KR20150020075A - 대장균의 지놈 엔지니어링용 플라스미드 및 이를 이용한 대장균의 지놈 엔지니어링 방법 - Google Patents

대장균의 지놈 엔지니어링용 플라스미드 및 이를 이용한 대장균의 지놈 엔지니어링 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20150020075A
KR20150020075A KR20140101760A KR20140101760A KR20150020075A KR 20150020075 A KR20150020075 A KR 20150020075A KR 20140101760 A KR20140101760 A KR 20140101760A KR 20140101760 A KR20140101760 A KR 20140101760A KR 20150020075 A KR20150020075 A KR 20150020075A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
plasmid
coli
gene
genome
engineering
Prior art date
Application number
KR20140101760A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101804145B1 (ko
Inventor
이성국
유영신
신광수
비누셀비 파리수탐
라제쉬 쿠마르 비스와스
Original Assignee
국립대학법인 울산과학기술대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 국립대학법인 울산과학기술대학교 산학협력단 filed Critical 국립대학법인 울산과학기술대학교 산학협력단
Publication of KR20150020075A publication Critical patent/KR20150020075A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101804145B1 publication Critical patent/KR101804145B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 대장균 지놈 엔지니어링용 플라스미드, 대장균 지놈에 이종 유전자를 통합시키기 위한 통합 플라스미드, 상기 플라스미드로 형질전환된 대장균, 및 상기 플라스미드를 이용한 야생형 대장균의 지놈 엔지니어링 방법에 관한 것으로, 본 발명의 지놈 엔지니어링용 플라스미드는 상이한 대장균 균주로의 이동성(portability)이 높고, 상기 플라스미드로 형질전환된 대장균은 높은 지놈 엔지니어링 효율을 보이며, 엔지니어링 후 잘못-짝지음 수선 시스템(MMR system)의 용이한 회복을 통하여 원치 않는 돌연변이의 발생을 막을 수 있으므로, 여러 합성 생물학 및 대사 엔지니어링 분야에서의 지놈 엔지니어링을 위해 매우 유용하다.

Description

대장균의 지놈 엔지니어링용 플라스미드 및 이를 이용한 대장균의 지놈 엔지니어링 방법 {Plasmids for Genome Engineering of E. coli and Method for Engineering Genome of E. coli Using Same}
본 발명은 대장균에서의 지놈 엔지니어링(genome engineering)을 위한 플라스미드, 상기 플라스미드로 형질전환된 대장균, 및 상기 플라스미드를 이용한 대장균의 지놈 엔지니어링 방법에 관한 것이다.
지놈 엔지니어링으로 인해 일부 기본적인 생물학적 현상을 이해하게 됨과 동시에, 진화 자체에 의해서는 쉽게 생성될 수 없는 유용한 유기체를 제조할 수 있게 되었다. 대립형질 재조합(allelic recombination)에 의해 매개되는 지놈 엔지니어링 도구는 합성 생물학 및 대사 엔지니어링에서 그 유용성을 입증하였다(Burdett et al., P Natl Acad Sci USA 98, 6765-6770 (2001); Mosberg et al., PLoS One 7 (2012)). 염색체 상의 다중 유전자좌(지놈 시퀀스)의 동시 편집은 목적하는 기능의 효과적인 진전을 야기하였으며(Esvelt and Wang, Mol Syst Biol 9 (2013)), 지놈 엔지니어링에 특별한 도구가 된다. 상기 방법은, 에스케리키아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 마이코박테리움(Mycobacterium) 및 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함하는 모델 유기체들의 목적하는 유전자좌를 변이시키기 위해 십여 년에 걸쳐 성공적으로 사용되어 온(Swingle et al., Bioeng Bugs 1, 263-266 (2010)), 파지 λ Red 리콤비네이즈 효소 β, γ 및 엑소(exo)(Poteete, Ferms Microbiology Letters 201, 9-14 (2001)) 단백질들에 의해 촉진된다.
다중 자동화 지놈 엔지니어링(multiplex automated genome engineering, MAGE)은 세포의 대규모 프로그래밍 및 진화를 위한 합성 생물학 및 대사 엔지니어링 분야의 독립적 재조합공학(recombineering) 도구로서, 비-생존성 돌연변이의 축적을 허용하지 않는 지놈 엔지니어링 도구이다(Lajoie et al., Nucleic Acids Research 40, e170-e170 (2012)). 상기 방법은 24개의 유전자 성분들을 동시에 변이시킴으로써 라이코펜 생성 쪽으로 흐름을 이동시키기 위해 적용되어, 라이코펜 역가를 5배 증가시켰다(Wang et al., Nature 460, 894-898 (2009a)). 또한, MAGE를 사용하여, 대장균의 314개의 TAG 정지 코돈을 TAA 정지 코돈으로 치환시켜 비천연(non-canonical) 아미노산에 사용하기 위한 코돈 공간을 생성시켰다(Isaacs et al., Science 333, 348-353 (2011)). T7 프로모터를 12개 유전자좌 내에 동시 도입시켜 인디고 생성을 20% 증가시켰다(Wang et al., Nat Methods 9, 591-593 (2012b)). 사상 최대의 MAGE 순환(110 주기)에 의해, His 표지(tag)가 대장균의 전체 번역 기구를 암호화하는 38개의 필수 유전자 내에 삽입되어, 고순도로 시험관내 번역 추출물의 용이한 재구축을 가능케 하였다(Wang et al., ACS Synthetic Biology 1, 43-52 (2012a)).
여러 변형된 균주(EcNR2, DY330 및 EcHW24) 및 플라스미드(pSIM5 및 pKD46)가 대장균에서의 상기 지놈 엔지니어링 실행에 이용될 수 있다(Sandoval et al., P Natl Acad Sci USA 109, 10540-10545 (2012); Wang and Church, Method Enzymol 498, 409-426 (2011); Yu et al., P Natl Acad Sci USA 97, 5978-5983 (2000)). 그 다용성이 입증됨에도 불구하고, 상기 균주들은 kill 유전자와 같은 박테리오파지 λ의 용균성 유전자의 존재, 영구 파괴된 숙주 MMR(mis-match repair, 미스-매치 복구)시스템, 최소 배지에서의 불량한 성장 또는 BAC 벡터에 대한 비호환성(incompatibility)을 포함하여 여러 약점들을 갖는다(Burdett et al., P Natl Acad Sci USA 98, 6765-6770 (2001); Court et al., Gene 315, 63-69 (2003); Mosberg et al., PLoS One 7 (2012)). 상기 숙주들에서 λ 프로파지의 kill과 같은 용균성 유전자의 발현은 최소 배지 또는 영양소 제한 배지 상에서 숙주의 성장을 제한한다. 또한, 결손 프로파지는 상이한 대장균 플랫폼으로 용이하게 이동할 수 없으므로, 광범위한 지놈 편집을 위해 MAGE의 기능성을 충분히 활용하는데 큰 방해요인이 된다. 더욱이, EcNR2 균주는 그의 지놈을 다중 이종 유전자에 의해 추가 변형하는데 있어서 항생물질의 선택이 제한된다.
MAGE의 유용성 및 상이한 대장균 균주로의 플라스미드의 이동성(portability)을 개선하기 위해, 본 발명자들은 대립형질 재조합에 필수적인 성분들을 모두 가지며 mutS의 불활성화에 의해 숙주 MMR 시스템의 일시적 불활성화를 허용하는 자살 플라스미드를 개발하였다. 또한, 대장균 염색체 내에 거대 이종 유전자를 도입시킬 수 있는 통합 플라스미드를 개발하였다. 상기 플라스미드들을 이용하여 제조된 대장균 균주들은 MAGE의 유용성을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 목적은 간단한 방법으로 제조될 수 있고 상이한 대장균 균주로의 플라스미드의 이동성(portability)이 개선된 대장균 지놈 엔지니어링용 플라스미드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 대장균 염색체 내에 거대 이종 유전자를 도입시킬 수 있는 플라스미드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 플라스미드로 형질전환된 대장균 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 플라스미드를 이용한 야생형 대장균의 지놈 엔지니어링 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 복제 기점(ori) 서열; 파지 람다(λ)의 레드(Red) 리콤비네이즈를 코딩하는 exo, β, 및 γ 유전자; mutS 유전자 단편; 항생제 내성 유전자; 및 c1 억제자(repressor)를 포함하는, 대장균 지놈 엔지니어링용 플라스미드를 제공한다.
본 발명은 또한 복제 기점(ori) 서열; lacZ 유전자 단편; 항생제 내성 유전자; FRT(FLP recognition site) 부위, 및 다중 클로닝 부위(MCS)를 포함하는, 대장균 지놈에 이종 유전자를 통합시키기 위한 플라스미드를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 플라스미드로 형질전환된 대장균을 제공한다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 야생형 대장균의 지놈 엔지니어링 방법을 제공한다:
1) 복제 기점(ori) 서열; 파지 람다(λ)의 레드(Red) 리콤비네이즈를 코딩하는 exo, β, 및 γ 유전자; mutS 유전자 단편; 항생제 내성 유전자; 및 c1 억제자를 포함하는, 대장균 지놈 엔지니어링용 플라스미드를 제조하는 단계;
2) 상기 플라스미드를 야생형 대장균에 도입시켜 mutS 유전자의 상동 재조합에 의해 지놈에 통합시키는 단계; 및
3) 다중 자동화 지놈 엔지니어링(multiplex automated genome engineering; MAGE)에 의해 재조합 대장균의 지놈 엔지니어링을 수행하는 단계.
본 발명의 지놈 엔지니어링용 플라스미드는 상이한 대장균 균주로의 이동성(portability)이 높고, 상기 플라스미드로 형질전환된 대장균은 높은 지놈 엔지니어링 효율을 보이며, 엔지니어링 후 잘못-짝지음 수선 시스템(MMR system)의 용이한 회복을 통하여 원치 않는 돌연변이의 발생을 막을 수 있으므로, 여러 합성 생물학 및 대사 엔지니어링 분야에서의 지놈 엔지니어링을 위해 매우 유용하다.
도 1은 본 발명의 플라스미드 및 MAGE를 이용한 지놈 엔지니어링 방법을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2a는 플라스미드 pRED-1의 개열지도이고, 도 2b는 플라스미드 pRED-2의 개열지도이다.
도 3a는 플라스미드 pINZ-1의 개열지도이고, 도 3b는 플라스미드 pINZ-2의 개열지도이다.
도 4는 대장균의 지놈 내에 본 발명의 플라스미드들이 통합된 것을 나타내는 유전자 지도 및 전기영동 결과로서, A는 최소 프로파지 플라스미드에 의해 대장균 MG1655 지놈 내의 mutS 유전자좌에 λ-Red 단백질이 통합된 것을 도식적으로 나타낸 것이고, B는 통합 플라스미드에 의해 이종 유전자가 대장균 MG1655 지놈 내의 lacZ 유전자좌에 삽입된 것을 도식적으로 나타낸 것이며, C 및 D는 각각 본 발명의 최소 프로파지 플라스미드 및 통합 플라스미드 각각에 의한 mutS 및 lacZ 유전자좌의 성공적인 불활성화를 PCR 및 전기영동으로 확인한 것이다. 상응하는 프라이머 위치는 A 및 B에 나타나 있으며, C에서 레인 M은 DNA 크기 표지(DNA ladder), 레인 1은 야생형 MG1655 균주, 레인 2는 MG1655-pRED2 균주이고, D에서 레인 1은 야생형 MG1655 균주, 레인 2는 MG1655-pINZ2 균주를 각각 나타낸 것이다.
도 5는 야생형 대장균 MG1655 균주와 재조합공학 대장균 균주들인 EcNR2, EcSIM1 및 EcSIM2 균주의 재조합 효율을 나타낸 것으로, 여기에서 재조합 효율 퍼센트는 각 균주에 대해 수행된 2회의 MAGE 주기에 걸친 돌연변이의 출현 퍼센트이다.
도 6은 야생형 대장균 MG1655 균주와 재조합공학 대장균 균주들인 MG-pSIM5, EcNR2 및 EcSIM1 균주의 M9-최소 배지에서의 세포 성장률을 비교한 것이다. 실험은 3회 반복하여 수행하였고, 측정된 표준 편차(SD)를 그래프에 표시하였다.
도 7은 본 발명의 지놈 엔지니어링 방법의 효율을 라이코펜 생합성의 중요 경로인 DXP(deoxyxylulose-5-phosphate) 생합성 경로의 최적화를 통해 확인한 것이다. 도 7에서, A 및 B는 각각 대조균주인 EcSIM1.1과 18 사이클의 MAGE를 수행한 후의 지놈 변이체 라이브러리의 LB 배지에서의 성장을 나타낸 것이고, C는 대조균주인 EcSIM1.1과 지놈 변이체인 EcSIM1.1-a 내지 EcSIM1.1-g의 LB 배지에서의 라이코펜 생산을 비교한 것이다.
도 8a는 플라스미드 pINZ1-LYC의 개열지도이고, 도 8b는 플라스미드 pINZ1-LYC04의 개열지도이다.
본 발명은 대장균에서의 지놈 엔지니어링(genome engineering)을 위한 플라스미드, 상기 플라스미드로 형질전환된 대장균, 및 상기 플라스미드를 이용한 대장균의 지놈 엔지니어링 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
대장균 지놈 엔지니어링용 플라스미드 ( pRED 플라스미드)
본 발명의 대장균 지놈 엔지니어링용 플라스미드는 복제 기점(ori) 서열; 파지 람다(λ)의 레드(Red) 리콤비네이즈를 코딩하는 exo, β, 및 γ 유전자; mutS 유전자 단편; 항생제 내성 유전자; 및 c1 억제자(repressor)를 포함한다.
본 발명에서는 상기 플라스미드를 pRED 플라스미드로 지칭한다.
본 발명의 pRED 플라스미드는 잘못-짝지음 수선 시스템(mismatch repair (MMR) system)의 구성 단백질인 mutS의 유전자 단편 및 파지 람다(λ)의 유전자 중 레드(Red) 리콤비네이즈(recombinase)의 구성 유전자인 exo, β, 및 γ 유전자만을 자살 플라스미드(suicide vector)에 클로닝하여 제조할 수 있다. 얻어진 플라스미드를 야생형 대장균에 도입시키면 pRED에 존재하는 mutS 유전자 부분과 야생형 대장균의 mutS 오픈 리딩 프레임(ORF) 사이의 단일 크로스오버 사건을 통한 상동 재조합(homologous recombination)에 의해 λ-Red 단백질의 통합 및 mutS 유전자의 파괴가 동시에 이루어짐으로써, 재조합 대장균의 MMR 시스템 기능의 일시적인 불활성화를 통해 지놈 엔지니어링 효율을 높일 수 있다.
또한, 본 발명의 pRED 플라스미드는 상이한 대장균 균주에 상동 재조합 원리를 이용하여 용이하게 지놈상에 삽입되고 제거될 수 있으므로 이동성(portability)이 높은 장점이 있다.
pRED 플라스미드의 제조에 사용될 수 있는 자살 플라스미드는 온도에 의해 복제가 조절되거나 특정 단백질(Pir)이 존재할 경우 복제가 조절되는 조건을 가진 것들로서, pSIM5 플라스미드(Datta et al., Gene 379, 109-115 (2006a)), pKD13 플라스미드(Datsenko et al.. PNAS 97(12), 6640-6645 (2000)) 등을 예시할 수 있다.
지놈 엔지니어링용으로 공지된 대장균들의 경우, 대장균 지놈에 파지 람다 지놈 전체가 삽입되어 있어 람다의 다른 유전자들에 의해서 대장균의 성장에 문제가 발생하는 등의 문제가 있지만, 본 발명의 pRED 플라스미드는 람다 유전자들 중에서 지놈 엔지니어링에 꼭 필요한 exo, β, 및 γ 유전자만을 대장균의 mutS 유전자에 삽입하여 지놈 엔지니어링을 수행할 수 있는 장점과, 연구를 마무리한 후 이를 대장균 지놈에서 다시 제거하여 mutS 기능을 용이하게 복원할 수 있는 장점을 가지고 있다. 특히, 지놈 상에서 잘못-짝지음(mismatch) 돌연변이를 교정하는 mutS 의 기능을 복원하지 않고 계속 사용할 경우 돌연변이 빈도가 높아져 원하는 기능을 잃어버릴 수 있는 문제점이 있으므로, 지놈 엔지니어링을 위해서는 mutS의 기능을 반드시 복원하는 것이 중요하다.
본 발명의 pRED 플라스미드에 포함되는 mutS 유전자는 대장균 지놈 mutS 유전자와 상동 재조합하는데 충분한 길이를 갖는 그의 단편으로서 300 bp 이상, 바람직하게는 300 내지 1000 bp의 크기를 갖는 단편일 수 있다. 예를 들어, 상기 mutS 유전자는 542 bp 단편일 수 있다. 완전한 유전자가 아닌 단편을 통합해야만 mutS 유전자 내에 플라스미드가 통합되어 mutS의 활성을 억제할 수 있다. 단편의 길이가 길어질수록 통합효율이 높아질 수 있다.
본 발명의 pRED 플라스미드에서 복제 기점 서열은 pSC101 repA ts 복제 기점 또는 R6K 복제 기점일 수 있다.
pSC101 repA ts 복제 기점을 가진 플라스미드는 42 ℃의 고온에서는 야생형 대장균에서 복제가 될 수 없으므로, 이 플라스미드가 지놈에 삽입되지 않은 대장균은 항생제를 포함하는 42 ℃의 배지에서 자랄 수 없어, 배양 온도의 조절을 통해 플라스미드가 지놈에 삽입된 재조합 대장균을 용이하게 선별할 수 있다. 예를 들어, 도 2에 개시된 개열지도를 갖는 pRED-1 플라스미드는 이를 포함하는 대장균을 플라스미드의 생존이 허용되지 않는 온도인 42 ℃에서 배양할 때 단일 크로스-오버 사건을 통해 대장균 염색체의 mutS 영역 내로 효과적으로 삽입된다(도 1 및 도 4의 A).
그러나, 표적 돌연변이체의 온도를 매개로 한 선별은 삽입되지 않은 플라스미드의 완전한 큐어링(curing)을 위해 42 ℃에서의 선별을 수 회 반복해야 하는 불편함이 있다. 이런 이유로, pSC101 repA ts 복제 기점을 R6Kγ 복제 기점으로 치환시킨 플라스미드를 이용하면, R6Kγ 기점을 갖는 플라스미드가 pir 유전자 산물의 부재 하에서는 생존할 수 없기 때문에 단 1회의 선별로도 플라스미드가 지놈에 통합된 균주를 효율적으로 선별할 수 있다(Metcalf et al., Plasmid 35, 1-13 (1996)).
한편, pRED 플라스미드에 포함될 수 있는 항생제 내성 유전자로는 사용 균주에서 항생제 내성을 보이는 어떠한 유전자도 사용할 수 있다. 예를 들어, 카나마이신 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 또는 스트렙토마이신 내성 유전자를 사용할 수 있으며, 본 발명의 한 실시양태에서는 클로람페니콜 내성 유전자를 사용한다.
본 발명의 실시양태에 따라, 대장균 지놈 엔지니어링용 플라스미드로서 도 2a 의 개열지도를 갖는 플라스미드 pRED-1, 또는 도 2b의 개열지도를 갖는 플라스미드 pRED-2가 제공된다.
대장균 지놈 통합 플라스미드 ( pINZ 플라스미드)
본 발명에서 대장균의 지놈에 이종 유전자를 통합시키기 위한 통합 플라스미드는 복제 기점(ori) 서열; lacZ 유전자 단편; 항생제 내성 유전자; FRT(FLP recognition site) 부위, 및 다중 클로닝 부위(MCS)를 포함한다.
본 발명에서는 상기 플라스미드를 pINZ 플라스미드로 지칭하며, pINZ 플라스미드는 지놈 상에 통합될 수 있다.
상기 pINZ 플라스미드의 MCS에 지놈 엔지니어링을 위한 이종 유전자를 클로닝한 후 이를 대장균에 도입시키면, 상기 pINZ 플라스미드에 포함된 lacZ 유전자 단편과 대장균 지놈 상의 lacZ 유전자 사이의 상동 재조합을 통해서 이종 표적 유전자가 대장균 지놈의 lacZ 유전자좌 내로 용이하게 통합된다. 이렇게 제조된 재조합 균주는 X-gal 플레이트에서 블루/화이트 선별 방법에 의해 간편하게 스크리닝할 수 있으며, 항생제 내성을 이용하여 이중으로 선별이 가능하다.
pINZ 플라스미드의 통합 원리는 통상적인 클로닝 및 단일 크로스-오버 매개 통합을 기초로 하기 때문에, 이종 유전자의 크기는 제한 요인이 될 수 없으며 보다 거대한 지놈 단편의 효과적인 통합이 가능하다.
또한, pINZ 플라스미드는 MCS의 양쪽에 전사 종결 서열(transcriptional termination sequence)을 포함하고 있어, MCS에 삽입된 이종 유전자는 대장균 내의 다른 프로모터의 영향을 전혀 받지 않고 주입된 프로모터에 의해서만 전사가 일어나게 된다. MCS 앞쪽의 T1(4) 전사종결 서열은 lacZ 삽입 후 lacZ 프로모터에 의한 영향을 차단하고 뒤쪽의 T1, T0 종결서열은 클로닝된 이종 유전자의 발현을 종결시킨다.
또한, pINZ 플라스미드는 lacZ 상동 서열의 상류에 및 카나마이신 저항성 유전자(KmR) 성분의 하류에 표적 유전자의 통합 시 내성 마커의 효과적인 제거를 위한 FRT(FLP recognition site) 부위를 포함한다. 내성마커 양쪽의 FRT 서열은 동일한 염기서열이 반복되고 두 영역이 서로 상동적이기 때문에 크로스오버 후 FLP 단백질에 의해 FRT 사이의 유전자가 효과적으로 제거될 수 있다(Datsenko et al., PNAS 97(12), 6640-6645 (2000)).
상기 상동 재조합을 위해, 본 발명의 플라스미드에 포함되는 lacZ 유전자는 대장균 지놈 lacZ 유전자와 상동 재조합하는데 충분한 길이를 갖는 그의 단편으로서 300 bp 이상, 바람직하게는 300 내지 1000 bp의 크기일 수 있다. 예를 들어, 상기 lacZ 유전자는 733 bp 단편일 수 있다. 완전한 유전자가 아닌 단편을 통합해야만 lacZ 유전자 내에 플라스미드가 통합되어 lacZ의 활성을 잃어서 통합 후 선별이 가능하다. 단편의 길이가 길수록 통합효율이 높아질 수 있다.
본 발명의 pINZ 플라스미드에서 복제 기점 서열은 pSC101 repA ts 복제 기점 또는 R6K 복제기점일 수 있다. 이 복제기점들의 특징 및 장점은 위에서 설명한 바와 같다.
한편, pINZ 플라스미드에 포함될 수 있는 항생제 내성 유전자로는 사용 균주에서 항생제 내성을 보이는 어떠한 유전자도 사용할 수 있다. 예를 들어 카나마이신 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 또는 스트렙토마이신 내성 유전자를 사용할 수 있으며, 본 발명의 한 실시양태에서는 클로람페니콜 내성 유전자를 사용한다.
본 발명의 실시양태에 따라, 대장균 지놈 통합용 플라스미드로서 도 3a의 개열지도를 갖는 플라스미드 pINZ-1, 또는 도 3b의 개열지도를 갖는 플라스미드 pINZ-2가 제공된다.
상기에서 설명한 pRED 플라스미드와 함께 pINZ 플라스미드를 사용하여 어느 균주에서나 거대 이종 유전자의 지놈 엔지니어링이 가능하다.
재조합 대장균
본 발명은 상기 대장균 지놈 엔지니어링 플라스미드 pRED로 형질전환된 재조합 대장균을 제공한다.
pSC101 repA ts 복제 기점을 가진 pRED 플라스미드로 형질전환된 대장균은 플라스미드의 생존이 허용되지 않는 온도인 42 ℃에서 배양함으로써 용이하게 선별할 수 있으나, 통합되지 않은 플라스미드의 완전한 큐어링(curing)을 위해 42 ℃에서의 선별을 수 회 반복해야 한다. 한편, R6Kγ 복제 기점을 갖는 플라스미드 pRED 플라스미드로 형질전환된 재조합 대장균은, 37 ℃에서 단 1회의 선별로도 효율적으로 선별될 수 있다.
한편, 상기 재조합 대장균은 상술한 pINZ 플라스미드의 다중 클로닝 부위에 이종 유전자를 삽입시킨 플라스미드로 추가로 형질전환될 수 있다.
이종 유전자를 포함하는 pINZ를 MG1655 균주에 형질전환시키고 37 ℃에서 X-gal, IPTG 및 항생제를 함유하는 LB 플레이트 상에서 선별하여 형질전환된 대장균 균주를 수득한다. 상기 pINZ 내의 이종 유전자가 대장균 지놈에 통합되면 lacZ 유전자가 파괴되므로, 형질전환된 대장균은 선별 배지 상에서 백색 콜로니 생성에 의해 용이하게 선별될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에 따라, pRED가 도입된 재조합 대장균 균주의 MAGE 효율을 완전 프로파지를 함유한 기존의 재조합공학 균주인 EcNR2 (Wang 등, Nature 460, 894-898 (2009b))와 비교한 결과, 본 발명의 재조합 균주가 EcNR2의 재조합 효율과 유사하거나 더 우수한 재조합 효율을 나타내어 MAGE의 효율이 최소 및 완전 프로파지 함유 균주 사이에서 유사함이 확인되었다(도 5).
한편, 본 발명의 pRED로 형질전환된 재조합 균주는 kill과 같은 용균성 유전자의 부재로 인해 글루코스가 보충된 M9-최소 배지에서 야생형 MG1655 균주에 필적하는 높은 성장률을 나타낸 반면, EcNR2 균주는 성장률이 매우 낮았다(도 6). 따라서, 본 발명의 pRED로 형질전환된 재조합 균주는 특히 최소 또는 불량한 영양 배지에서의 성장의 최적화를 위해 EcNR2에 대한 더 나은 대안이 될 수 있다.
야생형 대장균의 지놈 엔지니어링 방법
본 발명의 야생형 대장균의 지놈 엔지니어링 방법은 하기 단계들을 포함한다:
1) 복제 기점(ori) 서열; 파지 람다(λ)의 레드(Red) 리콤비네이즈를 코딩하는 exo, β, 및 γ 유전자; mutS 유전자 단편; 항생제 내성 유전자; 및 c1 억제자를 포함하는, 대장균 지놈 엔지니어링용 플라스미드를 제조하는 단계;
2) 상기 플라스미드를 야생형 대장균에 도입시켜 mutS 유전자의 상동 재조합에 의해 지놈에 통합시키는 단계; 및
3) 다중 자동화 지놈 엔지니어링(multiplex automated genome engineering; MAGE)에 의해 재조합 대장균의 지놈 엔지니어링을 수행하는 단계.
상기 단계 1)에서 제조되는 대장균 지놈 엔지니어링용 플라스미드는 pRED 플라스미드로서 이의 제조 방법은 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 단계 2)에서, pINZ 플라스미드의 다중 클로닝 부위에 이종 유전자를 삽입한 후, 이렇게 제조된 플라스미드를 상기 pRED 플라스미드와 동시에 또는 순차적으로 대장균에 도입시켜 지놈에 통합시키는 공정을 추가로 수행할 수 있다.
pINZ 플라스미드의 다중 클로닝 부위에 삽입될 이종 유전자의 크기는 특별히 제한되지 않으며, 다양한 이종 유전자의 통합이 가능하다.
상기 단계 3)에서, 통상의 다중 자동화 지놈 엔지니어링(MAGE) 방법에 따라 지놈 엔지니어링을 수행할 수 있으며, 본 발명의 한 실시태양에 따르면 lacZ 유전자 내에 넌센스 돌연변이를 도입하는 서열번호: 22의 90 bp 올리고뉴클레오티드(lacZ-MAGE)를 사용하여 상기 균주들의 MAGE 효율을 확인할 수 있다.
한편, 본 발명의 지놈 엔지니어링 방법은 상기 단계 3)에서 지놈 엔지니어링의 결과로 얻어진 재조합 대장균의 지놈에서 통합된 플라스미드를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법으로 제조된 재조합 대장균 균주에 통합된 플라스미드(pRED 및 pINZ 플라스미드 모두)에 상동 영역들이 유지되기 때문에, 플라스미드의 절제를 유발하는 제2의 크로스-오버의 가능성이 존재한다(Hirayama et al., Appl Environ Microbiol 78, 4984-4994 (2012); Sadowski, BMC Biotechnol 3, 9 (2003)). 이에 근거하여, 상기 플라스미드가 통합된 재조합 대장균들을 계대배양함으로써 재조합 대장균의 지놈으로부터 통합된 플라스미드를 제거할 수 있으며, 특히 항생물질을 포함하지 않는 배지에서 30 내지 37 ℃, 바람직하게는 약 30 ℃에서 계대배양함으로써 통합된 플라스미드를 용이하게 제거할 수 있다.
MMR 시스템의 영구적 부재는 농축-기반 선별 과정에 사전에 조작된 MAGE 균주를 사용하는 것을 제한하지만, 본 발명의 플라스미드들은 MMR 시스템의 일시적 불활성화 및 최소 프로파지의 정확한 절제에 의한 회복이 가능하여 MMR의 결여로 인한 바람직하지 않은 돌연변이 가능성을 감소시키므로, 목적 표현형의 고-정확성 선별을 보장한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 하기 실시예는 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 발명의 범위를 한정하려는 것은 아니다.
참고예 : 세균 균주, 배양 배지 및 성장 조건
하기 실시예에서 사용된 균주 및 플라스미드를 하기 표 1에 나타내었으며, 프라이머 및 올리고뉴클레오티드를 표 2에 나타내었다.
명칭 특성 입수처 또는 참고문헌
균주 E. coli DH10B F- mcrA △(mrr-hsdRMS mcrBC) φ 80dlacZ△M15 △ lacX74 deoR recA1 ara△139 △ (ara leu)7697 galU galK λ- rpsL endA1 nupG Strr Invitrogen
E. coli DB3.1pir F - gyrA462 endA1 △(sr1 - recA) mcrB mrr hsdS20 (rB - mB -) supE44 ara -14 galK2 lacY1 proA2 rpsL20 (Strr) xyl-5 △ leu mtl -1 λ pir lysogen Durfee T. 등, J Bacteriol 190: 25972606 (2008)
E.coli MG1655 야생형 Fu 등, Nucleic Acids Res 36, e54 (2008)
ECNR2 MG1655, bio :: bla,
lamda-Red1, mutS ::Cmr 		Wang 등, Nature 460, 894-898 (2009b)
MG-pSIM5 pSIM5 플라스미드를 갖는
MG1655		 하기 실시예에서 제조
EcSIM1 pRED-1이 지놈에 통합된 MG1655 하기 실시예에서 제조
EcSIM2 pRED-2가 지놈에 통합된 MG1655 하기 실시예에서 제조
EcINZ1 pINZ-1이 지놈에 통합된 MG1655 하기 실시예에서 제조
EcINZ2 pINZ-2가 지놈에 통합된 MG1655 하기 실시예에서 제조
EcSIM1.1 pINZ1-LYC04 플라스미드를 갖는
EcSIM1		 하기 실시예에서 제조
EcSIM1.1a-g EcSIM1.1의 18회의 MAGE에 의한 변이체 하기 실시예에서 제조
플라스미드 pSIM5 ori101 ori; Cmr, Red, , Exo Datta 등, Gene 379, 109-115 (2006b)
pProbe[ tagless ] ori101 ori ; Km r Ham 등, PLoS One 3(2008)
pAC - LYC Erwinia herbicola crtEBI 유전자를 포함하는 pACYC184 Kang 등, Biotechnol. Bioeng. 91: 636642 (2005)
pAC-LYC04 Hematococcus pluvialis ipi 유전자를 포함하는 pAC-LYC Kang 등, 상기 문헌
pRED-1 mutS 단편, PSC101ori; Cmr 포함
pSIM5		 하기 실시예에서 제조
pRED-2 mutS 단편, R6K ori; Cmr 포함
pSIM5		 하기 실시예에서 제조
pINZ-1 lacZ 단편, ori101 orits; Kmr 포함 pProbe[tagless] 하기 실시예에서 제조
pINZ1-LYC Erwinia herbicola crtEBI 유전자를 포함하는 pINZ-1 하기 실시예에서 제조
pINZ1-LYC04 Erwinia herbicola crtEBI 유전자 및 Hematococcus pluvialis ipi 유전자를 포함하는pINZ-1 하기 실시예에서 제조
pINZ-2 R6K ori; Kmr 포함 pINZ-1 하기 실시예에서 제조
명칭 서열 서열번호
프라이머 mutS F GAGAGATCTAGCGAGCAATCATCGACACA 1
mutS R TTCAGATCTAACTACCGGATGGCGACCTT 2
R6KF ACGGCTGACATACTAGTGCCGCAAATCGCTGAATATTCCT 3
RP4R CCAAGCCAACCAGCATATGGGCAGATGAAAACGGTGTAAAAAAGAT 4
RP4F GCCCATATGCTGGTTGGCTTGGTTTCATCAG 5
R6KR GGCACTAGTATGTCAGCCGTTAAGTGTTCCTGT 6
P1F2 ATGGATATCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC 7
P4R2 GGAACTTCGAACTCGAGGTCGACGGACGTCCGGAATTAATTCTCATGTTTGACAGCGATCGGTG 8
lacZF1 GCAACTCGAGTTAACGCCGTGCGCTGTTCG 9
lacZR1 TCCGGACGTCTGGAAAAACTGCTGCTGGTG 10
pKD13R ATGAATGTCAGCTACTGGGCTATC 11
lacZF TTAATTCTCATGTTTGACAGTTAACGCCGTGCGCTGTTCGC 12
lacZF2 GATAGCCCAGTAGCTGACATTCATCTGGTTGGCTTGGTTTCATC 13
lacZR2 TTAACTCGAGTTATGTCAGCCGTTAAGTGTTC 14
ptaclacZF CAATTTCACACAGGAGATATCATATGACCATGATTACGGATTCAC 15
P4R CTGTCAAACATGAGAATTAA 16
mutS_seqF GCACTAATCCTGCGGAACTG 17
Cm_R CCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACG 18
pKD13F CCGGGGTCAGCACCGTTTCTGCGG 19
pKD13-ori101F GATAGCCCAGTAGCTGACATTCATTCAGATCCTTCCGTATTTAGCC 20
pKD13-ori101R CCGCAGAAACGGTGCTGACCCCGGTCATGACCAAAATCCCTTAACG 21
dxs seqF ACCAGCAACTTGGTAAAAGTACC 22
dxs seqR CGATTTTGTCGCGGCG 23
ipi seqF CTCTCTATTCCTGTCATTTCTGACTG 24
ipi seqR CAGGAGGCGTAATTTCCACG 25
Trc F GAGCTGAATTCGATCTGGTTTGACAGCTTATCATCGA 26
crtE F GAGCTGAATTCAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATC 27
crtB R GCAGTCGACCTAAACGGGACGCTGCCAAAGACC 28
올리고
뉴클레오티드		 lacZ-MAGE GGAAACAGCTATGACCATGATTACGGATTCACTGGCCGTCGTTTGACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCG 29
dxs MAGE GCGGACTACATCATCCAGCGTAATAAATAAACAATAAGTATTNNNNN GCCCCTGATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCGACCCTGGCA 30
ipi MAGE TTCACTCTTCAATTATCTATAATGATGAGTGATCAGAATTACNNNNN AGAAATTATGCAAACGGAACACGTCATTTTATTGAATGCACAG 31
하기 실시예에서 대장균 MG1655 균주를 모 균주로 사용하였다. 달리 명시하지 않는 한, 균주는 LB(Luria Bertani) 배지 (Difco, BD Diagnostic System, Sparks, MD, USA) 또는 글루코스 함유 M9-최소 배지에서 30 ℃에서 배양하였다. MAGE를 위해, 절반 농도의 염화나트륨(NaCl)을 함유하는 LB 배지를 사용하였다. 배지에 적당한 항생물질(50 ㎍/mL의 카나마이신, 30 ㎍/mL의 클로람페니콜, 또는 100 ㎍/mL의 암피실린)을 첨가하였다.
실시예 1: 플라스미드의 제작
(1) 최소 프로파지 플라스미드(pRED 플라스미드)의 제작
pSIM5 플라스미드(Datta et al., Gene 379, 109-115 (2006a))의 간단한 변형에 의해 pRED-1 최소 프로파지 플라스미드(도 2a)를 제조하였다. 구체적으로, 야생형 MG1655의 지노믹 DNA를 주형(template)으로 하고 제한효소 BglII 부위를 각각 포함하는 mutS F 정방향(forward) 프라이머(서열번호: 1) 및 mutS R 역방향(reverse) 프라이머(서열번호: 2)를 사용하여 542 bp의 mutS 유전자를 함유하는 영역을 PCR로 증폭시켰다. PCR 산물을 BglII로 처리하고, pSIM5 벡터 내의 동일 제한효소 절단 부위에 삽입하여 pRED-1 플라스미드를 얻었다.
pRED-2 최소 프로파지 플라스미드의 제조를 위해, pRED-1 플라스미드의 pSC101 repA ts 복제 기점(ori)을 PCR 기반 SLIC(Sequence and Ligase Independent Cloning, 서열 및 리가제 비의존성 클로닝) 방법(Jeong et al., Apple Environ Microb 78, 5440-5443 (2012); Li and Elledge, Methods Mol Biol 852, 51-59 (2012))에 의해 R6kγ 복제 기점으로 치환시켰다. 구체적으로, pSC101 repA ts 복제기점을 제외한 pRED-1 플라스미드를 R6KF 프라이머(서열번호: 3) 및 RP4R 프라이머(서열번호: 4)를 사용하여 PCR로 증폭시켰으며, R6Kγ 기점은 pKNOCK 플라스미드(Alexeyev, M.F., Biotechniques 26, 824-828, (1999))로부터 RP4F 프라이머(서열번호: 5) 및 R6KR 프라이머(서열번호: 6)를 사용한 PCR에 의해 증폭시켰다. 얻어진 플라스미드 및 삽입물을 T4 DNA 폴리머라제로 각각 처리한 후 1:2의 몰비(Molar ratio)로 혼합하여 어닐링하고, 이를 이용하여 대장균 DB3.1λ pir 컴피턴트 세포를 형질전환시켜 pRED-2 플라스미드(도 2b)를 얻었다.
(2) 통합(integration) 플라스미드(pINZ 플라스미드)의 제작
이종 유전자로서 lacZ 유전자를 대장균 지놈에 통합시킬 수 있는 통합 플라스미드들을 다음과 같이 제작하였다.
먼저, pKD13(Datsenko et al., PNAS 97(12), 6640-6645 (2000))에 pSC101 repAts 를 삽입하기 위하여, pKD13을 주형으로 pKD13F(서열번호: 19)와 pKD13R(서열번호: 11) 프라이머를 이용하여 pKD13 단편을 제조하고, pKD46(Datsenko et al., PNAS 97(12), 6640-6645 (2000))을 주형으로 pKD13-ori101 F(서열번호: 20)와 pKD13-ori101 R(서열번호: 21) 프라이머를 이용하여 pSC101 repA ts 를 제조한 다음, 얻어진 단편들을 서로 연결하였다. 제작된 pKD13-pSC101 플라스미드를 주형으로 하고 P1F2 프라이머(서열번호: 7) 및 P4R2 프라이머(서열번호: 8)를 이용한 PCR에 의해 pSC101 repA ts 기점과 항생제 내성 유전자를 제조한 후, pPROBE-GFP(무표지) 벡터(Ham et al., PLoS One 3 (2008)) 내의 pvuI 및 EcoRV 절단 부위에 클로닝하였다. 또한, 생성된 플라스미드의 XhoI/AatII 부위 내에, 야생형 MG1655 지노믹 DNA(Blattner 등, Science 277, 5331, 1453-1474 (1997))를 주형으로 하고 lacZF1 프라이머(서열번호: 9) 및 lacZR1 프라이머(서열번호: 10)를 이용하여 PCR로 제조한 733 bp의 부분 lacZ 유전자 단편을 삽입하였다. 이렇게 제작된 통합 플라스미드를 pINZ-1로 명명하였다(도 3a).
한편, lacZ 유전자의 효과적인 통합을 위해, pINZ-1로부터 repAts(pSC101 repAts) 대신에 R6Kγ 복제 기점을 함유하는 다른 플라스미드를 제조하였다.
구체적으로, 통합 플라스미드 pINZ-1의 pSC101 복제기점을 제외한 부분을 프라이머 pKD13R(서열번호: 11) 및 lacZF(서열번호: 12)를 사용하여 증폭시키고, SOE-PCR(Ho et al., Gene 77, 51-59 (1989))에 의해 R6Kγ 복제 기점을 함유하는 단편에 연결시켰다. 상기 R6Kγ 복제 기점을 함유하는 단편은 pKNOCK 플라스미드를 주형으로 하고 lacZ-RP4F2 프라이머(서열번호: 13) 및 lacZ-R6KR 프라이머(서열번호: 14)을 사용하여 PCR에 의해 제조하였다. 이렇게 작제된 통합 플라스미드를 pINZ-2로 명명하였다(도 3b).
pINZ-1 및 pINZ-2 플라스미드는 733 bp의 lacZ의 상동 단편 및 다중 클로닝 부위를 포함한다. 또한, 상기 플라스미드들은 lacZ 상동 서열의 상류에 및 카나마이신 저항성 단백질(KmR) 성분의 하류에 표적 유전자의 통합 시 내성 마커의 효과적인 제거를 위한 FRT(FLP recognition site) 부위를 포함한다.
(3) 라이코펜 생합성 유전자 발현 플라스미드(pINZ-LYC, pINZ-LYC04)의 제작
DXP 생합성 경로 라이브러리의 스크리닝을 위해, 라이코펜 생합성 유전자의 발현을 위한 플라스미드를 다음과 같이 제작하였다.
pAC-LYC를 주형으로 사용하고 프라이머 crtE F(서열번호: 27)와 crtB R(서열번호: 28)을 이용하여 crtEBI 유전자를 증폭한 후, pINZ-1 플라스미드와 연결하여 플라스미드 pINZ1-LYC(도 8a)를 제작하였다. pAC-LYC04 유전자를 주형으로 사용하고 프라이머 Trc F(서열번호: 26)와 crtB R(서열번호: 28)을 이용하여 ipi 유전자를 포함한 crtEBI 유전자를 증폭한 후, pINZ-1 플라스미드와 연결하여 pINZ1-LYC04 (도 8b)를 제작하였다.
실시예 2: 플라스미드 통합 및 형질전환체 회수
pRED 플라스미드 (pRED-1 및 pRED-2) 및 pINZ 플라스미드(pINZ-1 및 pINZ-2)는 다음과 같이 대장균 MG1655 균주의 지놈에 성공적으로 완전히 통합되었다.
pSC101 repA ts 복제기점을 갖는 플라스미드 pRED-1 및 pINZ-1의 경우에는, 이 플라스미드들을 각각 전기천공(electroporation)에 의해 대장균에 도입시킨 후, 대장균을 플라스미드의 생존이 허용되지 않는 온도인 42 ℃에서 배양하여 형질전환체 EcSIM1 및 EcINZ1을 각각 회수하였다.
한편, R6Kγ 복제 기점을 갖는 pRED-2 또는 pINZ-2 플라스미드를 전기천공에 의해 MG1655 균주에 도입시켰고, 대장균을 각각 37℃에서 배양하여 형질전환체 EcSIM2 및 EcINZ2를 회수하였다.
상기 배양시 단일 크로스-오버 사건을 통해 pRED-1 및 pRED-2 플라스미드는 대장균 지놈의 mutS 영역 내로, pINZ-1 및 pINZ-2 플라스미드는 대장균 지놈의 lacZ 영역 내로 각각 삽입된다(도 4, A 및 B).
대장균 염색체 내로 pRED 플라스미드가 통합되었는지를 알아보기 위해, mutS_seqF(서열번호: 17) 및 Cm_R(서열번호: 18) 프라이머를 사용한 PCR로 얻어진 1,518 bp의 앰플리콘을 전기영동에 의해 확인하였다(도 4, C). 대조군으로 야생형 MG1655를 이용하였고, pRED2가 통합된 균주(MG1655-pRED2 균주, 즉 EcSIM2 균주)의 경우에만 1,518 bp의 앰플리콘이 만들어졌음을 확인할 수 있었다.
한편, pINZ-1 및 pINZ-2 플라스미드를 각각 전기천공에 의해 MG1655 균주에 도입시켰고, 얻어진 대장균을 각각 30℃ 또는 37℃에서 Xgal 및 IPTG가 첨가된 LB-Km 플레이트 상에서 선별하여 형질전환체 EcINZ1 및 EcINZ2를 얻었다. EcINZ1 및 EcINZ2 균주 내의 이종 유전자는 대장균 지놈에 통합될 때 lacZ 유전자를 파괴하므로, 형질전환체는 블루/화이트 스크리닝에서 백색 콜로니 생성에 의해 용이하게 선별되었다.
pINZ 플라스미드의 통합 여부는 ptaclacZF 프라이머(서열번호: 15) 및 P4R 프라이머(서열번호: 16)를 사용한 PCR 및 전기영동으로 확인하였다(도 4, D). 대조군으로 야생형 MG1655를 이용하였고, pINZ2가 통합된 균주(MG1655-pINZ2 균주, 즉 EcINZ2 균주)의 경우에만 앰플리콘을 얻을 수 있었으며, 얻어진 1,914 bp의 앰플리콘(amplicon)을 서열분석으로 확인하였다.
pINZ 플라스미드의 통합 효율은 수 회의 반복 실험에 걸쳐서 약 50%로 관찰되었다.
실시예 3: MAGE
lacZ 유전자에 넌센스(non-sense) 돌연변이를 도입하는 90 bp 올리고뉴클레오티드 lacZ-MAGE(서열번호: 29)를 사용하여 MAGE를 수행하였다. MAGE는 2회의 연속 주기 동안 수행되었다(Wang et al., Nature 460, 894-898 (2009b)).
구체적으로, 플라스미드 pRED-1로 형질전환된 대장균 MG1655 균주를 LB-클로람페니콜 배지에서 30 ℃ 조건으로 밤새 성장시킨 배양물을 3 ml의 새 LB에 1:100의 중량비로 희석하고, 30℃에서 OD600이 0.5가 될 때까지 성장시켰다. 세포를 42 ℃에서 15 분간 배양하여 λ 단백질의 발현을 유도하고 즉시 4 ℃로 냉각시켰다. 0.5 OD600에서 1 mL의 배양액을 4 ℃에서 원심분리하여 세포를 수거하고, 4℃의 멸균된 증류수를 이용하여 2회 세척한 후 일렉트로컴피턴트(electrocompetent) 세포로 만들고, 0.5 μM의 lacZ-MAGE로 형질전환시키고, MAGE를 위해 1 mL의 1/2농도의 NaCl을 가진 LB 중에서 회수하였다. 세포를 다음 회차의 MAGE를 위해 새 LB에 재접종하거나 또는 목적 재조합체를 선별하기 전에 3시간동안 생장시켰다. 재조합체는 X-gal/IPTG 플레이트 상에서 선별하였다.
시험예 1: EcSIM 및 다른 재조합공학 균주의 재조합 효율 비교
상기 실시예에서 제조된 플라스미드의 완전한 기능성을 이 플라스미드로 형질전환된 대장균 MG1655 균주(EcSIM1 및 EcSIM2 균주)를 EcNR2 균주와 같은 다른 재조합공학 균주와 비교하여 입증하였다.
실시예 3에서와 같이 lacZ-MAGE를 사용한 MAGE 방법을 수행하여 상기 균주들의 MAGE 효율을 확인하였다. 재조합 효율은 2회의 연속적인 MAGE 주기에 걸쳐 나타난 백색 콜로니의 비율을 계수함으로써 산출하였다. EcNR2의 재조합 효율은 약 20%인 것으로 관찰되었으며, 이는 이전에 보고된 결과들과 유사하다(Wang et al., Nature 460, 894-898 (2009a)). EcSIM1 및 EcSIM2 균주의 재조합 효율은 20% 이상으로, MAGE의 효율이 최소 및 완전 프로파지 함유 균주 사이에서 유사할 수 있음을 시사하였다(도 5). 임의의 재조합공학 시스템 없이 MG1655 균주에서 lacZ-MAGE를 사용하여 실시한 MAGE는 동일한 양의 lacZ-MAGE를 사용하였음에도 어떤 돌연변이도 나타내지 않았다.
시험예 2: 재조합공학 균주들의 성장능 비교
본 발명의 EcSIM 균주들은 kill과 같은 용균성 유전자의 부재로 인해 최소 배지에서 다른 재조합공학 균주들보다 더 우수한 성장능을 가질 것으로 예측되었다.
이에, 대장균 MG1655 균주, EcSIM1 균주, EcNR2 균주 및 MG-pSIM5 균주(pSIM5 플라스미드를 갖고, mutS 유전자가 불활성화되지 않은 균주)를 LB 배지 또는 글루코스가 보충된 M9-최소 배지에서 배양하면서 세포 성장 특성을 확인하였다.
LB 배지에서 밤새 배양한 각 세포 배양액 0.5 ml를, 250 mL 플라스크에 들어 있는 2 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2 및 4 g/L의 글루코스를 포함하는 M9-최소 배지 50 ml에 접종하고, 30 ℃ 및 200 rpm에서 배양하였다. 세포 성장은 바이오크롬 리브라(Biochrom Libra) S22 분광광도계를 사용하여 600 nm에서의 흡광도(OD600)를 측정함으로써 모니터링하였다.
그 결과, EcNR2 균주는 LB 배지에서 성장시킨 경우에는 EcSIM1 균주 또는 심지어 야생형 MG1655 균주에 비해 더 우수한 성장능을 나타내었으나, 글루코스가 보충된 M9 최소 배지에서는 매우 느린 성장률을 나타내었다. 이에 비해, 본 발명의 EcSIM1 균주는 야생형 MG1655 균주에 필적하는 높은 성장률을 나타내었다(도 6). EcNR2의 불량한 성장률은, 선별 및 농축 단계가 길어지고 결국 다른 원치 않는 불리한 돌연변이를 야기할 수 있기 때문에, 바이오재료(biocommodity) 생산을 위한 중심 대사 경로의 최적화에 대한 그의 유용성에 제한 요인이 될 수 있다. 따라서, EcSIM1 또는 EcSIM2 균주는 특히 최소 배지 또는 빈영양 배지(poor nutrient medium)에서의 성장의 최적화를 위해 EcNR2에 대한 더 나은 대안이 될 수 있다.
시험예 3: 통합된 플라스미드의 절제 및 큐어링
본 발명의 재조합 대장균 균주 모두에서 지놈에 통합된 pRED 및 pINZ 플라스미드들에 상동 영역들이 유지되기 때문에, 플라스미드의 절제를 유발하는 제 2의 크로스-오버의 가능성이 존재한다(Hirayama et al., Appl Environ Microbiol 78, 4984-4994 (2012); Sadowski, BMC Biotechnol 3, 9 (2003)). 플라스미드 절제는 재조합공학 시스템의 일시적 존재 및/또는 MMR 시스템의 불활성화를 허용하는데 유리할 수 있다.
플라스미드 절제(excision)를 분석하기 위해, 재조합 대장균(EcINZ1)을 OD600이 1에 이를 때마다 계대배양하여 연속 5대에 걸쳐 배양하고, 이어서 카나마이신을 함유한 LB 아가/Xgal/IPTG 플레이트 상에서 평판배양한 후, 콜로니를 계수하였다. 10% 이상의 복귀돌연변이체(revertant)가 존재한 것으로 관찰되었다. 이로부터, 반복되는 MAGE 주기동안 플라스미드의 절제율이 높지 않을 것임을 예상할 수 있다.
다른 한편으로, 세포를 24 시간마다 계대배양한 경우, 5 세대 미만에서 50% 이하 절제율의 이유가 되는 증가된 비율(%)의 복귀돌연변이체가 존재하였다. 더욱이, 관찰된 플라스미드 절제 현상은 허용되지 않는 온도, 즉, 42 ℃와 비교하여, 허용되는 온도(30 ℃ 또는 37 ℃)에서 더 높은 것으로 밝혀졌다. 상이한 온도에서 세대에 걸친 절제율은 항생물질 없이 30 ℃에서 배양한 경우가 다른 경우보다 더 높은 것으로 밝혀졌다.
상기 두 가지 경우를 모두 고려할 때, 본 발명의 플라스미드는 MMR 시스템의 불활성화와 함께 목적 표현형을 스크리닝하는 것을 기초로 한 농축(enrichment)을 위해 더 우수한 플라스미드이며, 따라서 MMR의 결여로 인한 바람직하지 않은 돌연변이 가능성을 감소시킨다.
시험예 4: DXP ( deoxyxylulose -5- phosphate ) 생합성 최적화를 위한 본 발명의 지놈 엔지니어링 방법의 적용
본 발명의 지놈 엔지니어링 방법의 효율을 측정하기 위해, 본 발명의 방법에 의한 DXP 생합성 경로의 최적화를 라이코펜 생합성을 통해 확인하였다.
라이코펜 생합성 과정에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있는 dxs 와 ipi 유전자의 RBS (Ribosome binding sequence) 부분을 바꾸기 위해 dxs 와 ipi의 MAGE 올리고뉴클레오티드들(서열번호: 30 및 31)을 제작하였다.
구체적으로, 플라스미드 pRED-1로 형질전환된 대장균 MG1655 균주를 LB-클로람페니콜 배지에서 30 ℃ 조건으로 밤새 성장시킨 배양물을 3 ml의 새 LB에 1:100의 중량비로 희석하고, 30 ℃에서 OD600이 0.5가 될 때까지 성장시켰다. 세포를 42℃에서 15 분간 배양하여 λ 단백질의 발현을 유도하고 즉시 4℃로 냉각시켰다. 0.5 OD600에서 1 mL의 배양액을 4 ℃에서 원심분리하여 세포를 수거하고, 4℃의 멸균된 증류수를 이용하여 2회 세척한 후 일렉트로컴피턴트(electrocompetent) 세포로 만들고, 각각 0.25 μM의 dxs 와 ipi MAGE 올리고뉴클레오티드 혼합물로 형질전환시키고, MAGE를 위해 1 mL의 1/2농도의 NaCl을 가진 LB 중에서 회수하였다. 세포를 다음 회차의 MAGE를 위해 새 LB에 재접종하거나 또는 목적 재조합체를 선별하기 전에 3시간동안 성장시켰다. 이와 같은 MAGE를 18회 반복하여 지놈 다양성을 가지는 대장균 라이브러리를 제작하였다.
제작된 대장균 라이브러리를 3ml 의 LB 배지에 1:100의 중량비로 희석하고 30℃에서 0.5 OD600이 될 때까지 성장시켰다. 배양된 균주를 즉시 4℃로 냉각시킨 후 1ml의 배양액을 4 ℃에서 원심분리하여 세포를 수거하였다. 세포를 4℃의 멸균된 증류수를 이용하여 2회 세척한 후 일렉트로컴피턴트(electrocompetent) 세포로 만들고, pINZ-LYC04 플라스미드로 형질전환한 후 SOC 배지를 이용하여 회수하였다. 세포를 30℃에서 1시간동안 배양하고 SOC 배지에서 1000배 희석한 후, 50ug/ml 농도의 카나마이신 항생제를 함유한 LB 고체배지에 100ul 씩 도말하였다. 세포를 30℃에서 18시간 배양한 후 1주일동안 실온보관하면서 콜로니 발색을 이용하여 라이코펜 생합성을 관찰하였다.
MAGE 효율은 dxs 유전자의 RBS 부분 증폭용인 서열번호 22 및 23의 프라이머들과 ipi 유전자의 RBS 부분 증폭용인 서열번호 24 및 25의 프라이머들을 이용하여 형질전환체의 dxs 와 ipi 유전자의 RBS 부분들을 각각 PCR로 증폭시킨 후 염기서열을 분석하여 확인하였다.
그 결과, 무작위로 선별된 24개의 콜로니 중 13개에서 dxs 와 ipi 유전자 모두의 RBS가 변화되었고, 1개는 dxs만, 4개는 ipi만 변화되었음을 확인하였다. 배지에서 강한 붉은색을 보이는 콜로니는 라이코펜 생합성의 증가를 보여준다. 대장균 지놈 상의 dxs나 ipi 유전자의 RBS 염기서열이 변화된 경우 생성된 콜로니의 색이 변화됨을 볼 수 있었다(도 7). 이러한 결과는 야생형 대장균에서 광범위한 유전자 다양성을 지닌 라이브러리 제작에 본 발명의 지놈 엔지니어링용 플라스미드 및 지놈 엔지니어링 방법이 유용하게 이용될 수 있다는 것을 보여준다.
<110> UNIST Academy-Industry Research Corporation <120> Plasmids for Genome Engineering of E. coli and Method for Engineering Genome of E. coli Using Same <130> FPD/201408-0016 <160> 31 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer mutS F <400> 1 gagagatcta gcgagcaatc atcgacaca 29 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer mutS R <400> 2 ttcagatcta actaccggat ggcgacctt 29 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer R6KF <400> 3 acggctgaca tactagtgcc gcaaatcgct gaatattcct 40 <210> 4 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer RP4R <400> 4 ccaagccaac cagcatatgg gcagatgaaa acggtgtaaa aaagat 46 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer RP4F <400> 5 gcccatatgc tggttggctt ggtttcatca g 31 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer R6KR <400> 6 ggcactagta tgtcagccgt taagtgttcc tgt 33 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer P1F2 <400> 7 atggatatcg tgtaggctgg agctgcttc 29 <210> 8 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer P4R2 <400> 8 ggaacttcga actcgaggtc gacggacgtc cggaattaat tctcatgttt gacagcgatc 60 ggtg 64 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer lacZF1 <400> 9 gcaactcgag ttaacgccgt gcgctgttcg 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer lacZR1 <400> 10 tccggacgtc tggaaaaact gctgctggtg 30 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pKD13R <400> 11 atgaatgtca gctactgggc tatc 24 <210> 12 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer lacZF <400> 12 ttaattctca tgtttgacag ttaacgccgt gcgctgttcg c 41 <210> 13 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer lacZF2 <400> 13 gatagcccag tagctgacat tcatctggtt ggcttggttt catc 44 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer lacZR2 <400> 14 ttaactcgag ttatgtcagc cgttaagtgt tc 32 <210> 15 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ptaclacZF <400> 15 caatttcaca caggagatat catatgacca tgattacgga ttcac 45 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer P4R <400> 16 ctgtcaaaca tgagaattaa 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer mutS_seqF <400> 17 gcactaatcc tgcggaactg 20 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Cm_R <400> 18 ccgttttcac catgggcaaa tattatacg 29 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pKD13F <400> 19 ccggggtcag caccgtttct gcgg 24 <210> 20 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pKD13-ori101 F <400> 20 gatagcccag tagctgacat tcattcagat ccttccgtat ttagcc 46 <210> 21 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pKD13-ori101 R <400> 21 ccgcagaaac ggtgctgacc ccggtcatga ccaaaatccc ttaacg 46 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer dxs seqF <400> 22 accagcaact tggtaaaagt acc 23 <210> 23 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer dxs seqR <400> 23 cgattttgtc gcggcg 16 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ipi seqF <400> 24 ctctctattc ctgtcatttc tgactg 26 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ipi seqR <400> 25 caggaggcgt aatttccacg 20 <210> 26 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Trc F <400> 26 gagctgaatt cgatctggtt tgacagctta tcatcga 37 <210> 27 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer crtE F <400> 27 gagctgaatt caattctcat gtttgacagc ttatcatc 38 <210> 28 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer crtB R <400> 28 gcagtcgacc taaacgggac gctgccaaag acc 33 <210> 29 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide lacZ-MAGE <220> <221> terminator <222> (44)..(46) <400> 29 ggaaacagct atgaccatga ttacggattc actggccgtc gtttgacaac gtcgtgactg 60 ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg 90 <210> 30 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide dxs MAGE <400> 30 gcggactaca tcatccagcg taataaataa acaataagta ttnnnnngcc cctgatgagt 60 tttgatattg ccaaataccc gaccctggca 90 <210> 31 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ipi MAGE <400> 31 ttcactcttc aattatctat aatgatgagt gatcagaatt acnnnnnaga aattatgcaa 60 acggaacacg tcattttatt gaatgcacag 90

Claims (18)

  1. 복제 기점(ori) 서열; 파지 람다(λ)의 레드(Red) 리콤비네이즈를 코딩하는 exo, β, 및 γ 유전자; mutS 유전자 단편; 항생제 내성 유전자; 및 c1 억제자(repressor)를 포함하는, 대장균 지놈 엔지니어링용 플라스미드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 복제 기점 서열이 pSC101 repA ts 복제 기점, 또는 R6K 복제기점 서열인 것을 특징으로 하는 플라스미드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항생제 내성 유전자가 카나마이신 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 또는 스트렙토마이신 내성 유전자인 것을 특징으로 하는 플라스미드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 mutS 유전자 단편이 300 내지 1,000 bp 크기인 것을 특징으로 하는 플라스미드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 플라스미드가 도 2a 또는 도 2b의 개열지도를 갖는 플라스미드인 것을 특징으로 하는 플라스미드.
  6. 복제 기점(ori) 서열; lacZ 유전자 단편; 항생제 내성 유전자; FRT(FLP recognition site) 부위, 및 다중 클로닝 부위(MCS)를 포함하는, 대장균 지놈에 이종 유전자를 통합시키기 위한 플라스미드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 복제 기점 서열이 pSC101 repA ts 복제 기점, 또는 R6K 복제기점 서열인 것을 특징으로 하는 플라스미드.
  8. 제6항에 있어서, 상기 lacZ 유전자 단편이 300 내지 1,000 bp 크기인 것을 특징으로 하는 플라스미드.
  9. 제6항에 있어서, 상기 항생제 내성 유전자가 카나마이신 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 또는 스트렙토마이신 내성 유전자인 것을 특징으로 하는 플라스미드.
  10. 제6항에 있어서, 상기 플라스미드가 도 3a 또는 도 3b의 개열지도를 갖는 플라스미드인 것을 특징으로 하는 플라스미드.
  11. 제1항의 플라스미드로 형질전환된 대장균.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 대장균이 복제 기점(ori) 서열, lacZ 유전자 단편, 항생제 내성 유전자, FRT(FLP recognition site) 부위 및 다중 클로닝 부위(MCS)를 포함하는 플라스미드의 다중 클로닝 부위에 이종 유전자를 삽입시킨 플라스미드로 추가로 형질전환된 것을 특징으로 하는 대장균.
  13. 하기 단계를 포함하는, 야생형 대장균의 지놈 엔지니어링 방법:
    1) 복제 기점(ori) 서열; 파지 람다(λ)의 레드(Red) 리콤비네이즈를 코딩하는 exo, β, 및 γ 유전자; mutS 유전자 단편; 항생제 내성 유전자; 및 c1 억제자를 포함하는, 대장균 지놈 엔지니어링용 플라스미드를 제조하는 단계;
    2) 상기 플라스미드를 야생형 대장균에 도입시켜 mutS 유전자의 상동 재조합에 의해 지놈에 통합시키는 단계; 및
    3) 다중 자동화 지놈 엔지니어링(multiplex automated genome engineering; MAGE)에 의해 재조합 대장균의 지놈 엔지니어링을 수행하는 단계.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 단계 2)에서, 복제 기점(ori) 서열, lacZ 유전자 단편, 항생제 내성 유전자, FRT(FLP recognition site) 부위, 및 다중 클로닝 부위(MCS)를 포함하는 플라스미드의 다중 클로닝 부위에 이종 유전자가 삽입된 플라스미드를, 상기 대장균 지놈 엔지니어링용 플라스미드와 동시에 또는 순차적으로 대장균에 도입시켜 지놈에 통합시키는 공정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 단계 3)에서 다중 자동화 지놈 엔지니어링이 서열번호: 22의 올리고머를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 단계 3)에서 지놈 엔지니어링을 수행한 후, 재조합 대장균 지놈에서 통합된 플라스미드를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 통합된 플라스미드의 제거 단계가 재조합 대장균들을 계대배양 함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 계대배양이 항생물질을 포함하지 않는 배지를 이용하여 30 내지 37 ℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020140101760A 2013-08-14 2014-08-07 대장균의 지놈 엔지니어링용 플라스미드 및 이를 이용한 대장균의 지놈 엔지니어링 방법 KR101804145B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130096943 2013-08-14
KR20130096943 2013-08-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150020075A true KR20150020075A (ko) 2015-02-25
KR101804145B1 KR101804145B1 (ko) 2017-12-04

Family

ID=52579018

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140101760A KR101804145B1 (ko) 2013-08-14 2014-08-07 대장균의 지놈 엔지니어링용 플라스미드 및 이를 이용한 대장균의 지놈 엔지니어링 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101804145B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160116535A (ko) * 2015-03-30 2016-10-10 울산과학기술원 tetA 유전자를 이용한 이중선별에 의한 대장균의 지놈 엔지니어링 방법
KR20190062477A (ko) * 2016-10-03 2019-06-05 에이비-바이오틱스 에세.아. 소독제-내성 락트산 박테리아

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7674621B2 (en) * 2004-05-21 2010-03-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Plasmids and phages for homologous recombination and methods of use

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160116535A (ko) * 2015-03-30 2016-10-10 울산과학기술원 tetA 유전자를 이용한 이중선별에 의한 대장균의 지놈 엔지니어링 방법
KR20190062477A (ko) * 2016-10-03 2019-06-05 에이비-바이오틱스 에세.아. 소독제-내성 락트산 박테리아

Also Published As

Publication number Publication date
KR101804145B1 (ko) 2017-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7187435B2 (ja) ゲノム編集
US11639511B2 (en) CRISPR enabled multiplexed genome engineering
Guo et al. A rapid and versatile tool for genomic engineering in Lactococcus lactis
Bloor et al. An efficient method of selectable marker gene excision by Xer recombination for gene replacement in bacterial chromosomes
Fels et al. Bacterial genetic engineering by means of recombineering for reverse genetics
Carr et al. Engineering the genome of Thermus thermophilus using a counterselectable marker
WO2008040387A1 (en) Process for chromosomal integration and dna sequence replacement in clostridia
JP2007020583A (ja) 操作された組換え部位を使用する組換えクローニング
US20220290120A1 (en) Plasmids for gene editing
US20100055669A1 (en) Generation of Recombinant Genes in Bacteriophages
KR101804145B1 (ko) 대장균의 지놈 엔지니어링용 플라스미드 및 이를 이용한 대장균의 지놈 엔지니어링 방법
Synefiaridou et al. Harnessing CRISPR-Cas9 for genome editing in Streptococcus pneumoniae D39V
US20090305421A1 (en) Recombinant vector for deleting specific regions of chromosome and method for deleting specific chromosomal regions of chromosome in the microorganism using the same
Gorshkova et al. Mu-driven transposition of recombinant mini-Mu unit DNA in the Corynebacterium glutamicum chromosome
Riedl et al. Novel conditional plasmids regulated by chemical switches provide versatile tools for genetic engineering in Escherichia coli
Bubnov et al. Excision of selectable markers from the Escherichia coli genome without counterselection using an optimized λRed recombineering procedure
KR102226714B1 (ko) tetA 유전자를 이용한 이중선별에 의한 대장균의 지놈 엔지니어링 방법
Sung et al. Escherichia coli Genome Engineering and Minimization forthe Construction of a Bioengine
Schwarz et al. New tools for the genetic modification of industrial Clostridia
Porter Conjugation
Lobanova et al. Genome engineering of the Corynebacterium glutamicum chromosome by the Dual-In/Out strategy
Synefiaridou et al. Harnessing CRISPR-Cas9 for genome editing in Streptococcus pneumoniae
WO2023156585A1 (en) Systems, tools, and methods for engineering bacteria
Näsvall Direct and Inverted Repeat stimulated excision
Kolisnychenko Genome engineering in Escherichia coli: methods and applications

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
N231 Notification of change of applicant
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant