KR20190062477A - 소독제-내성 락트산 박테리아 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 소독제에 대해 내성을 나타내는 능력을 갖는 락트산 박테리아 균주에 관한 것이다. 락트산 박테리아 균주는 경구 병원균의 성장을 길항하는 능력을 추가로 갖는다. 특히, 이러한 특성을 갖는 락트산 박테리아는 페디오코커스 속, 보다 특히, 페디오코커스 에시디락티시 종에 속한다. 이에 따라, 본 발명의 균주는 개인 위생, 및 특히, 구강 위생의 분야에서의 조성물 및 제품뿐만 아니라 약제학적 제품에 대해 유용하다.

Description

소독제-내성 락트산 박테리아
본 발명은 개인 위생, 의약, 및 미생물학의 분야에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 소독제, 보다 특히, 구강 위생(oral care)을 위한 소독제와의 병용에 특히 유용한 락트산 박테리아 균주를 포함한다.
건강한 입(mouth)은 독특하고 값진 자산으로서, 일반적인 건강 및 삶의 질의 통합된 구성성분(integrated component)이다. 그러나, 구강 건강(oral health)은 다양한 형태의 구강 질병(oral disease), 주로, 치아 충치(dental caries) 및 치주 질병(periodontal disease)에 의해 및 가끔 구강암(oral cancer), HIV/AIDS의 병변, 점막 및 타액선 질병, 구강안면 통증(orofacial pain) 및 갈림증(cleft)에 의해 매일 자주 영향을 받는다. 이러한 구강 장애는 필수적인 구강 기능, 자존감(self-esteem), 삶의 질, 및 전반적인 건강 및 복지(well-being)에 큰 영향을 미치는 인류의 총괄적으로 가장 일반적인 만성 질병이다. 구강 질병이 세계적 전염병 및 주요 공중 보건 문제라는 것이 현재 인식되고 있다. 세계 인구의 약 90%의 추정치는 이의 인생 과정(life course)의 일부 지점에서 일부 형태의 구강 질병으로 고통 당한다[Jin LJ et al. "Global burden of oral diseases: emerging concepts, management and interplay with systemic health" Oral Diseases 2016].
치주 질병(periodontal disease)은 매우 일반적인 것으로서, 치주 조직들 중 하나 이상에 영향을 미치는 다수의 질환을 포함한다. 여러 상이한 질병이 치아-지지 구조에 영향을 미치지만, 플라크-유발 염증 병변은 대부분의 치주를 구성하고 전통적으로 치은염 또는 치주염 중 어느 하나로 그룹화되었다.
치은염은 인류에 영향을 미치는 가장 흔한 만성 염증성 질병들 중 하나로서, 대략 75%의 서구 인구에서 출현한다. 이는 발적; 치은의 부기 및 잦은 출혈에 의해 특징되며, 이는 치아-치은 환경에서 박테리아의 축적에 의해 유발된다. 이러한 만성 염증은 치은에 국한될 수 있거나, 치아 부착 장비가 파괴될 때 치주염으로 발전할 수 있다. 이에 따라, 치은염은 항상 치주염에 선행하지만, 일부 개체에서, 치은염은 치주염으로 진행하지 않을 수 있다.
이에 따라, 치주 질병은 치아를 둘러싸는 연조직의 박테리아 바이오막-유발 염증으로 시작한다. 치아 플라크로도 알려진, 박테리아 바이오막은 백색의 다른 색조로 나타나고, 치아와 접하는 치은연(gingival margin)에서 통상적으로 발견되는 음식 잔해(food debris)와 조합된다. 바이오막은 또한, 통상적으로 치아 사이에서 발견되며, 여기서, 이의 제거는 치실 및 치간 브러시(interproximal brush)를 사용함으로써 추가적인 노력을 필요로 한다. 임상적으로 명백할 때, 박테리아 바이오막은 주요 원인으로 여겨지며, 축적은 통상적으로, 염증의 중증도에 비례한다. 바이오막에서 박테리아의 양은 치주 질병의 중증도와 상관 관계가 있다. 파괴적인 치주 질병과 관련이 있는 특정 박테리아는 고위험으로 여겨지고, 다른 것들 중에서, 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 프레보텔라종(Prevotella sp.), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 푸소박테륨 누클레아튬(Fusobacterium nucleatum), 및 타네넬라 포르시티아(Tannerella forsythia)를 포함한다[Haffajee, AD et al. "Microbial etiological agents of destructive periodontal Diseases" Periodontology 2000. 1994, vol. 5, pp. 78-11].
초기 치주 치료는 통상적으로, 바이오막의 물리적 제거를 수반하고, 염증의 감소 및 전체 치주 상태의 개선을 야기시킨다. 치과 의사 및 치주 치료사는 외과적 괴사조직제거(surgical debridement), 국소 화학치료제의 사용, 전신 항생제의 처방을 포함하는 추가적인 치료 방법(treatment modalities)을 제안할 수 있다. 심각한 치주 질환을 의심하는 의사의 경우에, 특히, 경험적 치주 진단을 기초로 할 때, 항박테리아 구강 세정제를 추천하는 것은 종종 치료 옵션(therapeutic option)이다. 이러한 전략은 치과 의사가 환자를 평가하고, 진단을 규명하고, 추가 치료를 제안할 수 있을 때까지 치주 상태의 일시적인 관리를 허용한다[Laudenbach et al. "Common Dental and Periodontal Diseases. Evaluation and management" Med Clin N Am 2014, vol. 98, pp.1239-1260]
박테리아-유발 치주염을 위한 일반적인 소독 구강 세정제는 클로르헥시딘 글루코네이트 0.12%이다. 총 2주 동안 하루에 2회 사용하기 위한 이러한 세정제를 처방하는 것이 일반적이다. 클로르헥시딘 글루코네이트가 치과 플라크 병원체에 대해 효과적인 것으로 입증되었지만, 이는 단독 치료로서 거의 제안되지 않고, 통상적으로, 박테리아 플라크 및 치석 괴사조직제거(calculus debridement)의 외과적 및 비외과적 치료에 대한 보조제로서 사용된다. 또한, 환자는 잠재적인 부작용에 대해 통보받아야 한다. 클로르헥시딘은 구강 점막을 자극시키고 손상시키고, 치아 및 다른 구강 표면의 변색 및 착색을 야기시키고, 치석의 형성을 증가시키고, 미각 인지를 변화시킬 수 있다. 경구 자극 및 국소 알레르기-타입 증상이 또한 보고되었다. 또한, 구내염, 치은염 및 궤양을 포함하는, 점막 부작용이 보고되어 있다. 결과적으로, 장기간 동안 클로르헥시딘의 사용이 제안되지 않는다[Floetra, L. et al. "Side effects of chlorhexidine mouth washes". Scand J Dent Res 1971, vol. 73, p. 119-125].
구강 청결제에서 사용되는 다른 일반적인 소독제는 트라이클로산([5-클로로-2-(2,4-다이클로로페녹시)페놀)이다. 트라이클로산은 비이온성 할로겐화된 페놀이며, 이는 북아메리카, 유럽 및 아시아 전역에서 널리 사용되는 광범위한 항균 활성 스펙트럼을 갖는다. 트라이클로산은 여러 타입의 박테리아 및 특정 타입의 진균에 대해 효과적이고, 박테리아 세포벽의 침투 및 RNA 합성 및 거대분자의 생산을 포함하는 다중 세포질 및 막 부위의 표적화를 포함하는 기전에 의해 박테리아 전파를 방지하고/하거나 결국 세포사를 초래한다. 그러나, 트라이클로산은 화합물이 인간 건강 및 환경에 유해할 수 있다는 우려가 제거된 후에 점점 더 면밀히 조사되고 있다. 트라이클로산의 사용을 둘러싼 잠재적인 건강 문제는 항생제 내성, 피부 자극, 내분비 교란, 알레르기 속도 증가 및 발암 부산물의 형성을 포함한다[Dann AB, et al. "Triclosan: environmental exposure, toxicity and mechanisms of action" Journal of Applied Toxicology 2011, vol. 31, pp. 285-311].
합성 화합물을 함유한 구강 청결제에 대한 대안으로서, 일부 제품은 에센셜 오일과 같은 '천연' 화합물로 제형화된다. 예를 들어, Listerine®은 에센셜 오일로부터 추출된 화합물, 즉 멘톨, 유칼립톨, 티몰 및 메틸 살리실레이트의 혼합물이다. Listerine®은 유해한 박테리아, 예를 들어, 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 및 에이케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens) 및 효모 칸디다 알비칸스(Candida albicans)를 공격한다[Vlachojannis C, et al. "A Preliminary Investigation on the 항균제 Activity of Listerine®, Its Components, and of Mixtures Thereof" Phytotherapy research 2015, vol. 29, pp.1590-1594]. 에센셜 오일을 갖는 구강 청결제는 클로르헥시딘을 함유한 것보다 더 안전한 것으로 여겨지고, 불쾌한 부작용이 더 적다(예를 들어, 치아 착색 및 치석 축적). 그러나, 단기 치료에서의 효과는 또한 낮다고 보고되었다. 또한, 일부 에센셜 오일 성분은 세포독성 효과를 나타낼 수 있고, 이에 따라, 관련된 임의의 에센셜 오일 성분의 노출 기간 및 농도를 특별히 주의하면서, 이를 함유한 제품이 포괄적인 독성 연구에 의해 뒷받침되어야 한다고 제안하는 것이 타당하다[Vlachojannis C, et al. "Listerine® Products: An update on the efficacy and safety" Phytotheraphy Research 2016, vol. 30, pp. 367-373].
소독제의 가장 관련된 요망되지 않는 효과들 중 하나는 이의 비선택적 소독제 효과의 결과로서 구강 미생물총(oral microbiota)에서 야기된 변화와 관련이 있다. 선택적으로 독성을 나타내고 박테리아 세포 내의 특정 부위에서 작용하는 항생제와는 달리, 대부분의 소독제는 소독제의 장기간의 사용, 특히, 고농도에서 작용하는 별도의 박테리아 세포 표적을 가지고 있지 않고, 바이오막을 제거하고/하거나 질병-관련-박테리아를 사멸시킬 수 있고, 또한, 상주하는 구강 미생물총의 천연 및 유익한 성질을 파괴할 수 있다. 이는 구강에서 장내 불균형(dysbiosis)(또한, 장내 세균 불균형(dysbacteriosis)으로 지칭됨)의 문제를 유발할 수 있으며, 이는 충치 또는 치주 질병의 규명을 예고할 수 있는 미생물 불균형이다. 장내 불균형 가설은 치주 건강에서 질병으로의 전이(transition)가 치주 포켓(periodontal pocket)의 박테리아 군집에서 풍부하지 않는 종의 풍부함의 변화(changes in abundance)를 반영한다는 것을 주장한다. 미생물 군집의 이러한 조성 이동(shift)은 파괴적 염증 및 뼈 손실을 매개하기에 충분한 숙주-미생물 누화(host-microbe crosstalk)의 변화를 야기시킨다. 실제로, 치주 질병의 병인(etiology)이 활성 치주 질병이 일어나는 지의 여부를 결정하는 3가지 그룹의 인자, 즉, 감수성 숙주(susceptible host), 병원성 종의 존재, 소위 "유익한 박테리아"의 부재를 기초로 하는 것이 고려된다. 결과적으로 엄격한 공생균(symbiont)과 유해균(pathobiont) 간의 비례 관계의 결과적인 파괴는 염증의 활성화 및 후속 뼈 파괴로 이어지는 파괴적 캐스케이드(destructive cascade)를 촉발시킨다[Castalonga M, et al. "The oral microbiome and the immunobiology of periodontal disease and caries" Immunology Letters 214, vol. 12, pp. 22-38].
이에 따라, 입안 구강 세척제(oral mouth wash)의 부작용을 감소시킬 수 있거나 이의 효율을 증가시킬 수 있고, 이에 따라, 특히, 장기간 치료 동안에 더 적은 용량이 요구되는 대안물 또는 개선된 제품을 찾는 것이 바람직하다.
대안적인 예방 툴(preventive tool)로서, 프로바이오틱(probiotic)의 사용이 제안되었다. 프로바이오틱은 치주 치료에서 유망된 연구 분야일 수 있다. 프로바이오틱스는 "적절한 양으로 투여될 때 숙주에 건강상 이익을 부여하는 살아있는 미생물"로서 규정된다. 프로바이오틱스가 유익한 박테리아를 재증식시켜, 병원성 박테리아를 사멸시키고 감염에 대해 싸울 수 있다고 여겨진다. 경구 투여되는 프로바이오틱스는 유해한 미생물총의 성장을 방지함으로써 구강에서 점막 면역을 조절함으로써 구강 건강에 유익할 수 있다. 프로바이오틱 종은 주로 락토바실러스(Lactobacillus) 속 및 비피도박테륨(Bifidobacterium) 속에 속한다.
시장(market)에서 알려진 구강 프로바이오틱은 L. 류테리 프로덴티스(L. reuteri Prodentis)이다. 최근 연구에서는, 프로바이오틱 균주 L. 류테리를 함유한 정제로의 구강 치료가 만성 치주염을 갖는 전염증 사이토카인 반응의 현저한 감소 대부분의 환자에서 임상 파라미터의 개선을 유도한다는 것을 나타낸다[Szkaradkiewicz, A.K. et al. "Effect of Oral Administration Involving a Probiotic Strain of Lactobacillus reuteri on Pro-Inflammatory Cytokine Response in Patients with Chronic Periodontitis". Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 2014, vol. 62, p. 495-500]. 다른 연구는 만성 치주염 환자에서 스케일링 및 치근활택술(scaling and root planing: SRP)에 대한 보조제로서의 L. 류테리-함유 프로바이오틱 로젠지의 효과를 평가할 목적을 갖는다. 포르피로모나스 진지발리스의 감소는 프로바이오틱으로 치료된 SRP 그룹에서 관찰되었지만, 다른 연구된 병원성 박테리아에서 어떠한 변화도 관찰되지 않았다[Teughels, W. et al. "Clinical and microbiological effects of Lactobacillus reuteri probiotics in the treatment of chronic periodontitis: a randomized placebo-controlled study" Journal of clinical periodontology 2013, vol. 40 p. 1025-35]. 그러나, 구강 미생물총에 대한 L. 류테리의 효과는, 병행 연구에서, L. 류테리(ATCC55730 및 ATCC PTA5289)를 함유한 프로바이오틱 로젠지의 일일 섭취가 플라크 축적, 염증 상태 또는 실험적 치은염 동안 바이오막의 조성에 상당한 영향을 미치는 것으로 보이지 않기 때문에 의심스럽다[Hallstroem, H. et al. "Effect of probiotic lozenges on inflammatory reactions and oral biofilm during experimental gingivitis". Acta Odontologica Scandinavica 2013, vol. 71, p. 828-833].
다른 예는 건강한 청소년에서 플라크의 양, 치은 염증, 및 구강 미생물총에 대한 경구 투여된 L. 람노서스(L. rhamnosus) GG 및 B. 애니말리스 서브종 락티스(B. animalis subsp. lactis) BB-12을 갖는 로젠지의 효과를 기술한 최근 연구이다. 프로바이오틱 로젠지는 플라크 및 치은염 지수 둘 모두를 감소시켰지만, 어느 한 그룹에서 타액의 미생물 조성물에서 프로바이오틱-유발 변화가 발견되지 않았다. 결론은 프로바이오틱 로젠지가 구강 미생물총에 영향을 미치지 않고 치은 염증의 측면에서 치주 상태를 개선시켰다는 것이다[Toiviainen, A. et al., "Impact of orally administered lozenges with Lactobacillus rhamnosus GG and Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 on the number of salivary mutans streptococci, amount of plaque, gingival inflammation and the oral microbiome in healthy adults". Clin Oral Investig 2015, vol. 19, p. 77-83].
다른 프로바이오틱스, 예를 들어, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CD2는 구강 건강을 증진시키고 염증성 뼈 손실을 저해하는 데 유용할 수 있다. 그러나, 임상적 효능은 아직 명확하지 않다[Maekawa, T. et al. "Topical treatment with probiotic Lactobacillus brevis CD2" inhibits experimental periodontal inflammation and bone loss" J Periodont Res 214, vol. 44, p. 785-791].
Nadkerny 등은 2015년에 0.2% 클로르헥시딘 및 염수를 갖는 프로바이오틱 구강 청결제의 항플라크 및 항염증 가능성을 평가하고 비교하는 임상 시험을 발표하였다. 프로바이오틱 구강 청결제(Sporlac Plus®)는 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 스포로게네스(Lactobacillus sporogenes), 비피도박테륨 롱검(Bifidobacterium longum), 및 사카로마이세스 보울라디(Saccharomyces boulardii)를 함유한 프로바이오틱 제형을 화학자에 의해 상업적으로 입수 가능한 10㎖의 증류수와 혼합함으로써 제조된다. 치은염 지수 및 구강 위생 지수에 대한 프로바이오틱 및 클로렉시딘의 효과는 유사하였다[Nadkerny PV, et al. "A comparative evaluation of the efficacy of probiotic and chlorhexidine mouthrinses on clinical inflammatory parameters of gingivits: A randomized controlled clinical study" J Indian Soc Periodontol 2015 vol 16, pp. 633-639].
최근 임상 시험에서는 만성 치주염 및 구취를 갖는 환자의 치료에서 스케일링 및 치근활택술(SRP)에 대한 보조제로서 프로바이오틱스의 국소 사용을 연구하였다[Penala, S. et al. "Efficacy of local use of probiotics as an adjunct to scaling and root planing in chronic periodontitis and halitosis: A randomized controlled trial" J Res Pharm Pract. 2016 Vol. 5(2), pp. 86-93]. 대상체는 시험군 및 대조군으로 무작위로 지정되었다. 시험군(SRP + 프로바이오틱스)은 프로바이오틱스 및 프로바이오틱 구강 청결제의 치은연하 전달을 수용하였으며, 대조군(SRP + 플라시보)은 15일 동안 플라시보 및 플라시보 구강 청결제의 치은연하 전달을 수용하였다. 프로바이오틱은 2개의 프로바이오틱 유기체의 조합으로 이루어졌다: 캡슐 당 락토바실러스 살리바이러스(Lactobacillus salivarius)(2E+09 CFU) 및 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)(2E+09 CFU). 환자에게 각각 28개의 캡슐을 제공하였고, 10㎖ 증류수에 캡슐을 비우라고 요청하였고, 14일 동안 매일 2회씩, 1분간 세정하기를 요청하였다. 모든 임상적 및 미생물학적 파라미터는 연구의 마지막에 두 군 모두에서 감소되었으나, PD 감소(PDR) 및 임상적 부착 이득(clinical attachment gain: CAG)의 군간 비교는 시험군에 대한 중간 포켓(moderate pocket)에서의 PDR을 제외하고 통계학적 유의성을 나타내지 않았다. 이에 따라, 프로바이오틱 소비의 임상적 효능은 의문의 여지가 있다.
반대로, 본 분야에서의 리뷰(review)[Yanine, N. et al. "Effects of probiotics in periodontal diseases: a systematic review". Clinical oral investigations 2013, vol. 17, p. 1627-34]는 치주 질병의 예방 및 치료에 대한 프로바이오틱스의 효과가 의심스럽다고 결론지었다. 1차 결과에 대하여, 포켓 깊이를 프로빙하는 경우에, 프로바이오틱스의 임상적 유익한 효과가 존재하지 않을 것이다. 2차 결과에 대하여, 프로바이오틱스는 플라크 지수 및 치은 염증에 대한 작은 이점을 나타내었다. 유사하게, 더욱 최근의 메타-분석에서는, 치은 염증의 지표가 프로바이오틱 치료에 의해 긍적적인 영향을 받을 수 있지만, 치주 질병을 관리(즉, 예방 또는 치료)하기 위해 프로바이오틱스의 사용을 지지하는 증거가 현재 충분치 않다고 결론지었다. 이에 따라, 특히, 비히클의 효과 또는 프로바이오틱 치료의 용량을 고려하여 이러한 방향에서의 더 많은 연구가 바람직할 수 있다[Gruner, D. et al. "Probiotics for managing caries and periodontitis: Systematic Review and Meta-Analysis". J Dent 2016, vol. 48, pp. 16-15]. 요약하면, 종래 기술에서 프로바이오틱스가 치주 및 치은 과정에서 염증의 개선에 기여할 수 있지만, 프로바이오틱스가 명확한 임상 효과를 가질 수 있는 지의 여부는 의문의 여지가 있는 것으로 나타났다.
L. Dunn 등의 문헌[Journal of Food Science·Vol. 81, Nr. 2, 2016, pages M438-M444]에는 상이한 락트산 박테리아(예를 들어, 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici), 락토바실러스 부크네리(Lactobacillus buchneri) 및 레우코노스톡 시트로보룸(Leuconostoc citrovorum))에 대한 에센셜 오일(및 예를 들어, 티몰과 같은 개별 오일 성분)의 어레이의 항균 효능의 시험이 기술되어 있다. 문헌의 목적은 에센셜 오일 성분(예를 들어, 티몰)이 관련된 락트산 박테리아 성장을 적절히 저해하기 위해 사용될 수 있고, 이에 의해 식품에 대한 보존 첨가제로서 사용될 수 있는 지를 시험하는 것이었다. 이에 따라, 문헌에서 식품에서 락트산 박테리아(예를 들어, 페디오코커스 에시디락티시)의 존재가 원치 않는 것으로 보여질 수 있다. 다른 말로 하면, 문헌에서는 예를 들어, 구강에서의 장애의 예방 및/또는 치료와 같은, 임의의 실용적 목적을 위해 소독제(예를 들어, 티몰)와 병용한 페디오코커스 균주의 사용이 기술되어 있지 않다.
WO2017012905A1(AB-BIOTICS)호에는 구강(oral cavity)에서 프로바이오틱의 적절한 콜로니화를 허용하는, 분말 형태의 자가-막-형성 조성물이 개시되어 있다. 예를 들어, 구강에서 장애의 예방 및/또는 치료와 같은, 임의의 실용적 목적을 위해 소독제(예를 들어, 티몰)와 병용하여 페디오코커스 균주를 사용하는 것이 기술되어 있지 않다.
본 발명에 의해 해소되는 하나의 문제는 소독제를 포함하는 치료 요법에서 투여될 수 있는 락트산 박테리아(LAB)를 제공하는 것과 관련이 있는 것으로 볼 수 있다. 본 발명자는 페디오코커스 균주가 특히 소독제에 대해 내성이라는 것을 발견하였다.
이에 따라, 본 발명의 제1 양상은 적어도 하나의 소독제와 병용하여 사용하기 위한 페디오코커스 균주로서, 페디오코커스 균주는
a) 트라이클로산;
b) 적어도, 멘톨, 유칼립톨, 티몰 및 메틸 살리실레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 개별 구성성분을 포함하는 에센셜 오일; 및
c) 멘톨, 유칼립톨, 티몰 및 메틸 살리실레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 개별 구성성분
으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 소독제에 대해 내성을 나타내는 능력을 가지며,
페디오코커스 균주는 페디오코커스 균주에 대해 관찰된 디스크 확산 검정에 의해 결정된 저해 할로(inhibition halo)가 포르피로모나스 진지발리스의 저해 할로보다 더 작을 때 소독제에 대해 내성을 나타내는 능력을 갖는 것으로 여겨지며, 소독제는 포르피로모나스 진지발리스의 저해를 관찰할 수 있는 농도를 가지며;
페디오코커스 균주 및 소독제는 별도, 순차적, 동시 투여를 위해 또는 혼합물로 제형화되는, 페디오코커스 균주에 관한 것이다.
이러한 제1 양상은 대안적으로, 소독제와 병용하여 페디오코커스 균주의 사용으로서 제형화될 수 있으며, 여기서, 페디오코커스 균주는 전술한 바와 같이 적어도 하나의 소독제에 대해 내성을 나타내는 능력을 갖는다.
제2 양상은 104 내지 1012 cfu/g의 적어도 하나의 페디오코커스 균주의 생존 세포를 포함하는 박테리아 조성물로서, 페디오코커스 균주는 적어도, 제1 양상에서 규정된 바와 같은 특징을 갖는, 박테리아 조성물에 관한 것이다.
제3 양상은 구강에서의 장애의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 제2 양상에 따른 조성물에 관한 것이다.
제4 양상은 허용되는 부형제 및/또는 담체와 함께, 제2 양상에서 규정된 바와 같은 조성물을 포함하는 개인 관리 제품 또는 약제학적 제품에 관한 것이다.
제5 양상은 락트산 박테리아 균주를 스크리닝하고 단리시키는 방법으로서,
i) 락트산 박테리아 균주 후보물의 풀(pool)로부터 락트산 박테리아의 개체의 소독제에 대해 내성을 나타내는 능력을 검정하는 단계; 및
ii) 포르피로모나스 진지발리스보다 더 높은 소독제에 대해 내성을 나타내는 능력을 갖는 락트산 박테리아 균주를 선택하고 단리시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 청구범위 및 양상에서 사용되는 용어는 본 명세서에서 이의 광범위하고 일반적인 의미로 이해된다. 그럼에도 불구하고, 이러한 것은 하기의 본 발명의 상세한 설명에서 규정된다.
명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 단어 "포함하다(comprise)" 및 이의 변형어는 다른 기술적 특징, 첨가제, 성분, 또는 단계를 배제하려는 것은 아니다. 본 발명의 추가적인 목적, 장점 및 특징은 명세서의 검토 시에 당업자에게 명백하게 될 것이거나, 본 발명의 실시에 의해 학습될 수 있다. 또한, 본 발명은 본 명세서에 기술된 특정 및 바람직한 실시형태들의 모든 가능한 조합을 포함한다. 하기 실시예 및 도면은 본 명세서에서 예시적인 목적을 위해 제공되고, 본 발명을 한정하려고 의도되는 것은 아니다.
상기에서 설명된 바와 같이, 일반적으로, 소독제가 광범위한 항균 활성 스펙트럼을 갖는다는 것이 인식된다. 이는 다수의 박테리아 및 진균종을 사멸시킬 수 있지만, 이러한 것은 또한, 공생 또는 프로바이오틱 박테리아에 대한 부정적인 영향을 갖는다. 실제로, 미량의 소독제가 이의 투여 후에 발견될 수 있고, 이에 따라 또한, 소독제의 투여 후에도 프로바이오틱스의 사용을 저해한다는 것이 알려져 있다. 이에 따라, 특히, 프로바이오틱 치료로서, 락트산 박테리아의 사용은 소독제와 병용하여 가능한 것으로 제안된 적이 없다.
본 발명자들은, 놀랍게도, 페디오코커스 균주가 소독제에 대해 더 높은 내성을 나타내는 능력을 가지며, 이에 따라, 소독제가 치료 또는 미용 목적을 위해 사용될 때, 균주를 투여하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다. 이론으로 구속하고자 하는 것은 아니지만, 우호적인 박테리아를 선호하는 경쟁적 배제(competitive exclusion)의 원리에 의해, 이러한 것이 병원성 균주 이전에 부착하는 경우에, 소독제와 병용한 페디오코커스 투여가 기회감염 병원체의 콜로니화에 대해 특히 효과적으로 보호할 수 있는 것으로 사료된다.
이에 따라, 본 발명의 일 양상은 소독제와 병용하여 사용하기 위한 페디오코커스 균주로서, 페디오코커스 균주는,
a) 트라이클로산;
b) 적어도, 멘톨, 유칼립톨, 티몰 및 메틸 살리실레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 개별 구성성분을 포함하는 에센셜 오일; 및
c) 멘톨, 유칼립톨, 티몰 및 메틸 살리실레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 개별 구성성분
으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 소독제에 대해 내성을 나타내는 능력을 가지며;
페디오코커스 균주는, 페디오코커스 균주에 대해 관찰된 디스크 확산 검정에 의해 결정된 저해 할로가 포르피로모나스 진지발리스의 저해 할로보다 더 작을 때 소독제에 대해 내성을 나타내는 능력을 갖는 것으로 여겨지며, 소독제는 포르피로모나스 진지발리스의 저해를 관찰하기 위한 농도로 존재하며;
페디오코커스 균주 및 소독제는 별도, 순차적, 동시 투여를 위해 또는 혼합물로 제형화되는, 페디오코커스 균주를 제공한다.
이러한 양상은 대안적으로, 소독제와 병용한 페디오코커스 균주의 용도로서 제형화될 수 있으며, 여기서, 페디오코커스 균주는 전술한 바와 같이, 적어도 하나의 소독제에 대해 내성을 나타내는 능력을 갖는다.
소독제-내성 락트산 박테리아 균주
본 명세서에 논의된 바와 같은 페디오코커스 균주가 단리된 락트산 박테리아 균주인 것이 바람직하다. 본 문맥에서 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 용어 "단리된"은 락트산 박테리아 균주가 이의 자연 환경으로부터 단리되는 것, 즉, 이러한 것이 이의 자연 환경에서 존재하지 않고, 이에 따라, 자연 환경에 존재하는 다른 유기체 및 물질이 존재하지 않는다는 것에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "내성(tolerance)"은 유전되거나 유전되지 않던지 간에, 필수적인 박테리아 과정을 늦춤으로써 종종 달성되는, 소독제에 대한 일시적인 노출에서 생존할 수 있는 미생물의 능력을 지칭한다. "내성"은 문헌에서, 일반적으로, 최소 저해 농도(minimal inhibitory concentration: MIC)의 변화 없이 생존할 수 있는 미생물의 능력으로 이해된다. 그러나, 이는 또한, 최소 저해 농도(MIC)의 상승에 의해 특징되는 항생제에 대한 미생물의 감수성 감소, 또는 항균제가 더 이상 미생물 성장을 방지하지 않는 상황으로서 이해될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "소독제(antiseptic)"는 살아있는 조직에서 또는 살아있는 조직 상에서 미생물을 파괴하거나 미생물의 성장을 저해하는 항균제를 지칭한다. 용어 "항균제(antimicrobial)"는 본 발명에서, 본 발명의 분야에서 정상적인 의미, 즉, 미생물을 사멸시키거나 이의 성장을 저해하는 제제를 갖는다. 이러한 것은 주로, 예를 들어, 박테리아에 대해(항박테리아제) 및 진균에 대해(항진균제) 작용하는 미생물에 따라 추가로 그룹화될 수 있다. 소독제는 일반적으로, 항생제가 신체 내에서 박테리아를 파괴하기 위해 일반적으로 이동되기 때문에 항생제와, 그리고, 비생물체 상에서 발견된 미생물을 파괴하는, 살균제와는 구별된다.
실시예 2 및 실시예 3에 기술되어 있는 세부 검정을 기초로 하여, 당업자는 관례대로, 특정 균주가 소독제에 대해 내성을 나타내는 능력을 갖는 지의 여부를 객관적으로 결정하기 위해 검정을 반복할 수 있다. 특히, 실시예 2는 균주가 소독제에 대해 내성을 나타낼 수 있는 지의 여부를 결정하는 방법을 제공하며, 여기서, 내성은 디스크 확산 검정에 의해 측정된 저해 할로(inhibition halo)로서 표현된다. 예를 들어, 페디오코커스 균주는 페디오코커스 균주에 대해 관찰된 디스크 확산 검정에 의해 결정된 저해 할로가 포르피로모나스 진지발리스의 저해 할로보다 작을 때 소독제에 대해 내성을 나타내는 능력을 갖는 것으로 여겨지며, 여기서, 소독제는 P. 진지발리스의 저해를 관찰하는 농도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 페디오코커스 균주는 페디오코커스 균주에 대한 디스크 확산 검정에 의해 결정된 저해 할로의 직경이 P. 진지발리스에 대해 결정된 직경보다 적어도 1㎜, 2㎜, 3㎜ 또는 4㎜ 작을 때 소독제에 대해 내성을 나타내는 능력을 갖는 것으로 여겨질 것이다. 더 특정 실시형태에서, 페디오코커스에 대해 관찰된 저해 할로의 직경은 P. 진지발리스에 대해 결정된 저해 할로의 직경보다 적어도 4㎜ 작다.
본 발명에 의해 제공된 페디오코커스 균주는 제1 양상에서 기술된 소독제 중 적어도 하나에 대해 내성을 나타내는 능력을 갖는 것을 특징으로 한다. 그러나, 이러한 능력 이외에, 균주가 또한 실시예에 나타낸 바와 같이, 다른 관련 소독제에 대해 견딜 수 있다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 제1 양상에 기술된 특징이 본 발명의 목적을 위해 유용한 페디오코커스 균주의 그룹을 정의하는 중요한 특징 또는 마커로 여겨질 수 있음을 의미한다.
실시예를 통해, 상이한 균주는 P. 진지발리스보다 더 양호한 방식으로 이러한 소독제에 대해 내성을 나타내는 능력을 따르기 위해 제공된다. 상기 균주에 추가하여, 상세히 기술된 방법에 의하여, 소독제에 대해 동일한 내성을 나타내는 능력을 갖는, LAB의 풀 내에서 다른 균주를 동정하고 단리시키는 것이 타당할 것이다. 또한, 실시예에 의해, 소독제에 대한 내성의 특징이 본 발명의 목적을 위해 유익하다는 것이 입증되었다. 이에 따라, 일부 특정 균주가 이러한 유익한 특징으로 시험되고 동정되었지만, 다른 양호한 균주를 얻기 위한 방법의 모든 단계가 본 명세서에 타당할 정도로 기술되어 있기 때문에, 본 발명의 범위를 이러한 균주로 제한할 이유가 없다. 이에 따라, 본 발명은 또한, 동일한 특징을 갖는 실시예에서 사용되는 것과는 다른 균주의 풀을 제공한다. 모든 LAB 균주가 소독제에 대해 내성을 나타내는 능력을 가질 것이라는 것을 주목하는 것이 중요하다. 이에 따라, 본 발명은 이러한 것을 인식하는 방법을 제공한다.
유사하게, 디스크 확산 검정의 사용 및 실시예 2에 개시된 검정의 조건이 본 발명의 범위를 제한하지 않는다는 것을 주목하는 것이 관련이 있다. 검정은 소독제를 견딜 수 있는 균주의 능력을 시험하기에 적합한 검정이다. 소독제의 농도 및 양은 시험되는 소독제에 따라 균주의 내성을 시험하기 위해 당업자에 의해 선택될 것이다. 특히, 사용되는 소독제의 농도 및 양은 P. 진지발리스의 저해를 관찰하는 데 필요한 것일 것이다.
트라이클로산(CAS 등록 번호 3380-34-5)(TCS)은 다이페닐 에터이고, 2,4,4'-트라이클로로-2'-하이드록시다이페닐 에터, 5-클로로-2-(2,4-다이클로로페녹시)페놀 또는 트라이클로사눔으로서 지칭될 수 있다. TCS에 대한 분자식은 C12H7Cl3O2이며, 화학물질은 289.55의 분자량을 갖는다. 대부분의 상업적으로 획득한 등급의 TCS는 99% 이상의 순도를 가지고, 거의 검출되지 않는 방향성 냄새(aromatic odor)를 갖는 백색 내지 회백색 결정질 분말로서 고체 형태로 입수 가능하다. 트라이클로산은 여러 타입의 박테리아 및 특정 타입의 진균에 대해 효과적이어서, 박테리아 전파 및/또는 결국 세포사를 방지한다. 이는 박테리아 세포벽을 침투하고, RNA 합성 및 상이한 생체분자의 생산을 포함하는, 다수의 세포질 및 막 부위를 표적으로 한다.
에센셜 오일은 또한, 대안적인 소독제로서, 특히, 구강 위생을 위해 사용된다. 본 명세서에서 규정된 "에센셜 오일(essential oil)"(EO)은 식물 또는 동물 공급원으로부터 얻어진 오일, 또는 이의 합성 균등물이고, 모노터펜 및 세스퀴터펜, 탄화수소, 모노터펜 및 세스퀴터펜 알코올, 에스터, 에터, 알데하이드, 케톤, 옥사이드, 등과 같은 여러 구성성분들의 복잡한 혼합물로 이루어진다.
"에센셜 오일의 개별 구성성분"은 오일(천연)로부터 단리될 수 있거나 전체적으로 또는 부분적으로 화학적으로 합성될 수 있는 화합물이다.
멘톨은 또한, 2-아이소프로필-5-메틸사이클로헥산올 또는 5-메틸-2-(1-메틸에틸)사이클로헥산올로서 지칭될 수 있고, 합성적으로 제조되거나 콘 민트(corn mint), 페퍼민트(peppermint), 또는 다른 민트 오일(mint oil)로부터 수득된 유기 화합물이다.
유칼립톨은 환형 에터 및 모노터페노이드로서, 이는 유칼립투스(Eucalyptus) 속으로부터의 식물의 에센셜 오일에서 특히 풍부하다. 유칼립톨은 또한, 다음과 같은 다양한 동의어로도 알려져 있다: 1,8-시네올, 1,8-시네올레, 카제푸톨(cajeputol), 1,8-에폭시-p-멘탄, 1,8-옥시도-p-멘탄, 유칼립톨, 유칼립톨레, 1,3,3-트라이메틸-2-옥사바이사이클로[2,2,2]옥탄, 시네올, 시네올레.
티몰(또한, 2-아이소프로필-5-메틸페놀로서 공지됨)은 티민의 오일에서 발견되고 티무스 불가리스(Thymus vulgaris)(일반적으로 타임(thyme)) 및 다양한 다른 부류의 식무로부터 상쾌한 방향성 냄새 및 강력한 소독 성질의 백색 결정질 물질로서 추출되는, 카르바크롤을 갖는 이성질체인 시멘의 천연 몬터펜 페놀 유도체이다.
메틸 살리실레이트는 여러 종의 식물, 특히, 윈터그린(wintergreen)에 의해 자연적으로 생성된 유기 에스터가다. 메틸 살리실레이트는 또한, 일반적으로 메틸 2-하이드록시벤조에이트, 가울테리아 오일(gaultheria oil), 윈터그린 오일 또는 베툴라 오일(betula oil)로서 지칭된다.
일 실시형태에서, 페디오코커스 균주는 또한, 비스구아딘의 군으로부터의 소독제에 대해 내성을 나타내는 능력을 갖는다.
"비스구아나이드(bisguanide)"는 이의 박테리아 성질에 대해 공지된 화학적으로 관련된 화합물의 부류이다. 이러한 화합물은 소독제 알렉시딘 및 클로르헥시딘을 포함한다. 알렉시딘은 또한, 1-[N'-[6-[[아미노-[[N'-(2-에틸헥실)카바미도일]아미노]메틸리덴]아미노]헥실]카바미도일]-2-(2-에틸헥실)구아니딘으로서 지칭될 수 있다. 클로르헥시딘은 양이온성 폴리구아나이드이고, 또한, (1E)-2-[6-[[아미노-[(E)-[아미노-(4-클로로아닐리노)메틸리덴]-아미노]메틸리덴]아미노]헥실]-1-[아미노-(4-클로로아닐리노)메틸리덴]구아니딘으로서 지칭될 수 있다.
보다 특히, 페디오코커스 균주는 클로르헥시딘 글루코네이트를 견딜 수 있는 능력을 갖는다.
본 발명자는 또한, 페디오코커스 균주가 박테리아 병원체, 특히, 구강(buccal cavity)의 병원체의 성장을 저해(즉, 길항)할 수 있는 능력을 가질 수 있다는 것을 발견하였다. 이는 페디오코커스 균주가 병원체의 콜로니화를 피하고 심지어 이의 성장을 저해하여, 미생물총 프로파일을 개선시키는 데 특히 유용할 수 있게 한다.
이에 따라, 일 실시형태에서, 페디오코커스 균주는 또한, 푸사리움 누클레아툼(Fusarium nucleatum), 트레포네마 덴티콜라 및 프레보텔라 덴티콜라(Prevotella denticola)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 병원체를 길항시킬 수 있는 능력을 갖는다. 특히, 페디오코커스 균주는 이러한 병원체들 중 적어도 2가지를 길항시킬 수 있는 능력을 갖는다. 보다 특히, 페디오코커스 균주는 F. 누클레아툼, T. 덴티콜라 및 P. 덴티콜라를 길항시킬 수 있는 능력을 갖는다.
하나의 특정 실시형태에서, 페디오코커스 균주는 또한 타네넬라 포르시티아를 길항시킬 수 있는 능력을 갖는다.
하나의 특정 실시형태에서, 페디오코커스 균주는 또한 포르피로모나스 진지발리스를 길항시킬 수 있는 능력을 갖는다.
본 명세서에 기술된 상세한 검정(길항 활성 검정에 대해 실시예 4 참조)을 기초로 하여, 당업자는 고려되는 균주가 병원체를 길항시키는지의 여부를 객관적으로 결정하기 위해 이러한 검정을 관례대로 반복할 수 있다. 길항 활성 검정의 설명 및 조건은 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 검정은 병원체를 길항시킬 수 있는 고려되는 균주의 능력을 시험하기에 적합한 검정이다.
특정 실시형태에서, 페디오코커스 균주는 페디오코커스 에시디락티시 균주이다. 보다 특히, 페디오코커스 균주는 수탁 번호 CECT 8633호로 스페인 생물자원 센터(Spanish Type Culture Collection)에 기탁된 페디오코커스 에시디락티시이다.
이에 따라, 본 발명의 일 양상은 수탁 번호 CECT 8633호로 스페인 생물자원 센터에 기탁된 페디오코커스 에시디락티시 종에 속하는 균주에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양상은 104 내지 1012 cfu/g의 적어도 하나의 페디오코커스 균주의 생존 세포를 포함하는 조성물로서, 페디오코커스 균주는 적어도, 제1 양상에서 규정된 바와 같은 특징(소독제에 대해 내성을 나타내는 능력)을 갖는 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 단일 균주를 포함하거나 동일하거나 상이한 종에 속하는 상이한 LAB 균주들의 조합물일 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 페디오코커스 균주는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 균주 및/또는 락토바실러스 브레비스의 균주와 함께 발견된다. 보다 특히, 본 발명의 페디오코커스 균주를 포함하는 조성물은 수탁 번호 CECT 7481호로 스페인 생물자원 센터에 기탁된 락토바실러스 플란타룸의 균주, 및 수탁 번호 CECT 7480호로 스페인 생물자원 센터에 기탁된 락토바실러스 브레비스의 균주를 추가로 포함한다.
출발 물질로서 기탁된 균주를 사용함으로써, 당업자가 관례대로, 통상적인 돌연변이유발 또는 재단리 기술에 의해 본 발명의 조성물을 형성하는 균주의 본 명세서에 기술된 관련 특징 및 장점을 보유하거나 향상시키는 추가 변이체 또는 돌연변이체를 얻을 수 있다는 것이 명확하다. 이에 따라, 본 발명은 또한, 본 명세서에 개시된 균주의 변이체에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 균주의 "변이체(variant)" 또는 "돌연변이체(mutant)"는 균주보다 소독제에 대해 유사한 내성을 나타내는 능력을 유지하는, 주로 돌연변이에 의해, 기준 균주 X로부터 얻어진 임의의 자연 발생 또는 특이적으로 발달된 균주를 지칭한다.
예를 들어, 본 명세서에서 고려되는 "변이체" 균주의 16S rRNA 유전자는 본 명세서에 개시된 균주의 16S rRNA 서열인 서열번호 1과 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 공유할 수 있다.
다른 실시형태에서, 변이체와 부모 균주 간의 관련도(degree of relatedness)는 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 펄스-필드 겔 전기영동(Pulsed-field gel electrophoresis: PFGE)에 의해 부모 균주의 게놈 및 변이체 균주의 게놈을 분석할 때 얻어진 유사성의 정도로서 결정된다. PFGE에 의해 얻어진 유사성의 정도는 다이스 유사성 계수(Dice similarity coefficient)에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 변이체와 부모 균주 간의 다이스 유사성 계수는 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.1%, 약 99.5%, 약 99.6%, 약 99.7%, 약 99.8%, 약 99.9%, 약 99.99%, 약 99.999%, 약 99.9999%, 약 99.99999%, 약 99.999999% 이상, 그러나, 100% 미만이다.
하나의 특정 실시형태에서, 돌연변이체는 재조합 DNA 기술을 이용함으로써 얻어진다. 다른 실시형태에서, 돌연변이체는 랜덤 돌연변이유발에 의해 얻어진다. 이에 따라, 본 발명의 다른 양상은 페디오코커스 에시디락티시의 돌연변이체를 얻는 방법으로서, 균주는 균주 CECT 8633이며, 방법은 출발 물질로서 기탁된 균주를 사용하고 돌연변이유발을 적용하는 것을 포함하며, 얻어진 변이체 또는 돌연변이체는 적어도, 소독제를 견딜 수 있는 기탁된 균주의 능력을 추가로 보유하거나 향상시키는 방법에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, 균주는 박테리아 세포를 얻기 위해, 인공 배지에서 발효되고, 발효 후 후처리되었으며, 얻어진 박테리아 세포는 액체 배지 또는 고체 배지 중에 있다. 특히, 후처리는 건조, 냉동, 냉동-건조, 유체층-건조, 분무-건조, 및 액체 배지 중 냉장이고, 보다 특히, 냉동-건조이다.
본 발명의 균주는 적합한 인공 배지에서 및 적합한 조건 하에서 박테리아를 배양(또는 발효)시킴으로써 형성된다. 표현 미생물에 대한 "인공 배지"는 천연 물질, 및 선택적으로, 합성 화학물질, 예를 들어, 혈청의 기능들 중 일부를 재현할 수 있는 폴리머 폴리비닐 알코올을 함유한 배지로 이해된다. 통상적인 적합한 인공 배지는 탄소원(예를 들어, 글루코스), 질소원(예를 들어, 아미노산 및 단백질), 물 및 박테리아 성장을 위해 요구되는 염을 함유한 영양 브로쓰(nutrient broth)이다. 성장 배지는 액체 형태이거나, 종종 고체 배지를 얻기 위해 아가 또는 다른 겔화제와 혼합될 수 있다. 균주는 순수한 배양물을 형성하기 위해 단독으로, 또는 다른 미생물과 함께 혼합된 배양물로서, 또는 상이한 타입의 박테리아를 별도로 배양하고 이후에 이러한 것을 요망되는 비율로 합함으로써 배양될 수 있다. 배양 후, 그리고 최종 제형에 따라, 균주는 정제된 박테리아로서 사용될 수 있거나, 대안적으로, 박테리아 배양물 또는 세포 현탁액은 그 자체로, 또는 적절한 후처리 후에 사용될 수 있다. 이러한 설명에서, 용어 "바이오매스(biomass)"는 배양(또는 배양(배양)와 동일한 용어로서 발효) 후 얻어진 박테리아 균주 배양물로 이해된다.
용어 "후처리(post-treatment)"는 본 발명의 문맥에서 저장 가능한 박테리아 세포를 얻을 목적으로 바이오매스 상에서 수행되는 임의의 가공으로 이해된다. 후처리의 목적은 바이오매스에서 세포의 대사 활성을 감소시키고, 이에 따라, 세포 유해 반응의 속도를 늦추는 것이다. 후처리의 결과로서, 박테리아 세포는 고체 또는 액체 형태일 수 있다. 고체 형태에서, 저장된 박테리아 세포는 분말 또는 과립일 수 있다. 임의의 경우에, 박테리아 세포를 함유한 고체 형태 및 액체 형태 둘 모두는, 이러한 것이 인공 후처리 공정(들)의 결과이기 때문에, 자연에 존재하지 않고, 이에 따라, 자연적으로 발생하지 않는다. 후처리 공정은 특정 실시형태에서, 소위 후처리제 중 하나 이상의 사용을 필요로 할 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 표현 "후처리제(post-treatment agent)"는 본 명세서에 기술된 후처리 공정을 수행하기 위해 사용되는 화합물을 지칭한다. 후처리제 중에서, 비제한적으로, 탈수제, 세균발육 저지제, 저온 보호제(동결보호제(cryoprotectant)), 불활성 충전제(또한 동결건조보호제(lyoprotectant)로서 공지됨), 담체 물질(또한 코어 물질로서 공지됨), 등이 단독으로 또는 조합하여 사용되는 것이 포함된다.
박테리아 세포의 대사 활성을 감소시키는 2가지 기본 방법, 및 이에 따라, 후처리를 수행하기 위한 2가지 방법이 존재한다. 제1 방법은 모든 화학 반응 속도를 감소시키며, 이는 냉장고, 기계 냉동고, 및 액체 질소 냉동고를 이용하여 냉장 또는 냉동시킴으로써 온도를 낮춰서 수행될 수 있다. 대안적으로, 모든 화학 반응의 속도를 감소시키는 것은 박테리아 세포의 성장을 저해하는 물질, 즉, Bstatic로 약칭되는 세균발육 저지제를 첨가함으로써 달성될 수 있다.
후처리를 수행하기 위한 제2 방법은 바이오매스로부터 물을 제거하는 것으로서, 이러한 공정은 동결건조기를 이용한 물의 승화를 포함할 수 있다. 바이오매스로부터 물을 제거하는 적합한 기술은 건조, 냉동-건조, 분무-건조, 또는 유체층-건조이다. 고체 형태를 야기시키는 후처리는 건조, 냉동, 냉동-건조, 유체층-건조, 또는 분무-건조일 수 있다.
후처리는 바람직하게, 냉동-건조이며, 이는 감압 하에서 승화에 의해 냉동된 박테리아 현탁액으로부터 물의 제거를 포함한다. 이러한 공정은 하기 3 단계로 이루어진다: 냉동된 구조물을 형성하기 위해 생성물을 사전-냉동시키는 단계, 대부분의 물을 제거하기 위해 1차 건조시키는 단계, 및 결합수(bound water)를 제거하기 위해 2차 건조시키는 단계. 동결건조된 박테리아 배양물의 제조 및 분리를 위한 산업적 공정의 객관적 및 예측된 가변성으로 인하여, 후자는 통상적으로 특정 양의, 동결건조보호제로도 알려진 불활성 충전제를 함유한다. 이의 역할은 생성물에서 살아있는 프로바이오틱 박테리아의 함량을 표준화하는 것이다. 상업적으로 입수 가능한 동결건조된 배양물에서의 하기 불활성 충전제가 사용된다: 수크로스, 사카로스, 락토스, 트레할로스, 글루코스, 말토스, 말토덱스트린, 옥수수 전분, 이뉼린, 및 다른 약제학적으로 허용 가능한 비-흡습성 충전제. 선택적으로, 다른 안정화 또는 냉동-보호제, 예를 들어, 아스코르브산이 또한, 냉동-건조되는, 점성 페이스트를 형성하기 위해 사용된다. 임의의 경우에, 이에 따라 수득된 물질은 분말을 포함하여, 적절한 크기로 그라인딩될 수 있다.
소독제와 병용한 락트산 박테리아의 사용
전술한 바와 같이, 본 발명의 페디오코커스 균주는 소독제를 견딜 수 있으며, 이에 따라, 이는 소독제와 병용하여 사용하기에 적합하다. 소독제의 예는 비제한적으로, 트라이클로산, 식물 추출물 및 에센셜 오일, 비스구아나이드 및 세틸피리디늄을 포함한다.
하나의 특정 실시형태에서, 페디오코커스 균주는 트라이클로산과 병용하여 사용된다.
다른 특정 실시형태에서, 페디오코커스 균주는 에센셜 오일과 함께 사용된다. 이러한 것들의 예는 계피 오일, 바실 오일, 베르가못 오일, 클라리세이지 오일, 일랑-일랑 오일, 네롤리 오일, 샌들우드 오일, 프랑킨센스 오일(frankincense oil), 생강 오일, 페퍼민트 오일, 라벤더 오일, 자스민 앱솔루트(jasmine absolute), 게라늄 오일 버번(geranium oil bourbon), 스피어민트 오일, 클로브 오일, 파촐리 오일, 로즈마리 오일, 로즈우드 오일, 샌들우드 오일, 티트리 오일(tea tree oil), 바닐라 오일, 레몬그라스 오일(lemongrass oil), 시더우드 오일(cedarwood oil), 발삼 오일, 탄제린 오일(tangerine oil), 히노키 오일(Hinoki oil), 히바 오일(Hiba oil), 은행 오일, 유칼립투스 오일, 레몬 오일, 오렌지 오일, 스위트 오렌지 오일(sweet orange oil), 석류씨유, 마누카 오일, 시트로넬라 오일, 윈터그린 고일 및 칼렌듈라 오일을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 더 특정 실시형태에서, 페디오코커스 균주는 페퍼민트 오일, 유칼립투스 오일, 타임 오일, 및 윈터그린 오일로 이루어진 군으로부터 선택된 에센셜 오일과 함께 사용된다.
하나의 특정 실시형태에서, 페디오코커스 균주는 "에센셜 오일의 개별 구성성분"과 함께 사용된다. "에센셜 오일의 개별 구성성분"의 예는 타임, 오레가노, 쿠르쿠민, 1-시트로넬롤, a-아밀신남알데하이드, 리랄(lyral), 게라니올, 파르네솔, 하이드록시시트로넬랄, 아이소유게놀, 유게놀, 캄포르, 유칼립톨, 리날로올, 시트랄, 티몰, 리모넨 및 멘톨을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 개별 구성성분의 추가 예는 세스퀴터페노이드 화합물을 포함하며, 이는 에센셜 오일에서 활성 화합물일 수 있다. 15개의 탄소를 함유한, 세스퀴터페노이드 화합물은 3개의 5-탄소 아이소프렌 단위로부터 생합성적으로 형성된다. 세스퀴터페노이드 화합물은 파르네솔, 네롤리돌, 비사볼롤, 아프리톤, 카마줄렌, 산탈롤, 진기베롤, 카로톨, 및 카리오필렌을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 더 특정 실시형태에서, 페디오코커스 균주는 멘톨, 유칼립톨, 티몰 및 메틸 살리실레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 에센셜 오일의 개별 구성성분과 함께 사용된다.
하나의 특정 실시형태에서, 페디오코커스 균주는 비스구아딘, 보다 특히, 알렉시딘 또는 클로르헥시딘과 병용하여 사용된다. 알렉시딘 및 클로르헥시딘은 주로 이의 염으로서 사용된다. 본 발명에 따른 클로르헥시딘 염은 클로르헥시딘 팔미테이트, 클로르헥시딘 다이포스파닐레이트, 클로르헥시딘 다이글루코네이트, 클로르헥시딘 다이아세테이트, 클로르헥시딘 다이하이드로클로라이드, 클로르헥시딘 다이클로라이드, 클로르헥시딘 다이하이드로아이오다이드, 클로르헥시딘 다이퍼클로레이트, 클로르헥시딘 다이니트레이트, 클로르헥시딘 설페이트, 클로르헥시딘 설파이트, 클로르헥시딘 티오설페이트, 클로르헥시딘 다이-산 포스페이트, 클로르헥시딘 다이플루오로포스페이트, 클로르헥시딘 다이폼에이트, 클로르헥시딘 다이프로피오네이트, 클로르헥시딘 다이-요오도부티레이트, 클로르헥시딘 다이-n-발레레이트, 클로르헥시딘 다이카프로에이트, 클로르헥시딘 말로네이트, 클로르헥시딘 석시네이트, 클로르헥시딘 말레에이트, 클로르헥시딘 타타레이트, 클로르헥시딘 다이모노글리콜레이트, 클로르헥시딘 모노다이글리콜레이트, 클로르헥시딘 다이락테이트, 클로르헥시딘 다이-알파-하이드록시아이소부티레이트, 클로르헥시딘 다이글루코헵토네이트, 클로르헥시딘 다이-아이소티오네이트, 클로르헥시딘 다이벤조에이트, 클로르헥시딘 다이신나메이트, 클로르헥시딘 다이만델레이트, 클로르헥시딘 다이-아이소프탈레이트, 클로르헥시딘 다이-2-하이드록시나프토에이트, 및 클로르헥시딘 엠보네이트를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 더 특정 실시형태에서, 페디오코커스 균주는 클로르헥시딘, 보다 특히, 클로르헥시딘 글루코네이트와 병용하여 사용된다.
본 발명의 균주 및 소독제는 별도, 순차적, 동시 투여를 위해 또는 혼합물로 제형화될 수 있다.
투여 요법 및 형태는 시험되는 장애에 따라 당업자에 의해 결정될 것이다. 소독제 및 락트산 박테리아의 투여는 별도로(페디오코커스 균주의 투여와 소독제의 투여 상의 시간 간격을 대기함), 공동으로(concomitantly)(동시에) 또는 혼합하여(함께) 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 소독제 및 본 발명의 균주는 12시간 이하의 시간 간격 내에서 투여된다. 특히, 시간 간격은 6시간 이하이다. 보다 특히, 시간 간격은 1시간 이하이다. 보다 특히, 시간 간격은 10분 이하이다. 더 특정의 실시형태에서, 치료 요법은 소독제 및 균주의 동시 투여를 기초로 한 것이다. 하나의 통상적인 투여 요법은 소독제를 투여하고 후속하여 본 발명의 페디오코커스 균주를 투여하는 것으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 소독제 및 페디오코커스 균주는 동시에 투여된다. 소독제 및 락트산 박테리아가 동시에 환자에게 투여될 때, 이러한 것은 별도의 형태로서 또는 단일 조성물의 일부로서 투여될 수 있다. 생성물이 별도의 투약 형태로 투여될 때, 투약 형태는 동일한 또는 상이한 용기에 존재할 수 있다.
특정 투여 처리에서, 치료될 대상체는 30 내지 60초 동안 소독제(0.12%(w/v)의 농도의 클로르헥시딘)를 함유한 구강 청결제로 대상체의 입을 양치(gargle)하도록 지시된다. 이후에, 구강 청결제는 제거되며(split out), 락트산 박테리아를 함유한 경구 정제를 입에 도입하였고, 서서히 용해시킬 수 있다.
투여는 특히, 질병 상태 또는 임의의 요망되지 않는 부작용의 임의의 변화의 측면에서, 관리 의사(supervising practitioner)에 의해 적절하다고 판단되는 경우, 만성적이거나 간헐적일 수 있다. "만성(chronic)" 투여는 연속 방식으로 조성물의 투여를 지칭하며, "간헐적(intermittent)" 투여는 중단(interruption)과 함께 수행되는 치료를 지칭한다.
비제한적인 실시형태에서, 본 발명의 페디오코커스 균주 및 조성물은 치과 전문의에 의해 급성 치료에서 사용되며, 환자는 츄잉 검, 치아-페이스트, 구강 세척제, 구강 스프레이, 로젠지 또는 본 발명의 분말 형태의 자가-막-형성 조성물 또는 통상적인 부형제를 갖는 락트산 박테리아를 포함하는 구강 분산 가능한 정제와 같은 구강 위생 제품으로의 유지 치료(maintenance treatment)로 이어질 수 있다. 치아 전문가에 의한 투여는 예를 들어, 본 발명의 조성물을 시린지에 의해, 특히, 무딘 첨단 니들(blunt tip needle)으로 적용함으로써 수행될 수 있다. 전문가 투여의 다른 비제한적인 예는 본 발명의 조성물을 포함하는 겔을 함유한 구강 부목(mouth splint)을 적용하거나, 브러쉬(brush)를 이용하여 치아 표면 상에 바니시(varnish)로서 제형화된 조성물을 적용한다. 구취, 치주염, 치은염, 또는 충치와 같은 적용에서, 본 발명의 조성물은 또한, 환자 자신에 의해 적용될 수 있다.
하나의 특정 실시형태에서, 소독제는 0.05 내지 0.5%(w/w) 범위의 농도로 존재한다. 보다 특히, 소독제의 농도는 0.05 내지 0.2%(w/w) 범위의 농도로 존재한다. 보다 특히, 농도는 0.05, 0.1, 0.12 또는 0.2%(w/w)이다.
본 발명의 일 양상은 a) 소독제를 포함하는 제1 바이알; 및 b) 적어도, 페디오코커스 균주를 포함하는 제2 바이알을 포함하는 부분의 키트를 제공한다. 특정 실시형태에서, 키트는 보다 특히, 투여량 및/또는 투여 요법과 관련된 정보를 포함하는, 사용 설명서를 포함한다.
개인 관리 제품
일 양상에서, 본 발명은 허용되는 부형제 및/또는 담체와 함께 본 발명의 균주 및 조성물을 포함하는 개인 관리 제품을 제공한다. 용어 "개인 관리 제품"은 개인 위생(personal hygiene) 및/또는 미화(beautification)(화장품)에서 사용되는 제품을 지칭한다.
본 문맥에서 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 개인 관리 제품은 유효량의 본 발명의 균주를 포함한다. 페디오코커스 균주의 유효량은 당업자에 의해 결정되고, 달성되는 특정 목표, 치료되는 환자의 연령 및 신체적 상태, 기저 장애(underlying disorder)의 중증도, 및 최종 제형에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 경구 건강 제품에서, 균주 또는 균주들은 약 105 cfu/g 내지 약 1012 cfu/g의 양, 특히, 약 107 cfu/g 내지 약 1011 cfu/g의 양으로 존재한다. 용어 "콜로니 형성 단위(colony forming unit)"("cfu")는 아가 플레이트 상에 미생물 수에 의해 밝혀지는 박테리아 세포의 수로서 정의된다. 특정 실시형태에서, 조성물은 107 내지 1010 cfu/g을 포함한다.
용어 "부형제(excipient)"는 약제학적 제품, 수의 제품, 약제, 식품 보조제, 의료 식품 및 개인 위생 제품의 활성 성분과 함께 제형화된 임의의 천연 또는 합성 물질을 포함하는, 본 명세서에서 이의 광범위한 의미로 이해된다. 사용되는 가장 적절한 부형제(들)는 최종 제형에 따른다.
본 발명을 사용할 수 있는 개인 관리 제품의 비제한적인 예는 막대 비누(bar soap), 액체 비누(예를 들어, 핸드 비누), 손 세정제(린스 오프(rinse off) 및 리브-온(leave-on) 알코올 기반 및 수성-기반 손 살균제를 포함함), 면봉 및 패드, 면도 크림, 탈쿰 파우더(talcum powder), 화장지(toiled paper), 수술전 피부 살균제, 습윤 페이퍼(wet paper), 클렌징 와이프(cleansing wipe), 소독 와이프(disinfecting wipe), 바디 세척제, 여드름 치료 제품, 항진균 기저귀 발진 크림, 항진균 피부 크림, 샴푸, 컨디셔너(conditioner), 화장품 탈취제(cosmetics deodorant), 항균제 크림, 바디 로션, 핸드 크림, 국소 크림, 애프터쉐이브 로션(aftershave lotion), 스킨 토너(skin toner), 구강 위생 제품, 선스크린 로션, 및 유아 용품, 예를 들어, 비제한적으로, 클렌징 와이프(cleansing wipe), 유아 샴푸, 유아 비누 및 기저귀 크림을 포함한다.
본 발명은 또한, 상처 관리 물품, 예를 들어, 비제한적으로, 상처 치유 연고, 크림, 및 로션, 상처 피복, 화상 크림, 붕대, 테이프, 및 스테리-스트립(steri-strip), 및 의약품, 예를 들어, 의료 가운, 캡(cap), 안면 마스크, 및 신발-커버, 외과적 드롭스(surgical drops) 등에 적용될 수 있다.
하나의 특정 실시형태에서, 개인 관리 제품은 국소 크림 또는 겔이다.
본 발명의 다양한 비제한적인 실시형태에서, 본 발명의 조성물을 포함하는 개인 관리 제품은 증점 및/또는 겔화제, 예를 들어, 스테아릴 알코올, 양이온성 하이드록시 에틸 셀룰로스(Ucare; JR30), 하이드록시 프로필 메틸 셀룰로스, 하이드록시 프로필 셀룰로스(Klucel), 키토산 피롤리돈 카복실레이트(Kytamer), 베헤닐 알코올, 스테아르산아연, Incroquat 및 Polawax를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 에멀젼화 왁스, 아크릴산의 첨가 폴리머, 수지, 예를 들어, Carbopol(R) ETD™ 2020, 구아검, 아카시아, 아크릴레이트/스테아레스-20 메타크릴레이트 공중합체, 아가, 알긴, 알긴산, 암모늄 아크릴레이트 공중합체, 암모늄 알기네이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 설페이트, 아밀로펙틴, 애터펄자이트, 벤토나이트, C9-15 알코올, 칼슘 아세테이트, 칼슘 알기네이트, 칼슘 카라기난, 칼슘 클로라이드, 카프릴 알코올, 카보머 910, 카보머 934, 카보머 934P, 카보머 940, 카보머 941, 카복시메틸 하이드록시에틸 셀룰로스, 카복시메틸 하이드록시프로필 구아, 카라기난, 셀룰로스, 셀룰로스 검, 세테아릴 알코올, 세틸 알코올, 콘 전분, 다마(damar), 덱스트린, 다이벤질리딘 소르비톨, 에틸렌 다이수소화된 탈로우아마이드, 에틸렌 다이올아마이드, 에틸렌 다이스테아라미드, 젤라틴, 구아검, 구아 하이드록시프로필트라이암모늄 클로라이드, 헥토라이트, 히알루론산, 수화된 실리카, 하이드록시부틸 메틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시에틸 에틸셀룰로스, 하이드록시에틸 스테아라미드-MIPA, 아이소세틸 알코올, 아이소스테아릴 알코올, 카라야 검, 켈프, 라우릴 알코올, 로쿠스트 콩 검, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 마그네슘 실리케이트, 마그네슘 트라이실리케이트, 메톡시 PEG-22/도데실 글리콜 공중합체, 메틸셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 몬트모릴로나이트, 미리스틸 알코올, 오트 가루, 올레일 알코올, 팜핵 알코올, 펙틴, PEG-2M, PEG-5M, 폴리아크릴산, 폴리비닐 알코올, 알긴산칼륨, 칼륨 알루미늄 폴리아크릴레이트, 칼륨 카라기난, 염화칼륨, 황산칼륨, 감자 전분, 프로필렌 글리콜 알기네이트, 아크릴산나트륨/비닐 알코올 공중합체, 나트륨 카복시메틸 덱스트란, 나트륨 카라기난, 나트륨 셀룰로스 설페이트, 염화나트륨, 나트륨 폴리메타크릴레이트, 나트륨 실리코알루미네이트, 황산나트륨, 스테아르알코늄 벤토나이트, 스테아르알코늄 헥토라이트, 스테아릴 알코올, 우지 알코올, TEA-하이드로클로라이드, 트래거캔스 검, 트라이데실 알코올, 트로메타민 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 밀가루, 잔탄검, 아비에틸 알코올, 아크릴리놀레산, 베헨산알루미늄, 카프릴산알루미늄, 알루미늄 다이리놀레에이트, 알루미늄염, 예를 들어, 다이스테아레이트, 및 아이소스테아르산알루미늄, 밀납, 베헨아마이드, 부타다이엔/아크릴로니트릴 공중합체, C29-70 산, 베헨산칼슘, 스테아르산칼슘, 칸델릴라 왁스, 카르나우바, 세레신, 콜레스테롤, 콜레스테롤 하이드록시스테아레이트, 코코넛 알코올, 코팔, 다이글리세릴 스테아레이트 말레이트, 다이하이드로비에틸 알코올, 다이메틸 라우라민 올레에이트, 도데칸산/세테아릴 알코올/글리콜 공중합체, 에루카마이드, 에틸셀룰로스, 글리세릴 트라이아세틸 하이드록시스테아레이트, 글리세릴 트라이-아세틸 리시놀레이트, 글리콜 다이베헤네이트, 글리콜 다이-옥타노에이트, 글리콜 다이스테아레이트, 헥산다이올 다이스테아레이트, 수소화된 C6-14 올레핀 폴리머, 수소화된 캐스터 오일, 수소화된 목화씨 오일, 수소화된 라드, 수소화된 멘헤이든 오일, 수소화된 팜핵 글리세라이드, 수소화된 팜핵 오일, 수소화된 팜 오일, 수소화된 폴리아이소부텐, 수소화된 대두 오일, 수소화된 우지 아마이드, 수소화된 우지 글리세라이드, 수소화된 식물성 글리세라이드, 수소화된 식물성 오일, 일본 왁스(Japan wax), 조조바 왁스, 라놀린 알코올, 시어 버터, 라우라미드, 메틸 데하이드로아비에테이트, 메틸 수소화된 로시네이트, 메틸 로시네이트, 메틸 스티렌/비닐톨루엔 공중합체, 미정질 왁스, 몬탄산 왁스, 몬탄 왁스, 미리스틸에이코산올, 미리스틸옥타데칸올, 옥타데센/말레산 안하이드린 공중합체, 옥틸도데실 스테아로일 스테아레이트, 올레아마이드, 올레오스테아린, 오우리커르 왁스(ouricury wax), 산화된 폴리에틸렌, 오조케라이트, 파라핀, 펜타에리트리틸 수소화된 로시네이트, 펜타에리트리틸 테트라옥타노에이트, 펜타에리트리틸 로시네이트, 펜타에리트리틸 테트라아비에테이트, 펜타에리트리틸 테트라베헤네이트, 펜타에리트리틸 테트라올레에이트, 펜타에리트리틸 테트라스테아레이트, 오프탈름산 무수물/글리세린/글리시딜 데카노에이트 공중합체, 오프탈름/트라이멜리트/글리콜 공중합체, 폴리부텐, 폴리부틸렌 테레프탈레이트, 폴리다이펜텐, 폴리에틸렌, 폴리아이소부텐, 폴리아이소프렌, 폴리비닐 부티랄, 폴리비닐 라우레이트, 프로필렌 글리콜 다이카프릴레이트, 프로필렌 글리콜 다이코코에이트, 프로필렌 글리콜 다이아이소노나노에이트, 프로필렌 글리콜 다이라우레이트, 프로필렌 글리콜 다이펠라르고네이트, 프로필렌 글리콜 다이스테아레이트, 프로필렌 글리콜 다이운데카노에이트, PVP/에이코센 공중합체, PVP/헥사데센 공중합체, 쌀겨 왁스, 스테아를코늄 벤토나이트, 스테아르알코늄 헥토라이트, 스테아라미드, 스테아라미드 DEA-다이스테아레이트, 스테아라미드 DIBA-스테아레이트, 스테아라미드 MEA-스테아레이트, 스테아론, 스테아릴 에루카미드, 스테아릴 스테아레이트, 스테아릴 스테아로일 스테아레이트, 합성 밀랍, 트라이하이드록시스테아린, 트라이아이소노나노인, 트라이아이소스테아린, 트라이-아이소스테아릴 트라이리놀레이트, 트라이라우린, 트라이리놀레산, 트라이리놀레인, 트라이미리스틴, 트라이올레인, 트라이팔미틴, 트라이스테아린, 라우르산아연, 미리스트산아연, 네오네칸산아연, 로진산아연, 및 이들의 혼합물을 추가로 포함할 수 있다. 비히클에서 사용되는 겔화제는 천연 겔화제, 예를 들어, 천연 검, 전분, 펙틴, 아가 및 젤라틴일 수 있다. 종종, 겔화제는 다당류 또는 단백질을 기초로 한다. 예는 구아검, 잔탄(Xanthum)검, 알긴산(E400), 알긴산나트륨(E401), 알긴산칼륨(E402), 알긴산암모늄(E403), 알긴산칼슘(E404, 갈조류로부터의 다당류), 아가(E406, 붉은 해초로부터 얻어진 다당류), 카라기난(E407, 붉은 해초로부터 얻어진 다당류), 로커스트콩검(E410, 캐럽 나무의 종자로부터의 천연 검), 펙틴(E440, 사과 또는 감귤-열매로부터 수득된 다당류), 및 젤라틴(E441, 동물 콜라겐의 부분 가수분해에 의해 제조됨)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명의 다양한 비제한적인 실시형태에서, 개인 관리 제품에서 사용되는 균주 및 조성물은 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 계면활성제는 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제, 또는 비이온성 계면활성제일 수 있다. 비이온성 계면활성제의 예는 폴리에톡실레이트, 지방 알코올(예를 들어, 세테스-20(평균 약 20개의 에틸렌 옥사이드 단위를 갖는 폴리에틸렌 옥사이드의 세틸 에터) 및 ICI Americas, Inc.(델라웨어주 윌밍턴 소재)로부터 입수 가능한 다른 "BRIJ"(R) 비이온성 계면활성제, 코카미도프로필 베타인, 알킬 페놀, 소르비톨의 지방산 에스터, 소르비탄, 또는 폴리옥시에틸렌 소르비탄을 포함한다. 적합한 음이온성 계면활성제는 라우릴황산암모늄 및 라우릴 에터 설포석시네이트를 포함한다. 본 발명의 다양한 비제한적인 실시형태에서, 개인 관리 제품은 물을 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 비제한적인 실시형태에서, 개인 관리 제품에서 사용되는 균주 및 조성물은 예를 들어, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 양이온성 하이드록시에틸 셀룰로스(U-케어 폴리머), 에틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시메틸 셀룰로스, 카복시 메틸 셀룰로스, 폴리에틸렌 옥사이드(폴리옥스 수지), 및 키토산 피롤리돈 카복실레이트(Kytomer PC)와 같은 화합물을 포함하는 하이드로겔을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 균주 및 조성물은 또한, 구강 건강 적용에서 사용하기 위한 것이다. 이에 따라, 하나의 특정 실시형태에서, 개인 관리 제품은 약제학적 부형제, 또는 미용학적으로 허용되는 부형제, 또는 다른 식용 구성성분과 함께, 본 발명의 균주 또는 조성물을 포함하는, 구강 위생 제품이다. 본 발명의 조성물이 유효량으로 존재하는 것으로 이해된다. 용어 "구강 위생 제품"은 치과 문제, 가장 일반적으로, 우와(dental cavity), 치은염, 치주(검) 질병 및 구취를 예방하기 위해 입 및 치아를 깨끗하게 유지하는 데 사용되는 제품을 지칭한다. 이러한 의미에서, 구강 위생 제품은 특정 치료제의 전신 투여를 위해 의도적으로 연하되지 않고, 대신에 구강 활성의 목적을 위해 실질적으로 모든 치아 표면 및/또는 구강 조직과 접촉하기에 충분한 시간 동안 구강 내에 유지된다. 이러한 제품의 비제한적인 예에는 치약, 치마제(dentifrice), 치아 분말(tooth powder), 국소 구강 젤, 구강 세정제, 의치용 제품, 구강 스프레이, 츄잉 검, 치실, 치과용 테이프, 블라스팅 분말(blasting powder), 폴리싱 페이스트(polishing paste), 치과용 바니시(dental varnish), 균열 밀봉제, 충전재, 구강 크림 또는 겔, 캔디, 로젠지, 구강 분산 가능한 정제 또는 스트립, 또는 구강에 직접적으로 뿌려질 수 있는 분말이 있다.
특정 실시형태에서, 구강 위생 제품은 치약, 구강 젤, 구강 스프레이, 구강 세정제 또는 구강 분산 가능한 정제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
구강 위생 제품은 추가적으로, 착향제 및 맛-차폐제를 포함할 수 있다. 구강 위생 제품에서 사용하기 위한 이러한 제제의 비제한적인 예는 신남 알데하이드, 유게놀, 유칼립톨, 멘톨, N-에틸-p-메탄-3-카복스아마이드, 아네톨, 페퍼민트 오일, 스피어민트 오일 및 콘 민트 오일을 포함한다.
구강 위생 제품은 선택적으로, 습윤제, 겔화제, 연마제, 플루오라이드 공급원, 탈감작제, 착향제, 착색제, 감미제, 보존제, 구조화제, 계면활성제, 결석방지제 및 플라크방지제를 포함할 수 있다.
구강 위생 제품은 또한, 다른 경구 활성제, 예를 들어, 표백 또는 산화제, 예를 들어, 퍼옥사이드, 퍼보레이트, 퍼카르보네이트, 퍼옥시산, 퍼설페이트, 금속 클로라이트, 및 이들의 조합을 포함하는, 치아 미백 활성물을 포함할 수 있다. 본 발명에서 유용한 구강 위생 활성물들 중에서 치아 칼라 변경 물질이 또한 고려될 수 있다.
치약의 제형은 당업자에 의해 널리 공지되어 있다. 치약 조성물에서, 음이온성 계면활성제가 검의 섬세한 상피 조직에 대해 부정적인 영향을 미치기 때문에, 비이온성(예를 들어, 당을 갖는 지방산 에스터) 또는 양쪽성(예를 들어, 코코-유도 베타인) 계면활성제를 사용하는 것이 바람직하다. 치약의 경우에, 구강 산도를 중화시키기 위한 중탄산나트륨의 사용이 또한 특히 바람직하다. 또한, 치약은 증점제, 예를 들어, 잔탄 검, 연마 실리카 충전제, 및 치약 산업에서 일반적으로 사용되는 것 이외의 다른 보조제를 함유할 수 있다. 바람직하게, 락트산 박테리아는 치약에 도입하게 위해 다른 형태로 캡슐화되거나 보호된다.
당업자에 의해 알려진 바와 같이, 본 명세서에서 사용되는 "구강 청결제(mouthwash)", "구강 세정제(mouthrinse)", "치아 세정제(dental rinse)", "경구 세정제(oral rinse)" 또는 "구강 베쓰(mouth bath)"는 말초 근육의 수축 및/또는 머리의 움직임에 의해 입안에서 수동적으로 유지되거나 입 주변을 씻어내고 머리를 뒤로 기울어지게 하고 액체를 입의 양쪽에서 버블링하는 경우에, 양치질될 수 있는 액체 조성물을 지칭한다. 대개, 구강 청결제는 입안의 미생물 부하를 감소시키도록 의도된 소독제 용액이며, 이의 진통제, 소염 또는 항진균 작용을 위한 것과 같은 다른 이유로 다른 구강 청결제가 제공될 수 있다. 추가적으로, 일부 세정제는 산을 중화시키고 구강 건조증(xerostomia)(구강 건조(dry mouth))에서 입안에 수분을 유지시키기 위해 타액 대체물로서 작용한다. 물 이외에, 폴리하이드록실화된 화합물, 예를 들어, 글리세린 또는 글리콜(예를 들어, 프로필렌 글리콜, 비이온성 계면활성제, 등) 및 외관, 풍미, 및 보존을 개선시키기 위한 다른 첨가제가 포함될 수 있다.
스프레이는 구강 청결제와 동일하거나 유사하지만, 후속 세정을 필요로 하지 않으면서 입안에 수분을 공급하고 보호하기 위해 요구되는 용량의 통상적인 적용을 위해 스프레이 병에 분산되어 있는 조성물이다.
구강 젤은 구강에 대한 직접적이고 안정한 적용을 가능하게 하는 폴리머를 포함한다. 이러한 폴리머와 관련하여, 본 발명의 목적을 위하여, 일반적으로 폴리카르보필 및 카르보머로서 알려진 폴리머들의 조합을 사용하는 것이 바람직한데, 왜냐하면, 이러한 것이 극한의 온도 조건 하에서 매우 긴 시간 동안 겔 구조를 안정하게 유지하기 때문이다. 겔은 또한, 소정 양의 천연, 비우식성 감미제(noncariogenic sweetener), 예를 들어, 소르비톨을 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 개인 관리 제품은 화장용으로 허용되는 부형제와 함께, 페디오코커스 균주 또는 본 발명의 조성물을 포함하는, 화장품 제품이다. "화장품 제품(cosmetics product)" 또는 "화장품(cosmetic)"은 신체의 구조 또는 기능에 영향을 미치지 않으면서 클렌징, 미화(beautifying), 매력 증진, 또는 외모 변화를 위해 인간 신체에 적용되도록 의도된 제품이다. 화장품은 또한, 치료 이득을 가질 수 있다.
용어 "화장용으로 허용되는(cosmetically acceptable)"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 다른 것들 중에서, 과도한 독성, 비혼화성, 불안정성 및 알레르기 반응 없이 인간 피부와 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투약 형태를 지칭한다. 각 "화장용으로 허용되는" 담체, 부형제, 등은 또한, 화장품 제형의 다른 구성성분들과 혼화 가능하다는 의미에서 "허용 가능"해야 한다. 화장품 제형을 위한 적합한 담체, 부형제, 등은 표준 텍스트(standard text)에서 확인될 수 있다.
화장품 제품의 비제한적인 예는 클렌징 패드, 콜런(cologne), 면봉, 면 패드(cotton pad), 아이 라이너(eye liner), 안면 티슈(facial tissue), 헤어 클립퍼(hair clipper), 립 글로스(lip gloss), 립스틱(lipstick), 로션, 메이크업(make-up), 손톱 줄(nail file), 포마드(pomade), 퍼퓸(perfume), 면도칼, 면도 크림, 보습제(moisturizer), 탤컴 파우더(talcum powder), 화장지(toilet paper) 및 습윤 와이프(wet wipe)(액체 또는 분말 파운데이션, 액체 또는 고체 아이라이너, 마스카라, 크림 아이섀도, 틴트 분말, 건식 또는 습식으로 사용되는 "팬케이크(pancake)" 타입 파우더 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않음)를 포함한다.
약제학적 제품 및 식품 보조제
일 양상에서, 본 발명의 페디오코커스 균주 및 조성물은 약제학적 제품으로서 제형화된다. 용어 "약제학적 제품"은 약제학으로 허용 가능한 부형제와 함께, 활성 성분, 이러한 경우에, 바람직하게 조성물 형태 및 선택적으로 적어도 하나의 소독제 형태의 본 발명의 균주를 포함하는 임의의 조성물을 포함하는, 이러한 명세서에서 이의 넓은 의미로 이해된다. 이러한 용어는 약제로 한정되는 것은 아니다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 당해 분야에 인지되고, 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 합리적인 유익/유해비에 비례하여, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 대상체(예를 들어, 인간)의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 담체, 비히클 및/또는 투약 형태에 대해 포함한다. 각 담체, 부형제, 등은 또한, 제형의 다른 구성성분과 혼화 가능하다는 의미에서, "허용 가능"해야 한다. 적합한 담체, 부형제, 등은 표준 약제 텍스트에서 확인될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체로서 역할을 할 수 있는 물질의 일부 비제한적인 예는 당, 예를 들어, 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예를 들어, 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스, 및 이의 유도체, 예를 들어, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 분말화된 트래거캔스; 맥아; 젤라틴; 탈크; 코코어 버터 및 좌제 왁스; 오일, 예를 들어, 땅콩 오일, 목화씨 오일, 해바라기 오일, 세삼 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 대두 오일; 글리콜, 예를 들어, 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예를 들어, 글리세린, 글리콜; 폴리올, 예를 들어, 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스터, 예를 들어, 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 아가; 완충제; 예를 들어, 마그네슘 하이드록사이드 및 알루미늄 하이드록사이드; 알긴산; 발열원-부재 수; 등장성 염수; 링거 용액; 에틸 알코올; 포스페이트 완충 용액; 및 약제학적 제형에서 사용되는 다른 비독성 혼화성 물질을 포함한다.
부형제는 비제한적으로, 충전제/윤활제/벌크화제, 결합제, 접착방지제, 붕해제, 코팅제, 해산제(anti-caking agent), 항산화제, 윤활제, 감미제, 풍미제, 착색제, 텐시드(tenside), 및 다른 부류의 약제학적으로 및 수의학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 군으로부터 선택된다.
충전제는 비제한적으로, 인눌린, 올리고프럭토스, 펙틴, 변형된 펙틴, 미정질 셀룰로스, 락토스, 전분, 말토덱스트린, 사카로스, 글루코스, 프럭토스, 만니톨, 자일리톨, 비-결정화 소르비톨, 탄산칼슘, 인산이칼슘, 다른 불활성 무기 및 유기 약리학적으로 허용되는 충전제, 및 이러한 물질들의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택된다. 경구 현탁액의 투약 형태에서, 충전제 또는 희석제는 식물성 오일, 올레산, 올레일 알코올, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 다른 약리학적으로 허용되는 불활성 액체, 또는 이러한 물질들의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택된다.
결합제는 예를 들어, 정제에서 구성성분들을 함께 유지시키고, 요망되는 기계적 강도를 갖는 정제 및 과립이 형성될 수 있게 하고, 낮은 활성 용량 정제에 부피를 제공하기 위해, 고체 투약 형태에서 사용된다. 정제와 같은 고체 투약 형태에서의 결합제에는 락토스, 수크로스, 곡식(옥수수) 전분, 변형된 전분, 미정질 셀룰로스, 변형된 셀룰로스(예를 들어, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스(HPMC) 및 하이드록시에틸셀룰로스), 다른 수용성 셀룰로스 에터, 포비돈으로도 알려진 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리에틸렌 글리콜, 소르비톨, 말티톨, 자일리톨 및 이염기성 칼슘 포스페이트; 다른 적합한 약리학적으로 허용되는 결합제, 또는 이러한 물질들의 혼합물이 있다.
접착방지제는 분말(과립)과 펀치 페이스(punch faces) 간의 접착을 감소시키고 이에 따라 정제 펀치(tablet punch)에 대한 점착(sticking)을 방지하기 위해 사용된다. 이러한 것은 또한, 정제가 점착하는 것을 방지하는 데 도움을 주기 위해 사용된다. 가장 일반적으로, 스테아르산마그네슘이 사용된다.
정제 및 캡슐과 같은 고체 투약 형태에서 붕해제 및 초붕해제로서, 비제한적으로, 하기 물질이 사용된다: 가교된 폴리비닐피롤리돈, 나트륨 전분 글리콜레이트, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 칼슘 카복시메틸 셀룰로스, 및 포름알데하이드-카제인, 다른 적합한 약리학적으로 허용되는 붕해제 및 초붕해제, 또는 이들의 혼합물.
캡슐 충전을 위한, 정제 및 과립과 같은 고체 투약 형태의 경우에서의 코팅은 공기 중 수분에 의해 구성성분이 저하되는 것을 방지하고/하거나, 크고 불쾌한 맛을 갖는 정제를 더 용이하게 연하하게 만들고/거나, 정용 코팅의 경우에, 위액의 강한 산성 매질(pH 대략 1)을 통해 손상되지 않은 통과를 보장하고, 십이지장 또는 회장(소장)에서 방출을 허용한다. 대부분의 코팅된 정제를 위하여, 셀룰로스 에터 하이드록시프로필 메틸셀룰로스(HPMC) 막 코팅이 사용된다. 가끔, 다른 코팅 물질, 예를 들어, 합성 폴리머 및 공중합체, 예를 들어, 폴리비닐아세테이트 프탈레이트(PVAP); 메틸 아크릴레이트-메타크릴산의 공중합체; 메탈 메타크릴레이트-메타크릴산의 공중합체; 셀락, 옥수수 단백질 제인(corn protein zein) 또는 다른 다당류; 왁스 또는 왁스-유사 물질, 예를 들어, 밀납, 스테아르산; 고차 지방 알코올, 예를 들어, 세틸 또는 스테아릴 알코올; 고체 파라핀; 글리세롤 모노스테아레이트; 글리세롤 다이스테아레이트, 또는 이들의 조합이 사용된다. 캡슐은 젤라틴 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스로 코팅된다.
장용 코팅(enteric coating)은 약물 방출 속도를 조절하고, 소화관에서 약물이 방출될 지를 결정한다. 장용 코팅을 위해 사용되는 물질은 지방산, 왁스, 셀락, 플라스틱, 및 식물 섬유 및 이들의 혼합물을, 또한 다른 전술한 코팅과 함께 포함한다.
해산제는 덩어리의 형성(케이킹)을 방지하고 패키징, 수송, 및 소비를 용이하게 하기 위해 분말화되거나 과립화된 물질에 배치된 첨가제이다. 정제, 캡슐, 또는 분말과 같은 고체 투약 형태에서의 해산제로서, 하기 물질이 사용된다: 스테아르산마그네슘, 콜로이드성 이산화규소, 탈크, 다른 약리학적으로 허용되는 해산제, 또는 이들의 혼합물.
윤활제는 구성성분들이 함께 군집화되는 것을 방지하고 정제 펀치 또는 캡슐 충전 기계에 대해, 및 또한 경질 캡슐에서 점착되는 것을 방지하기 위해, 고체 투약 형태, 특히, 정제 및 캡슐에서 사용된다. 윤활제로서, 탈크 또는 실리카, 및 지방, 예를 들어, 식물성 스테아린, 스테아르산마그네슘 또는 스테아르산, 및 이들의 혼합물은 정제 또는 경질 젤라틴 캡슐에서 가장 흔히 사용되는 윤활제이다.
감미제는 특히, 고체 투약 형태, 예를 들어, 츄어블 정제에서뿐만 아니라 액체 투약 형태, 예를 들어, 진해 시럽(cough syrup)에서 구성성분을 더욱 맛좋게 만들기 위해 첨가된다. 감미제는 인공, 천연 또는 합성 또는 반합성 감미제로부터 선택될 수 있으며, 감미제의 비제한적인 예에는 아스파탐, 아세설팜 칼륨, 시클라메이트, 수크랄로스, 사카린, 당 또는 이들의 임의의 혼합물이 있다.
풍미제는 임의의 투약 형태에서 불쾌한 맛을 내는 활성 성분을 차폐하기 위해 사용될 수 있다. 풍미제(flavoring)는 천연(예를 들어, 열매 추출물) 또는 인공일 수 있다. 예를 들어, (1) 쓴 맛의 제품을 개선하기 위해, 민트, 체리 또는 아니스(anise)가 사용될 수 있으며; (2) 짠 제품을 개선하기 위해, 복숭아 또는 살구 또는 감초가 사용될 수 있으며; (3) 신 제품을 개선하기 위해, 라즈베리(raspberry)가 사용될 수 있으며; (4) 과도하게 달콤한 제품을 개선하기 위해, 바닐라가 사용될 수 있다.
부형제 부류로부터의 보조 물질을 제외하고, 본 발명으로부터의 제형은 비타민, 예를 들어, 약제학적으로 허용 가능한 화학적 형태, 염 또는 유도체의 비타민 D(칼시페롤); 약제학적으로 및 영양학적으로 허용되는 화학적 형태의 미네랄; 및 L-아미노산을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 다른 약리학적 활성 또는 영양 물질을 함유할 수 있다. 본 발명의 제형의 제조에 관해서는 당업자의 범위 내에 있고, 최종 투약 제형에 따를 것이다. 예를 들어, 그리고, 비제한적으로, 최종 투약 형태가 경구 고체 형태, 예를 들어, 정제, 캡슐, 분말, 과립, 경구 현탁액, 등일 때, 제형의 고체 투약 형태의 제조를 위한 공정은 예를 들어, 요건에 따라, 분말의 최종 투약 형태를 수득하는 스테아르산마그네슘 또는 다른 윤활제로 윤활처리되는 균질한 혼합물을 형성하기 위해, (1) 유효량의 적어도 하나 이상의 본 발명의 후처리된 프로바이오틱 박테리아를 포함하는 활성 성분(들)을 (2) 하나 이상의 부형제로의 균질화를 포함한다. 이러한 균질한 분말은 일반적인 젤라틴 캡슐 내에 또는 대안적으로, 위-내성 캡슐 내에 충전된다. 정제의 경우에, 이러한 것은 직접 압축 또는 과립화에 의해 제조된다. 첫번째 경우에, 활성 구성성분과 적합한 부형제, 예를 들어, 무수 락토스, 비-결정화 소르비톨, 등의 균질한 혼합물이 제조된다. 두번째의 경우에, 정제는 과립화된 형태로 혼합물 상에서 가공된다. 과립은 적합한 충전제, 결합제, 붕해제, 및 소량의 정제수로 제형의 활성 성분의 과립화 공정에 의해 제조된다. 이러한 제조된 과립은 1% w/w 미만의 물 함량까지 시빙되고 건조된다.
액체 투약 형태(예를 들어, 경구 현탁액)의 제조를 위한 공정과 관련하여, 이는 불활성 액체 희석제(충전제), 예를 들어, 다양한 식물성 오일, 예를 들어, 해바라기, 대두 또는 올리브 오일; 올레산; 올레일 알코올; 액체 폴리에틸렌 글리콜, 예를 들어, PEG 200, PEG 400 또는 PEG 600; 또는 다른 불활성의 약리학적으로 허용되는 액체 중에 유효량의 적어도 하나 이상의 본 발명의 후처리된 프로바이오틱 박테리아를 포함하는 제형의 활성 성분(들)의 균질화를 포함한다. 본 공정은 (1) 밀납, 콜로이드성 이산화규소, 등과 같은 현탁액 안정화제의 첨가 및 균질화에 의한, 제형의 안정화; (2) 감미제의 첨가 및 균질화에 의한 제형의 감미화(sweetening); (3) 풍미제의 첨가 및 균질화에 의한 제형의 풍미화(flavoring)를 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 공정으로 균질한 혼합물의 처리를 추가로 포함한다. 이러한 제형의 형태는 또한, 당해 분야에서 일반적으로 사용되는, 다른 부형제 또는 구성성분을 함유할 수 있다.
약제학적 제품은 제품 승인 경로에 따라 그리고 국가에 따라 다른 형태 또는 명칭을 채택할 수 있다. 예를 들어, 약제는 특정 약제학적 제품이다. 의료 식품은 다른 특정 약제학적 제품이다. 용어 "의료 식품" 또는 "특수 의료 목적을 위한 식품"은 몇몇 국가에서, 일반 식사 단독에 의해 충족되지 못할 수 있는 독특한 영양 요구를 갖는 질병의 식이 관리를 위해 특수하게 제형화되고 의도된 식품을 지칭하기 위해 사용된다. 이러한 것은 미국에서 규제[예를 들어, Food and Drug Administration's 1988 Orphan Drug Act Amendments], 및 유럽에서 규제[Commission Directive 1999/21/EC]에서 규정된다. 의료 식품은 식품 보조제의 더 넓은 카테고리 및 건강 정조(health claim)를 갖는 전통적인 식품과 구별된다. 이에 따라, 특정 실시형태에서, 본 발명의 균주는 의료 식품으로서 제형화된다.
종종, 페디오코커스 균주 및 조성물, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 것은 식품 보조제로서 여겨진다. 식이 보충제 또는 영양 보충제로서도 공지된, 식품 보조제는 다른 특정 약제학적 제품으로 여겨진다. 이는 대개 식품에서 사용되는 화합물로부터 제조된, 식사를 보충하도록 의도된 제조물 또는 제품이며, 이는 대개 일반 식사에서 섭취되지 않거나 충분한 양으로 소비되지 않을 수 있는 영양소 또는 유익한 구성성분을 제공한다. 대부분, 식품 보조제는 식료품으로서 여겨지지만, 때때로, 이러한 것은 약물, 천연 건강 제품, 또는 영양학적 제품으로서 규정된다. 본 발명의 측면에서, 식품 보조제는 또한, 영양제를 포함한다. 식품 보조제는 대개, 즉, 처방전 없는, "일반 의약품(over the counter)"으로 판매된다. 식품 보조제가 환제, 캡슐, 정제 또는 분말의 형태를 채택하는 경우에, 이는 약제에서 사용되는 것과 동일한 부형제를 포함한다. 그러나, 식품 보조제는 또한, 일부 영양소가 강화된 식료품의 형태(예를 들어, 바 또는 요거트)를 채택할 수 있다. 이에 따라, 특정 실시형태에서, 본 발명의 균주는 식품 보조제로서 제형화된다. 식품 보조제는 그 자체로 투여될 수 있거나, 적합한 음용 가능한 액체, 예를 들어, 물, 요거트, 우유 또는 과일 쥬스와 혼합될 수 있거나, 고체 또는 액체 식품과 혼합될 수 있다. 이러한 문맥에서, 식품 보조제는 정제 또는 로젠지, 환제, 캡슐, 과립, 분말, 현탁액, 사셰(sachet), 스위트(sweet), 바(bar), 시럽의 형태 및 상응하는 투여 형태, 대개 단위 용량 형태의 상응하는 투여 형태일 수 있다.
본 발명의 균주는 또한, 다양한 식료품, 예를 들어, 유제품(요거트, 치즈, 발효유, 분유, 우유 기반 발효 제품, 아이스크림, 발효 시리얼 기반 제품, 우유 기반 분말), 빵, 바, 스프레드, 비스킷, 및 시리얼, 음료, 상이한 타입의 오일, 또는 드레싱(dressing)에 포함될 수 있다. 용어 "식료품(food product)"은 본 명세서에서 의약품 및 수의 제품을 제외한, 동물에 의해 섭취될 수 있는, 임의 제시 형태의, 임의의 타입의 제품을 포함하는 이의 가장 넓은 의미로 사용된다. 다른 식료품의 예에는 식육제품, 초콜릿 스프레드(chocolate spread), 필링(filling) 및 프로스팅(frosting), 초콜릿, 제과, 구운 상품(baked goods), 소스 및 수프, 과일 쥬스 및 커피 화이트너(coffee whitener)가 있다. 특히 고려되는 식료품에는 식품 보조제 및 유아용 조제식(infant formula)이 있다. 식료품은 바람직하게, 담체 물질, 예를 들어, 오트밀 죽, 락트산 발효 식품, 저항성 전분, 식이 섬유, 탄수화물, 단백질 및 글리코실화된 단백질을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 균주는 캡슐화되거나 코팅된다.
본 발명의 다른 양상은 동결보호제; 적어도 하나의 본 발명의 락트산 박테리아를 포함하는 냉동-건조된 바이오매스; 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 고체 조성물에 관한 것이다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 바람직하게, 유효량의 이전 양상에서 규정된 바와 같은 조성물을 포함하는, 에멀젼, 겔, 페이스트, 과립, 분말 및 검으로부터 선택된다. 본 발명의 추가적인 양상은 유효량의 이전 양상에서 규정된 바와 같은 조성물을 포함하는, 구강 위생 제품, 약제 조성물, 및 식용 제품, 식이 보충제 및 화장품 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 구강 위생 제품에는 츄잉 검, 치약, 구강 스프레이, 로젠지 또는 구강 분산 가능한 정제가 있다. 특정 실시형태에서, 약제 조성물, 식용 제품 또는 식이 보충제는 로젠지 또는 구상 분산 가능한 정제이다.
의료 적용 및 사용 방법
본 발명의 양상은 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 페디오코커스 균주 및 조성물에 관한 것이다. 이러한 양상은 대안적으로, 프로바이오틱 치료를 필요로 하는 대상체에 유효량의 적어도 하나의 본 발명의 제1 양상에서 규정된 바와 같은 락트산 박테리아의 단리된 균주를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 프로바이오틱 치료 방법으로서 제형화될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "프로바이오틱(probiotic)"은 적절한 양으로 투여될 때 숙주 상에 건강 이득을 제공하는 살아 있는 미생물을 지칭한다.
상세하게, 인간 숙주에서 여러 유익한 효과를 발휘 시에, 본 발명의 균주는 장내 불균형(dysbiosis)과 관련되거나 병원체에 의해 야기된 질병 또는 질환을 치료하는 데 유용하다. 본 명세서에서 사용되는 장내 불균형(또한 장내 세균 불균형으로 지칭됨)은 손상된 미생물총과 같은 신체 상에 또는 신체 내부에서 미생물 불균형 또는 부적응에 대한 용어이다. 예를 들어, 피부 상재균(skin flora), 장 세균총(gut flora), 질 세균총(vaginal flora), 경구와 같은 인간 미생물총의 일부는 정상이 아니게 될 수 있으며, 일반적으로 일반 공생 지배 종은 과소 표시되고(underrepresent) 일반적으로 경쟁하지 못하거나 공극을 채우기 위해 증가하는 종을 함유하였다. 유익한 미생물의 손실, 유해균(pathobiont)의 확대, 및 다양성의 상실은 장내 불균형을 포함하는 사건이다. 장내 불균형은 반복되고 부적절한 항생제 또는 소독제 노출과 같은 다양한 원인에 의해 야기될 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 일 양상은 장내 불균형 또는 장내 불균형과 관련된 질환의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한, 소독제와 병용하여 유용한, 본 발명의 균주이다.
다른 양상은 장내 불균형 또는 장내 불균형과 관련된 질환의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 균주는 치아 위생에서 특히 유용하다. 이에 따라, 일 양상에서, 본 발명은 인간을 포함하는 동물의 구강에서의 장애의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한, 소독제와 병용하여 사용하는 본 발명의 조성물 및 균주를 제공한다. 대안적으로, 이러한 양상은 인간을 포함하는 동물의 구강의 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 균주 또는 조성물의 사용으로서 제형화될 수 있다. 또한, 대안적으로, 본 발명은 또한 인간을 포함하는 동물의 구강에서의 장애를 예방 및/또는 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 상기 동물에 본 발명에서 규정된 바와 같은 균주 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
특히, 구강에서의 장애는 경구 병원균에 의해 유발된다. "경구 병원균에 의해 유발된 구강으로부터의 장애"의 비제한적인 예에는 다른 것들 중에서, 플라크 관련 질병, 충치, 치은염, 치주염, 칸디다증, 헤르페스 및 궤양뿐만 아니라 구취, 얼룩진 치아(stained teeth), 민감한 치아(sensitive teeth), 임플란트 주변 질병(peri-implant disease)이 있다.
일 실시형태에서, 페디오코커스 균주 및 이의 조성물은 치은염, 치주염 및 임플란트 주변 질병을 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 치주 질병의 치료 및/또는 예방을 위해 사용된다. 특히, 치주 질병은 치은염 또는 치주염이다.
추가 실시형태에서, 칸디다증의 치료 및/또는 예방을 위해 페디오코커스 균주 및 조성물이 사용된다.
치주 치료법(periodontal therapy)은 통상적으로, 먼저, 스크레이핑(scraping)에 의해 또는 초음파에 의해; 이러한 기계적 제거에 의해 치은연하 플라크를 기계적으로 제거하며, 바이오막에서의 박테리아는 배출되고 제거된다(flush out). 이러한 치료 과정에서, 오늘날 그램-음성 박테리아에 의해 재-콜로니화를 방지하도록 설계된, 소독제 조성물이 사용된다. 그러나, 소독제를 함유한 조성물의 규칙적이고 광범위한 사용의 단점은 이러한 제품의 부작용 및 공생 미생물총에 대한 해로운 영향이다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 균주 및 조성물은 피부 장애를 치료하는 데 유용하다. 피부 장애의 예는 네일 진균 감염증; 표피 장애(예를 들어, 단독(erysipelas), 열린 상처 감염증, 여드름, 농양, 종기, 습진, 피부염, 접촉 피부염, 과민증(hyper-sensitinitis), 접촉 병소, 욕창, 및 당뇨병 병소)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
스크리닝 방법
본 발명의 일 양상은 락트산 박테리아 균주를 스크리닝하고 단리시키는 방법으로서,
i) 락트산 박테리아 균주 후보물의 풀로부터 개별 락트산 박테리아의 소독제에 대해 내성을 나타내는 능력을 검정하는 단계; 및
ii) 포르피로모나스 진지발리스보다 더 높은 소독제에 대해 내성을 나타내는 능력을 갖는 락트산 박테리아 균주를 선택하고 단리시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, 소독제에 대해 내성을 나타내는 능력은 디스크 확산 검정에 의해 측정된 저해 할로로서 표현된다.
하나의 특정 실시형태에서, 소독제에 대해 내성을 나타내는 능력은 하기 단계를 포함한다:
i) 컨플루언트 층(confluent layer)을 수득하기 위해 플레이트에서 영양 배지 상에 Mc 파랜드 표준 제3호(Farland standard No. 3)과 균등한 광학 밀도를 갖는 인산염 완충 식염수 0.1M 중 락트산 박테리아의 현탁액을 균질하게 면봉으로 닦는 단계;
ii) 영양 배지와 접촉하게 6㎜ 직경의 셀룰로스 디스크를 배치시키는 단계;
iii) 셀룰로스 디스크에 포르피로모나스 진지발리스의 성장을 저해하는 농도로 소독제를 첨가하는 단계;
iv) 혐기성 또는 미호기성 조건 하 37℃에서 밤새 인큐베이션하는 단계;
v) 플레이트를 편평한 자(flat rule) 위에 배치시킴으로써 24 또는 48시간 후에 저해 구역을 밀리미터 단위로 측정하는 단계;
vi) 결과를 저해 할로로서 표현하는 단계.
당업자는 관례대로, 시험되는 락트산 박테리아 균주의 영양 요건에 따라 단계 i) 및 단계 ii)의 영양 배지를 선택할 수 있다.
일 실시형태에서, 락트산 박테리아를 스크리닝하고 단리시키는 방법은 개인 위생을 위한 락트산 박테리아 균주를 스크리닝하고 단리시키기 위해 사용된다. 특정 실시형태에서, 본 방법은 구강 위생을 위한 락트산 박테리아를 스크리닝하고 단리시키기 위한 것이다.
일 실시형태에서, 소독제에 대해 내성을 나타내는 능력을 검정하기 위해 사용되는 락트산 박테리아 균주 후보물의 풀은 락토바실러스 또는 페디오코커스 속의 락트산 박테리아 균주를 포함한다. 특히, 균주 후보물은 페디오코커스 균주, 보다 특히, 페디오코커스 에시디락티시 균주이다.
도면의 간단한 설명
도 1. 디스크 확산 검정에 의해 결정된 밀리미터(㎜) 단위의 저해 할로(Inh)로서 표현된 트라이클로산에 대한 박테리아의 내성. 락토바실러스 브레비스 CD2(L.b. CD2); 페디오코커스 에시디락티시 AB134(P.a. AB134); 페디오코커스 에시디락티시 CECT 8633(P.a. CECT 8633); 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) CECT 8330(P.p. CECT8330); 스트렙토코커스 오랄리스(Streptococcus oralis); 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) K12(S.s. K12); 및 포르피로모나스 진지발리스.
도 2. 디스크 확산 검정에 의해 결정된 밀리미터(㎜) 단위의 저해 할로(Inh)로서 표현된 티몰에 대한 박테리아의 내성. 락토바실러스 브레비스 CD2(L.b. CD2); 페디오코커스 에시디락티시 AB134(P.a. AB134); 페디오코커스 에시디락티시 CECT 8633(P.a. CECT 8633); 페디오코커스 펜토사세우스 CECT 8330(P.p. CECT8330); 스트렙토코커스 오랄리스; 스트렙토코커스 살리바리우스 K12(S.s. K12); 및 포르피로모나스 진지발리스.
도 3. 디스크 확산 검정에 의해 결정된 밀리미터(㎜) 단위의 저해 할로(Inh)로서 표현된 Listerine Original®에 대한 박테리아의 내성. 락토바실러스 브레비스 CD2(L.b. CD2); 페디오코커스 에시디락티시 AB134(P.a. AB134); 페디오코커스 에시디락티시 CECT 8633(P.a. CECT 8633); 페디오코커스 펜토사세우스 CECT 8330(P.p. CECT8330); 스트렙토코커스 오랄리스; 스트렙토코커스 살리바리우스 K12(S.s. K12); 및 포르피로모나스 진지발리스.
도 4. 디스크 확산 검정에 의해 결정된 밀리미터(㎜) 단위의 저해 할로(Inh)로서 표현된 Listerine Zero®에 대한 박테리아의 내성. 락토바실러스 브레비스 CD2(L.b. CD2); 페디오코커스 에시디락티시 AB134(P.a. AB134); 페디오코커스 에시디락티시 CECT 8633(P.a. CECT 8633); 페디오코커스 펜토사세우스 CECT 8330(P.p. CECT8330); 스트렙토코커스 오랄리스; 스트렙토코커스 살리바리우스 K12(S.s. K12); 및 포르피로모나스 진지발리스.
도 5. 디스크 확산 검정에 의해 결정된 밀리미터(㎜) 단위의 저해 할로(Inh)로서 표현된 클로르헥시딘에 대한 박테리아의 내성. 락토바실러스 브레비스 CD2(L.b. CD2); 페디오코커스 에시디락티시 AB134(P.a. AB134); 페디오코커스 에시디락티시 CECT 8633(P.a. CECT 8633); 페디오코커스 펜토사세우스 CECT 8330(P.p. CECT8330); 스트렙토코커스 오랄리스; 스트렙토코커스 살리바리우스 K12(S.s. K12); 및 포르피로모나스 진지발리스.
도 6. 디스크 확산 검정에 의해 결정된 밀리미터(㎜) 단위의 저해 할로(Inh)로서 표현된 클로르헥시딘 글루코네이트에 대한 박테리아의 내성. 락토바실러스 브레비스 CD2(L.b. CD2); 페디오코커스 에시디락티시 AB134(P.a. AB134); 페디오코커스 에시디락티시 CECT 8633(P.a. CECT 8633); 페디오코커스 펜토사세우스 CECT 8330(P.p. CECT8330); 스트렙토코커스 오랄리스; 스트렙토코커스 살리바리우스 K12(S.s. K12); 및 포르피로모나스 진지발리스.
도 7. 20㎕의 클로르헥시딘 글루코네이트 0.12%(v/v)로 함침된 6㎜ 셀룰로스 디스크 둘레에서 페디오코커스 에시디락티시 CECT8633, 스트렙토코커스 살리바리우스 K12(S.S.) 및 포르피로모나스 진지발리스(P.g.)에 대해 관찰된 저해의 할로.
도 8. 상이한 농도의 Listerine Zero®의 부재(대조군) 또는 존재 하에서의 스트렙토코커스 살리바리우스 K12의 성장 역학(C, 소독제 없는 대조군; 1:1, 희석되지 않음; 1:2, 2배 희석; 1:4, 4배 희석; 1:8, 8배 희석). X축= 시(h) 단위의 시간(t).
도 9. 상이한 농도의 Listerine Zero®의 부재(대조군) 또는 존재 하에서의 스트렙토코커스 오랄리스의 성장 역학(C, 소독제 없는 대조군; 1:1, 희석되지 않음; 1:2, 2배 희석; 1:4, 4배 희석; 1:8, 8배 희석). X축= 시(h) 단위의 시간(t).
도 10. 상이한 농도의 Listerine Zero®의 부재(대조군) 또는 존재 하에서의 락토바실러스 브레비스 CD2의 성장 역학(C, 소독제 없는 대조군; 1:1, 희석되지 않음; 1:2, 2배 희석; 1:4, 4배 희석; 1:8, 8배 희석). X축= 시(h) 단위의 시간(t).
도 11. 상이한 농도의 Listerine Zero®의 부재(대조군) 또는 존재 하에서의 페디오코커스 펜토사세우스 CECT8330의 성장 역학(C, 소독제 없는 대조군; 1:1, 희석되지 않음; 1:2, 2배 희석; 1:4, 4배 희석; 1:8, 8배 희석). X축= 시(h) 단위의 시간(t).
도 12. 상이한 농도의 Listerine Zero®의 부재(대조군) 또는 존재 하에서의 페디오코커스 에시디락티시 AB134의 성장 역학(C, 소독제 없는 대조군; 1:1, 희석되지 않음; 1:2, 2배 희석; 1:4, 4배 희석; 1:8, 8배 희석). X축= 시(h) 단위의 시간(t).
도 13. 상이한 농도의 Listerine Zero®의 부재(대조군) 또는 존재 하에서의 페디오코커스 에시디락티시 CECT8633의 성장 역학(C, 소독제 없는 대조군; 1:1, 희석되지 않음; 1:2, 2배 희석; 1:4, 4배 희석; 1:8, 8배 희석). X축= 시(h) 단위의 시간(t).
도 14. 액체 배지 검정에 의해 측정될 때 백분율(mm)로서 표현된 락트산 박테리아 균주의 생존비(S.r). 락토바실러스 브레비스 CD2(L.b.CD2); 페디오코커스 에시디락티시 AB134(P.a. AB134); 페디오코커스 에시디락티시 CECT 8630(P.a. CECT 8630); 페디오코커스 펜토사세우스 CECT 8330(P.p. CECT 8330) 스트렙토코커스 오랄리스; 스트렙토코커스 살리바리우스 K12(S.s. K12).
도 15. 경구 병원균, 푸소박테륨 누클레아튬, 트레포네마 덴티콜라 및 프레보텔라 덴티콜라에 대한 밀리미터 단위의 성장 저해(GI)로서 표현되는 스트렙토코커스 살리바리우스 K12, 락토바실러스 루테리 ATCC 55730 및 페디오코커스 에시디락티시 CECT8633의 길항 활성.
도 16. 본 연구의 개시와 비교하여 가장 나쁜 치은염 지수 스코어(GI=3)를 나타내는 치아 표면 수의 감소. 검정색 막대는 표준 구강 위생 절차 후의 대상체의 군(플라시보 군)을 나타낸다. 백색 막대는 표준 구강 위생 절차 및 프로바이오틱 후 대상체의 군(프로바이오틱 군)을 나타낸다. Y축= 3과 동일한 치은염 지수를 갖는 치아 표면의 수(N t. surf. GI=3).
도 17. 병원체 타네넬라 포르시티아 및 포르피로모나스 진지발리스의 농도 변화(Δ Conc= 로그로서 표현된 본 연구의 종료 시의 농도 - 본 연구의 개시 시의 농도). 검정색 막대는 표준 구강 위생 절차 후 대상체의 군(플라시보 군)을 나타내며, 백색 막대는 표준 구강 위생 절차 및 프로바이오틱 후 대상체의 군(프로바이오틱 군)을 나타낸다.
실시예
실시예 1. 페디오코커스 에시디락티시 CECT8633의 단리 및 동정
락트산 박테리아 후보물을 0 내지 9세 어린이로부터의 새로운 대변으로부터 단리하였다. 샘플을 PBS 완충제(pH 7.4)에 용해시키고, 분취하여, 다양한 항균제 조합물이 보충된 MRS 상에 플레이팅하였다. 균주를 37 또는 30℃에서 미호기성 조건(5% CO2) 하에서 배양하였다. 인큐베이션 시간은 성장 속도에 의존적이었지만, 일반적으로 24시간 내지 3일 동안 수행되었다. 개별 균주의 단리는 동일한 선택 배지로 진행되었으며, 이후에 그램 착색이 첫 번째 동정을 수행하기 위해 그램 착색이 수행되었다. 성장된 직후에, 단리된 균주를 15% 탈지분유를 함유한 PBS 0.1x 중에서 냉동-건조에 의해 저장하였다.
16S rRNA 유전자를 시퀀싱함으로써 종 수준에서의 동정을 수행하였다. 박테리아를 5% CO2를 함유한 대기 중, 37℃에서 MRS 배지(pH 6.4) 상에서 밤새 성장시켰다. 박테리아를 추가로 수확하고, 세척하고, 사전-용해 완충제(pre-lysis buffer)(480㎕ EDTA 50mM pH 8.0; 120㎕ 리소자임 10㎎/㎖) 중에 재현탁시키고, 37℃에서 60분 동안 추가로 인큐베이션하였다. DNA를 Wizard 게놈 DNA 정제 키트(Promega)를 이용하여 추출하였다. 상청액을 제거하기 위해 14000g에서 2분 동안 사전-처리된 박테리아를 원심분리한 후에, 프로메가 프로토콜(Promega's protocol)을 수행하였다. 간단하게, 박테리아를 핵 용해 용액(Nuclei Lysis Solution) 중에 재현탁시키고, 80℃에서 5분 동안 인큐베이션하고, 이후에, 실온까지 냉각시켰다. 세포 용해물을 37℃에서 60분 동안 RNase 용액 중에서 인큐베이션하고, 단백질 침전 용액(Protein Precipitation Solution)을 첨가하고 고속으로 와류시킴으로써(vortexing) 단백질을 침전시켰다. 샘플을 냉각시키고, 15000g에서 3분 동안 원심분리하였다. DNA를 함유한 상청액을 깨끗한 1.5㎖ 미세원심분리 튜브로 옮기고, 뒤집음으로써 600㎕의 아이소프로판올과 혼합하였다. DNA를 15000g에서 2분 동안 원심분리에 의해 수집하고, 상청액을 조심스럽게 따라내었다. 튜브를 여러 차례 온화하게 뒤집음으로써 DNA 샘플을 600㎕의 70% 에탄올로 세척하였다. 15000g에서 2분 동안 원심분리 후에 에탄올을 흡입에 의해 제거하였다. 최종적으로, DNA 펠릿을 65℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 100㎕의 재수화 용액(Rehydration Solution) 중에 재현탁시켰다. 샘플을 2 내지 8℃에서 저장하였다.
유박테리아 Eub27f 및 Eub1492r에 대한 유니버셜 프라이머를 이용한 PCR에 의해 16S rRNA를 증폭시켰다. 이후에, 상기에서 설명된 바와 같이 얻어진 DNA를 키트 Quiaquick(Quiagene)를 이용하여 세척하였다. 4회 연속 시퀀싱 반응을 프라이머 27F, 357F, 907R 및 1492R을 이용하여 BigDye kit v.3.1을 이용하는 Genetic Analyzer 3130(Applied Biosystems)에서 각 샘플에 대해 수행하였다. 데이터 수집 및 크로마토그램을 DNA Sequence Analysis v.5.2 소프트웨어(Applied Biosystems)를 이용하여 구축하고, Chromas(Technelysium Pty Ltd.) 및 BioEdit(Ibis Biosciences)로의 시각적 분석에 의해 체크하였다.
속 동정(Genus Identification)을 Ribosomal Database Project 툴을 이용하여 수행하고, Ribosomal Database Project 툴 및 종 동정(Species identification)을 BLASTN을 이용한 RefSeq 데이터 베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/) 및 Ribosomal Database Project(http://rdp.cme.msu.edu/)) 둘 모두로부터의 공지된 유기체의 16S 서열과 얻어진 서열의 비교에 의해 수행하였다.
균주 CECT8633을 페디오코커스 에시디락티시로서 동정하고, 2014년 5월 26일에 스페인 생물자원 센터(스페인 발렌시아 46100 부르자소트 에디프 데 인베스티카코인, 캄퍼스 데 부르자소트 발렌시아 대학에 소재)에 기탁하였다. 기탁된 균주는 생균이고, 이의 기탁물과 관련한 모든 이의 특징을 유지한다.
균주 CECT8633에 대해 얻어진 16S rRNA 서열은 서열번호 1에 해당한다.
실시예 2. 소독제에 대한 락트산 박테리아 균주의 내성(디스크 확산 검정)
추정된 프로바이오틱 성질을 갖는 LAB 균주, 즉, L. 브레비스(L. brevis), P. 에시디락티시, P. 펜토사세우스, S. 오랄리스(S. oralis) 및 S. 살리바리우스(S. salivarius)를 적절한 영양소 배지를 갖는 아가 플레이트에 파종하고, 단리된 콜로니를 얻기 위해 인큐베이션하였다. 포르피로모나스 진지발리스 DSM20709를 치주 병리학과 관련된 병원체의 일례로서 사용하였다. 각 균주에 대해, 사용되는 영양 배지 및 대기 조건은 표 1에서 요약된 바와 같이 이의 적절한 성장을 위해 가장 적합한 것이다.
Figure pct00001
각 미생물에 대하여, Mc 파랜드 표준 제3호와 동등한 광학 밀도를 갖는 인산염 완충 식염수 0.1M(PBS) 중 현탁액을 제조하기 위해 단리된 콜로니를 사용하였다. 멸균 면봉을 사용하여 미생물을 균일하게 파종함으로써 상응하는 영양소 배지(표 1) 위에 미생물의 컨플루언트층을 얻기 위해 현탁액을 사용하였다.
플레이트에서 균주를 접종한 직후에, 6㎜의 셀룰로스 디스크를 배치시켰다. 디스크를 표 2에 따른 상이한 통상적인 소독제로 함침시켰다:
Figure pct00002
사용되는 부피는 배지 상에 퍼지지 않는 디스크에 의해 허용되는 최대치이다. 용매는 사용되는 양에서 박테리아에 대해 저해되지 않는 것으로 확인되었다. 미생물을 표 1의 조건에 따라 성장하였으며, 미생물에 대한 상응하는 최적의 성장 조건에 따라 24시간 또는 48시간 후에 저해의 할로(밀리미터)를 측정하였다. 결과는 3회 얻어졌다.
도 1은 상이한 농도에서의 트라이클로산의 존재 하에서 각 미생물에 대해 관찰된 저해를 도시한 것이다. 병원체 P. 진지발리스뿐만 아니라 스트렙토코쿠스종 균주는 트라이클로산에 의해 저해되었다. 그러나, 락토바실러스 브레비스 및 페디오코커스 속에 속하는 균주는 저해되지 않았다. 유사하게, 티몰은 P. 진지발리스 및 스트렙토코쿠스종 균주의 성장을 저해하였으며, 시험된 최고 농도는 1.2㎎/㎖였으며, 락토바실러스 브레비스 또는 페디오코커스 균주의 성장을 저해하지 못하였다(도 2). 디스크가 희석되지 않은 20 마이크로리터의 Listerine Original®(알코올을 함유함)로 함침되었을 때 동일한 효과가 관찰되었다(도 3). P. 진지발리스 및 스트렙토코쿠스 균주는 또한, Listerine Zero® 및 이의 상응하는 2배 희석에 의해 저해되었다(도 4). Listerine Zero®의 존재에 대한 L. 브레비스의 내성은 Listerine Zero®의 4배 및 2배 희석의 존재 하에서 저해가 관찰되지 않기 때문에 P. 진지발리스 및 스트렙토코쿠스의 내성보다 더 높았다. 그러나, 트라이클로산, 티몰 및 Listerine Original®과는 반대로, 희석되지 않은 Listerine Zero®의 존재는 L. 브레비스에 대한 저해 효과를 갖는다. 페디오코커스 균주는 Listerine Original®에 대해 관찰된 바와 같이 Listerine Zero®의 존재에 의해 저해되지 않았다.
도 5 및 도 6에 도시된 바와 같이, 클로르헥시딘 및 클로르헥시딘 글루코네이트는 모든 균주가 시험된 최고 농도(0.12%, v/v)에서 저해되었기 때문에 최고 항균제 효과를 나타내는 구강 청결제 소독제이었다. 다른 구강 청결제 구성성분과 유사하게, P. 진지발리스 및 스트렙토코쿠스종은 이러한 것이 시험된 임의의 농도에서 저해되었기 때문에 클로르헥시딘에 대한 최고 감수성(susceptibility)을 나타내는 균주이었다. L. 브레비스는 0.12% 및 0.06%의 농도에 의해 저해되었지만, 0.03%의 농도에서는 그러하지 않았으며, 이에 따라, 이는 P. 진지발리스 및 스트렙토코쿠스종보다 더 높은 내성을 나타낸다. 페디오코커스종 균주는 클로르헥시딘에 대해 가장 큰 내성을 나타내는 LAB인 것으로 보였다. 클로르헥시딘으로 함침된 디스크 둘레에서 관찰된 저해 할로는 페디오코커스 펜토사셰오우스 CECT8330, P. 에시디락티시 CECT8633 및 P. 에시디락티시 AB134에 대해 각각 4, 3 및 2㎜였으며, 여기서, P. 진지발리스의 저해 할로는 9㎜였다. 이에 따라, 페디오코커스 에시디락티시 균주는 클로르헥시딘에 대해 특히 내성적이었다. 마찬가지로, 페디오코커스 균주는 클로르헥시딘 글루코네이트에 대해 최고의 내성을 나타내는 균주인 것으로 보였다. 도 7은 클로르헥시딘 글루코네이트 0.12%의 존재 하에서 S. 살리바리우스 K12 및 P. 진지발리스와 비교하여 P. 에시디락티시 CECT8633에 대해 관찰된 더 낮은 저해 할로를 명확하게 예시한다.
결론적으로, 소독제의 저해 효과가 병원체 P. 진지발리스뿐만 아니라 스트렙토코쿠스종의 속 이후 락토바실러스종으로부터의 프로바이오틱스에 대해 더 높은 것으로 나타났다. 페디오코커스종의 속으로부터의 프로바이오틱스, 및 특히, 페디오코커스 에시디락티시 종에 속하는 프로바이오틱스는 특히 소독제에 대해 내성적이었다.
실시예 3: 소독제에 대한 락트산 균주의 내성(액체 배지 검정)
LAC의 성장 역학이 구강 청결제의 존재에 의해 영향을 받을 수 있는 지의 여부를 확인하기 위하여, Listerine Zero®의 저해 효과를 액체 배지에서 연구하였다. 프로바이오틱 박테리아의 하룻밤 배양물을 실시예 2에서 기술된 바와 같이 제조하였다. 0.5의 Mc, 파랜드 표준(대략 1.5E+08 CFU/㎖)에 상응하는 광학 밀도에 도달하도록 멸균 0.1M PBS 중의 박테리아 현탁액을 제조하기 위해 단리된 콜로니를 사용하였다. 후속하여, 100배 희석을 제조하여 대략 1.5E+06 CFU/㎖의 농도를 얻었다. Listerine Zero®를 0.22 마이크로미터를 통해 여과하고, 4개의 연속 2배 희석을 제조하였다.
표 1(실시예 2)에 따른 각 미생물의 적절한 성장을 위해 적합한 액체 성장 배지(140 마이크로리터)를 96-웰 마이크로플레이트에서 피펫팅하였다. 이후에, 40 마이크로리터의 구강 청결제 희석물을 첨가하고, 20 마이크로리터의 1E+06 CFU/㎖를 함유한 박테리아 현탁액을 첨가하였다. 프로바이오틱이 없는 블랭크(blank) 및 (PBS를 제외한) 구성성분 없는 양성 대조군을 또한 제조하였다. 24시간 및 48시간에 프로바이오틱을 함유한 웰의 550 nm에서의 광학 밀도(O.D.)를 결정하고 프로바이오틱이 없는 것을 제외하고 동일한 농도의 구강 청결제를 갖는 웰의 O.D.를 차감함으로써 박테리아 성장을 평가하였다. 48시간에 생존비를 하기 수학식에 의해 계산하였다:
Figure pct00003
상기 식에서, ODp는 구강 청결제를 함유하지 않고 프로바이오틱이 접종된 웰의 광학 밀도이며(양성 대조군),
ODb는 프로바이오틱 및 구강 청결제를 함유하지 않는 웰의 광학 밀도이며,
ODm은 프로바이오틱 및 구강 청결제를 함유하는 웰의 광학 밀도이며,
ODmb는 프로바이오틱을 함유하지 않고 구강 청결제를 함유하는 웰의 광학 밀도이다.
조건은 3회 연구되었다.
도 8 내지 도 13은 상이한 농도의 Listerine Zero®에서 프로바이오틱 균주의 성장 역학을 도시한 것이다. 결과는, Listerine이 시험된 모든 농도에서 스트렙토코쿠스 균주의 성장을 감소시켰음을 확인한다. S. 살리바리우스 K12는 단지 희석 1:4 및 1:8에서 성장할 수 있었지만, 이의 성장은 양성 대조군(구강 청결제를 함유하지 않는 프로바이오틱)과 비교하여 크게 감소되었다. S. 오랄리스는, 단지, Listerine의 구강 청결제 희석이 본래 농도의 8배까지 도달하였을 때 성장할 수 있었다. 그러나, 이러한 농도에서도, 24시간에 성장이 관찰되지 않았으며, 프로바이오틱의 양은 48시간에 양성 대조군보다 대략 2배 더 낮았다. L. 브레비스의 성장 비율은 배지의 접종 후 48시간까지 성장이 관찰되지 않았기 때문에, 스트렙토코쿠스 균주보다 더 낮았다. 그러나, 구강 청결제에 대한 L. 브레비스 CD2의 내성은 구강 세척제가 희석되지 않았을 때 단지 완전히 저해되었기 때문에 스트렙토코쿠스 균주보다 더 높다는 것으로 확인되었다. 2배, 4배 및 8배 희석이 배지 중에 존재하였을 때 L. 브레비스 CD2의 농도는 대략 50%까지 감소되었다.
페디오코커스 균주는 구강 청결제에 대한 최고 내성을 나타내는 프로바이오틱스이었다. 희석되지 않은 Listerine®의 존재는 24시간에 P. 펜토사세우스 CECT8330, P. 에시디락티시 AB134 및 P. 에시디락티시 CECT8633의 성장을 완전히 저해하였다. 그러나, P. 에시디락티시 AB134 및 P. 에시디락티시 CECT8633은 단지, 48시간 후에 이러한 구강 청결제의 존재 하에서 성장할 수 있다.
도 14는 48시간에 상이한 균주의 생존비를 요약한 것이다. 단지 페디오코커스 에시디락티시 균주 CECT7780 및 CECT8633이 희석되지 않은 구강 청결제의 존재 하에서 어떻게 성장하였는지, 및 L. 브레비스 CD2 및 특히, P. 펜토사세우스 CECT8330이 구강 세척제가 2배로 희석되었을 때 어떻게 가능한 지가 명확하게 나타낼 수 있다. 스트렙토코쿠스 균주의 생존비는 모든 농도에서 다른 프로바이오틱 균주보다 항상 더 낮았다.
실시예 4: 치주 병원균에 대한 길항 활성
P. 에시디락티시 CECT8633의 길항 능력을 치은염, 치주염 및 구취와 광범위하게 관련된 병원체 종, 즉, 푸소박테륨 누클레아튬, 트레포네마 덴티콜라 및 프레보텔라 덴티콜라에 대해 시험하였다. 병원체를 파스테르 연구소의 컬렉션(Collection of Institute)으로부터 획득하였다(각각, 기탁 코드 CIP104988, CIP103919 및 CIP104478T).
P. 에시디락티시 CECT8633을 37℃ 및 5% CO2에서 MRS 플레이트 상에서 콘플루언스까지 성장하였다. 컨플루언트의 6 밀리미터 직경 실린더 섹션을 F. 뉴클레아툼 및 P. 덴티콜라가 접종된 M20 플레이트 또는 T. 덴티콜라가 접종된 M71 플레이트 상에 배치하였다. M20 플레이트의 배지는 리터 당 30g의 트립톤, 20g의 효모 추출물, 0.5g의 시스테인 염산염, 5g의 글루코스 및 25㎖ 헤민 용액(0.1g의 헤민 클로라이드, 4㎖ 트라이에탄올아민 및 96㎖ 증류수)이었다. M71 플레이트의 배지는 1 리터당 15g의 트립톤, 5g의 효모 추출물, 8g의 다이나트륨 하이드로겐 포스페이트, 1g의 탄산암모늄, 0.5g의 시스테인 염산염, 0.03㎖ 티오글리콜산, 0.05㎖ Tween 80 및 250㎖ 말 혈청이다. 플레이트를 혐기성 조건에서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 성장 저해 활성(GI)을 하기와 같이, 저해 구역 직경(IZD, ㎜)으로부터 실린더 직경(CD, ㎜)을 차감하여 계산하였다: GI=(IZD-CD)/2. 결과는 P. 에시디락티시 CECT8633과 동일한 조건에서 성장된 S. 살리바리우스 K12(BLIS Technologies Ltd., 뉴질랜드 소재) 및 L. 류테리 ATCC 55730(GumPeriobalance®(BioGaia, 스웨덴 소재))과 비교되었다.
결과는 도 15에 도시되어 있다. P. 에시디락티시 CECT8633은 시험된 3개의 병원체의 성장을 저해하는 능력을 나타내었으며, 이는 시험된 3개의 병원체 중 2개를 저해한, S. 살리바리우스 및 L. 류테리의 경우는 아니다. 또한, P. 에시디락티시 CECT8633은 상업적 대조군보다 F. 뉴클레아툼(F. nucleatum) 및 T. 덴티콜라(T. denticola)의 성장을 저해하기 위해 더 높은 용량을 나타내었다.
실시예 5: 임상 효능
LAB 균주의 안전성, 및 치은염과 관련된 파라미터를 개선하는 프로바이오틱스로서의 이의 효능을 평가하기 위해 이중 맹검 무작위 플라시보-제어 임상 시험을 수행하였다.
임상 시험에서 등록된 대상체는 모두 포함 기준 및 제외 기준을 충족한다. 포함 기준: 18 내지 55세의 연령; 남성 또는 여성(균형을 이루는 군); 비흡연자(흡연 미경험자(never smoker) 또는 적어도 6개월 동안 비흡연자); 평균 치은염 지수(GI) > 1.3으로서 규정된 자연 발생 치은염을 갖는 대상체; 대부분의 부위에서 2㎜ 초과의 근위부간 부착 손실 없음. 제외 기준: 고려되는 부위에서 치석 제거를 방해하는, 상악 측절치(maxillary lateral incisor), 제1 또는 제2 소구체 및 제1 대구체 또는 인접한 치아에서 여러 병변 및/또는 적절치 않은 수복; 현재 치과 치료 중인 대상체; 현재 교정 치료 중이거나 교합면 교합 가드(occlusal bite)를 착용하고 있는 대상체; 치은 조직의 반응 또는 적절한 플라크 조절을 수행하는 능력에 영향을 미칠 수 있는 임의의 전신 질병 또는 질환(임신, 당뇨병, 정량적 및/또는 정성적 다형핵 세포 결함, 다른 면역계 장애, 등); 치은 반응을 방해할 수 있는 약제를 먹은 대상체; 본 연구 2개월 내에 항생제 또는 소독제를 사용한 대상체; 본 연구 이전 2개월 내에 구강 건강을 위한 프로바이오틱 제품을 사용한 대상체; 치료 제품의 임의의 성분에 대한 과민성 또는 알레르기의 병력.
0일에, 전문 구강 위생(스케일 및 연마)을 모든 대상체에 대해 수행하였다. 구강 위생 습관을 표준화하기 위해 불소 치약뿐만 아니라 하루에 2회의 칫솔질에 대한 지시를 제공하였다.
대상체를 하기 2가지 치료 중 하나로 무작위로 배정하였다:
Figure pct00004
환자 또는 입원자는 각 대상체가 어떤 치료를 받는 지를 특권적으로 알지 못하였다. 분산 가능한 정제는 동일한 양상을 가지며, 이를 함유한 케이스는 본 연구의 코드 및 대상체의 상응하는 식별 번호를 포함하였다. 조사자는 동일한 양상을 갖는, 정제를 함유한 케이스를 참가자에게 제공하였다. 각 지원자(A 또는 B)로 배정된 치료는 날짜가 기록된 등록부에 등록되었다. 무작위화는 단지 연구의 종결 시에, 데이터가 분석된 직후에, 또는 눈을 멀게 만들 수 있는 임의의 관련된 사건이 존재하는 것을 나타났다. 대상체는 6주 동안 상응하는 제품을 소비하였다. 각 칫솔질을 종료한 직후에 구강 분산 가능한 정제를 입 안에서 서서히 용융시켰다(하루에 2회). 제품을 소비한 후에, 참가자들은 정제 소비 후 1시간 동안 이의 치아를 깨끗하게 하거나 임의의 식품 또는 음료(물 이외)를 마시는 것을 허용하지 않았다. 대상체는 프로토콜 준수를 위한 설문지를 매일 작성함으로써 정제의 섭취를 보고하도록 요청받았다. 이는 각 환자의 순응도를 연구하기 위하여, 사용되지 않은 정제를 갖는 박스와 함께 시험자에게 반환되었다.
1차 종결점은 프로빙 성분 상에 출혈(bleeding) 없이 Loe & Silness(1963)의 방법의 변형에 따른, 치은염 지수(GI)이다[Loe, H. et al. "Periodontal disease in pregnancy". Acta Odontologica Scandinavica 1963, vol. 21, pp. 533-551]. 각 치아의 모든 스코어의 총합을 시험된 치아의 총 수로 나눔으로써 평균 GI를 계산하였다.
0일(베이스라인)에 치은염 지수(GI)를 전문 구강 위생(스케일 및 연마) 전에 측정하였다. 동일한 변수를 6주 후에 측정하였다.
0일(베이스라인) 및 임상 시험 직전 6주(연구의 종료)에, 치은연상 플라크 샘플을 각 사분면(상악골 좌측-우측/아래턱뼈 좌측-우측)에 대해 수집하고, 풀링하였다. 치은연상 플라크를 10초 동안 적소에 잔류하는 멸균 페이퍼 포인트를 이용하여 얻었다. 샘플링된 페이퍼 포인트를 풀링하고, 200㎕의 TE 완충제(10㎜ 트리스[하이드록시메틸]-메틸아민 클로라이드, 1㎜ 에틸렌다이아민 테트라아세트산)를 함유한 미세원심분리 튜브로 옮기고, 분석할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 6개의 추정 치주 병원균(애그레가티박터 액티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans); 포르피로모나스 진지발리스; 탄네렐라 포르시티아; 푸소박테륨 종(Fusobacterium species); 스트렙토코커스 오랄리스; 캄필로박터 렉투(Campylobacter rectu))에 대한 특정 프라이머를 갖는 택맨 프로브(Taqman Probe)를 기초로 한 실시간 PCR을 수행하였다.
1차 및 2차 변수를 SAS로 분석하였다. 모든 분석을 치료 목적(intention-to-treat: ITT) 및 프로토콜별(per-protocol: PP) 기준 하에서 수행하였다. 데이터를 정규성 Shapiro-Wilks 시험에 대해 체크하였다. 데이터가 파라미터에 따라 분산된 경우에, 군들 간의 1차 변수 및 2차 변수의 차이는 변량 분석(analysis of variance; ANOVA)에 의해 결정될 것이다. 군들 간의 차이의 정확한 특성을 인지하기 위하여, 포스트 hoc 시험(post hoc test)을 결정하였다(예를 들어, Duncan 멀티스테이지 시험(Duncan's multirange test)). 데이터가 파라미터에 따라 분산되지 않는 경우에, 정량적 변수의 비교를 비-파라미터 시험(non-parametric test)(쌍체 데이터(paired data)의 경우 윌콕슨(Wilcoxon) 및 독립 데이터의 경우 Mann-Whitney)에 의해 수행하였다. 모든 가설 시험에서, 널 가설(null hypothesis)은 치료군들 간의 균등(equality)을 추정하였고, P 값이 0.05보다 낮을 때 거부되었다. 이는 유의성 차이가 α 또는 타입 I 오차가 0.05 미만일 때 고려됨을 의미한다.
59명의 환자를 적격성(eligibility)에 대해 평가하였고, 프로바이오틱 군(n=30) 또는 플라시보 군(n=29)로 무작위화하였다. 환자의 베이스라인 특징은 표 4에서 요약된 바와 같다:
Figure pct00005
환자의 94.2%는 적어도 75% 치료, 프로바이오틱 군에서 89.7% 및 대조군에서 100.0% 치료 받았다. 군들 간의 치료 순응에 있어서 차이가 없었다.
6주에, 3의 GI 스코어("개별 GI 스코어의 수 = 3")를 갖는 개별 치아 표면의 수는 대조군보다 프로바이오틱 군에서 더 낮았다(n=0 (0.0%) 대 n=5 (0.2%), p-값 =0.0418).
베이스라인과 종결점 간의 변화량(베이스라인-6주)은 또한, 대조군(표준 관리)보다 프로바이오틱의 경우에 유의미하게 더 높았다(P<0.01, ITT 또는 PP 분석과 무관함)(도 16).
프로바이오틱-함유 정제로의 치료는 포르피로모나스 진지발리스뿐만 아니라 타네넬라 포르시티아의 수준의 유의미한 감소와 상관관계가 있었다(도 17).
결론적으로, 프로바이오틱 정제는 치은염 환자에서, 전문적인 구강 위생 단독과 비교하여 심각한 염증을 나타내는 부위의 수를 감소시킬 수 있다. 프로바이오틱의 사용은, 또한, 이러한 것이 치은염의 과정에서 부정적으로 관여된 것으로 널리 인식되는 병원체인 T. 포르시티아 및 P. 진지발리스의 카운트의 감소와 관련이 있고, 연구 집단에서 측정된 병원성 박테리아들 중에서 심각한 염증을 나타내는 부위의 수와 매우 상관관계를 나타내기 때문에, 유의미한 미생물학적 영향을 나타내었다.
실시예 6: 구강 분산 가능한 정제의 제형
구강 분산 가능한 정제는 하기 조성을 갖는다:
125㎎ 페디오코커스 에시디락티시 CECT8633
1.3㎍ 콜레칼시페롤(Vitament D3)
20㎎ 민트 풍미제
80㎎ 구아검
689.53㎎ 소르비톨
9.35 실로이드(syloid)
9.35 스테아르산마그네슘
제형은 구강에서 느린 용융을 위해 적합하다. 저장 수명의 종료시에 프로바이오틱 농도는 정제 당 1E+09 CFU이다.
대안적으로, 정제는 페디오코커스 에시디락티시 CECT8633 이외에 락토바실러스 플란타룸 CECT7481, 락토바실러스 브레비스 CECT7480을 포함한다.
실시예 7: 구강 젤의 제형
바이알은 하기 구성성분들을 함유하는 500㎎의 분말을 함유한다:
페디오코커스 에시디락티시 CECT8633(저장 수명의 종료시에 프로바이오틱의 최소 농도는 6E+09 CFU/바이알임)
클로로필린 E141ii(4%, w/w)
구아검(5.2% w/w).
실시예 8: 츄잉 검의 제형
츄잉 검은 하기 조성을 함유한다:
1340.68의 검 베이스(Health in gum PWD-03)
125㎎ 락토바실러스 플란타룸 CECT7481, 락토바실러스 브레비스 CECT7480 및 페디오코커스 에시디락티시 CECT8633(비 1:1:1)
31.52㎎ 캡슐화된 풍미제
47.28㎎ 분말 풍미제
12.61㎎ 액체 풍미제
24.0㎎ 스테아르산마그네슘
15.75㎎ 이산화규소
1.89㎎ 아스파탐
1.26㎎ 아세설팜 K
실시예 9: 치약의 제형
치약 제형은 하기 성분들로 이루어진다:
125㎎의 페디오코커스 에시디락티시 CECT8633
0.12 클로르헥시딘 디글루코네이트
1g의 자일리톨
0.5g의 α-토코페롤 아세테이트
100g의 부형제.
대안적으로, 치약 제형은 저장 수명의 종료 시에 1E+09 CFU의 최종 농도를 달성하기 위해 페디오코커스 에시디락티시 CECT8633이다.
0.04g의 글리세르헤틴산(glycerhetinic acid)
0.16g의 나트륨 플루오라이드
8g의 PEG-12
0.8g의 제올라이트
5.6g의 실리카
1.6g의 폴리글리세릴-5 라우레이트
0.8g의 자일리톨
0.48g의 멘톨
0.4g의 나트륨 사카린
0.4g의 벤조산나트륨
0.24g의 유칼립투스 글로불러스(eucalyptus globulus)
0.08g의 사이클로덱스트린
0.96g의 하이드록시프로필셀룰로스
30.56g의 부틸렌 글리콜
실시예 10: 구강 청결제의 제형
구강 청결제는 전달 캡 및 바이알에 존재하는 구성성분들을 조합한다. 전달 캡은 100㎎의 냉동-건조된 프로바이오틱 균주 CECT8633(전달 캡당 1 내지 2 E+09 cfu), 스테아르산마그네슘(2.2㎎)(본 명세서에서, 예를 들어, 해산제 및 접착방지제로서 지칭됨) 및 이산화규소(0.5㎎)(본 명세서에서 해산제로서 지칭됨)를 함유하였다. 바이알은 0.092% 유칼립톨, 0.042% 멘톨, 0.06% 메틸살리실레이트, 0.064% 티몰 및 27% 에탄올(w/v)로 이루어진 10㎖ 구강 청결제를 함유한다.
캡을 밀어냄으로써, 프로바이오틱을 바이알에 함유되어 있는 액체 중에 배출한다. 조성물을 혼합하고, 이후에, 1분 동안 양치질하기 위해 사용한다.
실시예 11. 락트산 박테리아의 발효 및 후처리
발효 및 냉동-건조의 단계를 포함한 제조 공정에 의해 원료 물질로서 사용되는 후처리 바이오매스를 수득하였다. 80㎖의 MRS 브로쓰 배지에 P. 에시디락티시 균주를 접종함으로써 모 배양물을 제조하였다. 접종된 배지를 미호기성 조건, 37℃에서 48시간 동안 발효하였다. 브로쓰 배지 총 부피당 약 1 내지 2% 접종물의 비율로 600 리터의 MRS 브로쓰 배지를 접촉하기 위해 얻어진 배양물을 사용하였다. 얻어진 배지를 3 내지 5℃에서 냉각시키고, 브로쓰에 존재하는 대부분의 물을 제거하기 위해 원심분리하였다. 동결보호제를 농축된 배양물에 첨가하고, 얻어진 혼합물을 -45℃에서 냉동-건조시켰다.
서지 문헌
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
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Claims (18)

  1. 적어도 하나의 소독제와 병용되는 페디오코커스 균주(Pediococcus strain)의 용도로서,
    상기 페디오코커스 균주는,
    a) 트라이클로산(triclosan);
    b) 적어도, 멘톨, 유칼립톨, 티몰 및 메틸 살리실레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 개별 구성성분을 포함하는 에센셜 오일(essential oil); 및
    c) 멘톨, 유칼립톨, 티몰 및 메틸 살리실레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 개별 구성성분
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 소독제에 대해 내성을 나타내는 능력을 가지며;
    상기 페디오코커스 균주는, 상기 페디오코커스 균주에 대해 관찰된 디스크 확산 검정에 의해 측정된 저해 할로(inhibition halo)가 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)의 저해 할로보다 작을 때 소독제에 대해 내성을 나타내는 능력을 갖는 것으로 고려되며, 상기 소독제는 포르피로모나스 진지발리스의 저해를 관찰하는 농도로 존재하며;
    상기 페디오코커스 균주 및 상기 소독제는 별도, 순차적, 동시 투여를 위해 또는 혼합물(admixture)로 제형화되는, 페디오코커스 균주의 용도.
  2. 제1항에 있어서, 상기 포르피로모나스 진지발리스는 포르피로모나스 진지발리스 DSM20709인, 페디오코커스 균주의 용도.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 페디오코커스 균주는 페디오코커스 에시디락티시 균주(Pediococcus acidilactici strain)인, 페디오코커스 균주의 용도.
  4. 제3항에 있어서, 상기 페디오코커스 에시디락티시 균주는 수탁 번호 CECT 8633으로 스페인 생물자원 센터(Spanish Type Culture Collection)에 기탁된 페디오코커스 에시디락티시의 균주인, 페디오코커스 균주의 용도.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 페디오코커스 균주는 트라이클로산; 적어도, 멘톨, 유칼립톨, 티몰 및 메틸 살리실레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 개별 구성성분을 포함하는 에센셜 오일; 멘톨, 유칼립톨, 티몰 및 메틸 살리실레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 개별 구성성분; 및 비스구아딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 소독제와 병용되는, 페디오코커스 균주의 용도.
  6. 제5항에 있어서, 상기 페디오코커스 균주는 트라이클로산; 및 적어도, 멘톨, 유칼립톨, 티몰 및 메틸 살리실레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 개별 구성성분을 포함하는 에센셜 오일로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 소독제와 병용되는, 페디오코커스 균주의 용도.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소독제가 허용되는 부형제 및/또는 담체와 함께 개인 관리 제품(personal care product)의 형태로 제형화되며, 페디오코커스 균주가 허용되는 부형제 및/또는 담체와 함께 개인 관리 제품 또는 약제학적 제품(pharmaceutical product)의 형태로 제형화되는, 페디오코커스 균주의 용도.
  8. 제7항에 있어서, 상기 개인 관리 제품은 구강 위생 제품(oral care product)인, 페디오코커스 균주의 용도.
  9. 제8항에 있어서, 상기 구강 위생 제품은 치약, 구강 젤(oral gel), 구강 스프레이(oral spray), 구강 세정제(mouth rinse) 또는 구강 분산 가능한 정제(oral dispersible tablet)인, 페디오코커스 균주의 용도.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소독제 및 페디오코커스 균주는 별도로 투여되며(페디오코커스 균주와 소독제의 투여 사이에 소정 시간 간격 대기함), 상기 시간 간격이 1시간 이하인, 페디오코커스 균주의 용도.
  11. 제10항에 있어서, 치료될 상기 대상체가 30 내지 60초 동안 소독제를 함유한 구강 청결제(mouthwash)로 입을 양치질(gargle)하도록 지시되며, 이후에, 상기 구강 청결제가 제거되며(split out), 이후에, 상기 페디오코커스 균주를 함유한 경구 정제가 입에 도입되어 서서히 용해될 수 있는, 페디오코커스 균주의 용도.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 구강에서의 장애를 예방 및/또는 치료하기 위한, 페디오코커스 균주의 용도.
  13. 제12항에 있어서, 상기 구강에서의 장애는 경구 병원균(oral pathogen)에 의해 유발된, 페디오코커스 균주의 용도.
  14. 수탁 번호 CECT 8633으로 스페인 생물자원 센터에 기탁된 페디오코커스 에시디락티시 종에 속하는 균주.
  15. 수탁 번호 CECT 8633으로 스페인 생물자원 센터에 기탁된 페디오코커스 에시디락티시의 돌연변이체를 얻는 방법으로서,
    출발 물질로서 상기 기탁된 CECT 8633 균주를 사용하고 돌연변이유발(mutagenesis)을 적용하는 단계를 포함하되, 얻어진 돌연변이체는 적어도 소독제에 대해 내성을 나타내는 기탁된 균주의 능력을 보유하거나 향상시키는, 페디오코커스 에시디락티시의 돌연변이체를 얻는 방법
  16. 락트산 박테리아 균주를 스크리닝하고 단리시키는 방법으로서,
    i) 락트산 박테리아 균주 후보물의 풀(pool)로부터 락트산 박테리아 개체의 소독제에 대해 내성을 나타내는 능력을 검정하는 단계; 및
    ii) 포르피로모나스 진지발리스보다 더 높은 소독제에 대해 내성을 나타내는 능력을 갖는 락트산 박테리아 균주를 선택하고 단리시키는 단계를 포함하는, 락트산 박테리아 균주를 스크리닝하고 단리시키는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 락트산 박테리아 균주는 페디오코커스 균주인 스크리닝하는, 락트산 박테리아 균주를 스크리닝하고 단리시키는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 락트산 박테리아 균주는 페디오코커스 에시디락티시 균주인 스크리닝하는, 락트산 박테리아 균주를 스크리닝하고 단리시키는 방법.
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