IT202100000176A1 - Preparazioni orali a base di carnosina ad attività antivirale - Google Patents

Description

Titolo: ?Preparazioni orali a base di carnosina ad attivit? antivirale?

DESCRIZIONE

Campo della tecnica dell?invenzione

La presente invenzione trova applicazione nel campo medico e cosmetico e, in particolare, concerne preparazioni orali, come ad esempio un collutorio, per la riduzione della placca dentale e della sua componente patogena, nonch? per la riduzione della carica virale.

Stato dell?arte

Il microbiota orale ? una delle comunit? microbiche pi? diversificate che abitano il corpo umano. Ad oggi sono stati identificati oltre 700 taxa batterici che popolano la cavit? orale formando biofilm sulla superficie dei denti, delle gengive e della lingua, ma anche sulla superficie dei materiali dentari utilizzati, per esempio, per restauri conservativi oppure per soluzioni protesiche di tipo fisso o anche mobile.

Il microbiota orale ? in continua interazione con i fattori ambientali e il suo ospite con cui ? in una relazione di eubiosi.

I cambiamenti nell'equilibrio e nell'integrit? del microbiota orale dovuti a perturbazioni ambientali o dell'ospite possono far prevalere specie patogene su quelle saprofite, portando ad una condizione di disbiosi.

La relazione eubiotica con l'ospite viene interrotta e viene facilitata l'insorgenza di infezioni locali o malattie sistemiche (infezioni polmonari e cardiache, febbre reumatica, setticemia o meningite).

Tra le patologie locali, ovviamente, sono comprese la carie dentale e le diverse forme di parodontite.

In particolare, la carie dentale si contraddistingue per una prevalenza di biofilm contenenti un'alta percentuale di batteri cariogeni.

Streptococcus mutans rappresenta la specie cariogena pi? studiata e rilevante tra le varie specie di microrganismi che coabitano i biofilm che colonizzano le superfici dentali.

La prevenzione e il trattamento delle malattie orali sono spesso ottenuti con l'aiuto di antimicrobici, come antibiotici e antisettici, che agiscono diminuendo il carico microbico totale, causando spesso una disbiosi che pu? essere cos? alla base della malattia.

La clorexidina (CHX) ? un agente battericida fra quelli di uso pi? frequente per l?igiene orale. Si tratta di un agente non selettivo e con un'efficacia ad ampio spettro, che agisce interferendo con la parete batterica citoplasmatica o interna.

La clorexidina quando aggiunta nei prodotti per uso orale quale principale ingrediente attivo ha una concentrazione di circa 0,12-0,3%.

La clorexidina presenta, tuttavia, alcuni inconvenienti; infatti, oltre al fatto di macchiare i denti, ha un gusto estremamente amaro e causa alterazioni della percezione del gusto (disgeusia), che limita la compliance del paziente.

? stato dimostrato che l'uso, soprattutto prolungato, di clorexidina pu? provocare necrosi tissutale e inibizione della rigenerazione.

Inoltre, diversi studi hanno dimostrato che la clorexidina ha indotto danni primari al DNA nei leucociti di ratto e nelle cellule della mucosa orale, fornendo prove di una sua azione genotossica.

La letteratura pi? recente, inoltre, ha messo in discussione i vantaggi di un approccio legato a un trattamento antisettico indifferenziato e avente un impatto profondo e non specifico sui biofilm orali.

In particolare, ? stato scoperto che la clorexidina, inducendo un trattamento ampio e non mirato, pu? avere un elevato impatto sull'innata comunit? microbica commensale.

In particolare, ? stato riscontrato che la clorexidina mostra una temporanea inattivazione del biofilm orale a cui fa seguito una rapida ricrescita, indicando cos? che l'attivit? antisettica ? insufficiente e quindi inefficace nel mantenimento dell'igiene orale a lungo termine.

Inoltre, l'ampio spettro di attivit? non pu? garantire una ricrescita verso uno stato pi? sano (eubiotico), ma al contrario pu? perturbare ulteriormente il microbioma commensale.

Un recente studio in vivo mostra, ad esempio, che il trattamento con clorexidina ha prodotto abbondanze relative pi? elevate di numerosi taxa correlati alla parodontite (Fusobacterium).

Inoltre, recentemente hanno riferito che il trattamento del biofilm con la clorexidina ha mostrato profondi spostamenti da una comunit? dominata da V. parvula (99%) a una comunit? dominata da streptococco, pi? specificamente Streptococcus gordonii (98%) e questo ? spiegato dalla tolleranza sviluppata da S. gordonii alla clorexidina.

Il L-lattato ? il metabolita primario di Streptococcus gordonii e conduce ad un ambiente acido che ? responsabile della demineralizzazione dei denti, aumentando il rischio di carie dentale.

Il controllo della concentrazione di H3O<+ >(pH) nella saliva e pellicole salivari e nel biofilm stesso ? un requisito per l'integrit? dei denti e per prevenire la carie.

Il bicarbonato contenuto nella saliva ? il pi? importante sistema tampone che neutralizza gli ioni H3O<+ >derivanti dalla dieta e dai batteri acidogeni contenuti nel biofilm.

La reazione di neutralizzazione mediata da HCO3<- >? catalizzata dall?enzima anidrasi carbonica salivare che porta alla decomposizione dell'acido carbonico in CO2 e H2O accelerando cos? la reazione di neutralizzazione:

HCO3<- >+ H3O = H2CO3 = H2O CO2

Il pH del biofilm orale in condizioni di equilibrio, prima di attivit? fermentative, ? di circa 6,7.

In presenza di zuccheri fermentabili, il pH della placca ? ridotto in breve tempo a meno di 5,0 a causa dell'attivit? metabolica dei batteri acidogeni della placca e a questo valore pH ha luogo la demineralizzazione dei tessuti duri che costituiscono gli elementi dentari.

Il principale costituente minerale dei tessuti duri dentari, l?idrossiapatite, ? un cristallo complesso formato da ioni calcio e fosfato e il reticolo cristallino ? dopato da minime quantit? di altri ioni quali, ad esempio, carbonato, magnesio, stronzio, eventualmente zinco e fluoro.

Generalmente i tessuti duri dentali hanno un pH critico di circa 5,5 (smalto) e 6,2 (dentina).

Qualora il pH del microambiente circostante scende sotto tali valori, inizia la demineralizzazione dei suddetti tessuti. Biofilm orali costituiti da specie patogene acidogene possono raggiungere valori di pH anche inferiori a 4,0 entro qualche minuto dall?assunzione di carboidrati semplici.

In questa condizione, la produzione di acidi organici da parte della placca supera l'attivit? tampone mediata dal sistema bicarbonato/anidrasi carbonica.

Una volta che il pH della placca si ripristina a un livello superiore al pH critico, lo smalto pu? essere remineralizzato in presenza di saliva e fluidi orali che sono sovrasaturati rispetto all'idrossiapatite e alla fluoroapatite.

In condizioni fisiologiche esiste un equilibrio demineralizzazione-remineralizzazione che, se ben bilanciato, mantiene l'integrit? dei tessuti duri nel tempo.

La recente pandemia causata dal coronavirus SARS-COV-2 ha posto nuove sfide alla ricerca di prodotti in grado di ridurre la possibilit? di trasmissione del virus.

E? ormai noto, infatti, che le goccioline (droplets) emesse con il respiro, nel parlare e, in misura maggiore, con colpi di tosse o sternuti, trasportano con loro particelle virali che possono raggiungere persone a breve distanza, causando il diffondersi della malattia.

E? stato appurato che l?alcool etilico ? in grado di ridurre la carica batterica; la concentrazione necessaria, tuttavia, non ne consente l?uso orale.

Riassunto dell?invenzione

Gli inventori della presente domanda di brevetto hanno sorprendentemente trovato che la carnosina, eventualmente in associazione e sinergia con una preparazione di lattobacilli, ? efficace nella prevenzione, nel trattamento e nella cura della placca dentale.

La composizione della presente domanda di brevetto comprende, inoltre, un componente che ha dimostrato di poter ridurre la carica virale orale, anche dovuta al coronavirus SARS-COV-2.

Breve descrizione delle figure

La Figura 1 mostra l?effetto dose dipendente della carnosina nel ridurre l?adesione di S. mutans su di un substrato dopo 2 ore di incubazione. Significativit? vs controllo: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.

La Figura 2 mostra l?effetto dose-dipendente di carnosina nel ridurre la formazione del biofilm di S. mutans. Significativit? vs controllo: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.

La Figura 3 mostra l?effetto dose-dipendente della componente dell?invenzione nel ridurre la formazione del biofilm multiceppo. Significativit? vs controllo: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.

La figura 4 mostra l?effetto di carnosina nell?aumentare la propriet? tampone della saliva e in particolare di neutralizzare gli ioni H<+>.

La figura 5 mostra l?effetto dell?associazione carnosina e lattobacilli nell?incremento del flusso salivare.

Oggetto dell?invenzione

Un primo oggetto della presente invenzione ? rappresentato dall?uso medico della carnosina per la prevenzione e il trattamento della placca dentale.

In un aspetto dell?invenzione, l?uso pu? essere anche di tipo cosmetico.

Secondo una forma realizzativa alternativa dell?invenzione, la carnosina ? in combinazione con un componente caratterizzato da un?attivit? antivirale.

Un secondo oggetto ? rappresentato da una preparazione orale comprendente carnosina per l?uso nella prevenzione e nel trattamento della placca dentale.

Secondo una forma realizzativa alternativa dell?invenzione, la preparazione orale comprendente carnosina comprende, inoltre, un componente caratterizzato da un?attivit? antivirale.

Un terzo oggetto dell?invenzione ? rappresentato da una preparazione comprendente carnosina per il rivestimento di dispositivi medici, materiali dentari e dispositivi protesici orali.

Dispositivi medicali, materiali dentari e dispositivi protesici orali rivestiti con la preparazione di rivestimento dell?invenzione rappresentano ulteriori oggetti dell?invenzione.

In un ulteriore oggetto dell?invenzione ? descritto l?uso medico della preparazione dell?invenzione comprendente carnosina e una preparazione di lattobacilli per il trattamento della xerostomia.

Secondo una forma realizzativa alternativa dell?invenzione, ? descritto l?uso medico della carnosina in combinazione con un componente avente attivit? antivirale.

Descrizione dettagliata dell?invenzione

In accordo con un primo oggetto dell?invenzione ? descritta la carnosina per l?uso medico nella prevenzione e nel trattamento della placca dentale.

Sempre in accordo con un primo oggetto dell?invenzione ? descritta la carnosina per l?uso cosmetico nella prevenzione e nel trattamento della placca dentale.

L?uso ? da intendersi, appunto, sia di tipo medico, laddove significa che viene prevenuta o trattata o curata una patologia oppure si esplica un?attivit?, anche di tipo modulatorio, che concorre alla prevenzione o al trattamento o alla cura di una patologia, come ad esempio la riduzione della placca dentale o la disbiosi del biofilm orale o la carie.

Per quanto concerne, invece, l?uso cosmetico, si intende il miglioramento dell?aspetto estetico, ad esempio nel colore degli elementi dentari, grazie alla prevenzione o riduzione della placca dentale.

Per gli scopi della presente invenzione, la carnosina pu? essere sostituita, completamente o parzialmente, da un suo derivato.

Derivati della carnosina comprendono, in particolare: anserina (N-?-alanil-1-metilistidina), balenina (N-?-alanil-3-metilistidina), omocarnosine (N-4-aminobutiril-istidina), N-acetil-carnosina, carcinina (?-alanil-istamina), Gly-His, carnosinamide.

Per gli scopi della presente invenzione, la carnosina e/o un suo derivato ? in forma libera.

Alternativamente, la carnosina e/o un suo derivato sono nella forma complessata con ioni metallici.

Ioni metallici sono selezionati preferibilmente nel gruppo che comprende: Cu<2+>, Co<2+>, Ni<2+>, Cd<2+>, Zn<2+>, Fe<2+>.

Per gli scopi della presente invenzione, la carnosina o un suo derivato sono descritti per l?uso sopra riportato in una quantit? di circa 0,01-10 (p/v %) e preferibilmente di circa 0,05-5 (p/v %) e pi? preferibilmente di 0,1-2 (p/v %), rispetto ad una formulazione che la comprende.

Ancor pi? preferibilmente, la carnosina (o un suo derivato) ? compresa in una quantit? di circa 0,25% (p/v %).

In accordo con un aspetto particolare dell?invenzione, l?uso medico e/o cosmetico della carnosina, secondo quanto sopra descritto, ? in associazione con una preparazione di lattobacilli.

Per gli scopi della presente invenzione, tale preparazione ? preferibilmente una preparazione di Lactobacillus helveticus o una preparazione di Streptococcus salivarius.

In alternativa, la preparazione comprende sia Lactobacillus helveticus sia Streptococcus salivarius.

In un aspetto preferito dell?invenzione, la preparazione di Lactobacillus helveticus ? una preparazione del Lactobacillus helveticus MIMLh5 (DSM 32422).

In un aspetto preferito dell?invenzione, la preparazione di Streptococcus salivarius ? una preparazione del Streptococcus salivarius ST3 (DSM 32423).

Per gli scopi della presente invenzione la preparazione di lattobacilli ? descritta in associazione con la carnosina o un suo derivato per l?uso sopra riportato in una quantit? tale da ottenere un rapporto compreso fra circa 0,01:1 e 1:1 e, preferibilmente, di circa 0,1:1 (p/p) con la componente rappresentata dalla carnosina (lattobacilli:carnosina).

In accordo con un aspetto preferito della presente invenzione, la carnosina e/o un suo derivato ? in combinazione con un acido inorganico o organico.

In particolare, un acido inorganico ? scelto fra: acido cloridrico.

Per quanto concerne l?acido organico, questo ? scelto nel gruppo che comprende acido ascorbico, acido maleico, acido malico, acido citrico, acido lattico, acido acetico, acido tartarico, acido succinico.

Secondo una forma realizzativa alternativa dell?invenzione, la carnosina ? in combinazione con un componente caratterizzato da un?attivit? antivirale.

Per gli scopi della presente invenzione, tale componente ? rappresentato da cetilpiridinio cloruro (CPC).

In particolare, il cetilpiridiniio cloruro pu? essere presente in una quantit? di circa 0,01-2 (p/v%).

Vantaggiosamente, secondo tale forma realizzativa si esplica un?attivit? anche di tipo virale.

In accordo con un secondo oggetto della presente invenzione, ? descritta una preparazione orale comprendente carnosina, secondo quanto sopra descritto.

In particolare, la preparazione descritta ? per l?uso medico o cosmetico, come sopra definito; ci? significa che la preparazione dell?invenzione pu? essere considerata avere sia un?attivit? terapeutica sia un?attivit? cosmetica, disgiunte oppure in contemporanea.

Per gli scopi della presente invenzione, la preparazione orale comprendente carnosina o un suo derivato in una quantit? di circa 0,01-10 (p/v %) e preferibilmente di circa 0,05-5 (p/v %) e pi? preferibilmente di 0,1-2 (p/v %), rispetto ad una formulazione che la comprende.

Per gli scopi della presente domanda di brevetto, la preparazione orale dell?invenzione pu? ulteriormente comprendere una preparazione di lattobacilli.

In particolare, tale preparazione ? preferibilmente una preparazione di Lactobacillus helveticus o una preparazione di Streptococcus salivarius.

In alternativa, la preparazione comprende sia Lactobacillus helveticus sia Streptococcus salivarius.

In un aspetto preferito dell?invenzione, la preparazione di Lactobacillus helveticus ? una preparazione del Lactobacillus helveticus MIMLh5 (DSM 32422).

In un aspetto preferito dell?invenzione, la preparazione di Streptococcus salivarius ? una preparazione del Streptococcus salivarius ST3 (DSM 32423).

Per gli scopi della presente invenzione la preparazione di lattobacilli ? descritta in associazione con la carnosina o un suo derivato in una quantit? tale da ottenere un rapporto compreso fra circa 0,01:1 e 1:1 e, preferibilmente, di circa 0.1:1 (p/p) con la componente rappresentata dalla carnosina (lattobacilli:carnosina).

Secondo una forma realizzativa alternativa dell?invenzione, la preparazione orale dell?invenzione comprende inoltre un componente caratterizzato da un?attivit? antivirale.

Per gli scopi della presente invenzione, tale componente ? rappresentato da cetilpiridinio cloruro (CPC).

In particolare, nella composizione descritta, il cetilpiridiniio cloruro pu? essere presente in una quantit? di circa 0,01-2% (p/v%).

In un ulteriore aspetto dell?invenzione, la composizione descritta comprende, inoltre, clorexidina.

In particolare, nella composizione descritta, la clorexidina pu? essere presente in una quantit? di circa 0,01-2% (p/v%).

Secondo aspetti preferiti, la preparazione orale della presente invenzione ? rappresentata da un collutorio, un gel orale o una pasta dentifricia.

Secondo un altro aspetto della presente invenzione, la preparazione ora della presente invenzione ? rappresentata da una formulazione orale solida come, ad esempio, una compressa, ad esempio masticabile, caramella, pastiglia orale.

A seconda del tipo di preparazione orale potranno essere presenti uno o pi? ulteriori componenti.

La preparazione dell?invenzione pu? comprendere acido ialuronico o, alternativamente, un suo sale farmaceuticamente accettabile, come ad esempio il suo sale sodico o il suo sale potassico, o una miscela dei due sali.

Per gli scopi della presente invenzione, l?acido ialuronico ? acido ialuronico a basso peso molecolare.

In particolare, l?acido ialuronico pu? essere presente preferibilmente in una quantit? di circa 0,01-1% (peso/peso), preferibilmente di circa 0,1-0,4% (peso/peso) e pi? preferibilmente di circa lo 0,2% (peso/peso).

Pu? essere inoltre previsto un agente sbiancante, ad esempio rappresentato da Plasdone<TM >K-29/32.

Le preparazioni dell?invenzione comprendono acqua, preferibilmente demineralizzata.

Inoltre, possono essere inclusi uno o pi? estratti di piante medicinali, eventualmente in forma glicolica, scelti nel gruppo che comprende: un estratto di Matricaria chamomilla, un estratto di Echinacea (ad esempio, Echinace Angustifolia), Eucalyptus globulus Labill, Prunus armeniaca L. Garcinia kola Heckel, Garcinia kola Heckel, Sysimbrium officinale Scop. (Syn. Erysimum officinale L.).

In un aspetto ancor pi? preferito, ciascuno di tali estratti ? compreso, indipendentemente l?uno dall?altro, in una quantit? di circa 0,01-5% (peso/peso) e preferibilmente di circa 1% (peso/peso) nelle preparazioni descritte.

Ad esempio, la preparazione pu? comprendere uno o pi? dei componenti scelti fra: conservanti, antiossidanti, agenti chelanti, tamponanti (ad esempio sodio bicarbonato), regolatori di viscosit?, stabilizzanti, disperdenti, dolcificanti, aromatizzanti, agenti filmanti, etc adatti all?ottenimento della preparazione.

Fra i conservanti sono contemplati ad esempio: alcool etilico, glicerina, glicol propilenico, acido sorbico e sorbati, benzoato di sodio, etc.

In un aspetto preferito dell?invenzione, la preparazione comprende una combinazione di conservanti comprendente: sodio benzoato e potassio sorbato.

In particolare, la concentrazione di conservanti ? nei limiti previsti dalla normativa.

Ad esempio, ciascuno del sodio benzoato e del potassio sorbato possono essere presenti in quantit? di circa 0,05-0,2% (peso/peso) e preferibilmente in quantit? di circa 0,1% (peso/peso).

Fra gli antiossidanti sono contemplati ad esempio: acido ascorbico e suoi esteri, idrosolfiti e bisolfiti, butilidrossianisolo (BHA), tocoferoli, lecitine, etc.

Fra gli agenti chelanti sono contemplati ad esempio: acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e suoi sali, acido citrico e acido tartarico, etc.

Fra i dolcificanti sono contemplati ad esempio: glucosio, fruttosio, xilitolo, sorbitolo, saccarosio, sucralosio o altri dolcificanti artificiali (saccarina, acesulfame K, etc.), 4,1?,6?-triclorogalattosucrosio.

In particolare, i dolcificanti potranno essere presenti in una quantit? di circa 0,04-0,1% (peso/peso) e preferibilmente di circa 0,06-0,08% (peso/peso).

Gli aromatizzanti comprendono uno o pi? dei composti aromatizzanti ammessi per le preparazioni farmaceutiche, in particolare per uso orale.

Possono essere impiegati a tale scopo: aroma di menta, di arancia, di fragola ed altri aromi generalmente graditi.

Agenti di carica potranno essere opportunamente impiegati e scelti, ad esempio, fra biossido di titanio e silice anidra.

Altri componenti potranno essere impiegati opportunamente, come, ad esempio: eccipienti, sospendenti, come sciroppo di sorbitolo, derivati della cellulosa o grassi idrogenati; emulsionanti, come ad esempio: lecitina o acacia, Montanox 80 Tween 80; tensioattivi, come ad esempio: sodio laurilsolfato; altri veicoli non acquosi, come ad esempio: olio di mandorla, esteri di oli, alcool etilico o oli vegetali frazionati; conservanti, come ad esempio: metil- o propil-p-idrossibenzoato o acido sorbico; agenti antibatterici; addensanti; viscosanti.

In accordo con la presente invenzione ? preparata una formulazione di un collutorio avente la seguente composizione:

Alternativamente, la composizione di un collutorio secondo la presente invenzione pu? essere come segue:

La composizione sopra riportata pu? eventualmente comprendere anche clorexinida, in una quantit? di circa 0,01-2 (p/v %).

In accordo con la presente invenzione ? preparata una formulazione di una pasta dentifricia con la seguente composizione:

In accordo con un terzo oggetto dell?invenzione, ? descritto un dispositivo medico per l?uso orale rivestito almeno parzialmente con la preparazione comprendente carnosina sopra descritta.

La preparazione per rivestire almeno parzialmente un dispositivo medico per l?uso orale secondo l?invenzione pu? comprendere quindi ulteriormente una preparazione di lattobacilli.

Per gli scopi della presente invenzione la preparazione di lattobacilli ? compresa in una quantit? di circa 0,001-2 (p/v %) e preferibilmente di circa 0,01-1 (p/v %).

In un aspetto particolarmente preferito della presente invenzione, la preparazione di lattobacilli ? compresa in una quantit? tale da ottenere un rapporto compresi fra circa 0,01:1 e circa 1:1 (p/p) e preferibilmente di circa 0,1:1 (p/p) con la componente rappresentata dalla carnosina (lattobacilli:carnosina).

Come sopra descritto, detta preparazione di lattobacilli ? preferibilmente una preparazione di Lactobacillus helveticus e/o di Streptococcus salivarius.

In un aspetto preferito, la preparazione di Lactobacillus helveticus ? una preparazione del Lactobacillus helveticus MIMLh5 (DSM 32422).

Per quanto concerne la preparazione di Streptococcus salivarius, questa preferibilmente ? una preparazione del Streptococcus salivarius ST3 (DSM 32423).

In un aspetto preferito dell?invenzione, il dispositivo medico almeno parzialmente rivestito con la preparazione descritta sopra ? rappresentato da uno scovolino o da filo interdentale.

In un altro aspetto dell?invenzione, il dispositivo medico ? rappresentato da un dispositivo protesico, di tipo fisso o di tipo mobile, rivestito, almeno parzialmente, con la preparazione dell?invenzione.

In un ulteriore oggetto della presente invenzione ? descritto l?uso della carnosina in associazione con una preparazione di lattobacilli per il trattamento della xerostomia.

In particolare, la preparazione di lattobacilli ? descritta in associazione con la carnosina o un suo derivato per l?uso nel trattamento della xerostomia in una quantit? tale da ottenere un rapporto compreso fra circa 0,01:1 e 1:1 e, preferibilmente, di circa 0.1:1 (p/p) con la componente rappresentata dalla carnosina (lattobacilli:carnosina).

Secondo una forma realizzativa alternativa dell?invenzione, l?uso medico della carnosina per il trattamento della xerostomia ? descritto in combinazione con un componente avente attivit? antivirale.

Per gli scopi della presente invenzione, tale componente ? rappresentato da cetilpiridinio cloruro (CPC).

In particolare, il cetilpiridiniio cloruro pu? essere presente in una quantit? di circa 0,01-2% (p/v%).

In tal caso, oltre all?effetto contro la xerostomia, si ? vantaggiosamente osservato un effetto antivirale orale.

In un ulteriore aspetto dell?invenzione, la composizione descritta comprende, inoltre, clorexidina.

In particolare, nella composizione descritta, la clorexidina pu? essere presente in una quantit? di circa 0,01-2% (p/v%).

L?invenzione verr? ulteriormente descritta con riferimento ai seguenti esempi non limitativi della presente invenzione.

Materiali e metodi

Tutti i reagenti, mezzi di coltura e materiale monouso sono stati ottenuti da Merck

Preparazione delle soluzioni test

La carnosina utilizzata per gli esperimenti descritti ? reperita in commercio.

Immediatamente prima di effettuare gli esperimenti, sono state allestite soluzioni contenenti, rispettivamente, il 4%, 2%, 1%, 0,5%, 0,25% e 0,13% in peso di carnosina in soluzione fisiologica. Parallelamente ? stato allestito un altro set di soluzioni identiche a cui ? stato aggiunto lo 0,2% in volume di clorexidina. La soluzione fisiologica ? stata utilizzata quale controllo negativo, mentre una soluzione fisiologica addizionata di 0,2% in volume di clorexidina ? stata utilizzata quale controllo positivo.

Microorganismi

? stata allestita una sospensione di Streptococcus mutans ATCC 35668 in brain-heart infusion (BHI), addizionato di saccarosio al 3% in peso. La sospensione ? stata incubata per 12 ore a 37?C in atmosfera addizionata con il 5% di CO2. Le cellule batteriche sono state raccolte mediante centrifugazione (1500 g per 5 minuti a 19?C) e successivamente lavate due volte con tampone fosfato salino (PBS). Queste ultime sono state risospese in BHI addizionato di saccarosio al 3% in peso e la sospensione ? stata sonicata per disperdere gli aggregati batterici (sonicatore modello B-150; Branson, utilizzato ad un?energia di 7W per 30 secondi). La sospensione ? stata infine diluita con BHI sterile fino ad ottenere una torbidit? equivalente a 1.0 su scala McFarland.

Per ottenere un inoculo di flora mista orale, ? stata raccolta la saliva di 5 volontari sani e non fumatori, previo ottenimento del loro consenso informato. I volontari hanno interrotto qualsiasi manovra di igiene orale nelle 24 ore precedenti la raccolta; non erano stati sottoposti a terapie antibiotiche nei tre mesi precedenti e non mostravano lesioni cariose attive. La saliva ottenuta ? stata diluita 1:1 in BHI addizionato di saccarosio al 3% in peso ed immediatamente utilizzata quale inoculo.

Sono stati effettuati 3 esperimenti differenti per studiare l?effetto delle soluzioni precedentemente descritte sull?adesione (2 h), sulla formazione di biofilm (24 h) da parte di S. mutans e sulla formazione di biofilm di flora mista orale (multiceppo) (24 h).

I risultati sono stati espressi in unit? di densit? ottica (OD) che nell?intervallo utilizzato risultano proporzionali al numero di cellule batteriche vitali e metabolicamente attive. Tali dati sono stati trasformati in percentuale di cellule batteriche vitali considerando come 100% il risultato medio della soluzione di controllo negativo, e come 0% il valore dei pozzetti di riferimento (BHI e PBS).

Analisi statistica

L?analisi statistica ? stata condotta utilizzando il software statistico JMP 10.0

. La normalit? della distribuzione dei dati ? stata verificata mediante il test di Shapiro-Wilk; L?omoscedasticit? ? stata verificata mediante il test di Lev?ne. I dati sono stati analizzati per evidenziare differenze significative intra ed intergruppo mediante ANOVA ad una via. Il test di Tukey ? stato utilizzato quale test post-hoc. Il livello di significativit? ? stato fissato in corrispondenza di p<0,05.

ESEMPIO 1

Inibizione dell?adesione di S. mutans ad un substrato Un totale di 100 microlitri di sospensione di S. mutans e 100 ?L di ciascuna delle soluzioni precedentemente allestite sono stati inoculati in ciascun pozzetto di 2 piastre da 96 pozzetti. Per ogni soluzione sono stati utilizzati sette pozzetti. Le piastre sono state incubate per 2 ore a 37?C in atmosfera addizionata con il 5% di CO2 per permettere alle cellule batteriche di aderire al substrato (polistirene trattato per colture cellulari). Successivamente, la biomassa vitale aderente al substrato ? stata quantificata utilizzando un saggio basato su sali di tetrazolio (3-(4,5)-dimetiltiazol-2-il-2,5-difeniltetrazolo bromuro e N-metilfenazino metil solfato quale accettore intermedio di elettroni) come descritto in letteratura (MTT assay).

I risultati sono mostrati in figura 1.

La soluzione di carnosina ha mostrato di possedere propriet? antiadesive nei confronti del ceppo microbico testato. In particolare, la carnosina ha ridotto l?adesione di S. mutans al substrato di polistirene in maniera significativa a partire gi? da una concentrazione in soluzione pari allo 0,25%. La riduzione massima ottenuta ? stata approssimativamente del 20% utilizzando una concentrazione del 4%.

ESEMPIO 2

Inibizione della formazione di un biofilm di S. mutans Un totale di 200 ?L di BHI addizionato di saccarosio al 3% in peso e 20 ?L di sospensione di S. mutans sono stati inoculati in ciascun pozzetto di 2 piastre da 96 pozzetti. Le piastre sono state incubate in agitatore orbitale per 24 ore a 37?C in atmosfera addizionata con il 5% di CO2 per permettere lo sviluppo di un biofilm multistrato. Successivamente, il surnatante ? stato eliminato mediante aspirazione ed i pozzetti sono stati lavati con PBS per rimuovere cellule non aderenti al substrato. In ogni pozzetto sono stati quindi inseriti 100 ?L di ciascuna delle soluzioni testate (7 pozzetti per ogni soluzione). Le piastre sono state incubate a 37?C per 5 minuti, quindi le soluzioni sono state aspirate, i pozzetti sono stati lavati con PBS e la biomassa vitale aderente ? stata quantificata mediante MTT assay.

I risultati sono mostrati in figura 2.

La soluzione di carnosina ha ridotto significativamente la vitalit? di S. mutans organizzato in biofilm di oltre il 30% a partire gi? da una concentrazione pari a 0,5%. La riduzione massima ottenuta ? stata approssimativamente del 40% utilizzando una concentrazione del 2%. Una concentrazione superiore non ha ottenuto un?ulteriore riduzione.

ESEMPIO 3

Inibizione della formazione di un biofilm multiceppo Un totale di 100 ?L di BHI addizionato di saccarosio al 3% in peso e 100 ?L di saliva sono stati inoculati in ciascun pozzetto di 2 piastre da 96 pozzetti. Le piastre sono state incubate in agitatore orbitale per 24 ore a 37?C in atmosfera addizionata con il 5% di CO2 per permettere lo sviluppo di un biofilm multispecie simile alla placca dentale. Successivamente, il surnatante ? stato eliminato mediante aspirazione ed i pozzetti sono stati lavati con PBS per rimuovere cellule non aderenti al substrato. In ogni pozzetto sono stati quindi inseriti 100 ?L di ciascuna delle soluzioni testate (7 pozzetti per ogni soluzione). Le piastre sono state incubate a 37?C per 5 minuti, quindi le soluzioni sono state aspirate, i pozzetti sono stati lavati con PBS e la biomassa vitale aderente ? stata quantificata mediante MTT assay.

I risultati sono mostrati in figura 3.

La soluzione di carnosina ha ridotto significativamente la vitalit? di un biofilm multiceppo di flora mista orale a partire da una concentrazione pari a 0,5%. La riduzione massima ottenuta ? stata approssimativamente del 40% utilizzando gi? la concentrazione pari a 0,5%. Una concentrazione superiore non ha ottenuto un?ulteriore significativa riduzione.

ESEMPIO 4

Attivit? tampone

E? stata valutata l?attivit? tampone della saliva, raccolta da volontari sani di et? compresa tra 20 e 30 anni, della carnosina e di saliva+carnosina ? stata determinata mediante analisi potenziometrica. La misurazione ? stata effettuata osservando la variazione di pH all?aggiunta di HCl 10 mM. L?analisi ? stata condotta a temperatura ambiente, usando un titolatore potenziometrico automatico e HCl 10 mM come agente titolante. La figura 4 riporta:

- curva pH/HCl relativa alla saliva tal quale con capacit? tamponante in grado di consumare un volume pari a 3.2 /-0.2 ml di HCl 10 mM prima di raggiungere il pH cariogenico di 5.5.

- curva pH/HCl relativa alla carnosina (10 mM) mostra un?azione tampone in grado di consumare un volume pari a 4.8 /-0.1 ml di HCl 10 mM prima di raggiungere il pH cariogenico di 5.5.

- curva pH/HCl relativa alla carnosina (10 mM) sciolta in saliva mostra un?azione tampone in grado di consumare un volume pari 10.2 /-0.1 di HCl prima di raggiungere il pH cariogenico di 5.5. Tale valore ? sorprendentemente superiore rispetto alla somma dei volumi di HCl neutralizzato dalla saliva e dalla carnosina quando testati separatamente (somma= 8.0) (ttest, p<0.001). I dati mostrano quindi in maniera inaspettata come l?aggiunta di carnosina alla saliva aumenti in modo sinergico l?azione tampone con un incremento di pi? del 20% rispetto alla somma delle singole attivit?.

ESEMPIO 5

Xerostomia

Volontari sani di et? compresa tra 40 e 55 anni sono stati suddivisi in quattro gruppi (n=5 per ogni gruppo): gruppo controllo, trattati con collutorio, formula base; gruppo carnosina, trattati con collutorio contenute 0,25% (p/v) di carnosina, gruppo lattobacilli trattati con collutorio contenente 0,025 (lattobacilli) e gruppo carnosina+lattobacilli, collutorio contenente carnosina allo 0,25% e lattobacilli allo 0,025%. I soggetti hanno utilizzato il collutorio tre volte al giorno, dopo i pasti e dopo essersi lavati i denti con pasta dentrificia. La valutazione del flusso salivare ? avvenuta alla mattina dell?ottavo giorno e dopo una settimana di trattamento misurando per via gravimetrica la saliva prodotta mediante spot test. In breve, il test prevede di raccogliere in provetta sterile la saliva raccolta ogni 30 secondi per 5 minuti consecutivi. La quantit? di saliva raccolta ? stata quindi determinata mediante analisi gravimetrica usando una bilancia elettronica. Per l?analisi statistica ? stata usata l?ANOVA e una via e post-test Tukey. La figura 5 riporta i risultati del saggio e mostra l?effetto sinergico della combinazione di carnosina con la preparazione di lattobacilli.

Dalla descrizione sopra fornita risulteranno evidenti alla persona esperta nel settore i numerosi vantaggi offerti dalla presente invenzione.

In particolare, le composizioni dell?invenzione, grazie alla presenza della carnosina, eventualmente in associazione con una preparazione di lattobacilli, inibiscono l?adesione e la crescita dello Streptococcus mutans, il batterio pi? studiato in qualit? di responsabile della carie.

Inoltre, la preparazione dell?invenzione ha dimostrato di poter controllare lo sviluppo della flora microbica orale preservandone l?integrit?.

Una formulazione secondo l?invenzione ha sorprendentemente dimostrato di ridurre notevolmente l'ambiente acido attraverso i seguenti meccanismi:

- riduzione della fonte di H3O<+ >riducendo il microbiota acidogeno quale per esempio il biofilm di S. mutans;

- neutralizzazione degli ioni H3O<+ >attraverso un'attivit? di tamponamento sinergica con i costituenti salivari, come dimostrato dagli studi potenziometrici;

- aumento della disponibilit? di bicarbonato e carbondrina stimolando la produzione di saliva.

Inoltre, la porzione rappresentata dai lattobacilli, in particolare di Lactobacillus helveticus MIMhL5, concorre ad innalzare e potenziare le difese immunitarie.

Lactobacillus helveticus MIMhL5 ? in grado di stimolare la risposta del sistema immunitario attraverso il macrofago e il reclutamento di cellule dendritiche.

Le attivit? di MIMhL5 sono correlate alla presenza sulla sua superficie di un complesso proteico chiamato S-Layer, ancora presente sulla superficie cellulare dopo l'inattivazione dei batteri da parte del calore.

La carnosina, inoltre, ? un composto di origine ampiamente disponibile, anche in elevata purezza e poco costoso.

Inoltre, la presente invenzione ? facilmente integrabile nei sistemi produttivi gi? esistenti.

Claims (25)

RIVENDICAZIONI

1. Carnosina o un suo derivato per l?uso medico o cosmetico nella prevenzione e nel controllo della placca dentale.

2. Carnosina per l?uso medico o cosmetico nel controllo della placca dentale impiegata in associazione con una preparazione di lattobacilli.

3. Carnosina per l?uso medico o cosmetico nel controllo della placca dentale secondo la rivendicazione 1 o 2, in associazione con una preparazione di Lactobacillus helveticus e/o di Streptococcus salivarius.

4. Carnosina per l?uso medico o cosmetico nel controllo della placca dentale secondo la rivendicazione precedente, in cui detta preparazione di Lactobacillus helveticus ? una preparazione del Lactobacillus helveticus MIMLh5 (DSM 32422) e/o in cui detta preparazione di Streptococcus salivarius ? una preparazione del Streptococcus salivarius ST3 (DSM 32423).

5. Carnosina per l?uso medico o cosmetico nel controllo della placca dentale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto derivato della carnosina ? scelto nel gruppo che comprende: anserina (N-?-alanil-1-metilistidina), balenina (N-?alanil-3-metilistidina), omocarnosine (N-4-aminobutirilistidina), N-acetil-carnosina, carcinina (?-alanilistamina), Gly-His, carnosinamide.

6. Carnosina per l?uso medico o cosmetico nel controllo della placca dentale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta carnosina o detto derivato della carnosina sono in forma libera o complessati con ioni metallici.

7. Carnosina per l?uso medico o cosmetico nel controllo della placca dentale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta carnosina ? in combinazione con un acido inorganico o organico.

8. Carnosina per l?uso medico o cosmetico nel controllo della placca dentale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta carnosina ? in combinazione con un componente avente attivit? antivirale rappresentato da cetilpiridinio cloruro e in cui detto uso medico ? anche come antivirale.

9. Una preparazione orale comprendente carnosina o un suo derivato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti nella forma di un collutorio, gel ad uso orale, di una pasta dentifricia o di una formulazione orale solida.

10. La preparazione orale comprendente carnosina secondo la rivendicazione precedente, in cui la carnosina ? contenuta in una quantit? di circa 0,01-10 (p/v %).

11. La preparazione orale comprendente carnosina secondo la rivendicazione 9 o 10, comprendente ulteriormente una preparazione di lattobacilli.

12. La preparazione comprendente carnosina secondo la rivendicazione precedente, in cui detta preparazione di lattobacilli e detta carnosina sono compresi in un rapporto compreso fra circa 0,01:1 e 1:1 e preferibilmente di circa 0,1:1 (p/p).

13. La preparazione comprendente carnosina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 12, comprendente ulteriormente un componente avente attivit? antivirale rappresentato da cetilpiridinio cloruro, eventualmente in una quantit? di circa 0,01-2 (p/v %).

14. Un dispositivo medico per l?uso orale rivestito almeno parzialmente con una preparazione comprendente carnosina.

15. Il dispositivo medico per l?uso orale secondo la rivendicazione precedente, in cui detta preparazione comprende ulteriormente una preparazione di lattobacilli.

16. Il dispositivo medico per l?uso orale secondo la rivendicazione 14 o 15, in cui detta preparazione di lattobacilli ? una preparazione di Lactobacillus helveticus e/o di Streptococcus salivarius.

17. Il dispositivo medico per l?uso orale secondo la rivendicazione 15 o 16, in cui detta preparazione di Lactobacillus helveticus ? una preparazione del Lactobacillus helveticus MIMLh5 (DSM 32422) e/o in cui detta preparazione di Streptococcus salivarius ? una preparazione del Streptococcus salivarius ST3 (DSM 32423).

18. Il dispositivo medico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti da 15 a 17, in cui detta preparazione di lattobacilli e detta carnosina sono compresi in un rapporto compreso fra circa 0,01:1 e 1:1 e preferibilmente di circa 0,1:1 (p/p).

19. Il dispositivo medico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 14 a 18, rappresentato da uno scovolino o da filo interdentale.

20. Carnosina o un suo derivato in associazione con una preparazione di lattobacilli per l?uso medico nel trattamento della xerostomia.

21. Carnosina o un suo derivato in associazione con una preparazione di lattobacilli per l?uso medico nel trattamento della xerostomia secondo la rivendicazione precedente, in cui detta preparazione di lattobacilli comprende Lactobacillus helveticus e/o di Streptococcus salivarius.

22. Carnosina o un suo derivato in associazione con una preparazione di lattobacilli per l?uso medico secondo la rivendicazione precedente, in cui detta preparazione di Lactobacillus helveticus ? una preparazione del Lactobacillus helveticus MIMLh5 (DSM 32422) e/o detta preparazione di Streptococcus salivarius ? una preparazione del Streptococcus salivarius ST3 (DSM 32423).

23. Carnosina o un suo derivato in associazione con una preparazione di lattobacilli per l?uso medico secondo la rivendicazione 20, in cui detto derivato della carnosina ? scelto nel gruppo che comprende: anserina (N-?-alanil-1-metilistidina), balenina (N-?alanil-3-metilistidina), omocarnosine (N-4-aminobutirilistidina), N-acetil-carnosina, carcinina (?-alanilistamina), Gly-His, carnosinamide.

24. Carnosina o un suo derivato in associazione con una preparazione di lattobacilli secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti da 20 a 23, comprendente ulteriormente un componente avente un?attivit? antivirale rappresentato da cetilpiridinio cloruro.

25. Carnosina o un suo derivato in associazione con una preparazione di lattobacilli secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti da 20 a 24 avente l?ulteriore uso medico come antivirale.