CN117821309A - 一株鼠李糖乳杆菌Lr-HS56及其用于女性私密制品的应用 - Google Patents

一株鼠李糖乳杆菌Lr-HS56及其用于女性私密制品的应用 Download PDF

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CN117821309A CN202311809405.5A CN202311809405A CN117821309A CN 117821309 A CN117821309 A CN 117821309A CN 202311809405 A CN202311809405 A CN 202311809405A CN 117821309 A CN117821309 A CN 117821309A
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朱丽华
张俊
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Shanghai Huayukang Biotechnology Co ltd
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Shanghai Huayukang Biotechnology Co ltd
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Abstract

本申请公开了从婴儿粪便中筛选得到一株具有显著改善女性私密功效的鼠李糖乳杆菌Lr‑HS56，其可有效调节阴道菌群平衡，防治阴道炎，此外，还有意想不到的防治子宫内膜炎的作用。

Description

一株鼠李糖乳杆菌Lr-HS56及其用于女性私密制品的应用
技术领域
本申请涉及干鼠李糖乳杆菌技术领域，尤其涉及一株鼠李糖乳杆菌Lr-HS56及其用于女性私密制品的应用。
背景技术
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)是目前研究最深入和应用最广泛的益生菌之一，被广泛应用在乳制品、食品添加剂等领域。高纯度的鼠李糖乳杆菌对过敏体质有良好的缓解作用，在医药领域也有广泛的应用和研究价值。试验结果表明，鼠李糖乳杆菌在肠内长久定殖和生存，能够有效预防由细胞因子所引起的胃肠道疾病，不会对人体产生不良反应和副作用。此外，鼠李糖乳杆菌还具有一些自身的优势，比如，耐胆汁、耐胃酸并且可寄存于机体的肠内，终极产品(如鲜奶)保质期内的活菌数可以维持在一定范围内等，其在调节肠道功能、降低胆固醇、增强免疫力、预防儿童营养不良、预防和治疗结直肠癌、缓解抑郁焦虑情绪等方面都表现出良好的益生性能。因此，鼠李糖乳杆菌相关产品的种类不断增多，其功效也备受关注。
本发明旨在提供一株鼠李糖乳杆菌Lr-HS56及其用于女性私密制品的应用。
发明内容
有鉴于此，本申请实施例的目的在于拓宽对鼠李糖乳杆菌的研究认知，以提供其在多领域的应用，甚至提供株经筛选得到的鼠李糖乳杆菌Lr-HS56及其用于女性私密制品的应用。
第一方面，本申请实施例公开了一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)Lr-HS56及其应用，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M 20221995，分类命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus caseiLr-HS56，保藏日期为2022年12月23，保藏地址为中国武汉武汉大学。
第二方面，本申请实施例公开了所述的鼠李糖乳杆菌Lr-HS56在制备女性私密用品中的应用。
第三方面，本申请实施例公开了所述的鼠李糖乳杆菌Lr-HS56的菌粉的制备方法。
第四方面，本申请实施例公开了所述的鼠李糖乳杆菌Lr-HS56的发酵产品的制备方法。
所述制备方法如下：
S1、制备种子悬液，将在-20℃下保藏的鼠李糖乳杆菌Lr-HS56的甘油管融化，取1mL接种到55～110mL含有蛋白陈10g/L，牛肉膏10g/L酵母粉5g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸三2g/L，乙酸钠5g/L，吐温-801mL/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸0.05g/L，单独分装灭菌的葡萄糖20g/L，pH＝6.5，110℃下灭菌30min的MRS液体培养基中，于32～35℃下静置培养15～20h，培养完成后，用无菌生理水离心洗涤3次，再用无菌水将菌悬液调至适宜浓度备用；
S2、获得发酵液，所述发酵液是将所述种子悬液转接至所述发酵培养液中，发酵培养液由50g/L脱脂乳粉、8g/L大豆分离蛋白、20g/L葡萄糖、8g/L牛肉膏、23g/L NaCl、2g/LMgSO4·7H2O、1g/L司盘S-80、调节pH＝5.80，在121℃灭菌下30min制得，将步骤S1得到的种子悬液转接至发酵培养液中于32～35℃，100～120rpm搅拌条件下通气发酵，发酵48～72h即可得到发酵液，其中空气量与罐容积之比为1:0.5～1(v/v.m)；
S3、离心收集，收集发酵完成的发酵液30ml置于无菌的50ml离心管中进行离心，离心条件为3000r/min、20min、4℃，3 000r/min、20min、4℃,5000r/min、20min、4℃，5000r/min、20min、4℃，离心完成后弃去上清液，收集菌泥；
S4、冻干菌悬液的制备，收集离心的菌体，加入由奶粉20％,海藻糖10％,甘油2％,低聚木糖5％和超纯水配制好的菌泥保护剂涡旋混匀,加入的保护剂体积为离心前培养液的1/5，得到冻干菌悬液,室温放置1h，使保护剂和菌体充分融合；
S5、真空冷冻干燥，于-80℃冰箱预冻5h，使得冻干菌悬液冻成固体，取出后立即放入冷冻干燥机中，避免因温度突然上升而致菌体受损，将样品置于冷冻干燥机中持续冻干24h，即可获得鼠李糖乳杆菌Lr-HS56菌粉；开始冻干前冷冻干燥机要预先开启，使冷阱温度降至-65℃，工作时真空度降至1000Pa。
本申请实施例中，步骤S4加入的保护剂体积为离心前培养液的1/5。
本发明的鼠李糖乳杆菌Lr-HS56筛选自婴儿粪便。
与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
本申请从婴儿粪便中筛选得到一株具有显著改善女性私密功效的鼠李糖乳杆菌Lr-HS56，其可有效调节阴道菌群平衡，防治阴道炎和子宫内膜炎。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为小鼠血清中炎症因子IL-6水平。
图2为小鼠血清中炎症因子IL-10水平。
图3为小鼠血清中炎症因子IL-8水平。
图4为小鼠血清中炎症因子IL-1β水平。
图5为小鼠血清中炎症因子TNF-α水平。
图6为鼠李糖乳杆菌Lr-HS56的光学显微镜图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
实施例1鼠李糖乳杆菌Lr-HS56的筛选和鉴定
申请人从婴儿粪便中进行了大量筛选，筛选得到了一株调节阴道菌群平衡，防治阴道炎的鼠李糖乳杆菌，其中命名为鼠李糖乳杆菌Lr-HS56。
鼠李糖乳杆菌Lr-HS56的鉴定
依据《伯杰氏细菌鉴定手册》与《常见细菌系统鉴定手册》对菌株Lr-HS56进行生理生化相应指标测定，具体结果见表1所示，参考菌种鉴定手册可知菌株Lr-HS56满足乳杆菌属细菌特征，可以初步确定其为乳杆菌属细菌。
表1菌株Lr-HS56的生理生化特性鉴定结果
由此，确定上述筛选的鼠李糖乳杆菌Lr-HS56进行分析和鉴定。乳酸菌分离培养基(MRS培养基):牛肉膏10g，蛋白10g，乙酸5g磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢2g，七水硫酸镁0.58g，四水硫酸0.25g，葡20g吐温-801mL，蒸馏水1L，pH 6.2-6.4，115℃、20min灭菌备用，固体培养基另加.5-2％的琼脂。
TE缓冲液配制：取pH＝8.0浓度为1M的Tris-HCl Buffer溶液5ml，再取pH＝8.0浓度为0.5M的EDTA溶液1ml，置于烧杯中向烧杯中加入约400ml去离子水均匀混合，然后转移到容量瓶中将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存.。
将鼠李糖乳杆菌Lr-HS56菌株以1％的接种量接种于MRS培养基中,37C过夜培养12h后取5ml菌液9000pm离心2in后弃上清得菌体，利用TE缓冲液再离心洗涤两次后，利用OMEGA公司的细菌基因组提取试剂盒提取目标菌株的基因组。
16SrDNA基因的PCR扩增和序列测定采用原核生物16SrDNA扩增的通用引物，正向引物:fD1 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物:rP1 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。
PCR反应体系包括:10x PCR buffer，5pL；10mmol/L MgCl2，3μL；2.0μmol/L dNTP，4μL；10mol/L fD1,3μL；10mol/L rP1,3μL；1.0mol/L DNA模板，1μL，5U/μL TagTM DNA聚合酶(TaKaRa),1μL；ddH2O,30L；总反应体系一共是50pL。PCR扩增得到的目的片段连接到T载体转化大肠杆菌DH5a，然后挑取转化子送上海生工生物工程股份有限公司测序，将所得到的16SrDNA基因序列在基因库中进行同源性搜索比对。结果发现，本申请实施例筛选得到的鼠李糖乳杆菌与鼠李糖乳杆菌Lactobacillus Rhamnosus ATCC 53103有99.5％的同源性，因而命名为鼠李糖乳杆菌Lr-HS56，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M20221995，分类命名为鼠李糖乳杆菌Lr-HS56，保藏日期为2022年12月23，保藏地址为中国武汉武汉大学。
实施例2菌液制备
鼠李糖乳杆菌Lr-HS56菌液的制备：将鼠李糖乳杆菌Lr-HG35发酵液接种入50～100mL含有蛋白陈10g/L，牛肉膏10g/L酵母粉5g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸三2g/L，乙酸钠5g/L，吐温-80 1mL/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸0.05g/L，单独分装灭菌的葡萄糖20/L，pH＝6.5，121℃下灭菌20min的MRS液体培养基中，在30～35℃下培养至菌液浓度为109cfu/mL，即可得到鼠李糖乳杆菌Lr-HG35菌液。
鼠李糖乳杆菌Lr-HS56灭活菌液的制备：将制得的鼠李糖乳杆菌Lr-HG35菌液在60℃下加热1h进行灭活，得到浓度为109cfu/mL的鼠李糖乳杆菌Lr-HG35灭活菌液。
鼠李糖乳杆菌Lr(鼠李糖杆菌ATCC 53103，购自上海暄科生物科技有限公司)菌液的制备：将鼠李糖乳杆菌Lr发酵液接种入50～100mL含有蛋白陈10g/L，牛肉膏10g/L酵母粉5g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸三2g/L，乙酸钠5g/L，吐温-80 1mL/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸0.05g/L，单独分装灭菌的葡萄糖20/L，pH＝6.5，121℃下灭菌20min的MRS液体培养基中，在30～35℃下培养至菌液浓度为109cfu/mL，即可得到鼠李糖乳杆菌Lr菌液。
实施例3防治阴道炎效果检测
念珠菌复苏及活化：采用直接划线接种法，用接种环挑取念珠菌，涂抹到哥伦比亚血平板培养基上，将涂布完成的培养皿置于温度为37℃，湿度>90％的，微需氧环境下(5％O2，10％CO2，85％N2)培养72小时，连续传代两次。将活化后的HP接种于含有10％胎牛血清的BHI培养基中，在37℃下，微需氧环境(5％O2，10％CO2，85％N2)培养96h，PBS洗涤后调整细菌浓度至109cfu/mL的浓度，分装于eppdorf管备用，得到念珠菌菌液。
实验动物：
SPF级健康昆明雌性小鼠25只，6-7周龄，25-28克/只，性成熟，未交配，分5笼饲养，每笼5只，适应性饲养一周，饲养湿度为32～37％，温度为20～25℃，在自然光下自由摄食饮水。正常饲养一周之后，所有实验小鼠进行阴道分泌物湿片和革兰氏染色干片镜检，清洁度Ⅰ-Ⅱ度，镜下未检测到致病微生物，BV-Nugent革兰染色细菌评分<4分，经评估25只实验小鼠均符合实验标准。
将25只实验小鼠进行药物假动情处理，具体方法为：背部皮下注射苯甲酸雌二醇注射液(1mL:1mg)0.5mL/10g，隔日1次，连续6天，共3次。第6天观察到小鼠阴道口较假动情前明显扩张，用无菌医用棉签轻触外阴时小鼠呈静止不动、头低脚高、臀部抬高的动情姿势，可进行下一步造模。
将小鼠随机分为5组，分别为空白对照组、模型组、Lr-HS56组、Lr组、Lr-HS56灭活组，每组5只。空白对照组正常饲养，不做任何处理。模型组、实施例Lr-HS56组、对比例Lr组、Lr-HS56灭活组进行阴道预处理，各组小鼠每天上午喂食后2小时，采用单手手持固定小鼠，使小鼠呈头低脚高位，保持不动，充分暴露阴道口，采用无菌5号头皮硅胶管吸取常温无菌PBS液(pH＝7.4)0.5mL，插入小鼠阴道1～1.5cm处，充分灌洗，每天1次，每次灌洗2～3mmin，持续3天。阴道预处理完成后进行菌液灌注，模型组、Lr-HS56组、对比例Lr组、Lr-HS56灭活组，在当日上午喂食后2小时进行念珠菌菌液灌注，小鼠单手手持固定为头低脚高位，暴露阴道口，无菌棉签蘸取少许75％酒精常规进行外阴消毒，采用无菌5号头皮硅胶管吸取念珠菌菌液0.25ml，缓慢插入至小鼠阴道约1～1.5cm处停下，将菌液推入小鼠阴道后，缓缓将头皮硅胶管向外撤出，用无菌镊子钳夹蘸有念珠菌菌液的无菌医用小棉球堵住阴道口，呈头低脚高位保持至少2～3mmin，1次/日，重复上述操作6天。进行通过观察小鼠外阴阴道有无红肿、分泌物等症状，及分泌物进行真菌镜检、念珠菌显色培养基培养检测是否感染成功。
6天后停止道菌液移植1天。然后Lr-HS56组、Lr组、Lr-HS56灭活组将念珠菌菌液分别替换为鼠李糖乳杆菌Lr-HS56菌液、鼠李糖乳杆菌Lr菌液和鼠李糖乳杆菌Lr-HS56灭活菌液，重复上述操作灌注一周进行治疗。一周停止阴道菌液移植1天。于造模第8天在动物手术室内处死，眼球取血，至取得眼球血0.5～1mL待用。小鼠血清离心后1.0L无菌EP管分装标记，置于-80℃冻存，用于行ELISA检测。
标本的检测:
(1)ELISA试剂盒进行室温平衡30分钟。板条室温平衡60分钟。同时从-80℃冰箱取出灌洗液，待灌洗液溶解后，1500rpm离心20分钟，取上清检测。
(2)按照说明书稀释标准品，蒸馏水将洗涤液稀释30倍。
(3)标准品孔加入:标准品50μL、链霉素-HRP50μL；待测样品孔加入：样本50μL、抗-TNF-α抗体10μL、链酶亲和素-HRP50μL，盖好封板膜，轻晃混匀37℃温育1小时。
(4)打开封板膜，将孔内残余液体甩掉，甩干后向孔内再滴满洗涤液，大约半分钟后倒掉，重复5次，最后将空内液体甩掉，直至甩干。
(5)先后加入A、B显色剂各50μL，反应10分钟。
(6)每孔加终止液50μL。
(7)测量各孔的吸光度(OD值)。
(8)根据OD值计算出对应的样品浓度。
实验结果
表1各组小鼠阴道外观情况
根据表1中模型组小鼠阴道外观情况可知造模成功，经鼠李糖杆菌Lr-HS56治疗后基本可以回复至正常状态，鼠李糖杆菌Lr-HS56灭活菌也有一定治疗效果，根据鼠李糖杆菌Lr组可知治疗效果欠佳。
从图1和图2中可以看出，在注射念珠菌菌液后，模型组IL-6和IL-10的表达水平明显升高，说明在注射念珠菌菌液后，小鼠阴道内有炎症反应。Lr-HS56组的小鼠在给药7日后，小鼠的IL-6和IL-10的表达水平与正常小鼠一致，说明本发明筛选的鼠李糖杆菌Lr-HS56治好了小鼠体内的炎症。而Lr-HS56灭活组的IL-6和IL-10的表达水平也明显降低，说明鼠李糖杆菌Lr-HS56灭活菌也有一定治疗效果。Lr组的IL-6和IL-10水平较另外两组要高，说明普通的鼠李糖乳杆菌虽然对阴道炎也有效，但是效果与本发明相比差很多。
实施例4防治子宫内膜炎效果检测
实验动物：
SPF级健康昆明雌性小鼠75只，6-7周龄，25-28克/只，性成熟，未交配，分5笼饲养，每笼15只，适应性饲养一周，饲养湿度为32～37％，温度为20～25℃，在自然光下自由摄食饮水。正常饲养一周之后，所有实验小鼠进行阴道分泌物湿片和革兰氏染色干片镜检，清洁度Ⅰ-Ⅱ度，镜下未检测到致病微生物，BV-Nugent革兰染色细菌评分<4分，经评估25只实验小鼠均符合实验标准。
分组:雌性小鼠随机分为五组:空白对照组、子宫内膜炎模型组、子宫内膜炎抗生素治疗组、子宫内膜炎鼠李糖杆菌Lr-HS56活菌治疗组、子宫内膜炎鼠李糖杆菌Lr治疗组、子宫内膜炎鼠李糖杆菌Lr-HS56灭活菌治疗组，每组15只。
建立子宫内膜炎动物模型:将合抗生素氨苄西林(1g/L)、万古霉素(0.5g/L)、新霉素(1g1 g/L)、甲硝唑(1g/L)加入饮用水中，抗生素饮水24h，并用灭菌生理盐水擦洗阴道，异氟烷吸入麻醉后，除空白对照组外，其余各组进行单次子宫内注射20μL，1x 103CFU/L，CE常见病原菌混合溶液(大肠杆菌:乙型溶血性链球菌:金黄色葡萄球菌＝2:1:1)，建立慢性子宫内膜炎雌鼠模型，空白对照组麻醉后给予子宫内注射无菌PBS20μL，连续观察小鼠造模情况(预计21天)，每隔7天随机抽取2只雌鼠，麻醉后辅以脱颈椎处死解剖取子宫组织观察造模情况。正常雌鼠子宫呈粉红色“Y”字型，两侧子宫体对称。子宫内膜炎雌鼠，子宫组织充血、水肿，两侧子宫体出现缩短。
造模成功后空白对照组及子宫内膜炎模型组:阴道置入用10μL PBS浸润的明胶海绵，连续1周。抗生素治疗组:阴道置入用10μL甲硝唑溶液浸润的明胶海绵(30mg/mL)，连续1周。子宫内膜炎鼠李糖杆菌Lr-HS56活菌治疗组:阴道置入用10μL子宫内膜炎鼠李糖杆菌Lr-HS56菌液润的明胶海绵(1x 107CFU/mL)，连续1周。子宫内膜炎鼠李糖杆菌Lr治疗组：阴道置入用10μL子宫内膜炎鼠李糖杆菌Lr菌液润的明胶海绵(1x 107CFU/mL)。子宫内膜炎鼠李糖杆菌Lr-HS56灭活菌治疗组:阴道置入用10μL子宫内膜炎鼠李糖杆菌Lr-HS56菌灭活菌液润的明胶海绵(1x 107CFU/mL)，连续1周。治疗结束后，每组预留4只雌鼠，收集雌鼠子宫组织进行病理学检查，评价治疗效果。
收集雌鼠子宫组织：异氟烷麻醉后处死小鼠，立即打开腹腔，收集雌鼠子宫样本，用PBS冲洗并清除周围脂肪及结缔组织，通过HE染色镜下观察子宫内膜细胞、腺体形态数量，炎性细胞浸润情况及子宫内膜形态。通过q-PCR，检测:IL-8、IL-1β、TNF-α表达水平。
图3-5中q-PCR结果显示与空白对照组相比模型组子宫内膜组织中促炎因子IL-8、IL-1β、TNF-α水平显著增高，干预后，Lr-HS56活菌组和Lr-HS56灭活组炎症因子表达水平显著下降，两组之间没有显著性差异，而Lr-HS56活菌组炎症因子水平下降至与C组接近。阴道炎的发病机制主要涉及细菌感染、真菌感染、寄生虫感染，而子宫内膜炎的发病机制主要涉及细菌感染、免疫失调和生理因素等，这两者发病机制并不是完全相同。上述结果说明鼠李糖杆菌Lr-HS56在活菌或灭活菌状态下均具有意想不到的防治子宫内膜炎的作用。
综上所述，本申请从婴儿粪便中中筛选得到一株鼠李糖乳杆菌Lr-HS56，其具有强效抗阴道炎效果，且活菌和灭活状态下都有用，同时，还具有意想不到的防止子宫内膜炎的作用，具有广泛的药用或保健用产品应用前景。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (7)

1.一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)Lr-HS56，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M 20221995，分类命名为鼠李糖乳杆菌Lr-HS56，保藏日期为2022年12月23，保藏地址为中国武汉武汉大学。
2.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌Lr-HS56在制备女性私密用品中的应用。
3.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌Lr-HS56制备得到的菌粉。
4.根据权利要求3所述的菌粉，其是活菌或者灭活状态。
5.权利要求3所述菌粉的制备方法，其步骤如下：
S1、制备种子悬液，将在-20℃下保藏的鼠李糖乳杆菌Lr-HS56的甘油管融化，取1mL接种到55～110mL含有蛋白陈10g/L，牛肉膏10g/L酵母粉5g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸三2g/L，乙酸钠5g/L，吐温-801mL/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸0.05g/L，单独分装灭菌的葡萄糖20g/L，pH＝6.5，110℃下灭菌30min的MRS液体培养基中，于32～35℃下静置培养15～20h，培养完成后，用无菌生理水离心洗涤3次，再用无菌水将菌悬液调至适宜浓度备用；
S2、获得发酵液，所述发酵液是将所述种子悬液转接至所述发酵培养液中，发酵培养液由50g/L脱脂乳粉、8g/L大豆分离蛋白、20g/L葡萄糖、8g/L牛肉膏、23g/L NaCl、2g/LMgSO4·7H2O、1g/L司盘S-80、调节pH＝5.80，在121℃灭菌下30min制得，将步骤S1得到的种子悬液转接至发酵培养液中于32～35℃，100～120rpm搅拌条件下通气发酵，发酵48～72h即可得到发酵液，其中空气量与罐容积之比为1:0.5～1(v/v.m)；
S3、离心收集，收集发酵完成的发酵液30ml置于无菌的50ml离心管中进行离心，离心条件为3000r/min、20min、4℃，3 000r/min、20min、4℃,5000r/min、20min、4℃，5000r/min、20min、4℃，离心完成后弃去上清液，收集菌泥；
S4、冻干菌悬液的制备，收集离心的菌体，加入由奶粉20％,海藻糖10％,甘油2％,低聚木糖5％和超纯水配制好的菌泥保护剂涡旋混匀,加入的保护剂体积为离心前培养液的1/5，得到冻干菌悬液,室温放置1h，使保护剂和菌体充分融合；
S5、真空冷冻干燥，于-80℃冰箱预冻5h，使得冻干菌悬液冻成固体，取出后立即放入冷冻干燥机中，避免因温度突然上升而致菌体受损，将样品置于冷冻干燥机中持续冻干24h，即可获得鼠李糖乳杆菌Lr-HS56菌粉；开始冻干前冷冻干燥机要预先开启，使冷阱温度降至-65℃，工作时真空度降至1000Pa。
6.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌Lr-HS56在制备益生菌粉片中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述菌粉含有保护剂。
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