CN114015598A - 分离自藏灵菇的乳酸片球菌及其在防治轮状病毒感染中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供分离自藏灵菇的乳酸片球菌及其在防治轮状病毒感染中的应用，分离自藏灵菇的乳酸片球菌被命名为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang，该菌已于2021年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 20211331。该菌耐酸、耐胆盐，对大多数病原菌具有良好的抑制作用，对抗生素敏感、在体内体外实验中均表现出优异的抗轮状病毒的作用。

Description

分离自藏灵菇的乳酸片球菌及其在防治轮状病毒感染中的 应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及分离自藏灵菇的乳酸片球菌及其防治轮状病毒感 染的应用。

背景技术

本发明背景技术中公开的信息旨在增加对本发明总体背景的理解，而该公开不应必然被视 为承认或以任何形式暗示该信息已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

轮状病毒是引起婴幼儿和幼龄动物腹泻的主要病原体之一，全世界每年因感染RV而死亡 的婴幼儿约为21.5万人，其中大多数发生在发展中国家。目前尚无抗RV特效药，接种减毒活 疫苗是防控RV腹泻最经济有效的手段，但在发展中国家由于疫苗接种率较低，使该病在发展 中国家尚未得到控制。益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，可维持机体微生态平衡、调节 免疫反应、减少传染性疾病以及肠道炎症的发生等，因此使用益生菌是临床中预防RV感染的 一个重要方案。近年来已有大量研究证实，益生菌可缩短RV腹泻的持续时间、减少腹泻发病 次数、增强RV弱毒苗的免疫效果等。

猪轮状病毒属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，是仔猪以及其他幼龄哺乳动物胃肠炎的主要病 原之一，猪轮状病毒病也称为轮状病毒性腹泻，是由于感染猪轮状病毒而引起的一种普遍发生 和流行的急性肠道传染病。该病具有较短的潜伏期，通常只有12-24h，传染性强，病死率非常 高。各个年龄段的猪都能够感染发病，其中以哺乳仔猪和断奶前后仔猪多发，主要表现出一系 列的比较严重的胃肠消化道症状，在一定程度上影响生长发育和饲料转化率，严重时会造成死 亡，损害养猪经济效益。猪轮状病毒病是猪感染轮状病毒后发生的一种常见的急性的肠道的传 染性疾病。猪轮状病毒病在全球范围内进行广泛的流行，给世界各国的养猪业带来了严重的损 失。所以，加强对猪轮状病毒病的防范是全球养猪业不可忽视的工作之一。

发明内容

发明人在研究过程中发现，分离自藏灵菇的乳酸菌表现出对轮状病毒的抑制作用，在此基 础上，发明人分离培养获得三株乳酸菌，分别为乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、干酪乳杆 菌(Lactobacillus casei)和副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)，结果发现三株菌均表现出对轮 状病毒的抑制作用，尤以乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的作用更强。该乳酸片球菌具有良 好的生长性能、在常温下能够稳定生长，并且能够耐受至少65℃的高温，利于后期制剂化以及制 剂的工业化生产，并且该菌耐酸、耐胆盐，在低至pH2.5的环境中存活率依然可以超过60％，利 于在动物体内尤其消化道内定植存活进而发挥作用，以及，该菌对大多数病原菌具有良好的抑制作 用，能够防止肠道内病原菌的增殖，保持肠道菌群的稳定性。更为重要的，该菌在体内体外实验中 均表现出优异的抗轮状病毒的作用，不仅能够减少病毒的拷贝数降低病毒的活跃度、而且能够激活 肠道免疫增加肠道SIgA的表达，减少促炎因子的产生，保护肠道绒毛健康，能够有效地发挥对轮 状病毒的防治作用。

具体地，本发明提供了下述的技术特征，以下技术特征的一个或多个的结合构成本发明的 技术方案。

在本发明的第一方面，本发明提供了一株分离自藏灵菇的乳酸片球菌，其命名为乳酸片球 菌(Pediococcus acidilactici)Wang，该菌已于2021年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏地址为：中国武汉武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:M 20211331。

所述乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang分离自藏灵菇。在本发明的实施方式中，本 发明对乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang进行了生化鉴定，该菌为革兰氏染色紫色阳性 球菌，其在七叶苷、麦芽糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、棉子糖、乳糖、1％马尿酸钠、吲哚实验 中呈现阴性结果，在纤维二糖、水杨苷、菊糖和硝酸盐还原试验中呈现阳性结果，且在葡萄糖氧化 /发酵(O/F)试验中为F型。

胃肠道作为动物的一个消化吸收的重要器官，其微生物区系的平衡对维持动物机体的健康起着 重要的作用。益生菌多经口服进入动物机体，必须先经过胃然后到小肠定植，因此，益生菌只有能 够抵抗较强的酸性环境和较高浓度的胆盐才能使其在肠道中存活和正常发挥作用。本发明菌株乳 酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang耐酸、耐胆盐及人工胃肠液耐受性好，可顺利通过胃进入 小肠发挥作用，提高动物机体性能。

乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang具有良好的生长性能，在人工肠液和人工胃液中 具有良好的耐受能力，表明其能够在人工肠液和人工胃液中良好的生存。

在本发明的一些实施方式中，本发明测试了乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)Wang对致病 菌沙门氏菌(salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 的抑制效果，结果乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)Wang对上述三种致病菌均表现出明显的 抑制作用，抑菌圈直径均在10mm以上。

在本发明的实施方式中，乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang表现出对大部分抗生素 的敏感性，比如，在本发明的一些实施方式中，乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)Wang对红 霉素、头孢唑林表现出强敏感性，对对卡那霉素、哌拉西林、多西环素、头孢曲松表现出较强的 敏感性，对多粘菌素B、苯唑西林、头孢氨苄表现出敏感性。

此外，本发明的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang具有良好的耐热性、耐酸以及耐 胆盐的性能。在本发明的一些实施方式中，乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)Wang在常温下 可正常生长，并且在37℃条件下的耐受率超过100％，在65℃的温度下的耐受率依然超过50％。 在本发明的一些实施方式中，乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)Wang在pH2.5的环境下耐受 率超过60％，0.3％胆盐耐受率均超过90％，0.5％胆盐耐受率均在85％以上，1％胆盐耐受率在70％ 以上。这些良好的性能表明乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang具有良好的稳定性、能够 在机体环境内良好的生存，有利于价值化利用。

以及，在本发明的实施方式中，乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang表现出良好的产 酸能力，在一些实施方式中，乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang培养6小时后pH可下 降至4左右。

在本发明的第二方面，本发明提供了乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang在抑制轮状 病毒中的应用。在本发明的实施方式中，乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)Wang在体内、体 外实验中均表现出对轮状病毒的抑制作用。所述轮状病毒尤其为猪轮状病毒。

在本发明的第三方面，本发明提供了乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang在制备轮状 病毒抑制剂中的应用。所述轮状病毒尤其为猪轮状病毒。

在本发明的第四方面，本发明提供了乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang在制备防治 轮状病毒感染的药物、菌剂或饲料中的应用。所述轮状病毒尤其为猪轮状病毒。

在本发明的第五方面，本发明提供了乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang在制备保护 肠道的药物、菌剂或饲料中的应用。在本发明的一些实施方式中，所述保护肠道为保护肠粘膜， 尤其为保护肠绒毛，所述肠绒毛为十二指肠肠绒毛和/或结肠肠绒毛；所述保护肠道肠绒毛包括 保护肠道肠绒毛的完整性和/或增强肠绒毛的长度和/或厚度。

在本发明的第六方面，本发明提供了乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang在制备免疫 治疗剂中的应用。在本发明的一些实施方式中，所述免疫治疗剂为提高肠道免疫力的药物、菌 剂或饲料；比如，在一些实施方式中，所述提高肠道免疫力包括提高SIgA的表达。

具体地，在本发明的实施方式中，本发明测试了乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)Wang 在体内和体外对于轮状病毒的作用情况，其中，以猪上皮细胞进行了体外测试，以小鼠进行了体 内测试。

在体外细胞实验中，乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang表现出优异的抗轮状病毒的 效果，在绝对定量实验中，相较于攻毒实验组，乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)Wang能够 显著减少病毒拷贝数，降低病毒活跃度，并且相较于其他两株分离自藏灵菇的菌株表现出对轮 状病毒的更强的抑制作用。在相对定量实验中，分别对细胞中的Pig-IL18、Pig-IL6、Pig-IFNβ、 Pig-TFNα、Pig-IL1β、Pig-IFNα的表达量进行定量，结果表明，乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici) Wang相较于对照组、抗病毒药物组和攻毒组，能够显著提升IFN-α、IFN-β的表达量，降低IL-18、 IL-6、TFN-α、IL-1β的表达量。

其中，在体内实验中，测血清中IFN-β、IL-6、TNF-α及粪便中的SIgA，结果发现，相较于 对照组、抗病毒药物组和攻毒组，乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang能够显著提升肠道 中SIgA的表达量，增强肠道免疫。根据绝对定量结果，免疫乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici) Wang后，相较于攻毒组能够显著降低轮状病毒的拷贝数，表现出对轮状病毒感染的良好的抵抗 作用。同时，根据病理学检查结果，攻毒组的小鼠十二指肠肠绒毛有所破损，在肠绒毛的顶端 有少量的消融，免疫乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)Wang后肠绒毛较为完整，在肠壁的肌 层比攻毒组的较厚，说明其对小鼠的十二指肠有一定的保护作用。在比较结肠中肠绒毛时，可 以发现，攻毒组的肠绒毛变窄，有断层，而在乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang组中， 肠绒毛变宽、增厚、说明在免疫乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang后，肠绒毛变的更加 的健康，可以有效的增加对食物中能量的吸收。

本发明的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang可以通过刺激肠道内的免疫机能，将过 低或过高的免疫活性调节至正常状态，同时还可以抑制有害病原菌在肠内的繁殖，激活肠道免 疫、保护肠道肠绒毛的完整性和/或增强肠绒毛的长度和/或厚度，促进肠道消化系统的健康。

在本发明的第七方面，本发明提供了一种菌剂，其包含乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici) Wang。所述菌剂中可以包含或不包含乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)Wang的发酵物。或者， 也可以进一步地包含其他益生菌。

所述乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang的发酵物通过发酵乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang获得。在本发明的一些实施方式中，所述乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici) Wang的发酵物可以通过以下方法获取：将乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang接种至培 养基上，静置培养。所述培养基可以为液体培养基，比如MRS培养基。

在本发明的第八方面，本发明提供了一种药物组合物或药物制剂或饲料，其包含乳酸片球 菌(Pediococcus acidilactici)Wang。

在本发明的一些实施方式中，本发明所述药物组合物或药物制剂中包含本发明所述的乳酸 片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang，以及，在此基础上，所述药物组合物或药物制剂还可以 包含至少一种药物载体或药学上可接受的辅料，或者其他治疗有效的试剂。其中，合适的药用 辅料可以是本领域已知的种类，比如溶剂、缓冲剂、稀释剂等等，例如可以是作者PaμL J Sheskey 等人编著的《药用辅料手册》(Handbook of ParmaceuticalExcipients)中所记载的。药物组合物或 药物制剂可以为固体、半固体或者液体形式，其可根据本领域已知的任何常规方法进行制备。所述 饲料中还可以进一步包含粮食类物质、微量元素、蛋白质等。

在本发明的一些实施方式中，所述菌剂可以制备成菌粉，所述菌粉中可以进一步包含冻干保护 剂，所述冻干保护剂的加入量为原料重量的2-95％，优选5-85％，所述冻干保护剂可采用本领域常 规的冻干保护剂，比如脱脂奶粉等。

在本发明的第九方面，本发明提供了一种治疗轮状病毒感染的方法，其包括采用免疫有效 量的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang免疫受试者。

所述“受试者”是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选猪(特别是仔猪)，老鼠， 人。所述“免疫有效量”是指能够引发动物有效免疫的量，在本发明的一些实施方式中，乳酸片 球菌(Pediococcus acidilactici)Wang的免疫浓度为1×10⁹CFU/ml。

相较于现有技术，本发明的优势在于：

乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang从藏灵菇中分离得到，其对人工肠液、人工胃液具 有良好的耐受性，表明其可抵抗较强的酸性环境和较高浓度的胆盐进入到肠道中存活并正常发挥作 用；乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang对致病菌沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌 具有明显的抑制作用，能够抑制有害病原菌在肠内的繁殖，并且对大部分抗生素具有较强的敏 感性，不易产生耐药性，同时具有良好的耐热、耐酸、耐胆盐、产酸的能力；以及，乳酸片球菌 (Pediococcus acidilactici)Wang在体内外均能有效抑制轮状病毒，减少病毒拷贝数，大大降低病 毒的活跃度，其中，在针对猪肠上皮细胞的体外实验中，乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang 能够刺激肠道细胞产生干扰素Pig-IFNβ、Pig-IFNα，并减少促炎因子Pig-IL18、Pig-IL6、Pig-TFNα、 Pig-IL1β的产生；在小鼠的体内实验中，口服免疫乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang能够 有效激活肠道免疫，促进SIgA的表达，并且能够保护肠道绒毛的完整性，增强肠绒毛的长度和厚 度，促进肠道消化系统的健康，有效防治轮状病毒的感染并尽快从轮状病毒感染中恢复。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施 例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发 明的实施方案，其中：

如无特殊说明，图5-9、图13-14、16-17中*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001。

图1：乳酸菌鉴定培养基中显黄色的菌落为乳酸菌。

图2：革兰氏染色图，1-2.为阳性杆菌，3.为阳性球菌。

图3：PCR鉴定结果。

图4：三株菌的生长曲线。

图5：模拟人工肠液和人工胃液耐受情况。

图6：三株菌对致病菌的抑制情况。

图7：三株菌的耐热情况。

图8：三株菌耐酸情况。

图9：三株菌耐胆盐情况。

图10：三株菌产酸曲线。

图11：轮状病毒NSP4基因PCR验证。

图12：绝对定量NSP4基因标准曲线。

图13：体外细胞实验病毒定量。

图14：体外细胞实验中细胞因子、炎性因子相对表达量。

图15：体重变化曲线。

图16：ELISA检测结果。

图17：小鼠肠道病毒定量结果。

图18：小鼠十二指肠和结肠的病理切片；A1-F1是十二指肠，A2-F2是结肠。A：PBS空白组、B：攻毒组、C：抗病毒药物组、D：乳酸片球菌组、E：干酪乳杆菌组、F副干酪乳杆菌 组。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制 造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。 本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂 或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或 均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明所述耐受率是指菌株经过处理后的菌量与未经处理的菌量间的比值，再乘以100％。

实施例1藏灵菇中乳酸菌的筛选

1、材料

藏灵菇(保存于-80℃中)、磷酸盐缓冲液、MRS琼脂平板、厌氧罐、1.5ml离心管、生化发酵 管、PCR酶、引物、去离子水

MRS培养基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫 酸锰0.2g/L、柠檬酸铵2g/L、乙酸钠5g/L、吐温-80 1ml/L，pH值6.0±0.05，121℃灭菌20min。 固体培养基需加1.2％的琼脂。

乳酸菌鉴别培养基：水100ml、牛肉膏1g、蛋白胨1g、酵母膏1g、番茄汁20g、葡萄糖1g、 吐温0.05ml、碳酸钙1.7g、溴甲酚绿0.01g、琼脂1-2g，121℃灭菌20min。

试剂配制

TAE：50*TAE的配制：Tris：242g，Na2EDTA·2H2O：37.2g，向烧杯中加入800ml去离子水， 充分搅拌。然后向其加入57.1ml的醋酸，充分搅拌。加入去离子水定容至1L，用时进行50倍稀 释。

6×Loading Buffer：EDTA：4.4g，Bromophenol Blue：250mg，Xylene Cyanol FF：250mg。向其中加入200买了去离子水，加热充分搅拌，向其加入180ml甘油，使用2M的NaOH调节PH值至7.0。用去离子水定容至500ml。

1％的琼脂糖凝胶配制：称取1g的琼脂糖，向其加入100mlTAE溶液，用微波炉打至澄清后， 待凉后，加入5μL的EB，凝固后，可使用。

2方法

2.1藏灵菇的处理及乳酸菌的分离

藏灵菇为固体发酵集合颗粒，将藏灵菇用新鲜的牛奶激活，37℃，激活好后，取100μL的藏 灵菇发酵乳，使用梯度稀释法，将藏灵菇发酵乳梯度稀释，分别为1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、 10^-6、10^-7、10^-8、10^-9，分别涂布于MRS培养基和乳酸菌鉴别培养基中，置于37℃厌氧培养罐中 18h，待培养基上长出单个菌落后，挑取单个菌落于液体MRS中，经培养，分别进行革兰氏染色 及过氧化氢酶检测，实验都是重复三次。

2.2乳酸菌的鉴定

革兰氏染色方法：在载玻片中加入一滴生理盐水，然后从平板中挑去单个菌落至生理盐水中并 摊平，火焰固定，待载玻片上液体蒸发干后进行染色。首先使用草酸铵结晶紫滴加覆盖，3min， 用流水冲洗，再加入鲁格氏碘液覆盖，2.5min，用流水冲洗，在加入95％的酒精脱色，10s，水洗， 最后使用石炭酸复红滴加覆盖，3min，用吸水纸吸干水分，置于显微镜下观察。

生化鉴定：购买了乳酸菌专用的生化发酵管对分离的乳酸菌进行鉴定，其中包括：七叶苷、纤 维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、菊糖、乳糖。(生化鉴定试剂购自山 东青岛海博生物有限公司)，37℃厌氧培养18h后，观察生化结果，将数据统计分析。同时，将分 离得到的乳酸菌接种于硝酸盐还原试剂中，观察其实验结果。

生化发酵管阴阳性判定结果：

葡萄糖酸盐试验：培养结束后，按体积比1:1向生化管中加入班氏试剂，混匀煮沸10min， 冷却后观察结果，若出现黄色或橙红色沉淀，则为阳性反应；若为蓝色或绿色，则为阴性反应。

氧化/发酵试验：每株菌接种2支生化管，接种后一支加液体石蜡封口，另一支不封口，培养 结束后，二者均变黄为发酵型细菌，不封口者变黄而封口者不变色为氧化型细菌；二者均不变黄者 为产碱型细菌。

硝酸盐还原试验：培养结束后，滴加硝酸盐还原试剂A液和B液各2～3滴，数秒后观察 颜色变化，若变红，则为阳性反应；若不变色，继续加入少量锌粒或锌粉，如仍不变红，则也为阳 性反应，如变红，则为阴性反应。

V-P试验：培养结束后滴加V-P试剂(A液6滴，B液2滴)，混匀后继续培养0.5～4h，4h之内变红则为阳性，不变色或棕黄色为阴性。

靛基质试验(吲哚试验)：培养结束后，需滴加Kovacs试剂2～3滴，摇匀后数秒内观察结 果，如出现玫红色环，则为阳性反应，如不变色(黄色环)则为阴性反应。

氧化酶试验：将氧化酶试纸用少量蒸馏水润湿，用细玻璃棒或塑料接种环挑取单个菌落涂在试 纸上。在30s内变为蓝色或蓝紫色为阳性，2min内不变色为阴性。不可使用铁制接种环或接种针 挑取菌落，否则可能出现假阳性结果。

马尿酸盐水解试验：用接种环挑取大量菌苔接种至生化管，混合均匀置于36±1℃水浴2h或 36±1℃温育4h。培养结束后，沿着试管壁缓缓加入0.2mL茚三酮溶液，不要震荡，在36±1℃的 水浴或培养箱中放置10min后判读结果。如出现深紫色反应，则为阳性；如无颜色变化或淡紫色， 则为阴性反应。3.5％(水合)茚三酮溶液的配制成分：(水合)茚三酮溶液1.75g，丙酮25.0mL， 丁醇25.0mL。制备：将(水合)茚三酮溶解于丙酮/丁醇混合溶液中。该溶液在避光冷藏时不超 过7d。

革兰氏阳性菌基因组DNA的提取：

(1)取细菌培养物1-5ml(10⁶-10⁸个细胞，最多不超过2×10⁹个细胞)置于离心管(自备) 中，12,000rpm(～13,400×g)离心1分钟，尽量吸净上清。

(2)加入180μl Enzymatic Lysis Buffer使菌体重悬。

(3)37℃孵育30分钟。

(4)加入20μl Proteinase K涡旋震荡，充分混匀。加入200μl Buffer GL，涡旋震荡混匀。注 意：不要把Proteinase K直接加到Buffer GL中。

(5)56℃孵育30分钟。

(6)加入200μl无水乙醇，涡旋震荡充分混匀。

(7)将步骤6所得溶液(包括形成的沉淀)全部加入到已装入收集管的吸附柱，若一次不能 加完溶液，可分多次转入。12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收 集管中。

(8)向吸附柱中加入500μl Buffer GW1，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将 吸附柱重新放回收集管中。

(9)向吸附柱中加入500μl Buffer GW2，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将 吸附柱重新放回收集管中。

(10)12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟彻底晾干。注 意：这一步目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应(酶切、PCR等)。

(11)将吸附柱置于一个新离心管中，向吸附柱中间部位悬空加入50-200μlBuffer GE，室温 放置2-5分钟，12,000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA

PCR鉴定：提取分离到的多株革兰氏阳性菌的基因组DNA，通过使用16S rDNA的方法，进 行PCR扩增，引物序列如下：27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG(SEQ ID NO：19)，1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID NO：20)，反应体系50μL如下：

成分	用量
		PCR酶	25μL
引物F	2.5μL
		引物R	2.5μL
H<sub>2</sub>O	15μL
		DNA模板	5μL

反应条件如下：98℃、20s，98℃、10s，59℃、15s，72℃、30s，72℃、7min共35个循环。PCR完成后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察实验结果，然后将PCR产物送至上海生工生 物有限公司进行测序，将测序结果在NCBI的基因库中比对。

2.3生长曲线的绘制

将分离鉴定得到的三株乳酸菌按照1*10⁷的细菌量加入至50ml的MRS液体培养基中，同时使 用紫外分光光度计检测其OD值，计为0h，然后分别检测3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h、 36h所对应的OD值，将结果绘制成生长曲线。

2.4对人工肠液和人工胃液耐受情况比较

将培养好的菌株按照1×10⁷的菌量加入至模拟的人工肠液和人工胃液中(人工肠液与胃液配制 符合中国药典)，厌氧培养12h后，通过梯度稀释后，进行MRS平板计数，统计其菌落数。

人工胃液配制方法：取稀盐酸16.4mL，加水约800mL及胃蛋白酶10g，搅匀后加水定容至 1000mL即可。

人工肠液配制方法:取磷酸二氢钾6.8g加水500mL。用0.4％的氢氧化钠溶液调节pH至6.8； 另取胰酶10g加水适量使溶解，将两液混合后，加水定容至1000mL即可。所谓的稀盐酸是1mol/L 的盐酸。

2.5对病原菌的抑制情况比较

选择了三种致病菌，分别是革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌(ATCC25923)和革兰氏阴性菌的 大肠杆菌(ATCC25922)及沙门氏菌(ATCC14028)(均由吉林农业大学动物微生态制剂研究开发 中心保藏并提供)，分别吸取200μL的菌液涂布于营养琼脂培养基的表面，然后按照打孔法，在其 中打6mm的孔，在吸取200μL的分离鉴定得到的三株乳酸菌加入孔中，于37℃厌氧培养18h后， 统计抑菌环的直径大小。

2.6对抗生素的敏感情况比较

为了验证其对抗生素的敏感性，选择10种抗生素，分别为卡那霉素(30μg)、哌拉西林 (100μg)、多粘菌素B(300μg)、多西环素(30μg)、苯唑西林(1μg)、头孢氨苄(30μg)、 头孢曲松(30μg)、红霉素(15μg)、头孢唑林(30μg)、的卡西林(75μg)。(药敏试剂购自 常德比克曼生物科技有限公司)，使用纸片法，检测乳酸菌对药物的敏感性，将分离鉴定得到的三 株乳酸菌均匀的涂布与MRS固体培养基的表面，然后将带有抗生素的纸片均匀的贴在上面，37℃ 厌氧培养18h，观察和统计抑菌环的大小，抑菌环S(≥21mm)、抑菌环M(15-20mm)、抑菌环R(≦15mm)。

2.7对不同温度的耐热情况比较

耐热情况是乳酸菌是否可以制作成微生态制剂的一项重要指标，分别选取37℃、50℃、 55℃、60℃、65℃的5个温度点对分离鉴定得到的三株菌比较其耐热情况。按照1*10⁴的细菌量将 三株菌分别加入至MRS液体培养基中，然后将MRS置于37℃、50℃、55℃、60℃、65℃的厌氧 培养箱中，培养12h，将菌离心后，使用100μLPBS重悬，进行计数，数据统计分析，本试验三个 重复。

2.8三株菌耐酸情况比较

对酸的耐受情况也是评价是否可以制作成微生态制剂的重要指标，将分离得到的三株菌按照 1*10⁵的细菌量接种到PH2.5的MRS液体培养基中，37℃厌氧培养12h，然后离心后进行计数，数 据统计分析，本试验三个重复。

2.9三株菌耐胆盐情况比较

对胆盐的耐受耐受情况也是评价是否可以制作成微生态制剂的重要指标，将分离得到的三株 菌按照1*10⁵的细菌量接种到浓度为0.30％、0.50％、1.0％的胆盐MRS固体培养基中，对平板进行 计数，数据统计分析，本试验三个重复。

2.10三株菌产酸情况比较

乳酸菌会产生大量的酸，更适合本身的生长，所以对于乳酸菌的产酸情况比较，是一项重要 的指标，绘制三株菌的产酸曲线，将分离得到的三株菌三株菌按照1*10⁶的细菌量接种到MRS液 体培养基中，每3h检测MRS液体培养基的PH，共检测至24h，数据统计分析，绘制曲线。

3结果

3.1革兰氏染色结果

在乳酸菌鉴定培养基中，挑取能够将培养基产生黄色的菌落(图1)，对其进行革兰氏染色， 通过革兰氏染色，观察到有两种紫色的阳性杆状菌和一种紫色阳性球菌，结果如图2所示。

3.2生化鉴定结果

表1：生化鉴定结果

	阳性杆菌1	阳性杆菌2	阳性球菌
				七叶苷	+	+	-
纤维二糖	+	+	+
				麦芽糖	+	+	-
甘露醇	+	+	-
				水杨苷	+	+	+
山梨醇	+	+	-
				蔗糖	+	+	-
棉子糖	-	-	-
				菊糖	+	+	+
乳糖	+	+	-
				1％马尿酸钠	-	-	-
吲哚试验	-	-	-
				O/F试验	F	F	F
硝酸盐还原试验	-	-	+

注：“+”为阳性；“-”为阴性。

3.3 PCR鉴定结果

通过对三株阳性菌的基因组DNA提取，进行PCR鉴定，鉴定结果如图3，使用通用引物，在 1900bp的位置出现目的条带，无明显杂带，证明菌株单一、较纯。将PCR产物送至上海生工生物 有限公司进行测序，将测序序列在NCBI的BLAST上比对，可以发现阳性菌1为干酪乳杆菌，阳 性菌2为副干酪乳杆菌，阳性球菌为乳酸片球菌。

乳酸片球菌的基因序列如SEQ ID NO：1中所示，被命名为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang，并于2021年10月28日保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为：CCTCC M 20211331。

以下实验及实施例中所述的乳酸片球菌，如无特殊说明，均指代乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Wang。

3.4生长曲线的绘制

取上述鉴定的三株菌干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌及乳酸片球菌，每3h测一次OD，测至36h， 绘制曲线图，结果如图4。

3.5耐人工肠液和人工胃液情况结果

通过比较三株菌对人工肠液和人工胃液耐受情况比较，如表2所示。可以在图5中观察到在人 工肠液中，乳酸片球菌与干酪乳杆菌耐受情况呈显著性差异，而与副干酪乳杆菌有差异，说明乳 酸片球菌比干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌更耐受人工肠液。而干酪乳杆菌更耐受人工肠液。

表2：三株菌在人工肠液和人工胃液中的耐受情况(耐受率，％)

	乳酸片球菌	干酪乳杆菌	副干酪乳杆菌
				人工肠液	181.667％	154％	162.33％
人工胃液	172.333％	198％	176.5％

3.6对致病菌的抑制情况结果

在对致病菌的抑制情况比较中，加入抗生素组作为阳性对照组，在对沙门氏菌、大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌的抑制时，乳酸片球菌的抑制效果更好，超过另外两株菌，呈显著性差异。而与 空白组(Mock)相比较，三株菌都有抑菌效果。抑菌圈直径采用宝工PD-151游标卡尺(可精确至 0.001mm)测量，结果如表3、图6所示。

表3：三株菌对致病菌的抑制情况(抑菌圈直径，mm)

	金黄色葡萄球菌	大肠杆菌	沙门氏菌
				乳酸片球菌	11.2	11.466	18.6
干酪乳杆菌	10.066	10.1	15.933
				副干酪乳杆菌	9.266	8.9	15.1

3.7对抗生素敏感情况结果

通过三株菌对抗生素药物敏感情况研究，通过纸片法研究其情况，结果如表4所示，可以发现 乳酸片球菌对红霉素、头孢唑啉最为敏感，对卡那霉素、哌拉西林、多西环素、头孢曲松较为敏 感，而干酪乳杆菌对卡那霉素、哌拉西林、头孢曲松、红霉素、头孢唑啉、的卡西林较为敏感。 乳酸片球菌对多种抗生素更为敏感，相对于副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌更不易对抗生素产生耐药 性。乳酸片球菌对多种广泛使用的抗生素普遍表现出更高的敏感性，相较于其他两株菌更不容易对 抗生素耐药。

表4：三株菌对抗生素敏感情况

注：无抑菌环为“-”，抑菌环直径在0-1cm之间为“+”，抑菌环直径在1-2cm之间为“++”，抑菌 环直径在2-3cm之间为“+++”

3.8对不同温度的耐热情况比较结果

通过对三株菌在不同温度下培养，统计其在不同温度培养后的数量，计算其耐受百分比，结 果如表5、图7所示。从结果可以发现，乳酸片球菌与干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌相比较，在 37℃、50℃、55℃、60℃、65℃下，乳酸片球菌更容易耐受高温，对高温更稳定。

表5：三株菌对热的耐受情况(耐受率，％)

	37℃	50℃	55℃	60℃	65℃
						乳酸片球菌	113.963％	83.3833％	78.2667％	78.4333％	54.2833％
干酪乳杆菌	111.467％	53.6833％	48.85％	44.667％	33.7％
						副干酪乳杆菌	104.433％	74.7667％	73.2％	64.4667％	30.7667％

3.9三株菌耐酸情况比较结果

通过比较三株菌在pH＝2.5的MRS液体培养基中耐受情况，如图8所示。从结果中发现，三 株菌对酸均具有较好的耐受率，在pH＝2.5的环境下的耐受率均高于63.6％，其中，副干酪乳杆菌 的耐受能力略强于乳酸片球菌及干酪乳杆菌。

3.10三株菌耐胆盐情况比较结果

通过比较三株菌在不同浓度的胆盐下的耐受情况，如表6、图9所示。从结果中可以发现，在 0.30％的胆盐下的MRS培养基中，干酪乳杆菌的耐受能力最好，在0.50％的胆盐下的MRS培养基 中，乳酸片球菌耐受能力最好，呈显著性差异，在1.0％的胆盐下的MRS培养基中，乳酸片球菌 的耐受能力最好。

表6：三株菌对胆盐的耐受情况(耐受率，％)

	0.30％胆盐	0.50％胆盐	1.0％胆盐
				乳酸片球菌	90.333％	87％	76％
干酪乳杆菌	96％	79％	66.66％
				副干酪乳杆菌	87％	78.33％	64％

3.11三株菌产酸情况比较结果

通过对每3个小时，检测每株菌的pH值，绘制呈产酸曲线，结果如图10所示，乳酸片球菌 的产酸能力更强，产酸比较多、也比较快，pH较低且数值一直在干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌之 下。而干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌产酸情况相似。

实施例2对轮状病毒的抑制效果研究

1、材料

6孔细胞培养板、1640细胞培养基、双抗、胎牛血清、猪肠上皮细胞(IPEC-J2细胞)、利巴 韦林、庆大霉素、PBS、质粒提取试剂盒、PCR酶、引物、去离子水、灌胃针、ELISA试剂盒(IFN-β、 IL-6、TNF-α、SIgA)、荧光定量酶、内参β-actin、猪轮状病毒、0.22μm滤器、反转录试剂盒

实验动物：3-4周龄的雌性BALB/c小鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)。并在SPF 动物房中饲养。

MRS培养基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫 酸锰0.2g/L、柠檬酸铵2g/L、乙酸钠5g/L、吐温-80 1ml/L，pH值6.0±0.05，121℃灭菌20min。 固体培养基需加1.2％的琼脂。

10％1640细胞培养基：5ml胎牛血清、44.5ml1640培养基、0.5ml双抗。

维持液：1ml胎牛血清、48.5ml1640培养基、0.5ml双抗。

0.5μg/L利巴韦林：0.5μg利巴韦林、1L去离子水，0.22μm滤器过滤。

2、方法

2.1体外抗病毒试验

试验分组：1、空白组，全程只加细胞维持液。2、病毒组(攻毒组)，先加维持液，后加轮状 病毒。3、抗病毒组，先加入浓度为

的抗病毒药物利巴韦林，后感染轮状病毒。4、乳酸片 球菌组，先加入乳酸片球菌，后感染轮状病毒。5、干酪乳杆菌组，先加入干酪乳杆菌，后感染轮 状病毒。6、副干酪乳杆菌组，先加入副干酪乳杆菌，后感染轮状病毒。每组菌株浓度为 1×10⁴CFU/mL。

试验设计：在细胞6孔板中铺1×10⁵的IPEC-J2细胞，按照试验分组向其加入各组，实验组的 乳酸菌先作用细胞2h，然后加入庆大霉素作用1h后，再使用PBS强力冲洗5次，最后加入轮状 病毒感染细胞，感染时间为12h，将细胞及培养基悬起，离心后，分别对上清和细胞一起提取其总 RNA，再反转录为cDNA，最后采用荧光定量PCR来探究对RV复制的抑制情况。

2.1.1绝对定量

将轮状病毒的NSP4基因(SEQ ID NO：2)，将其连接在克隆载体上，使用质粒提取试剂盒提 取质粒，测其浓度，分别将质粒以10的倍数进行梯度稀释，10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5，以质粒 为模板，在20μL反应体系中，进行实时PCR反应，20μL体系包括：10μL的酶、1μL的上游引物、 1μL的下游引物、2μL的模板和6μL的无菌水。反应条件为：52℃2min，95℃5min，95℃15s， 58℃1min，共45个循环，上机，然后绘制标准曲线，将实验结果代入标准曲线，计算各处理下的 病毒拷贝数。

NSP4引物序列：F—GCTCTAGAATGGATAAGCTTGCCGACCTCA(SEQ ID NO：3)

R--GGGGTACCTCACATAGACGCAGTTACTTCCGAC(SEQ ID NO：4)

2.1.2相对定量

通过相对定量，以内参β-actin为参照，比较猪肠上皮细胞中的Pig-IL18、Pig-IL6、Pig-IFNβ、 Pig-TFNα、Pig-IL1b、Pig-IFNα的相对表达量，从而分析在病毒感染过程中及乳酸菌处理下的细胞 因子及炎性因子的变化。实验结果将代入计算公式，统计最终结果，绘制柱形统计图。

荧光定量引物序列如表7：

表7：荧光定量引物

名称	荧光定量引物序列	序列编号
			(Pig-IL18)-F	TGAAAACGATGAAGACCTGGAA	SEQ ID NO：5
(Pig-IL18)-R	CCTGGTTAATGAAAAGGACTTGG	SEQ ID NO：6
			(Pig-IL6)-F	ATGAGAAGTGTGAAAACAGCAAGG	SEQ ID NO：7
(Pig-IL6)-R	CATTTGTGGTGGGGTTAGGG	SEQ ID NO：8
			(Pig-IFNβ)-F	TCGCTCTCCTGATGTGTTTCTC	SEQ ID NO：9
(Pig-IFNβ)-R	AAATTGCTGCTCCTTTGTTGGT	SEQ ID NO：10
			(Pig-TFNα)-F	GGCGTGAAGCTGAAAGACAAC	SEQ ID NO：11
(Pig-TFNα)-R	GGCTGATGGTGTGAGTGAGG	SEQ ID NO：12
			(Pig-IL1b)-F	AAGTGGTGTTCTGCATGAGCTTT	SEQ ID NO：13
(Pig-IL1b)-R	CAGGGTGGGCGTGTTATCTT	SEQ ID NO：14
			(Pig-IFNα)-F	ACCTCAGCCAGGACAGCAGTATC	SEQ ID NO：15
(Pig-IFNα)-R	TCGCAGCCCAGAGAGCAGATG	SEQ ID NO：16
			β-actin-F	GGACTTCGAGCAGGAGATGG	SEQ ID NO：17
β-actin-R	AGGAAGGAGGGCTGGAAGAG	SEQ ID NO：18

2.2体内抗轮状病毒实验

实验分组：共分6组，每组10只。1、空白组，全程只对小鼠口服PBS。2、攻毒组，先口服 PBS，后口服轮状病毒。3、药物组，先口服抗病毒药物利巴韦林，在感染轮状病毒。4、干酪乳杆 菌组，先口服干酪乳杆菌，后口服轮状病毒。5、副干酪乳杆菌组，先口服副干酪乳杆菌，后口服 轮状病毒。6、乳酸片球菌组，先口服乳酸片球菌，后口服轮状病毒。每组菌株浓度为1×10⁹CFU/mL。

免疫程序：先灌胃乳酸菌一天，休息两天，再次灌胃一天，休息两天，第三次灌胃一天，休 息两天，在口服轮状病毒三天。

2.2.1体重变化曲线

对各组的小鼠攻毒后15天的体重变化，统计分析数据，计算体重变化率绘制变化曲线。

2.2.2 ELISA检测血清中IFN-β、IL-6、TNF-α以及粪便中的SIgA

在动物实验中，分别采集了小鼠喂菌前、喂菌后、攻毒后三天的血清以及小鼠粪便，分别检测 血清中IFN-β、IL-6、TNF-α以及粪便中的SIgA。(ELISA试剂盒购自江苏酶免实业有限公司)。粪 便的处理：将粪便低温称重，然后加入无菌等量的PBS使其溶解，4℃过夜，12000r/min，离心2min， 吸取上清。

ELISA步骤：1、试剂盒中包括标准品，将标准品以2的倍数进行梯度稀释五次，分别加于包 被好的酶标板中，每孔三个重复，将待测样品进行5倍稀释，加于酶标板中，同时设立空白孔，加 好后进行封板。2、37℃孵育30min，然后使用洗涤液进行洗涤5次，加入酶标指示试剂50μL。3、 37℃孵育30min，继续进行洗涤5次，在向每孔中加入显色剂A50μL和显色剂B50μL，避光显色 10min后。4、每孔加入终止液50μL，通过酶标仪在450nm波长测量各孔的吸光度。将实验结果代 入标准曲线中，计算样品的实际浓度，统计数据，绘制柱状图。

2.2.3绝对定量

分别采集了各组小鼠相同重量的十二指肠段，用液氮将肠段冻住、研磨，使用组织RNA提取 试剂盒，提取其组织RNA，反转录成cDNA后，进行组织中病毒NSP4基因的绝对定量，统计数 据，绘制柱状体。

2.2.4病理切片的制作

样本的处理：将组织完全侵泡在多聚甲醛中4-6Day，待组织完全固定好后，对样品进行处理， 切合适大小，置于包埋盒中，准备脱水。

脱水：采用酒精梯度脱水(以验证如下脱水时间较合理)，70％2h，80％2h，85％过夜，90％ 2h，95％Ⅰ1-1.5h，95％Ⅱ1-1.5h，100％Ⅰ1h，100％Ⅱ1h。

透明：设二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ，透明时间(肠管较小各1min即可)(肺脏和肝脏可以各2min)， 透明到肉眼观察呈煮熟的肉皮样，透明时间切忌不要过长，影响较大。

浸蜡与包埋：浸蜡温度为55℃，勿调；蜡Ⅰ、蜡Ⅱ浸蜡时间各为40min，透蜡后将组织放入包 埋盒内进行包埋。

切片：将包裹好的蜡块置于冰上数分钟，取蜡块安装在切片机上，先切除表面的少量余蜡，然 后用冰敷20s，然后开始切片，一般肠段切片设置2.5微米，肝脾等组织设置5.切几片后用毛笔进 行拉伸，边切边拉，适当长度后，用镊子夹起，展开在42度的水面，用载玻片挑取。

染色：二甲苯1:8-10min，二甲苯2:8-10min。100％酒精3:1min。100％酒精4:1min。95％酒精 5:1min。80％酒精6:1min。70％酒精7:1min。水洗，苏木素8:2min。水洗，盐酸-酒精：几秒。水 洗，0.5％氨水：1min。水洗，0.5％伊红：2min。80％酒精：2min。95％酒精：2min。100％酒精： 2min。100％酒精：2min。

烘干和封片：立即将片子放入烘箱中，80度烘干，准备盖片。盖片：在载玻片上加入树脂胶， 盖上盖玻片，轻轻挤压，排出气泡。

3.结果

3.1体外细胞实验

3.1.1绝对定量

首先，构建轮状病毒的标准品，合成NSP4基因，PCR结果验证如图11，绘制绝对定量的标 准曲线结果见图12，对细胞及上清中提取的RNA进行病毒定量，将定量结果代入标准曲线，计算 结果如表8、图13，从结果中可知：三株乳酸菌与攻毒组相比较，都有减少病毒拷贝数的效果，都 是显著性差异，其中，乳酸片球菌的具有更好的抗病毒效果，更接近于使用利巴韦林的抗病毒药物 组。

表8：各组的病毒绝对定量(病毒拷贝数，个/μL)

组别	病毒拷贝数
		PBS组(空白组)	0
抗病毒组	15
		病毒组(攻毒组)	94.667
乳酸片球菌组	25.667
		干酪乳杆菌组	31.33
副干酪乳杆菌组	35.33

3.1.2相对定量

通过相对定量，分别对细胞中的Pig-IL18、Pig-IL6、Pig-IFNβ、Pig-TFNα、Pig-IL1β、Pig-IFNα 的表达量进行定量，定量结果见图14。

从结果中可以看到，在Pig-IFN-α的相对表达量中，乳酸片球菌的相对表达量最高，与PBS组 呈显著性差异，且明显高于干酪乳杆菌组、副干酪乳杆菌组。在Pig-IFN-β的相对表达量中，乳酸 片球菌相对表达量最高。在Pig-IL-1β的相对表达量中，攻毒组的相对表达量最高，而乳酸片球菌 最低，且相较于其他组具有显著性差异。在Pig-IL-6的相对表达量中，乳酸片球菌表达量最高，相 较于其他菌株组具有显著性差异。在Pig-IL-18的相对表达量中，乳酸片球菌与干酪乳杆菌、副干 酪乳杆菌的相对表达量相当，都明显低于攻毒组。在Pig-TFNα的相对表达量中，乳酸片球菌与干 酪乳杆菌、副干酪乳杆菌的相对表达量相当，都有明显的减少，都明显低于攻毒组。总而言之，三 株乳酸菌都可以刺激细胞产生干扰素Pig-IFN-β、Pig-IFN-α，减少细胞产生促炎因子Pig-IL-18、 Pig-IL-6、Pig-TFN-α、Pig-IL-1β，尤其乳酸片球菌具有更优更显著的效果。

3.2体内抗轮状病毒动物实验

3.2.1体重变化曲线

通过统计各组小鼠在攻毒后15天的体重变化情况，绘制的体重变化曲线如图15所示。由结果 可知，攻毒组在攻毒后，体重有明显的下降，其他组在短暂下降后都能较好的回升，受攻毒影响较 小。

3.2.2 ELISA检测血清中IFN-β、IL-6、TNF-α以及粪便中的SIgA

通过使用ELISA试剂盒检测血清中IFN-β、IL-6、TNF-α及粪便中的SIgA，结果如图16所示， 在结果中分为三个阶段，1：攻毒前7天。2：攻毒后3天。3：攻毒后10天。

从结果中可以发现，在检测IFN-β含量时，各组在攻毒前后，IFN-β的含量有所变化，攻毒组 与三株乳酸菌组相比较，有明显的差异，在攻毒后，IFN-β都有所上升。在检测IL-6含量时，三株 菌在攻毒后都会有显著性的差异，攻毒组明显高于其他各组。在检测TNF-α含量时，抗病毒药物 组的TNF-α含量最高，三株乳酸菌组较为平缓，趋于正常。在检测粪便中的SIgA时，可以发现乳 酸片球菌在攻毒前后有显著性的提升，干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌也有所升高，乳酸片球菌组粪便 中的SIgA含量最高，表明乳酸片球菌能够更加有效的激活肠道免疫，促进SIgA的表达。

3.2.3绝对定量结果

通过绝对定量的方法，探究各组中小肠内病毒的拷贝数，结果如图17所示。从结果中可以观 察到攻毒组与三株乳酸菌组呈显著性差异，免疫乳酸菌后，在小鼠的十二指肠中，乳酸片球菌中的 轮状病毒的拷贝数最低，与采用利巴韦林抗病毒药物组的结果更为接近，说明，三株乳酸菌免疫小 鼠后，对轮状病毒的感染具有一定的抵抗作用，以乳酸片球菌在体内的抗病毒效果最好，且接近抗 病毒药物利巴韦林。

表9：各组的病毒绝对定量(病毒拷贝数，个/μL)

组别	病毒拷贝数
		PBS组(空白组)	0
抗病毒组	6.5
		病毒组(攻毒组)	28.7
乳酸片球菌组	10.733
		干酪乳杆菌组	14.167
副干酪乳杆菌组	12.733

3.2.4病理学检查结果

通过病理学检查，可以有效直观的观察到各组之间的差异，分别选取了各组小鼠的相同位置的 十二指肠和结肠，比较在200μm、50μm下，各组长绒毛的完整性，从而说明各组之间的保护效果， 结果如图18所示。通过在200μm、50μm倍数下，可以观察到攻毒组的小鼠十二指肠肠绒毛有所 破损，在肠绒毛的顶端有少量的消融，可能是由病毒的破坏引起的，在三株乳酸菌组，肠绒毛较为 完整，在肠壁的肌层比攻毒组的较厚，说明三株乳酸菌对小鼠的十二指肠有一定的保护作用。在比 较结肠中肠绒毛时，可以发现，攻毒组(B)的肠绒毛变窄，有断层，而在三株乳酸菌组中，肠绒 毛变宽、增厚、说明在免疫三株乳酸菌后，肠绒毛变的更加的健康，可以有效的增加对食物中能量 的吸收，特别是乳酸片球菌(D)的肠绒毛情况最好，表现出了对肠绒毛的更好的保护效果。

4总结

通过体内外实验结果可知，三株乳酸菌组均具有抗轮状病毒的作用，尤其以乳酸片球菌的效果 最好最显著。乳酸片球菌能够有效降低轮状病毒的拷贝数，有效提高Pig-IFNβ、Pig-IFNα的相对 表达量，刺激细胞产生干扰素，并降低促炎因子Pig-IL6、Pig-IL18、Pig-TFNα、Pig-IL1β的表达； 在有效的激活肠道免疫，促进SIgA的表达，并且能够保护肠道肠绒毛的完整性并增强肠绒毛的 长度和厚度。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本 发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技 术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所 作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林农业大学

<120> 分离自藏灵菇的乳酸片球菌及其在防治轮状病毒感染中的应用

<130> 202126840

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1050

<212> DNA

<213> 乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)

<400> 1

cgtaggagac actctacggt tcattgttac gacttactga ggcacgatca aactctatag 60

ctacactgtt acgatgtgac gagcggtgtg tcaaggtccg gttacgtatt taccgcggcg 120

cgctgctccg cgattaccag caattcccac ttcatgcagg cgagttgcag cctgcaatcc 180

gaactgagaa tggttttaac agattagcgc accctcgcgg gttggcgacc ccgttgtacc 240

atccattgta gcacgtgtgt agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc 300

caccttcctc cggtttatca ccggcagtct cactagagtg cccaacttaa tgatggcaac 360

taataataag ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac 420

gacaaccatg caccacctgt atcccgtgtc ccgaaggaac tccttatctc taaggatagc 480

acgagtatgt caagacctgg taaggttctt cgcgttgctt ccaattaaac cacatgctcc 540

accgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt tgagtttcaa ccttgcggac gtactcccca 600

cgcggagtgc ttaatgcgtt agctgcgcta cagagaactt ataactccct acagctagca 660

ctcatcgttt acggcgtgga ctaccagggt atctaatcct gtttgctccc cacgctttcg 720

agcctcagtg tcagttacag gacagagagc cgctttcgcc tccggtgttc ctccatatat 780

ctacgcattt caccgctaca catgggaatt ccactctcct ctcctgcact caagtctccc 840

agtttccaat gcacacactg gttgagccac tgccttttac atcagactta agaaaccacc 900

tgcgctcgct ttacgcccaa taaatccgga cacgcttggg acctacgtat accgcggctg 960

ctggcacgta ttagcccgtc cgtttctggt agataccgtc cactgaagta atttctccac 1020

ctctactacc gttcctactc taacgacaga 1050

<210> 2

<211> 528

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggataagc ttgccgacct caactacaca ttgagtgtaa tcactttaat gaatgacaca 60

ctacattcta ttattcaaga tccaggaatg gcgtattttc catatatcgc atctgtcctg 120

actgttttgt ttactctaca taaagcatca attccaacga tgaagatagc gttaagaacg 180

tcaaagtgtt cgtacaaagt aattaaatat tgcatggtta cgatcattaa tactcttcta 240

aaattggctg gttataaaga acaggttact actaaggatg aaattgaaca acagatggac 300

agaattgtta aagagatgag gcgtcaattg gagatgattg acaaattgac aactcgtgaa 360

attgagcagg ttgaattact taagcgtata catgataaat tagttgctag accagttgat 420

gctatagaca tgtcaaaaga atttaatcag aaaaatatta gaacgctaga tgaatgggaa 480

agcggaaaaa atccatatga accatcagaa gtgactgcat ctatgtga 528

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gctctagaat ggataagctt gccgacctca 30

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggggtacctc acatagacgc agttacttcc gac 33

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgaaaacgat gaagacctgg aa 22

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cctggttaat gaaaaggact tgg 23

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgagaagtg tgaaaacagc aagg 24

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

catttgtggt ggggttaggg 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tcgctctcct gatgtgtttc tc 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aaattgctgc tcctttgttg gt 22

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggcgtgaagc tgaaagacaa c 21

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggctgatggt gtgagtgagg 20

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aagtggtgtt ctgcatgagc ttt 23

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cagggtgggc gtgttatctt 20

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

acctcagcca ggacagcagt atc 23

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tcgcagccca gagagcagat g 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ggacttcgag caggagatgg 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aggaaggagg gctggaagag 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (10)

1.一株分离自藏灵菇的乳酸片球菌，其命名为乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)Wang，该菌已于2021年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M20211331。

2.权利要求1中所述的分离自藏灵菇的乳酸片球菌在抑制轮状病毒中的应用。

3.权利要求1中所述的分离自藏灵菇的乳酸片球菌在制备轮状病毒抑制剂中的应用。

4.权利要求1所述的分离自藏灵菇的乳酸片球菌在制备防治轮状病毒感染的药物、菌剂或饲料中的应用。

5.权利要求1中所述的分离自藏灵菇的乳酸片球菌在制备保护肠道的药物、菌剂或饲料中的应用；

优选地，所述保护肠道为保护肠粘膜，尤其为保护肠绒毛，所述肠绒毛为十二指肠肠绒毛和/或结肠肠绒毛；

优选地，所述保护肠肠绒毛包括保护肠道肠绒毛的完整性和/或增强肠绒毛的长度和/或厚度。

6.权利要求1中所述的分离自藏灵菇的乳酸片球菌在制备免疫治疗剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述免疫治疗剂为提高肠道免疫力的药物、菌剂或饲料；

优选地，所述提高肠道免疫力包括提高SIgA的表达。

8.一种菌剂，其包含权利要求1所述的分离自藏灵菇的乳酸片球菌。

9.一种药物组合物或药物制剂，其包含权利要求1所述的分离自藏灵菇的乳酸片球菌或权利要求8所述的菌剂。

10.一种饲料，其包括权利要求1所述的分离自藏灵菇的乳酸片球菌。

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