CN117844713B - 一种提高免疫力的复合益生菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提高免疫力的复合益生菌及其应用，所述提高免疫力的复合益生菌由动物双歧杆菌乳亚种BLa80菌株、鼠李糖乳杆菌LRa05菌株、嗜酸乳杆菌LA05菌株组成。本发明创造性地开发了一种全新的益生菌复配方式和一种全新的提高机体免疫力的策略，即将BLa80菌株、LRa05菌株和LA05菌株进行复配联用，发现三者能够相互配合、相互促进、在提高机体免疫力方面的效果上协同增效，在使用菌量一致的情况下，与缺失任一种菌的菌种干预方式相比，三种菌的复配在提高机体免疫力方面的效果上显著提高。

Description

一种提高免疫力的复合益生菌及其应用
技术领域
本发明属于益生菌技术领域，涉及一种提高免疫力的复合益生菌及其应用。
背景技术
免疫系统是一个由各种结构和生物过程组成的网络，它保护宿主免受病原体的侵害。免疫系统损伤会影响机体对外来病原体的易感性，从而导致癌症和病毒感染等疾病。人体免疫系统可分为先天免疫和适应性免疫两个分支。首先，与适应性免疫相比，先天免疫的功能不需要通过获得性发育来调节，而是作为抵御外来有害物质的初始免疫屏障。其次，适应性免疫在生长发育过程中具有更精细的识别能力，可以更精确地识别自身和非自身抗原。
免疫力又被称为抵抗力，是身体抵抗细菌、病毒入侵的一种能力，也是保护机体健康的防御线。免疫力强的人不容易生病，身体更健康，精力更充沛。免疫力是由免疫系统提供，而免疫系统则通过调节免疫功能来维持和提高免疫力，从而保护人体免受感染和疾病。如果免疫系统失调，会影响免疫力的水平，导致免疫功能障碍和疾病的发生。因此，保护免疫系统的健康对于提高免疫力和预防疾病非常重要。目前免疫系统已进化到维持宿主与微生物的共生关系。
微生物群是一个密集而复杂的生态系统，越来越被认为是宿主免疫调节的重要组成部分。研究发现，肠道菌群往往发挥着不可忽视的免疫调节功能，这些相互作用的失调可导致炎症等相关疾病。事实上，肠道菌群已被发现对炎症/自身免疫性疾病有广泛的影响，当宿主及其肠道微生物的稳态被破坏时，会降低炎症因子如IL-10，TNF-α的表达，导致微生物群多样性的丧失，可能引起疾病如炎症性肠病的发生。益生菌可以通过维持上皮屏障、抑制病原体粘附在肠道表面、调节和适当成熟免疫系统来提高宿主免疫力。因此，使用益生菌控制肠道微生物群或许是一种有效的治疗或预防措施调节肠道菌群的组成，增强免疫力，为宿主提供许多健康益处，并积极调节肠道微生物组的组成和免疫系统的功能。
因此，提供一种益生菌产品，用来改善炎症反应、调节肠道菌群等免疫相关问题是非常有意义的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种提高免疫力的复合益生菌及其应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种提高免疫力的复合益生菌，所述提高免疫力的复合益生菌由保藏编号为CGMCC No. 15410的动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa80菌株、保藏编号为CGMCC No. 1.12734的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株、保藏编号为CGMCC No. 23546的嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA05菌株组成。
本发明创造性地开发了一种全新的益生菌复配方式和一种全新的提高机体免疫力的策略，即将动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa80菌株、鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株和嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA05菌株进行复配联用，发现三者能够相互配合、相互促进、在提高机体免疫力方面的效果上协同增效，在使用菌量一致的情况下，与缺失任一种菌的菌种干预方式相比，三种菌的复配在提高机体免疫力方面的效果上显著提高，具体表现在：（1）显著提高肝脏抗氧化因子的水平；（2）显著降低血清中抗炎因子的水平；（3）显著提高血清免疫球蛋白的水平；（4）显著提高小肠组织中α防御素的表达水平。因此，将该复合益生菌用于制备提高机体免疫力的产品具有很好的前景。同时，三种菌均为益生菌，产品的安全性高，且不易产生抗性。
所述复合益生菌的制备方法采用本领域常规的技术方法即可，示例性地可以为：将BLa80菌株、LRa05菌株或LA05菌株活化后，分别接种于培养基中进行培养，得到培养液；培养液离心，菌体重悬得到菌悬液；按照活菌数比例要求将三种菌悬液混合，即可。
优选地，所述BLa80菌株、LRa05菌株与LA05菌株的活菌数之比为(1-5):(1-5):(1-5)。
基于动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa80菌株、鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株和嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA05菌株的潜在相互作用关系，本发明还发现当三种菌株以上述特定的活菌数配比进行复合时，其在提高免疫力方面的效果更加显著。
所述(1-5)中的具体点值可以选择为1、1.2、1.5、1.8、2、2.3、2.5、2.8、3、3.2、3.5、3.8、4、4.2、4.5、4.8、5等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
第二方面，本发明提供一种提高免疫力的益生菌剂，所述益生菌剂中的菌株包括第一方面所述的复合益生菌。
优选地，所述BLa80菌株、LRa05菌株与LA05菌株在益生菌剂中的活菌含量不低于1×1010 CFU/g或1×1010 CFU/mL，例如1×1010 CFU/g（CFU/mL）、5×1010 CFU/g（CFU/mL）、1×1011 CFU/g（CFU/mL）、3×1011 CFU/g（CFU/mL）、5×1011 CFU/g（CFU/mL）、1×1012 CFU/g（CFU/mL）、1×1013 CFU/g（CFU/mL）等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
本发明所涉及的益生菌剂的剂型不受限制，包括最常用的冻干粉剂，或进一步制得的胶囊剂、片剂或颗粒剂。其中冻干粉剂示例性地可以采用如下方法制得：
将BLa80菌株、LRa05菌株或LA05菌株活化后，分别接种于培养基中进行培养，得到培养液；培养液离心，得到菌体；菌体用冻干保护剂重悬，得到重悬液；重悬液冻干，按配比混合，即得。
优选地，所述培养基包括MRS培养基。
优选地，所述MRS培养基以浓度计包括：蛋白胨8-12 g/L、牛肉膏8-12 g/L、葡萄糖15-25 g/L、乳糖10-20 g/L、酵母粉3-7 g/L、柠檬酸氢二铵1-3 g/L、K2PO4·3H2O 2-3 g/L、MgSO4·7H2O 0.05-0.2 g/L、MnSO4 0.01-0.1 g/L、吐温80 0.5-2 mL/L、半胱氨酸盐酸盐0.1-1 g/L。
优选地，所述冻干采用真空冷冻法。
优选地，所述益生菌剂中还包括保护剂和/或功能助剂。
优选地，所述保护剂包括脱脂乳、明胶、糊精、阿拉伯胶、右旋糖酐、藻胶钠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇或木糖醇中的任意一种或至少两种的组合。
所述功能助剂包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉、螺旋藻、节旋藻、云芝多糖、水苏糖、聚葡萄糖、α-乳淸蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
第三方面，本发明提供第一方面所述的复合益生菌或第二方面所述的益生菌剂在制备具有提高机体免疫力功效的产品中的应用。
第四方面，本发明提供第一方面所述的复合益生菌或第二方面所述的益生菌剂在制备提高肝脏抗氧化能力的产品中的应用。
第五方面，本发明提供第一方面所述的复合益生菌或第二方面所述的益生菌剂在制备提高血清抗炎因子水平的产品中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明创造性地开发了一种全新的益生菌复配方式和一种全新的提高机体免疫力的策略，即将动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa80菌株、鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株和嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA05菌株进行复配联用，发现三者能够相互配合、相互促进、在提高机体免疫力方面的效果上协同增效，在使用菌量一致的情况下，与缺失任一种菌的菌种干预方式相比，三种菌的复配在提高机体免疫力方面的效果上显著提高，具体表现在：（1）显著提高肝脏抗氧化因子的水平；（2）显著降低血清中抗炎因子的水平；（3）显著提高血清免疫球蛋白的水平；（4）显著提高小肠组织中α防御素的表达水平。因此，将该复合益生菌用于制备提高机体免疫力的产品具有很好的前景。同时，三种菌均为益生菌，产品的安全性高，且不易产生抗性。
附图说明
图1是各组小鼠的体重统计结果图；
图2是各组小鼠的脾脏重量统计结果图；
图3是各组小鼠肝脏的总抗氧化能力统计结果图；
图4是各组小鼠肝脏的谷胱甘肽过氧化物酶含量统计结果图；
图5是各组小鼠肝脏的超氧化物歧化酶含量统计结果图；
图6是各组小鼠血清的白细胞介素6含量统计结果图；
图7是各组小鼠血清的肿瘤坏死因子-α含量统计结果图；
图8是各组小鼠的血清免疫球蛋白IgG含量统计结果图；
图9是各组小鼠的血清免疫球蛋白IgA含量统计结果图；
图10是各组小鼠小肠组织α防御素Defa-rs1c表达水平统计结果图；
图11是各组小鼠小肠组织α防御素Defcr4表达水平统计结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中涉及的蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、乳糖、酵母粉、柠檬酸氢二铵、K2PO4·3H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4、吐温80和半胱氨酸盐酸盐购自国药集团化学试剂有限公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS培养基（g/L）：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖15g/L、乳糖15g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温80 1mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
下述实施例所涉及的BLa80菌株的分类命名为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2018年3月5日，保藏编号为CGMCC No. 15410，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
下述实施例所涉及的LRa05菌株的分类命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2020年7月20日，保藏编号为CGMCC No. 1.12734，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
下述实施例所涉及的LA05菌株的分类命名为嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年10月9日，保藏编号为CGMCC No. 23546，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
下述实施例中涉及的菌悬液：将所需菌株接种于MRS液体培养基中，37℃下培养24h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2%（v/v）的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃下培养24h，得到菌液；将菌液在6000g下离心10min，使用PBS重悬菌体，即得。
试验结果数据使用GraphPad进行统计分析，与对照组相比，***代表p<0.0001，**代表p<0.001，*代表p<0.05，NS代表无显著差异。
实施例
本实施例探究本发明所涉及的复合益生菌对于小鼠的免疫力的影响：
（1）试验动物
健康雌性SPF级昆明种小鼠由上海实验动物中心提供，并给予小鼠常规颗粒状啮齿动物饮食和纯净水。所有涉及小鼠的程序均符合上海市实验动物护理与动物实验中心提供的指导原则（许可证号2023052101）。
（2）动物分组及干预方式
60只小鼠适应性喂养2周后随机等分为6组，分别为对照组（Control）、益生菌BLa80联合LRa05组（BLa80+LRa05，总菌液量为1×109 CFU/天/只，两菌活菌数之比3:1）、益生菌LRa05联合LA05组（LRa05+LA05，总菌液量为1×109 CFU/天/只，两菌活菌数之比1:1）、益生菌BLa80联合LA05组（BLa80+LA05，总菌液量为1×109 CFU/天/只，两菌活菌数之比3:1）、益生菌BLa80联合LRa05联合LA05组（BLa80+LRa05+LA05，添加比例为3:1:1，总菌液量为1×109 CFU/天/只）、动物双歧杆菌乳亚种ATCC700541联合LRa05联合LA05组（动物双歧杆菌乳亚种ATCC700541+LRa05+LA05，添加比例为3:1:1，总菌液量为1×109 CFU/天/只）。
各组均进行灌胃干预处理，每次给予0.5 mL菌液灌胃，对照组小鼠给予0.5 mL纯净水灌胃。末次（益生菌干预4周）灌胃给药12 h后，戊巴比妥钠过量麻醉处死小鼠，收集样本。
（3）小鼠体重和器官指标分析：
实验期间，每7天监测小鼠体重，监测小鼠行为情况，与对照组相比，干预组均未观察到任何异常行为。试验结束后各组小鼠的体重统计结果如图1所示，由图可知，经益生菌干预后，BLa80+LRa05+LA05组的小鼠体重有显著上升，说明本发明所涉及的复合益生菌能够促进小鼠的生长。各组小鼠的脾脏重量统计结果如图2所示，由图可知，对照组与益生菌干预组相比脾脏重量无统计学差异（p>0.05）。
（4）小鼠抗氧化指标分析：
取出小鼠肝脏器官，无酶核酸水冲洗后，通过加入无菌0.9%盐水溶液使肝脏制备10%（w/v）匀浆液，采用南京建成生物工程研究所的商品试剂盒检测总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）和超氧化物歧化酶（SOD）的肝脏抗氧化指标。总抗氧化能力、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶是评价肝脏抗氧化能力的重要指标。氧化应激不仅会诱发多种疾病，还会影响动物的生长速度。
结果分别如图3、图4、图5所示。由图可知，与对照组相比，各益生菌组干预后，小鼠的总抗氧化能力、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶含量均有不同程度地提高，且BLa80+LRa05+LA05组的效果最优。说明本发明所涉及的复合益生菌能够显著提高肝脏抗氧化能力。
（5）小鼠血清抗炎因子分析：
小鼠眼眶取血后25℃静置2 h，将样品以2000×g离心10 min，并将上清液用于酶联免疫吸附试验（ELISA）和生化分析。细胞因子白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量按照联科生物制造商的说明使用小鼠特异性酶联免疫吸附试剂盒进行定量检测。使用酶标仪在400 nm波长下测量每个样品的光密度值。
结果分别如图6、图7所示。由图可知，与对照组相比，各益生菌组干预后，小鼠血清的白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）均有不同程度地降低，且BLa80+LRa05+LA05组的效果最优。说明本发明所涉及的复合益生菌能够显著降低血清炎性因子的水平。
（6）小鼠血清免疫球蛋白分析：
小鼠眼眶取血后室温静置2 h，将样品以2000×g离心10 min，并将上清液用于酶联免疫吸附试验（ELISA）和生化分析。血清免疫球蛋白IgG和血清免疫球蛋白IgA水平按照联科生物制造商的说明使用小鼠特异性酶联免疫吸附试剂盒进行定量。使用酶标仪在400nm波长下测量每个样品的光密度值。血清免疫球蛋白IgG能反映全身免疫状态，血清免疫球蛋白IgA是黏膜局部免疫的主要抗体，可形成生物屏障，防止和中和外源入侵病原体在黏膜表面定植，除此之外，血清免疫球蛋白IgA通过与特异性受体和免疫介质的相互作用介导一些保护功能。
结果分别如图8、图9所示。由图可知，与对照组相比，各益生菌组干预后，小鼠血清免疫球蛋白IgG和血清免疫球蛋白IgA水平均有不同程度地提高，且BLa80+LRa05+LA05组的效果最优。说明本发明所涉及的复合益生菌能够显著提高血清中免疫球蛋白的表达水平，能够提高机体免疫力。
（7）小鼠小肠组织α防御素分析：
采用实时定量荧光聚合酶链式反应（PCR）检测小鼠小肠组织α防御素Defa-rs1c和Defcr4 mRNA表达水平，利用提取试剂盒从小鼠小肠组织中分离总RNA，将分离的RNA逆转录为cDNA后，进行PCR：预变性：95℃，30 s，循环反应（40）：95℃，10 s；60℃，30 s，溶解曲线：95℃，15 s；60℃，60 s；95℃，15 s。基因表达归一化为β肌动蛋白，计算mRNA的相对表达量。α防御素在稳态控制、调节和塑造肠道微生物群的组成中至关重要。
结果分别如图10、图11所示。由图可知，与对照组相比，各益生菌组干预后，小鼠小肠组织α防御素Defa-rs1c、Defcr4表达水平均有不同程度地升高，且BLa80+LRa05+LA05组最显著。
综上可知，本发明所涉及的复合益生菌具有优异的提高机体免疫力的功效，且BLa80菌株、LRa05菌株和LA05菌株能够相互配合、相互促进，在提高机体免疫力方面的效果上协同增效。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的技术方案，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (7)

1.一种提高免疫力的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂中的菌株由保藏编号为CGMCC No. 15410的动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactisBLa80菌株、保藏编号为CGMCC No. 1.12734的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株、保藏编号为CGMCC No. 23546的嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA05菌株组成；所述BLa80菌株、LRa05菌株与LA05菌株的活菌数之比为(1-5):(1-5):(1-5)；所述BLa80菌株、LRa05菌株与LA05菌株在益生菌剂中的活菌含量不低于1×1010 CFU/g或1×1010 CFU/mL。
2.根据权利要求1所述的提高免疫力的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
3.根据权利要求1所述的提高免疫力的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂中还包括保护剂和/或功能助剂。
4.根据权利要求3所述的提高免疫力的益生菌剂，其特征在于，所述保护剂包括脱脂乳、明胶、糊精、阿拉伯胶、右旋糖酐、藻胶钠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇或木糖醇中的任意一种或至少两种的组合；
所述功能助剂包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉、螺旋藻、节旋藻、云芝多糖、水苏糖、聚葡萄糖、α-乳淸蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
5.权利要求1-4中任一项所述的益生菌剂在制备具有提高机体免疫力功效的产品中的应用。
6.权利要求1-4中任一项所述的益生菌剂在制备提高肝脏抗氧化能力的产品中的应用。
7.权利要求1-4中任一项所述的益生菌剂在制备提高血清抗炎因子水平的产品中的应用。
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