菌代谢产物，原液组加入鼠李糖乳杆菌代谢产物(由实施例2制备得到)，空白对照组加入稀释液。随后于37℃厌氧环境作用2h。作用结束后，采用10mmol/L的氢氧化钠将其反应液调整至pH＝7.0，将作用后的液体进行倍比稀释后平板培养计数。结果如下表所示，其中，1、2、3为同一时间的3次平行实验。

表1不同浓度鼠李糖乳杆菌代谢产物对肠炎产气荚膜梭菌的杀伤效果

通过上表发现，原液组和1:5组没有产气荚膜梭菌生长，1:10组和1:20组相比空白对照产气荚膜梭菌数量也大大降低，所以鼠李糖乳杆菌代谢产物可有效抑制肠炎产气荚膜梭菌。

实施例4

鼠李糖乳杆菌对产气荚膜梭菌的体外抑菌作用研究。

一、实验方法。

1、细胞培养。

采用结肠癌细胞系Caco-2作为体外细胞粘附模型研究鼠李糖乳杆菌对产气荚膜梭菌在Caco-2细胞粘附的影响。将Caco-2细胞置于含双抗的DMEM(含10％胎牛血清和1％非必需氨基酸)培养液中，于37℃、5％CO₂和95％空气培养箱中培养，待细胞生长良好时，采用0.25％胰酶-EDTA消化液消化传代，用DMEM细胞完全培养液调节细胞浓度为1×10⁵个/mL，装于六孔组织培养板中，用于下述粘附试验。

2、对产气荚膜梭菌竞争性粘附抑制。

将0.5mL的鼠李糖乳杆菌液(浓度1×10⁸CFU/mL)、0.5mL MRS液体培养基和0.5mL产气荚膜梭菌液(浓度1×10⁸CFU/mL)加到含1mL DMEM细胞培养液的六孔板中，同时设置0.5mL PBS缓冲液和0.5mL产气荚膜梭菌的对照实验，37℃、5％CO₂孵育2.0h，孵育后吸去培养液，并用无菌PBS缓冲液洗涤3次，每次洗涤时用巴氏吸管轻轻吹打，以除去未粘附的菌体。加入0.5mL胰酶-EDTA消化液消化，消化后加入0.5mL的无菌PBS缓冲液混合均匀，并用巴氏吸管吹打终止消化，梯度稀释平板计数，并计算出粘附的菌数。采用选择性培养基平板计数，计算粘附抑制率。竞争性粘附抑制率％＝(对照实验组－实验组)/对照实验组×100％。

3、对产气荚膜梭菌排斥性粘附抑制。

在含1mL DMEM培养液的六孔板中，分别加入1mL鼠李糖乳杆菌液(浓度1×10⁸CFU/mL)、1mL MRS液体培养基，对照组加入1mL的PBS缓冲液，37℃、5％CO₂培养箱中孵育1.0h后，吸去培养液并用无菌PBS缓冲液洗涤3次。加入1mL DMEM培养液和1mL产气荚膜梭菌液(浓度1×10⁸CFU/mL)，37℃、5％CO₂培养箱中孵育1.0h。采用选择性培养基平板计数，计算粘附抑制率。排斥性粘附抑制率％＝(对照实验组－实验组)/对照实验组×100％。

4、对产气荚膜梭菌置换性粘附抑制

同三中步骤类似，不同处是产气荚膜梭菌先粘附孵育1.0h，而后鼠李糖乳杆菌菌悬液MRS液体培养基等去取代置换粘附的产气荚膜梭菌。置换性粘附抑制率％＝(对照实验组－实验组)/对照实验组×100％。

二、实验结果。

鼠李糖乳杆菌对产气荚膜梭菌竞争性粘附抑制率达到80％，对产气荚膜梭菌排斥性粘附抑制率达到85％，对产气荚膜梭菌置换性粘附抑制达到32％。鼠李糖乳杆菌能够显著性的抑制产气荚膜梭菌在Caco-2细胞上的粘附。

实施例5

鼠李糖乳杆菌对产气荚膜梭菌在肉鸡盲肠定植的影响。

实验方法：将120只肉鸡随机分成3个处理组：阴性对照组(饲喂基础日粮，不进行产气荚膜梭菌感染)、阳性对照组(饲喂无抗生素基础日粮，并进行产气荚膜梭菌感染)、鼠李糖乳杆菌实验组(鼠李糖乳杆菌的添加剂量均为10⁹cfu/kg日粮，并进行产气荚膜梭菌感染)。鼠李糖乳杆菌通过发酵冻干，制成菌粉添加到基础日粮中。每个处理4个重复，每个重复10只鸡。在第5日龄，阴性对照组口腔灌服200μL PBS作为对照，阳性对照组和鼠李糖乳杆菌处理组口腔灌服200μL产气荚膜梭菌感染。感染后第5天进行样品采集分析。

实验结果：结果显示，感染后第5天，阳性对照组鸡肠道样品平均含产气荚膜梭菌2×10⁶CFU/g，鼠李糖乳杆菌实验组鸡肠道样品含产气荚膜梭菌4×10⁴CFU/g，减少了98％，与阳性对照组相比，鼠李糖乳杆菌处理组显著降低了产气荚膜梭菌的在肉鸡盲肠中的定植(P<0.05)。结果表明，在体外具有高抑菌效果和抗黏附能力的鼠李糖乳杆菌可以减少肠炎产气荚膜梭菌在肉仔鸡盲肠中的定植。

经分析，本申请的鼠李糖乳杆菌代谢产物对肠炎产气荚膜梭菌有抑制作用。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种鼠李糖乳杆菌，其特征在于，该鼠李糖乳杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63929。

2.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌的选育方法，其特征在于，该选育方法包括以下步骤：将虾肠道内容物稀释，涂布于培养基，进行培养，得到菌落，挑取黄色的单菌落，纯化。

3.一种发酵液，其特征在于，该发酵液由权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌发酵得到。

4.权利要求3所述发酵液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述鼠李糖乳杆菌接种于培养基，进行发酵，发酵至pH≤3.5时，停止发酵，得到发酵液。

5.一种代谢产物，其特征在于，该代谢产物由权利要求3所述的发酵液浓缩得到。

6.权利要求5所述代谢产物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求3所述的发酵液煮沸，离心，取上清液，得到代谢产物。

7.一种药物，其特征在于，包括药学上可接受的辅料和药物活性成分，所述药物活性成分包括权利要求5所述的代谢产物。

8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药物为抗产气荚膜梭菌的药物和/或用于治疗肠炎的药物。

9.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述辅料包括溶剂，崩解剂，矫味剂，着色剂，润滑剂，抗氧剂，防腐剂，黏合剂，填充剂，或增稠剂中的至少1种。

10.权利要求1所述鼠李糖乳杆菌、权利要求3所述发酵液和/或权利要求5所述代谢产物在制备抗产气荚膜梭菌药物中的应用。