CN111971056A - 用于治疗和缓解代谢及氧化应激、炎症和神经退行性变的益生菌制剂 - Google Patents

Abstract

在可选的实施方案中，提供了用于治疗和缓解代谢及氧化应激、炎症和神经退行性变的益生菌制剂和使用它们的方法，包括包含它们的组合物、制剂、制造品和试剂盒。在可选的实施方案中，如本文中所提供的益生菌制剂包含或由以下组成：发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)NCIMB 5221、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NCIMB 8826和婴儿长双歧杆菌(Bifidobacteria longum spp.infantis)NCIMB 702255的任何组合。在可选的实施方案中，如本文中所提供的益生菌制剂与三果宝结合。在可选的实施方案中，如本文中所提供的益生菌制剂用于治疗诸如糖尿病和肥胖症的代谢疾病，诸如IBD、IBS、关节炎的炎症性疾病；和诸如阿尔茨海默病和帕金森病的神经退行性疾病。在可选的实施方案中，本文中所提供的益生菌制剂用于抵抗氧化应激、减少炎症、降低血液的和总的葡萄糖水平、降低甘油三酯水平和管理胰岛素抵抗。

Description

用于治疗和缓解代谢及氧化应激、炎症和神经退行性变的益 生菌制剂

技术领域

本发明大体上涉及微生物学和益生菌。在可选的实施方案中，提供了用于治疗和缓解代谢及氧化应激、炎症和神经退行性变的益生菌制剂和使用它们的方法，包括包含它们的组合物、制剂、制造品和试剂盒。在可选的实施方案中，如本文中所提供的益生菌制剂包含或由以下三种益生菌株中任一组合组成：发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)NCIMB 5221、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)NCIMB8826和婴儿长双歧杆菌(Bifidobacteria longum spp.infantis)NCIMB702255。在可选的实施方案中，如本文中所提供的益生菌制剂与三果宝结合。在可选的实施方案中，如本文中所提供的益生菌制剂用于治疗诸如糖尿病和肥胖症的代谢疾病、诸如IBD、IBS、关节炎的炎症性疾病；和诸如阿尔茨海默病和帕金森病的神经退行性疾病。在可选的实施方案中，如本文中所提供的益生菌制剂用于抵抗氧化应激、减少炎症、降低血液的和总的葡萄糖水平、降低甘油三酯水平和管理胰岛素抵抗。

背景

肠道菌群由数以千计的共生地存在于胃肠道中的细菌种群组成。肠道菌群与人类宿主的共进化已使得肠道菌群对于消化健康、肠道动力、维生素合成、矿物质吸收、免疫和神经发育、能量平衡和代谢健康而言是不可缺少的。不良的饮食、抗生素使用和正常的衰老所引起的肠道菌群失衡(失调)造成包括代谢综合征、抑郁症、骨质疏松症和神经退行性变在内的慢性疾病。用有益的细菌种群(益生菌)和促进植物区系的难消化的碳水化合物(益生元)调整微生物群逆转失调并且促进抗炎和抗氧化环境，与此同时，正向调节免疫系统和能量平衡。

概述

在可选的实施方案中，提供了包含一种或多种益生菌的制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒，所述益生菌包含或由以下组成：发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)NCIMB 5221、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NCIMB 8826和婴儿长双歧杆菌(Bifidobacteria longum spp.infantis)NCIMB 702255的任何组合。

在可选的实施方案中，制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒还包含益生元组合物，其中任选地所述益生元组合物包含或由以组成：三果宝、或任何草本rasayana配方，任选地任何草本rasayana配方包含三种榄仁树属干果，或任何草本rasayana配方由相对等份的三种榄仁树属干果组成，任选地不含籽，其中任选地所述三种榄仁树属干果为庵摩勒(余甘子(Emblica officinalis))、毗黎勒(毛诃子(Terminalia bellirica))和诃黎勒(诃子(Terminalia chebula))，并且任选地包含所述三果宝或草本rasayana的制剂或药物组合物为水性或基于水的制剂，并且任选地所述制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒的约0.5％至50％、1.0％至40％、5.0％至30％或10.0％至25％为所述三果宝或所述草本rasayana。

在可选的实施方案中，制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒也包含或还包含：

-发酵乳杆菌NCIMB 5221，

-植物乳杆菌NCIMB 8826，

-婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255，

-发酵乳杆菌NCIMB 5221和植物乳杆菌NCIMB 8826，

-植物乳杆菌NCIMB 8826和婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255，

-发酵乳杆菌NCIMB 5221和婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255，或者

-发酵乳杆菌NCIMB 5221、植物乳杆菌NCIMB 8826和婴儿长双歧杆菌NCIMB702255。

在可选的实施方案中，制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒中的活性益生菌包含或由以下组成：

-发酵乳杆菌NCIMB 5221，

-植物乳杆菌NCIMB 8826，

-婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255，

-发酵乳杆菌NCIMB 5221和植物乳杆菌NCIMB 8826，

-植物乳杆菌NCIMB 8826和婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255，

-发酵乳杆菌NCIMB 5221和婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255，或者

-发酵乳杆菌NCIMB 5221、植物乳杆菌NCIMB 8826和婴儿长双歧杆菌NCIMB702255。

在可选的实施方案中，所述益生菌的一种、几种或全部均是活的或死的。在可选的实施方案中，所述益生菌：

(a)以相对等比例存在；

(b)总数在约10⁵CFU/ml至10¹¹CFU/ml，或在约10⁵CFU/gm至约3.0x 10¹¹CFU/gm，

(c)总数在约3.0x 10⁹CFU/ml或约3.0x 10⁹CFU/gm，任选地具有以下相对比例：

-约1.0x 10⁹CFU/ml的发酵乳杆菌NCIMB 5221(Lf5221)，

-约1.0x 10⁹CFU/ml的植物乳杆菌NCIMB 8826(Lp8826)，和

-约1.0x 10⁹CFU/ml的婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255(Bi702255)。

在可选的实施方案中，制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒制造或配制为溶液、悬浮液、乳化液、粉末、锭剂、丸剂、糖浆、片剂、胶囊、明胶、气溶胶、栓剂、咀嚼胶、胶囊、小袋或其任何等价的形式。

在可选的实施方案中，制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒制造或配制为可食用的材料、饮料或食品，任选地为(或包含)水、液体或固体的乳制品、牛奶、炼乳、可饮用的酸奶、酸奶、发酵饮料、冰淇淋、奶酪、豆奶、蔬菜汁、果汁、运动饮料、甜品、果冻、糖果、婴儿食品、保健食品、膳食补充剂或添加剂、或其任何等价物。

在可选的实施方案中，制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒制造或配制为具有以下的单位剂量：

(a)总计在约10⁵CFU/ml至约10¹¹CFU/ml，或在约10⁵CFU/gm至约3.0x 10¹¹CFU/gm；或者

(b)总计约3.0x 10⁹CFU/ml或约3.0x 10⁹CFU/gm，任选地具有以下相对比例：

-约1.0x 10⁹CFU/ml的发酵乳杆菌NCIMB 5221(Lf5221)，

-约1.0x 10⁹CFU/ml的植物乳杆菌NCIMB 8826(Lp8826)，和

-约1.0x 10⁹CFU/ml的婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255(Bi702255)。

在可选的实施方案中，提供了方法，其用于：

(a)在需要所述方法的个体中，治疗、改善、预防和/或缓解(例如减少其症状)代谢和氧化应激、炎症、衰老和/或神经退行性变，或减慢代谢和氧化应激、炎症、衰老和/或神经退行性变的发生或进展，或延长寿命；

(b)在需要所述方法的个体中，治疗、改善、预防和/或缓解(例如减少其症状)诸如糖尿病和肥胖症的代谢疾病，诸如炎症性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)的炎症性疾病；关节炎；诸如阿尔茨海默病和帕金森病的神经退行性疾病；包括抵抗氧化应激的氧化应激和/或包括减少炎症的炎症，或减慢诸如糖尿病和肥胖症的代谢疾病，诸如炎症性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)的炎症性疾病；关节炎；诸如阿尔茨海默病和帕金森病的神经退行性疾病、包括抵抗氧化应激的氧化应激和/或包括减少炎症的炎症的发生或进展；或者

(c)在需要所述方法的个体中，降低血液的和总的葡萄糖水平、降低甘油三酯水平和管理胰岛素抵抗，

所述方法包含向需要所述方法的个体给予本文所述的制造品、制剂、药物组合物或试剂盒，

其中任选地所述个体为人类或动物，

以及任选地向所述个体每天给予约1至4个剂量或单位剂量的所述制造品、制剂、药物组合物或试剂盒，并且任选地对于儿科使用，减少单位剂量，任选地减少约10％至90％。

在可选的实施方案中，提供了本文所述的制造品、制剂、药物组合物或试剂盒的用途，其用于：

(a)在需要所述用途的个体中，治疗、改善、预防和/或缓解(例如减少其症状)代谢和氧化应激、炎症、衰老和/或神经退行性变，或减慢代谢和氧化应激、炎症、衰老和/或神经退行性变的发生或进展；或延长寿命；

(b)在需要所述用途的个体中，治疗、改善、预防和/或缓解(例如减少其症状)诸如糖尿病和肥胖症的代谢疾病，诸如炎症性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)的炎症性疾病；关节炎；诸如阿尔茨海默病和帕金森病的神经退行性疾病、包括抵抗氧化应激的氧化应激和/或包括减少炎症的炎症，或减慢诸如糖尿病和肥胖症的代谢疾病，诸如炎症性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)的炎症性疾病；关节炎；诸如阿尔茨海默病和帕金森病的神经退行性疾病、包括抵抗氧化应激的氧化应激和/或包括减少炎症的炎症的发生或进展；或者

(c)在需要所述用途的个体中，降低血液的和总的葡萄糖水平、降低甘油三酯水平和管理胰岛素抵抗，

其包含向需要所述用途的个体本文所述的制造品、制剂、药物组合物或试剂盒，

其中任选地所述个体为人类或动物，

以及任选地向所述个体每天给予约1至4个剂量或单位剂量的所述制造品、制剂、药物组合物或试剂盒，并且任选地对于儿科使用，减少单位剂量，任选地减少约10％至90％。

在可选的实施方案中，提供了用于如下用途的本文所述的制造品、制剂、药物组合物或试剂盒：

(a)在需要其的个体中，治疗、改善、预防和/或缓解(例如减少其症状)代谢和氧化应激、炎症、衰老和/或神经退行性变，或减慢代谢和氧化应激、炎症、衰老和/或神经退行性变的发生或进展；或延长寿命；

(b)在需要其的个体中，治疗、改善、预防和/或缓解(例如减少其症状)诸如糖尿病和肥胖症的代谢疾病，诸如炎症性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)的炎症性疾病；关节炎；诸如阿尔茨海默病和帕金森病的神经退行性疾病、包括抵抗氧化应激的氧化应激和/或包括减少炎症的炎症，或减慢诸如糖尿病和肥胖症的代谢疾病，诸如炎症性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)的炎症性疾病；关节炎；诸如阿尔茨海默病和帕金森病的神经退行性疾病、包括抵抗氧化应激的氧化应激和/或包括减少炎症的炎症的发生或进展；或者

(c)在需要其的个体中，降低血液的和总的葡萄糖水平、降低甘油三酯水平和管理胰岛素抵抗，

其包含向需要其的个体给予本文所述的制造品、制剂、药物组合物或试剂盒，

其中任选地所述个体为人类或动物，

以及任选地向所述个体每天给予约1至4个剂量或单位剂量的制造品、制剂、药物组合物或试剂盒，并且任选地对于儿可使用，减少单位剂量，任选地减少约10％至90％。

本发明的一个或多个示例性实施方案的细节在附图和以下的描述中阐明。本发明的其他特征、目标和优势将随着描述和附图以及权利要求书而变得明晰。

出于所有的目的，本文所引用的所有的出版物、专利、专利申请均明确地通过引用的方式并入本文。

附图说明

本文中的附图是对本文所提供的实例性实施方案的说明，但并不意味着限制权利要求书所包含的发明的范围。

图1图示了显示本文所提供的示例性的益生菌制剂减少了果蝇中糖尿病和肥胖症标志物的数据。高糖饮食(HSD)喂养的果蝇的几个糖尿病表型的生理学标志物升高，益生菌制剂有效减少了该升高，所述生理学标志物包括(a)体重、(b)循环的普通糖水平和(c)总的葡萄糖水平。高脂饮食(HFD)喂养的果蝇的几个肥胖症的生理学标志物升高，益生菌制剂有效减少了该升高，所述生理学标志物包括(d)体重、(e)总的葡萄糖和(f)总的甘油三酯。每组表示与各自相同的用益生菌疗法处理的正常饮食的对照组做比较的HFD组的百分比变化。每组包含n＝5个个体的样本并且显著性被标记为*p<0.05和**p<0.01。

图2图示了显示用本文所提供的实例性益生菌处理并且暴露在急性口腔感染下的黑腹果蝇的免疫激活标志物的测量的数据：

将用单个的或本文所提供的实例性益生菌制剂预处理的果蝇置于大肠杆菌(EC)或金黄色葡萄球菌(SA)接种的介质。以50％的果蝇死亡所需时间天数记录为不同的大肠杆菌(a)或金黄色葡萄球菌(b)浓度下果蝇的存活率。在大肠杆菌(c)或金黄色葡萄球菌(d)的菌苔上都用益生菌处理过的果蝇的血淋巴进行琼脂扩散测试并且报告为抑菌圈的尺寸大小。各种炎性标志物的基因表达显示为5.0x10⁹ CFU/ml的大肠杆菌(e,i,k,m)或金黄色葡萄球菌(f,j,l,n)感染过的预处理的果蝇。双重氧化酶(Duox)(e,f)、IMD(g,h)、抗菌肽A(i,j)、蝇抗菌肽(k,l)和防御素(m,n)表达所有都表示为各自的益生菌介质上背面的果蝇与益生菌处理和致病菌株感染的果蝇之间的百分比变化。每组代表n＝5个个体的样本，以黑色星号表示(*)组间差异的显著性并且灰色星号(*)是相对于相同的益生菌处理方案进行的对照组的显著性。显著性的水平被标记为*p<0.05和**p<0.01。

图3图示了显示在用本文所提供的实例性益生菌处理后黑腹果蝇对急性氧化应激挑战的耐受性的测量数据：

用3％过氧化氢急性氧化应激挑战果蝇72小时。使用各种生化测定测量(a)残存物、(b)总的氧化剂、(c)超氧化物歧化酶(SOD)活性、(d)谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性和(e)脂质过氧化(LPO)的水平。所有的数值都表示为与用相同的益生菌方案处理的未挑战的对照做比较的百分比。灰色星号(**)表示相对于未处理的对照的显著性而黑色星号(**)表示组间显著性，*p<0.05和**p<0.01。每组包含n＝5个个体的样本。

图4图示了显示本文所提供的实例性益生菌制剂具有抗阿尔茨海默病和帕金森病的几个标志物的预防性效力的数据：

将表达α-突触核蛋白突变体A30P(帕金森病；PD)或APP-BACE1(阿尔茨海默病；AD)的人源性转基因的果蝇置于包含指示的益生菌处理的介质上，度过整个生命周期。每日直到30天通过对随着时间流逝而存活着的蝇的计数取平均值来记录AD(a)和PD(b)果蝇的存活率。在AD(a)和PD(b)蝇中使用负趋地性测试测量运动性并且表示为50％的蝇到达10cm标记处所花费的时间秒数。AD果蝇中，测量淀粉样蛋白β(Aβ)(e)随时间变化的水平并且表示为与第0天的果蝇作比较的百分比变化。还在AD果蝇中计算乙酰胆碱酯酶的活性(g)并且表示为U/min的数量。衰老果蝇中广泛的代谢参数的变化表示为AD(h)和PD(i)模型中总的葡萄糖以及AD(j)和PD(k)模型中总的甘油三酯。衰老AD(l)和PD(m)果蝇中氧化应激参数的摘要信息概述为果蝇在第0天至第30天间百分比变化。关于炎性标志物，对AD(n)和PD(o)果蝇而言，跟随琼脂扩散测试其后的抑菌圈均表示为抑菌圈的直径。对AD(p)和PD(q)果蝇而言，免疫调节基因的摘要信息还表示为第0天至第30天之间基因表达的百分比变化。最后，对AD(r)和PD(s)果蝇而言，线粒体的ETC复合物活性再次表示为从第0天至第30天的百分比变化。在所有的情况下，每组代表n＝5个个体的样本，其中黑色星号(*)表示组间比较的显著性，灰色星号(*)表示与对照组作比较的显著性，*p<0.05和**p<0.01。

图5图示了显示在肠道-大脑-轴交流的任何情况下本文所提供的实例性合生素制剂都不妨碍益生菌制剂的作用的数据：

益生元剂-三果宝(TFLA)与益生菌制剂(合生素)组合，然后在对照、单个的TFLA和合生素制剂之间比较几个生理学参数的活性。对(a)高糖饮食(HSD)处理的果蝇在(i)体重、(ii)循环的葡萄糖和(iii)总的葡萄糖的变化方面，或者对(b)高脂饮食(HFD)处理的果蝇其包括(i)体重、(ii)总的葡萄糖和(iii)总的甘油三酯测量代谢反应。所有数值都表示为普通饮食(黑灰条)果蝇或饮食挑战的饮食(浅灰条)果蝇两者中参数的全部枚举。用大肠杆菌(c)挑战合生素制剂处理过的果蝇急性口腔感染。概述了(i)存活率、(ii)抑菌圈直径以及(iii)双氧化酶、(iv)IMD、(v)抗菌肽A和(vi)蝇抗菌肽的基因表达。还用金黄色葡萄球菌(d)挑战合生素制剂处理过的果蝇急性口腔感染。概述了(i)存活率、(ii)抑菌圈直径以及(iii)双氧化酶、(iv)IMD、(v)抗菌肽A和(vi)蝇抗菌肽的基因表达。在未处理的(黑灰条)和过氧化氢挑战的(浅灰条)果蝇之间显示氧化应激(e)的总水平。显示了(i)存活率、(ii)总的氧化剂、(iii)超氧化物歧化酶(SOD)活性、(iv)谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性和(v)脂质过氧化水平。描述了阿尔茨海默病(AD)和帕金森病(PD)的人源化转基因果蝇模型(f)中对合生素处理应答的疾病途径的各种标志物。AD(i)和PD(ii)果蝇中的存活率显示为经过30天后存活的蝇数量。在AD(a)和PD(b)蝇中使用负趋地性测试测量运动性并且表示为50％的蝇到达10cm标记处所花费的时间。对AD而言，显示了包括(v)β淀粉样蛋白(Aβ)和乙酰胆碱酯酶(ACh)活性的疾病标志物，对PD果蝇而言，显示了总的多巴胺水平(vi)的疾病标志物。对AD(viii)和PD(ix)果蝇的代谢标志物描述为包括总的葡萄糖和总的甘油三酯水平与果蝇在第0天时作比较的百分比变化。AD(x)和PD(xi)果蝇的炎性标志物显示为在第30天和第0天之间双氧化酶、IMD、Relish、抗菌肽A、防御素和蝇抗菌肽的基因表达的百分比变化。AD(xii)和PD(xiii)果蝇的氧化应激概括为0天至30天之间百分比变化，测量总的氧化剂、SOD、GPx和LPO水平。最后，显示了AD(xiv)和PD(xv)中线粒体复合物活性，概括为对ETC复合物1直到4而言，0天至30天之间的％改变。在所有的情况下，每组代表n＝5个个体的样本，其中黑色星号(*)表示组间比较的显著性，灰色星号(*)表示与对照组作比较的显著性，*p<0.05和**p<0.01。

图6图示了益生菌、益生元或它们的组合的添加影响衰老黑腹果蝇中的代谢参数。测量衰老黑腹果蝇在第0天、10天、20天和30天包括(a)体重、(b)总的葡萄糖和(c)总的甘油三酯在内的代谢参数。每组包含n＝5个个体的组并且显著性表示为相对于第0天对照组的星号(*)，*p<0.05及**p<0.01和相对于处于相同的时间点未处理的对照的tau(τ)，其中τp<0.05。

图7图示了添加了益生菌制剂和合生素制剂的衰老黑腹果蝇中的糖尿病的基因标志物。在第0天、10天、20天和30天，分离15只蝇的样本用于RNA提取从而测量几种胰岛素信号基因的表达，即(a)果蝇胰岛素样肽(dilp)2、(b)dilp3、(c)胰岛素受体(InR)、(d)dAkt、(e)dTOR和(f)dFOXO。每组包含n＝5个个体的组并且显著性表示为相对于第0天对照组的星号(*)，*p<0.05及**p<0.01和相对于处于相同的时间点未处理的对照的tau(τ)，其中τp<0.05。

图8图示了添加了益生菌制剂和/或合生素制剂的衰老黑腹果蝇中的肥胖症的基因标志物。在第0天、10天、20天和30天，分离15只蝇的样本用于RNA提取从而测量脂肪代谢基因的表达，即(a)乙酰辅酶A羧化酶、(b)脂肪酸合成酶(FAS)、(c)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPCK)、(d)固醇调节元件结合蛋白(SREBP)、(e)脂质存储滴(Lsd)2和(f)E75。每组包含n＝5个个体的组并且显著性表示为相对于第0天对照组的星号(*)，*p<0.05及**p<0.01和相对于处于相同的时间点未处理的对照的tau(τ)，其中τp<0.05。

图9图示了黑腹果蝇中固有性免疫因子的年龄相关性变化被合生素制剂改善。在第0天、10天、20天和30天，检测添加了单个的益生菌、益生元或益生菌和/或益生元组合的介质上黑腹果蝇它们的免疫学反应。在带有(a)大肠杆菌和(b)金黄色葡萄球菌致病种类菌苔的平板上进行测量抗菌因子的产生的琼脂扩散试验。还检测几种免疫学基因的基因表达，所述免疫学基因包括(c)双氧化酶(duox)、(d)免疫缺陷(IMD)、(e)Relish、(f)抗菌肽A、(g)防御素和(h)蝇抗菌肽。每组包含n＝5个个体的组，相对于第0天对照组的显著性表示为星号(*)，*p<0.05和**p<0.01，相对于处于相同的时间点未处理的对照的tau(τ)，其中τp<0.05。

图10图示了益生菌制剂和合生素制剂对氧化应激的标志物具有组合效应。把单个的益生菌、益生元、益生菌或合生素制剂补充给黑腹果蝇并且在第0天、10天、20天和30天的寿命时测量(a)总的氧化剂、(b)超氧化物歧化酶活性、(c)谷胱甘肽过氧化物酶活性和(d)脂质过氧化的水平。还使用各种生化测定检测ETC(e)复合物1(NADH辅酶Q还原酶)、(f)复合物2(琥珀酸脱氢酶)、(g)复合物3(细胞色素bc1复合物)和(h)复合物4(细胞色素c氧化酶)的活性。每组包含n＝5组个体的25只蝇的组，相对于第0天对照组的显著性表示为星号(*)，*p<0.05和**p<0.01，相对于处于相同的时间点未处理的对照的tau(τ)，其中τp<0.05。

图11描述了影响衰老因素的肠道菌群-宿主交流的机制的模型。肠道菌群经由直接的和间接的机制与代谢、炎性和氧化应激途径交流。因为所有这三种轴中生理学的改变是交叉调节的，肠道菌群所施加的同时的作用使其强有力地干预衰老和年龄相关的慢性疾病发展。

缩略语：胰高血糖素样肽(GLP)-1、胰岛素受体(IR)、胰岛素受体底物(IRS)-1、磷脂酰肌醇三激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、雷帕霉素的靶标(TOR)、叉头框O蛋白(FOXO)、固醇调节元件结合蛋白(SREBP)、乙酰基CoA羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、紧密连接蛋白(TJPs)、脂多糖(LPS)、toll样受体(TLR)4、激活的B细胞的核因子卡帕轻链增强剂(NF-kB)、激活蛋白(AP)-1、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、T辅助(Th)17、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、过氧化物酶体增殖激活受体共激活剂(PGC)-1α、去乙酰化酶(SIRT)、活性氧类(ROS)。

不同附图中相同的附图标号表示相同的要素。

详述

在可选的实施方案中，提供了益生菌制剂，包括包含所述益生菌制剂的组合物、制造品和试剂盒以及使用它们的方法，其用于代谢和氧化应激、炎症和神经退行性变的治疗、改善、预防和/或缓解(例如减少其症状)。在可选的实施方案中，本文所提供的益生菌制剂用于治疗、改善、预防和/或缓解(例如减少其症状)诸如糖尿病和肥胖症的代谢疾病，诸如炎症性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)的炎症性疾病；关节炎；诸如阿尔茨海默病和帕金森病的神经退行性疾病，包括抵抗氧化应激的氧化应激和包括减少炎症的炎症。在可选的实施方案中，本文所提供的益生菌制剂用于降低血液的和总的葡萄糖水平、降低甘油三酯水平和管理胰岛素抵抗。

在可选的实施方案中，本文所提供的益生菌制剂由以下三种益生菌菌株的任何组合组成：发酵乳杆菌NCIMB 5221、植物乳杆菌NCIMB 8826和婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255。

已经证明本文所提供的益生菌制剂对于抵抗氧化应激、减少炎症、降低血液的和总的葡萄糖水平、降低甘油三酯水平和管理胰岛素抵抗有效。

在可选的实施方案中，本文所提供的益生菌制剂与三果宝、或任何草本rasayana配方组合，所述草本rasayana配方由相对等份的三种不含籽的榄仁树属干果组成：庵摩勒(余甘子(Emblica officinalis))、毗黎勒(毛诃子(Terminalia bellirica))和诃黎勒(诃子(Terminalia chebula))。在可选的实施方案中，三果宝的使用改善了本文所提供的益生菌制剂的效力。该实施方案提供了新颖的益生菌和合生素制剂。

在可选的实施方案中，包括与三果宝或任何草本rasayana配方组合的益生菌制剂在内，所述草本rasayana配方由相对等份的三种不含籽的榄仁树属干果组成：庵摩勒(余甘子)、毗黎勒(毛诃子)和诃黎勒(诃子)，本文所提供的益生菌制剂提供了通过治愈肠道菌群和有益地改变涉及肠-脑轴信号的信号转导途径，对管理与年龄相关的和与饮食相关的慢性疾病而言有效的方案。

在可选的实施方案中，益生菌制剂还包含下列微生物及其全部菌株中的任何一种或几种(例如，多种中的一种、两种、三种、四种或五种)：发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)11976，莱希曼乳杆菌(Lactobacillus leichmanni)NCIMB 7854，香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)NCIMB 11717，发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)NCFB1751，发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)NCIMB 2797，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)NCIMB 11951，耐酸乳杆菌(L.acetotolerans)，酸面乳杆菌(L.acidifarinae)，酸鱼乳杆菌(L.acidipiscis)，嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)，敏捷乳杆菌(L.agilis)，低温乳杆菌(L.algidus)，消化乳杆菌(L.alimentarius)，解淀粉乳杆菌(L.amylolyticus)、嗜淀粉乳杆菌(L.amylophilus)，发酵淀粉乳杆菌(L.amylotrophicus)，食淀粉乳杆菌(L.amylovorus)，动物乳杆菌(L.animali)，胃窦乳杆菌(L.antri)，田鼠乳杆菌(L.apodemi)，鸟乳杆菌(L.aviaries)，双发酵菌乳杆菌(L.bifermentans)，短乳杆菌(L.brevis)，布氏乳杆菌(L.buchneri)，茶叶乳杆菌(L.camelliae)，干酪乳杆菌(L.casei)，链状乳杆菌(L.catenaformis)，鲸乳杆菌(L.ceti)，人阴道乳杆菌(L.coleohominis)，丘状菌落乳杆菌(L.collinoides)，堆肥乳杆菌(L.composti)，曲面乳杆菌(L.concavus)，棒状乳杆菌(L.coryniformis)，卷曲乳杆菌(L.crispatus)，面包乳杆菌(L.crustorum)，弯曲乳杆菌(L.curvatus)，德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.delbrueckii subsp.bulgaricus)，德氏乳杆菌德氏亚种(L.delbrueckiisubsp.delbrueckii)，德氏乳杆菌乳亚种(L.delbrueckii subsp.lactis)，糊精乳杆菌(L.dextrinicus)，食二酸乳杆菌(L.diolivorans)，马乳杆菌(L.equi)，驯马乳杆菌(L.equigenerosi)，谷糠乳杆菌(L.farraginis)，香肠乳杆菌(L.farciminis)，发酵乳杆菌(L.fermentum)，近茎轴乳杆菌(L.fornicalis)，食果糖乳杆菌(L.fructivorans)，谷物乳杆菌(L.frumenti)，府中乳杆菌(L.fuchuensis)，母鸡乳杆菌(L.gallinarum)，加氏乳杆菌(L.gasseri)，胃乳杆菌(L.gastricus)，加纳乳杆菌(L.ghanensis)，草乳杆菌(L.gramini)，黑氏乳杆菌(L.hammesii)，仓鼠乳杆菌(L.hamster)，哈尔滨乳杆菌(L.harbinensis)，早来乳杆菌(L.hayakitensis)，瑞士乳杆菌(L.helveticus)，稀氏乳杆菌(L.hilgardii)，同型腐酒乳杆菌(L.homohiochii)，懒惰乳杆菌(L.iners)，果囊乳杆菌(L.ingluviei)，肠乳杆菌(L.intestinalis)，詹氏乳杆菌(L.jensenii)，约氏乳杆菌(L.johnsonii)，卡利克斯镇乳杆菌(L.kalixensis)，产马乳酒样乳杆菌(L.kefiranofaciens)，高加索酸奶乳杆菌(L.kefiri)，韩泡菜乳杆菌(L.kimchii)，北里氏乳杆菌(L.kitasatonis)，昆仑乳杆菌(L.kunkeei)，莱氏曼氏乳杆菌(L.leichmannii)，林氏乳杆菌(L.lindneri)，坏发酵乳杆菌(L.malefermentans)，苹果乳杆菌(L.mali)，食木薯乳杆菌(L.manihotivorans)，明登乳杆菌(L.mindensis)，黏膜乳杆菌(L.mucosae)，鼠乳杆菌(L.murinus)，内氏乳杆菌(L.nagelii)，那幕尔乳杆菌(L.namurensis)，南特港乳杆菌(L.nantensis)，寡发酵乳杆菌(L.oligofermentans)，口乳杆菌(L.oris)，面包乳杆菌(L.panis)，美洲虎乳杆菌(L.pantheris)，类短乳杆菌(L.parabrevis)，类布氏乳杆菌(L.parabuchneri)，类干酪乳杆菌(L.paracasei)，类丘状乳杆菌(L.paracollinoides)，类谷糠乳杆菌(L.parafarraginis)，类高加索酸奶乳杆菌(L.parakefiri)，类消化乳杆菌(L.paralimentarius)，类植物乳杆菌(L.paraplantarum)，戊糖乳杆菌(L.pentosus)，恶味乳杆菌(L.perolens)，植物乳杆菌(L.plantarum)，桥乳杆菌(L.pontis)，保护乳杆菌(L.protectus)，鹦鹉乳杆菌(L.psittaci)，蛋白原酶乳杆菌(L.rennini)，罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，龈沟乳杆菌(L.rimae)，罗氏乳杆菌(L.rogosa)，罗西氏乳杆菌(L.rossiae)，瘤胃乳杆菌(L.ruminis)，神话猪乳杆菌(L.saerimneri)，清酒乳杆菌(L.sakei)，唾液乳杆菌(L.salivarius)，旧金山乳杆菌(L.sanfranciscensis)，红条乳杆菌(L.satsumensis)，嗜黑麦乳杆菌(L.secaliphilus)，沙氏乳杆菌(L.sharpeae)，白面粉乳杆菌(L.siliginis)，斯比氏乳杆菌(L.spicheri)，瓦斯比乳杆菌(L.suebicus)，泰国乳杆菌(L.thailandensis)，厄尔纳拉乳杆菌(L.ultunensis)，牛粪乳杆菌(L.vaccinostercus)，阴道乳杆菌(L.vaginalis)，费尔斯莫尔德镇乳杆菌(L.versmoldensis)，酒杆菌(L.vini)，犊牛乳杆菌(L.vitulinus)，玉米乳杆菌(L.zeae)，老面乳杆菌(L.zymae)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FMCC 193，枯草芽孢杆菌FMCC 267，枯草芽孢杆菌FMCC PL-1，枯草芽孢杆菌FMCC 511，枯草芽孢杆菌NCIMB11034，枯草芽孢杆菌NCIMB 3610，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)ATCC 7661，球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)ATCC 14577和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC14580，乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)，婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)，青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)，角形双歧杆菌(Bifidobacteriumangulatum)，短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)，链状双歧杆菌(Bifidobacteriumcatenulatum)，龋齿双歧杆菌(Bifidobacterium denticolens)，齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)，高卢双歧杆菌(Bifidobacterium gallicum)，奇异双歧杆菌(Bifidobacterium inopinatum)，假小链双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)，乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)，最小双歧杆菌(Bifidobacterium minimum)，细长双歧杆菌(Bifidobacterium subtile)，嗜热酸双歧杆菌(Bifidobacterium thermacidophilum)，动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)，星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroids)，布氏双歧杆菌(Bifidobacterium bourn)，小猪双歧杆菌(Bifidobacterium choerinum)，棒状双歧杆菌(Bifidobacteriumcoryneforme)，家兔双歧杆菌(Bifidobacterium cuniculi)，鸡胚双歧杆菌(Bifidobacterium gallinarum)，印度双歧杆菌(Bifidobacterium indicum)，大双歧杆菌(Bifidobacterium magnum)，瘤胃双歧杆菌(Bifidobacterium merycicum)，假长双歧杆菌假长亚种(Bifidobacteriumpseudolongum subsp Pseudolongum)，假长双歧杆菌球亚种(Bifidobacterium pseudolongum subsp Globosum)，小鸡双歧杆菌(Bifidobacteriumpullorum)，反刍双歧杆菌(Bifidobacterium ruminantium)，世纪双歧杆菌(Bifidobacterium saeculare)，猪双歧杆菌(Bifidobacterium suis)，嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)或选自以下的酵母细胞：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)，薛瓦酵母(Saccharomyceschevalieri)，德尔布酵母(accharomyces delbrueckii)，少孢酵母(accharomycesexiguous)，发酵性酵母(Saccharomycesfermentati)，洛格酵母(Saccharomyces logos)，蜂蜜酵母(Saccharomyces mellis)，卵形酵母(Saccharomyces oviformis)，罗氏酵母(Saccharomyces rosei)，鲁氏酵母(Saccharomyces rouxu)，清酒酵母(Saccharomycessake)，葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)，威尔酵母(Saccharomyces willianus)，酵母属(Saccharomyces sp)，八孢裂殖酵母(Schizosaccharomyces octosporus)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，红掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)，白色球拟酵母(Torulopsis Candida)，无名球拟酵母(Torulopsisfamta)，球拟圆酵母(Torulopsisglobosa)，平常球拟酵母(Torulopsis inconspicua)，丝孢酵母(Trichosporonbehrendu)，头状丝孢酵母(Trichosporon capitatum)，皮状丝孢酵母(Trichosporoncutaneum)，荧光威客酵母(Wickerhamiafluoresens)，树状假丝酵母(Candida arborea)，克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)，朗比可假丝酵母(Candida lambica)，解脂假丝酵母(Candida lipolytica)，近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)，铁红假丝酵母(Candidapulcherrima)，皱褶假丝酵母(Candida rugousa)，热带假丝酵母(Candidatropicalis)，产朊假丝酵母(Candida utilis)，阿舒多囊霉(Crebrothecium ashbyu)，白地霉(Geotrichum candidum)，异常汉逊酵母(Hansenula anomala)，阿拉伯糖醇汉逊酵母(Hansenula arabitolgens)，杰丁汉逊氏酵母(Hansenula jadinii)，土星汉逊酵母(Hansenula saturnus)，施氏汉逊酵母(Hansenula schneggn)，亚膜汉逊酵母(Hansenulasubpelliculosa)，柠檬形克勒克酵母(Kloeckera apiculata)，斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)，粉状gnauhznef毕赤酵母(Pichia farinosa)，璞膜毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)，圆红冬孢酵母(Rhodospoπdium toruloides)，粘红酵母(Rhodotorula glutinis)，小红酵母(Rhodotorula minuta)，红酵母(Rhodotorularubar)，橙黄红酵母(Rhodotorula aurantiaca)，路德类酵母(Saccharomycodesludwigii)，中国类酵母(Saccharomycodes sinenses)，汉森酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae Hansen)AS2 375、AS2 501、AS2 502、AS2 503、AS2 504、AS2 535、AS2 558、AS2560、AS2 561、AS2 562或IFFI1048，或卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensisHansen)AS2 420和AS2 444，以及任何其等价物或其组合。

在可选的实施方案中，益生菌制剂还包含下列益生菌或益生菌样物质中的任一种或几种(例如多种中的一种、两种、三种、四种或五种)，其包括例如：果寡糖，半乳寡聚糖，葡萄糖，半乳糖，木糖，麦芽糖，蔗糖，乳糖，淀粉，木聚糖，半纤维素，菊粉，橡胶，人参(Panaxginseng，红色的，高丽参)，人参(白色的，中国参)，红景天(Rhodiola rosea，金色的根)，西洋参(Panax quinquefolium，美国参)，刺五加(Eleutherococcus senticosus，西伯利亚参)，洋蓟(Cynara scolymus，朝鲜蓟)，钩藤(Uncaria tomentosa，猫爪藤)，迈因葶苈(Lepidium meyenii，玛咖，秘鲁参)，瓜拉纳(Paullinia cupana，瓜拉那)，龙血巴豆(Croton lechleri，圣格雷德格拉多)，催眠睡茄(Withania somnifera，南非醉茄，印度人参)，竹节参(Panaxjaponicus，日本参)，越南人参(Panax vietnamensis，越南的人参)，三叶人参(Panax trifolius)，假人参(Panax pseudoginseng)，三七(Panax notoginseng)，西印度樱桃(Malpighia glabra，金虎尾)，巴拉圭草(Ylex paraguayiensis，巴拉圭茶)，膜荚黄芪(Astragalus membranaceus，黄芪)，甜叶菊(Stevia rebaudiana，甜菊属)，巴西人参(Pfaffia paniculata，巴西人参，苏马)，银杏(Ginkgo biloba)，斑叶钟花树(Tabebuiaimpetiginosa，保哥果)，紫锥菊(Echinacea purpurea)，波尔多树(Peumus boldus，波尔多)，绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum，绞股蓝，又称南方人参或仙草)，萨瑟兰迪亚灌木(Sutherlandia frutescens，非洲人参)，芦荟(Aloe vera，芦荟)，盐生肉苁蓉(Cistanchesalsa)，肉苁蓉(Cistanche deserticola，和其他肉苁蓉属)，党参(Codonopsispilosula，“穷人的人参”)，南美仙人掌(Nopal opuntia，梨果仙人掌)，橙子(Citrus sinensis，酸橙)和柑橘属家族的其他成员(柠檬，青柠，橘子，葡萄柚)，茶树(Camelia sinensis，茶)，洋车前草(Plantago psyllium，车前子)，苋菜(Amaranth edulis)和其他苋属植物(amaranthsp，苋菜)，印度没药(Commiphora mukul，印度香胶树脂)，锯棕榈(Serenoa repens)，锯叶棕榈(Serenoa serrulata，锯棕榈)，冬虫夏草(Cordyceps sinensis，蛹虫草)，香菇(Lentinula edodes，香菇)，韩芝(Ganoderma lucidium，瑞草)，灰树花(Grifola rondosa，舞茸)，白木耳(Tremella fuciformis，银耳)，茯苓(Poria cocos，茯苓)，猴头菇(Hericiumerinaceus，狮子的鬃毛)，姬松茸(Agaricus blazei，阳光蘑菇)，裂蹄木层孔菌(Phellinuslinteus，桑黄多孔菌)，杂色云芝(Trametes versicolor)，云芝(Coriolus versicolor，火鸡尾)，裂褶菌(Schizophyllum commune，白参菌)，桦褐孔菌(Inonotus obliquus，火山渣锥)，燕麦麸，米糠，亚麻籽，大蒜，长角豆(Ceratonia siliqua，槐豆胶或来源于角豆树的籽的粉状物)，关华豆(Cyanopsis tetragonoloba，瓜尔豆胶，欧盟食品添加剂编码E412)，野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris，黄原胶)，及其任何等价物或其组合。

在可选的实施方案中，本文所提供的制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒预防性地和/或治疗性地用于患有II型糖尿病或胰岛素抵抗的动物(例如动物模型)和人类；任选地，通过降低总的和循环的葡萄糖水平、甘油三酯水平、总体重、炎症、氧化应激和/或任何线粒体的功能障碍。

在可选的实施方案中，本文所提供的制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒，通过降低总的体重、甘油三酯水平、葡萄糖水平、胰岛素抵抗、炎症、氧化应激和/或线粒体的功能障碍，预防性地和/或治疗性地用于患有肥胖症、高脂血症或超重的动物(例如动物模型)和人类。

在可选的实施方案中，本文所提供的制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒，通过降低循环的炎性标志物(细胞因子、趋化因子等)，预防性地和/或治疗性地用于患有包括病原体感染、关节炎、炎症性肠病、炎症性肠综合征、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和炎性衰老的症状在内的炎症性疾病的动物(例如动物模型)和人类。

在可选的实施方案中，本文所提供的制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒，通过降低总的氧化剂计数、脂质过氧化和增加超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性，预防性地和/或治疗性地用于患有急性和/或慢性氧化应激的动物(例如，动物模型)和人类。

在可选的实施方案中，本文所提供的制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒，通过降低代谢疾病(例如高糖、高甘油三酯、肥胖症、胰岛素抵抗)，炎症，氧化应激并通过影响线粒体的电子链复合物的活性，预防性地和/或治疗性地用于患有包括阿尔茨海默病和帕金森病在内的神经退行性变的动物(例如动物模型)和人类。

在可选的实施方案中，本文所提供的益生菌制剂与任何其他的益生菌或益生元物质组合，任选地提供了增强效应，并且任选地对制剂针对前述参数的效力没有任何负作用。

参考本文所述的实施例将进一步描述本发明；然而，应理解的是本发明并不限于该等实施例。

实施例

黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)模型是用于评估人体中各种治疗的有效且可预测的模型，例如治疗饮食诱导的糖尿病/胰岛素抵抗和/或肥胖症/高脂血症；治疗或改善炎症；或治疗或改善急性应激；治疗或改善、或减慢包括阿尔茨海默病(AD)和帕金森病(PD)在内的神经退行性疾病的进展或发生。虽然黑腹果蝇可能较小，但是它们保留了大量的细胞和分子的人类同源性，包括基因表达的调节、膜运输、神经元连通、细胞信号、突触发生和细胞死亡。此外，果蝇(Drosophila)是高度遗传上可服从的，使其与更高等的生物体相比，对遗传性疾病建模更可行。果蝇中最常见的表达转基因系统之一是UAS(上游激活系统)-Gal4系统，其通过由选择的启动子所驱动的Gal4的特异性细胞表达，允许驱动UAS元件的基因下游。事实上，75％与疾病有关的人类基因与蝇具有80-90％功能结构域保守性的功能性同源(Reiter,Potocki,Chien,Gribskov,&Bier,2001)。果蝇还有组织有序的大脑，虽然大脑的细胞较少且有不同的神经解剖学结构。果蝇的简单性可能是它的最显著的力量，因为哺乳动物中存在的功能冗余在蝇中没有广泛发现，这使得可以破译分子学途径。最后，它的短的生命周期和完全测序的基因组是生物体所拥有的另一实验优势(Sang&Jackson,2005)；也见于：Reiter等(2001)黑腹果蝇中人类疾病相关基因序列的系统分析。基因组研究，11(6),1114–1125。以及Sang,T.-K.等(2005)神经退行性疾病的果蝇模型。神经学综述：美国实验性神经疗法协会，2(3),438–446。

实施例1：用于治疗糖尿病和肥胖症的实例性组合物

下列的实施例展示了实例性益生菌制剂对于治疗或改善糖尿病和肥胖症的效力。

我们已经概述了通过概述益生菌如何与宿主生理机能交流的机理研究所支持的被益生菌制剂积极影响的糖尿病和肥胖症的几种参数，该等机理研究支持益生菌治疗的强劲特性。我们评估了本文所提供的实例性益生菌制剂在影响本领域可接受的黑腹果蝇的模型中饮食诱导的糖尿病/胰岛素抵抗或肥胖症/高脂血症的生理学属性的能力。

方法

细菌培养

在37℃下，在MRS-琼脂平板或液体培养基中，将来自于冷冻甘油储物的细菌培养物(Lp8826,Lf5221,Bi702255)在获取于Sigma Aldrich(Oakville,ON,Canada)的Man-Rogosa-Sharpe(MRS)培养基中培养。进行一轮的液体培养后，在含有20％(v/v)甘油的MRS中制备几种细菌储物并且作为工作储物在-80℃下储存。因为所有实验都需要不断培养才能进行，每两周从冷冻储物更新一次细菌储物以保持培养物的纯度。为了进行每一单个的实验，将1％(v/v)接种物用于传代培养，在37℃下接种18小时并且在使用前立即移除。为了准备单个的果蝇治疗瓶，在4℃下以4000rpm离心过夜培养物10分钟。洗涤一次团粒并且再悬浮在0.85％(w/v)无菌的生理盐水中。与MRS平板上的集落形成单元(CFU)的标准曲线作比较，通过分光光度法确定总的集落计数。

果蝇喂养

从布卢明顿果蝇储备中心(印第安纳州大学，布卢明顿市印第安纳州)获得野生型黑腹果蝇(Oregon R)。将蝇喂养在无活性的酵母培养物的标准燕麦片-蔗糖-酵母培养基上，通过在蒸馏水中将燕麦片(83g)、蔗糖(50g)和酵母提取物(30g)煮沸30分钟制备所述培养基。将果蝇保存在25℃12h:12h光照-黑暗循环的受控条件下。通过将浓缩的细菌培养物分开到冷却的但仍然还是液体的培养基中来制备接种培养基。在通过每日CFU计数可检测出浓度损失之前，认为细菌可在果蝇培养基中存活长达2周。还可以通过实时PCR定量来核实在蝇的GIT中接种的菌株的存活率。尽管如此，在实验期间要每3至4天将蝇转移到刚接种的瓶子以确保纯的益生菌细菌的不断接种。

在包含对照培养基，或包含1.0x 10⁹CFU/ml的每个细菌的益生菌制剂的培养基上使新鲜封存的蝇适应7天，所述对照培养基是用3.0x10⁹CFU/ml的单一细菌(Lp8826,Lf5221,Bi702255)接种的培养基。根据实验程序，每组由5个独立的样本组成，每个样本有20至50只蝇。在环境适应和肠道菌群的正确构建后，将蝇转移到添加了高糖饮食(HSD)或高脂饮食(HFD)的相似处理过的培养基中，所述高糖饮食包含1M蔗糖，所述高脂饮食包含除了正常的培养基外，还包含30％椰子油。允许蝇在新处理的培养基上喂养10天，然后在处理前将它们麻醉，称重，在10％漂白液中冲洗并且水中冲洗三次。

生理学代谢参数

评估刚麻醉的蝇的生理学参数。通过称重10只蝇(重复5次)来评估体重。葡萄糖的测量均取自果蝇的血淋巴(循环葡萄糖)和全身匀浆。在测量前，在70℃下加热处理匀浆20分钟以去除任何复合物。根据制造商的说明，使用葡萄糖(HK)测定试剂盒(Sigma,Oakvilla,ON,Canada)在2μl血淋巴或5μl全身匀浆中测量葡萄糖水平。根据制造商的说明，使用甘油三酯测定试剂盒(终点法)(Stanbio,TX,USA)在10μl匀浆中确定全身甘油三酯。每一样本中的测量值均标准化至蛋白含量并且使用Turkey事后分析法的双因素方差分析计算统计学差异。

基因表达分析

根据制造商的说明，使用Trizol(ThermoFisher,MA,USA)从整只蝇中提取RNA。根据制造商的说明，使用高容量cDNA合成试剂盒(ThermoFisher,MA,USA)，从用ND-2000分光光度计(FisherScientific,Ottawa,ON,Canada)测量的1μg RNA合成cDNA。使用SybrGreen检测方法(Diamed,Mississauga,ON,Canada)在Eco实时PCR系统(Illumina,CA,USA)上进行实时PCR并且根据2-ddCT方法，Rp49作为参考标准，进行定量。引物对和退火温度列举于表1中：

表1：引物对和退火温度

统计

使用R统计学软件进行所有的统计。对所有组进行Turkey事后分析法的多变量双因素方差分析。p<0.05确定具有显著性。

结果与讨论

测量用以评估HSD(仿效饮食诱导的糖尿病)或HFD(仿效肥胖症)对果蝇的影响的生理学参数包括1)总体重、2)循环的葡萄糖、3)总的葡萄糖和4)总的甘油三酯。在HSD蝇中，对照组果蝇的总体重增加了32.4％(图1a)。Lp8826、Lf5221和Bi702255分别将该升高显著地降低到9.8％、14.3％和3.4％，与此同时益生菌制剂将增加的总体重减少了18.1％。正如对糖尿病表型的预期，对照组果蝇中的循环葡萄糖水平急剧上升了78.7％(图1b)。这一升高显著地高于Bi702255和益生菌制剂组，所述Bi702255和益生菌制剂组显示了循环葡萄糖水平与未治疗的对照组相比分别降低了2.2％和5.7％。对循环的葡萄糖的测量而言，与Lp8826和Lf5221单一的益生菌治疗相比，益生菌制剂更有效地减少葡萄糖水平。相似地，总的葡萄糖水平在HSD对照组中显著地增高了151.4％(图1c)。这一升高显著高于Lf5221、Bi702255和益生菌制剂组，所述Lf5221、Bi702255和益生菌制剂组与对照组相比，分别显示了41.0％、71.0％和58.7％的升高。总之，益生菌制剂不断证明了降低饮食诱导的糖尿病的生理参数的能力，虽然不是达到比单个益生菌更好的程度。尽管某些单个的益生菌显示了与益生菌制剂相同程度地减少糖尿病的生理学参数，但是没有一种益生菌能始终如一地将所有参数降低到与益生菌制剂相同的水平，这表明该制剂能够有力地治疗饮食诱导的糖尿病的所有方面。

在HFD喂养的黑腹果蝇中，对照组的总体重显著增加了41.0％(图1d)。这一增加显著地高于Lp8826、Bi702255和益生菌制剂组，所述Lp8826、Bi702255和益生菌制剂组与对照组相比较，分别显示了20.4％、11.9％和9.1％的重量增加。对照组蝇的总的葡萄糖水平升高了148％(图1e)，其显著地高于任何单个的益生菌或益生菌制剂。值得注意的是，与Lp8826和Bi702255组相比较，益生菌制剂显示了显著更低的总的葡萄糖水平(高出未治疗的对照组31.0％)。最后，HFD喂养的果蝇对照组的总的甘油三酯显著地升高了187％(图1f)。这一增加显著地高于Lf5221、Bi702255和益生菌制剂所治疗的果蝇，所述Lf5221、Bi702255和益生菌制剂所治疗的果蝇分别显示了119.0％、91.2％和32.3％的总的甘油三酯增加。值得注意的是，与任何单个的益生菌治疗组相比较，益生菌制剂显示了最小程度的总的甘油三酯的增加，这表明了累积效应。再次地，尽管某些单个的益生菌显示了与益生菌制剂相似的减少饮食诱导的肥胖症的生理学参数的能力，但是没有一种益生菌能如益生菌制剂一样强有力地降低所有肥胖症的生理学的参数。

通过实时PCR评估胰岛素信号、脂肪酸代谢和它们潜在的信号途径的各种遗传标志物。所有报告的数值都表示为与对照组蝇(相同的益生菌治疗但是正常饮食)相比的百分比变化。特别重要的是，HSD对照组果蝇的胰岛素受体(InR)基因的表达升高了148.1％，其显著地高于Lp8826治疗的蝇(7.0％的增加)或益生菌制剂治疗的蝇(6.5％的增加)。相似地，HSD喂养的对照组蝇中胰岛素效应分子(果蝇胰岛素样肽；dilp)显著地升高了174.7％(dilp2)和118.2％(dilp3)。对照组果蝇的dilp2的升高显著地高于Lp8826(13.0％的增加)、Lf5221(24.3％的增加)或益生菌制剂，所述益生菌制剂其实际上显示了dilp2表达减少了58.3％，显著地低于任何其他单个的益生菌。相似地，益生菌制剂显著地减少了37.2％的dilp3表达，这显著地低于任何单个的益生菌治疗组。这提示在减少导致胰岛素抵抗的HSD诱导的遗传变异方面，益生菌制剂比单个的益生菌有效得多，所述单个的益生菌仅仅对糖尿病的关键标志物具有轻微的和不一致的影响。

更仔细地分析结果，益生菌制剂还显著地影响胰岛素信号途径的下游，如典型的Akt-TOR-FOXO途径。在HSD对照组蝇中dAkt显著地升高了241.0％，这显著地高于每一单个的益生菌治疗组Lp8826(33.3％的增加)、Lf5221(83.6％的增加)和Bi702255(130.4％的增加)。与正常的对照饮食相比，益生菌制剂完全降低了HSD喂养的蝇的dAkt信号的增加，这显著地低于每一单个的益生菌。HSD饮食喂养的果蝇对照组中dTOR也显著地增加(164.1％)。如完全挽救了dTOR表达的升高的益生菌制剂一样，每一单个的益生菌制剂Lp8826(1.5％的增加)、Lf5221(3.0％的减少)和Bi702255(68.3％的增加)显著地减少了这一升高。注意到转录因子dFOXO有相似的现象，其被HSD饮食显著地减少了62.5％，这一减少显著地低于Lf5221(4.7％)并且特别是益生菌制剂，其再次完全地挽救了dFOXO表达的减少。

在HFD喂养的果蝇中在脂肪酸氧化基因的调节中观察到相似的趋势。通过实时PCR评估脂肪酸合成(SREBP,ACC,FAS)、糖原异生(PEPCK)和甘油三酯含量的调节(E78和LSD)的几种遗传标志物。HFD喂养的蝇对照组中，乙酰基辅酶A羧化酶(ACC)升高了79.9％，其显著地高于用Lf5221(0.8％的增加)或用Bi702255(27.8％的增加)治疗的果蝇。益生菌制剂挽救了ACC的表达，其显著地低于每一单个的益生菌。HSD喂养的果蝇对照组中，脂肪酸合成酶(FAS)也显著地升高了82.1％。这一升高显著高于用Lf5221(26.7％的减少)治疗的果蝇或用益生菌制剂治疗的果蝇(挽救了HFD-喂养的果蝇中FAS的表达)。HFD喂养的果蝇对照组中，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)显著地上调了239.8％。这一升高显著高于任何单个的益生菌Lp8826(36.8％的增加)、Lf5221(49.9％的增加)和Bi702255(165.8％的增加)；然而，PEPCK表达被益生菌制剂完全地挽救，其显著低于任何个体的益生菌。

观察上游调节因子，在HFD喂养的果蝇对照组中，调节所有的前述脂肪酸氧化基因的表达的固醇调节元件结合蛋白(SREBP)升高了165.0％。如同益生菌制剂(114.2％的增加)一样，每一单个的益生菌Lf5221(109.1％的增加)、Lp8826(51.7％的增加)和Bi702255(42.1％的减少)显著地减少这一升高。对照组中果蝇的dTOR也被显著上调了(93.7％)，其显著高于每一单个的益生菌Lp8826(52.0％的增加)、Lf5221(5.9％的减少)和Bi702255(29.3％的增加)并且被益生菌制剂完全地挽救。果蝇中的蜕化素诱导蛋白78(E78)为核受体，与Rev-erbα和PPARγ相似，已知的是其参与果蝇的能量调节。HFD处理的果蝇对照组中E78被升高了253.6％，其被Lf5221(53.7％的增加)和Bi702255(84.1％的增加)显著减少而且被Lp8826和益生菌制剂挽救。最后，果蝇脂质存储滴(LSD)2控制蝇的脂肪体中甘油三酯的存储。对照组HFD果蝇的LSD2升高了169.8％，其只有在益生菌制剂治疗的果蝇中减少(7.5％的增加)。对糖尿病和肥胖症的遗传标志物检查时，发现了如生理学标志物一样地相似的现象，因为益生菌制剂更为强有力地且始终一致地挽救了疾病标志物，然而单个的益生菌对基因表达只有不一致的影响。

结论

测试的单个的益生菌(Lp8826,Lf5221和Bi702255)对果蝇中饮食诱导的糖尿病的各种标志物都具有一些疗效；然而，它们的作用在测试的所有参数中是不一致的并且限制于潜在的遗传途径的一种或两种。胰岛素信号是动态的具有天然的稳健性的多途径系统，因此最大的益处来自于一致地减少经典的信号途径(InR-Akt-TOR-FOXO)，同时控制胰岛素和胰岛素效应因子(dilps)的表达。相似地，对于脂肪酸氧化而言，存在着几种调节水平来控制脂肪酸在脂肪组织中的积累，通过益生菌制剂其被同时靶向作用最有效地控制。在这种情况下，益生菌制剂对糖尿病和肥胖症的生理学参数和遗传参数提供了更加完全的、始终如一的和可靠的影响，这表明本文所提供的实例性Lp8826、Lf5221和Bi702255制剂比单个的益生菌在治疗整个疾病病理学方面更佳。

实施例2：用于治疗炎症的实例性组合物

下列的实施例阐明了实例性益生菌制剂用于治疗或改善炎症的效力。

为测试黑腹果蝇的炎症抵抗，用益生菌制剂处理它们并且用革兰氏阴性细菌(大肠杆菌)或革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌)的口腔细菌感染挑战它们。对包括存活率和抗菌剂的产生在内的基本的免疫参数以及免疫激活的遗传标志物进行评价。

方法

菌株

在-80℃下，将两种致病菌株，大肠杆菌ATCC 8739(革兰氏阴性致病菌)和金黄色葡萄球菌ATCC10832(革兰氏阳性致病菌)保持在20％甘油储备液中直到划线在包含3g/L牛肉膏和5g/L蛋白胨的营养琼脂平板上，调整到pH 7.0(营养肉汤；NB)。将集落接种到NB并且在37℃下震荡(250rpm)生长18小时。以1％接种物将过夜的集落接种到NB中并且将细菌悬浮液分离以用于并入到果蝇培养基或涂抹在营养琼脂平板上。

口腔感染

羽化后即刻转移蝇至添加了益生菌(Lp8826、Lf5221、Bi702255或益生菌制剂)的培养基。10天后，以0、1.0x10⁹、5.0x10⁹或1.0x10¹⁰CFU/ml的量，将蝇转移到包含益生菌疗法和大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的培养基。测量从金黄色葡萄球菌或大肠杆菌接种的培养基上分离的10只蝇的存活率(三次)，并且记录50％的蝇死亡所花费的时间。否则，就将蝇保持在培养基上5天(对照组中约50％的死亡率所需的时间)，然后移除蝇，在置于-80°下用于进一步的处理前，在10％漂白液和3x蒸馏水中冲洗。

琼脂盘扩散测定

为评估蝇的直接抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长的能力，将来自于包含益生菌疗法的培养基上喂养了10天的蝇的血淋巴置于TSC-琼脂平板上的金黄色葡萄球菌或大肠杆菌的菌苔。为分离血淋巴，用细针在胸腔部位刺穿50只蝇并且置于小的带有若干空洞的微量离心管中，再放入较大的微量离心管。在4℃下以3000x g离心刺穿的蝇20分钟以去除足够的血淋巴用于分析。用无菌盐水稀释血淋巴(20μl)至50μl并且用移液器吸取到位于刚涂满了100μl过夜的金黄色葡萄球菌或大肠杆菌溶液的营养琼脂平板的5mm无菌滤纸环。将带有血淋巴饱和滤纸的接种平板置于37℃下24小时，然后测量抑菌圈。每一处理都在单独的营养琼脂平板上重复三次。

实时PCR

如代谢部分中所述，进行mRNA分离、cDNA合成和实时PCR。用于炎性标志物的分析的特异的引物概括于表2中：

表2：用于炎性标志物的分析的引物

结果

存活率

正如预期的，喂食大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的对照组中存在着存活率呈剂量依赖性下降。随着大肠杆菌的浓度由1.0x 10⁹、5.0x 10⁹升高到1.0x 10¹⁰CFU/ml，对照组中50％存活率分别从7.8天、3.1天下降到2.5天(图2a；p<0.01)。在所有的治疗组中，尽管不同的组有不同的程度，但都存在着存活率呈剂量依赖性下降。1.0x 10⁹CFU/ml大肠杆菌组在不同治疗之间差异不大，然而在5.0x 10⁹CFU/ml大肠杆菌组中，对Bi702255和益生菌制剂组而言，存在着显著增加的存活率(图2a；p<0.01)。在1.0x10¹⁰ CFU/ml组中，只有在三重制剂组中存在着显著增加的存活率(图2a,p<0.01)，这表明了对抗大肠杆菌挑战的协同免疫效果。

口腔感染金黄色葡萄球菌的果蝇的存活率与感染大肠杆菌的果蝇相似。随着对照组中金黄色葡萄球菌的浓度由1.0x 10⁹、5.0x 10⁹升高到1.0x 10¹⁰CFU/ml，50％存活率分别从6.5天,2.8天下降到2.4天(图2b；p<0.01)，尽管在5.0x 10⁹和1.0x 10¹⁰CFU/ml组之间没有显著的差异。与大肠杆菌类似，1.0x 10⁹CFU/ml剂量组在各治疗组之间存活率没有显著的差异。然而，在5.0x10⁹ CFU/ml组，当被Bi702255或益生菌制剂治疗时，存在着显著增高的存活率(图2b,p<0.01)。在1.0x 10¹⁰CFU/ml剂量组，对所有治疗组而言，也都存在着显著增高的存活率，只是益生菌制剂组比单个的益生菌治疗组稍微更有效。

对每一益生菌疗法预处理的果蝇进行琼脂盘扩散测定，将其暴露于包含大肠杆菌或包含金黄色葡萄球菌的菌苔的平板。从果蝇分离血淋巴，并且将其斑点点涂在位于接种平板上的小滤纸盘。在大肠杆菌平板上，与未处理的对照组相比，Lp8826、Bi702255和益生菌制剂组中存在着显著增加的抑菌圈(图2c,p<0.01)。另外，益生菌制剂创建的抑菌圈大于每一单个的益生菌组，这表明了协同效应。相似地，对金黄色葡萄球菌接种的琼脂平板而言，在所有的治疗组中都有显著增加的抑菌圈(图2d；p<0.05)，而且益生菌制剂组与Lp8826和Lf5221组相比较具有更大的抑菌圈。总之，益生菌制剂抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的挑战比单个的益生菌种类更协同有效，这表明了它们在抑制革兰氏阴性细菌攻击和革兰氏阳性细菌攻击的潜力。

为评估分子水平上的免疫活性，通过实时PCR评估几种免疫激活的基因表达。基于已存在的存活率数据，选择大肠杆菌和金黄色葡萄球菌最佳的急性接种浓度为5.0x10⁹CFU/ml，并且只显示这一浓度下的遗传分析。为研究果蝇免疫反应的上游和第一反应元件，检测Duox、IMD和Relish的表达。双重氧化酶(Duox)是肠内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶家族的一员，其参与肠道菌群相互作用的几方面，如微生物的清除、肠上皮细胞更新和信号途径的氧化还原调整(例如见Kim&Lee,2014)。为对入侵的病原体和来自果蝇肠道菌群信号的应答，Duox在固有性免疫系统的任意分支中产生ROS颗粒清除那些病原体。典型地，伴随着免疫损伤，duox表达升高并且在大肠杆菌挑战的果蝇(197.1％的增加；图2e)和金黄色葡萄球菌挑战的果蝇(814％的增加；图2f)的对照组中精确地观察到这一结果。在大肠杆菌处理的果蝇中，所有治疗组都显著地减少了Duox表达水平，其中益生菌制剂组具有比Lf5221组显著低的Duox表达(图2e；p<0.01)。相似地，在金黄色葡萄球菌组中，所有治疗组都显著地减少了Duox表达(图2f；p<0.01)。

果蝇中免疫缺陷(IMD)因子被革兰氏阴性细菌感染的下游强烈地激活并且工作以引起包括细胞因子样Relish和AMPs抗菌肽A和双翅肽在内的效应分子的表达。如所预期的，大肠杆菌处理的对照组中存在IMD表达强烈地上调(165.4％的增加；图2g；p<0.01)。所有治疗组中的IMD表达被显著地下调，益生菌制剂具有比Lp8826和Lf5221组显著更大的影响。在金黄色葡萄球菌处理后，对照组果蝇中存在着显著的41.1％IMD表达的升高，其显著地高于Lp8826、Bi702255和益生菌制剂组(图2h；p<0.05)。值得注意的是，益生菌制剂减少IMD表达的程度高于Lf5221和Bi702255。

抗菌肽(AMPs)是果蝇免疫系统的效应分子并且由于它们的两性分子的性质具有几种作用模式，但是通常靶向于入侵病原体的特定亚单位。例如，防御素靶向于革兰氏阳性菌，而抗菌肽和双翅肽靶向于革兰氏阴性菌。在大肠杆菌挑战的蝇中，如所预期的，对革兰氏阴性菌而言，对照组中存在着抗菌肽A表达强烈地增加(232.7％的增加)(图2i,p<0.01)。这一增加显著地高于任何治疗组。金黄色葡萄球菌处理的对照组中也存在着抗菌肽A表达显著升高(183.9％的增加；图2j；p<0.01)，其显著地高于任何治疗组。如所预期的，大肠杆菌对照组中的双翅肽表达强烈地升高(251.2％的增加,图2k；p<0.01)并且这一高度显著地高于任何治疗组。值得注意的是，益生菌制剂组中双翅肽表达显著地低于Lp8826治疗组中双翅肽表达。在金黄色葡萄球菌对照组中，也存在着双翅肽表达显著地升高(115.1％的增加)，其大于Bi702255和益生菌制剂表达(图2l；p<0.01)。最后，评估防御素表达并且发现大肠杆菌接种的对照组中它是适度上调的(41.0％；图2m)。这显著地高于Lp8826、Lf5221和益生菌制剂组，其实际上将防御素的表达降低到比对照组更低的水平。在金黄色葡萄球菌对照组中，如对革兰氏阳性菌挑战所预期的，存在着防御素表达显著地增加(329.9％；图2n)。这一升高显著地高于任何治疗组，其中Bi702255组中防御素表达最低，处在或接近基线水平。

结论

本文所提供的实例性益生菌制剂治疗过的蝇的存活率增加，外加上免疫效应基因的表达减少，这些都表明治疗组的肠道菌群被有利地改变成为不允许病原微生物生长的环境。这可能包括诸如减少肠道渗透性或好细菌与致病菌株争夺生长资源的竞争的机制。

实施例3：用于治疗急性应激的实例性组合物

下列的实施例阐明了实例性益生菌制剂用于治疗或改善急性应激的效力。

方法：

果蝇和氧化挑战

如前述部分所述，将野生型黑腹果蝇(OregenR)喂养在常规的燕麦片-酵母-蔗糖培养基上，羽化后即刻将蝇转移到包含3.0x 10⁹CFU/ml Lp2389、Lf5221、Bi702255或三重制剂的培养基。10天后，将蝇或转移到对照培养基或转移到包含3.0％过氧化氢的培养基以模仿急性口腔氧化应激。3天后，当在对照-过氧化氢组中观察到约50％死亡率时，将蝇麻醉并且立即在Tris-EDTA-Triton X-100缓冲器中均质处理以释放细胞内的抗氧化剂酶。进行几种酶的测试：

总的氧化剂

如Hosamani et al.(Archives Insect Biochem)所概述的，使用2’-7’-二氯荧光乙酰乙酸盐(DCFA)(Sigma,Oakville,ON)测定总的氧化剂。简单地说，将20μl蝇匀浆与170μL洛克缓冲液混合。接下来，添加10μl的1mM DCFA溶液至每个孔并且在接种3分钟后，荧光读取474nm激发光和530nm发射光。

超氧化物歧化酶(SOD)测定

使用黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶以产生超氧化物自由基来测定SOD，并且硝基四唑兰(NBT)还原用作超氧化物产生的指示(Mockett 2002,Methods Enzymol)。简单地说，工作溶液由具有20mg/ml BSA、6.25μl过氧化氢酶(40U/ml)、6.25μl ofNBT和50μl黄嘌呤(1.8mM)的磷酸钾缓冲液110μl组成。添加7.5μl样品和20μl黄嘌呤氧化酶(XOD,5U/ml)至工作溶液并且在37℃下暗处搅拌孵育20分钟以允许颜色显影。读取570nm处还原的NBT的吸光度并且与SOD的标准曲线比较。

谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性

基于谷胱甘肽的氧化作用(GSSG)评估GPx活性，通过过量的谷胱甘肽还原酶(GR)持续供给所述的GPx。为测量GPx活性，正如(Weydert&Cullen 2010Nature Protocols)中所概述的那样，在340nm处监测随后的共底物NADPH的还原。简单地说，制备包含0.5M磷酸盐(pH7.2)、100mM EDTA和1.1mM叠氮化钠的GPx缓冲液。GPx测定缓冲液由1.33mM GSSH和1.33U/ml GR的GPx缓冲液组成。测定溶液由160μl GPx测定溶液、10μl NADPH(5mM)、20μl过氧化氢(0.5％)和15μl匀浆组成。监测340nm处吸光度3分钟并且就GPx活性而言评估曲线的线性部分。

脂质过氧化反应

摘自Gerard-Monnier 1998年的《化学红毒物学》，脂质过氧化反应评估为二丁基羟基甲苯(BHT)存在的情况下被水解的结合的丙二醇(MDA。反应溶液包含10mM 1-甲基-2-苯基吲哚的乙腈:甲醇3:1比例混合物。添加20μl样品和40μl 37％HCl至120μl的这种溶液并且允许在100℃下反应60分钟。在550nm处测量由此得到的溶液的吸光度并且与MDA标准溶液作比较。

结果

转移到含3％过氧化氢的培养基后，适应了未处理的培养基环境的蝇显示了3.4天后50％的死亡率，其被表示为与未处理的对照组比较33.3％的改变(图3a；p<0.01)。这种存活率的减少被Lf5221和益生菌制剂疗法显著地升高(p<0.01)。值得注意的是，在改善过氧化氢处理过的果蝇的存活率方面，益生菌制剂比Lp8826和Bi702255更有效率。所有治疗组都显著地减少了总的氧化剂的测量，与单个的益生菌疗法相比，益生菌制剂并没有显著的改善(图3b；p<0.01)。

抗氧化剂酶的活性不但反映了果蝇应对氧化挑战的能力，而且反映了由于益生菌疗法引起的固有性保护水平。过氧化氢处理的对照组中适度升高(132.3％)的SOD活性没有被任何益生菌疗法所影响。相比之下，过氧化氢处理的对照组中显著升高(192.9％)的谷胱甘肽过氧化物酶活性被Lp8826和益生菌制剂疗法显著地减少，益生菌制剂具有比包括Lp8826在内的任何单个的益生菌组更大的效应(图3d)。最后，过氧化氢处理的对照组中显著升高(278.4％)的LPO水平被Lp8826、Lf5221和和益生菌制剂显著地减少，而且益生菌制剂完全地挽救了脂质过氧化的水平(图3e)。

结论

急性氧化应激挑战减少了果蝇的存活率以及两种关键的抗氧化剂酶SOD和GPx的活性，升高了总的氧化剂、脂质过氧化的水平。在增加对氧化应激的存活率和减少总的氧化剂及脂质过氧化水平方面，给予本文所提供的实例性益生菌制剂是最有效的；然而，实例性益生菌制剂也显示了对升高的SOD和GPx抗氧化剂酶的活性的有益的影响。

实施例4：用于治疗神经退行性疾病的实例性组合物

下列的实施例阐明了实例性益生菌制剂对治疗或改善包括阿尔茨海默病(AD)和帕金森病(PD)在内的神经退行性疾病，或减缓包括阿尔茨海默病(AD)和帕金森病(PD)在内的神经退行性疾病进展或减缓包括阿尔茨海默病(AD)和帕金森病(PD)在内的神经退行性疾病发生的效力。

我们显示了通过用益生菌制剂修改肠道菌群能够减轻神经退行性变的三种主要环境病因(炎症、氧化应激和错误的代谢)从而改善疾病的分子标志物。这种独特的构建利用了肠-脑-轴的机制从而可从源头上持续且安全地治疗神经退行性变的病理学。

方法

帕金森病和阿尔茨海默病的果蝇遗传模型

使用UAS(上游激活序列)-GAL4系统在果蝇中建立PD和AD的遗传模型。对PD而言，使用神经元特异性elav-GAL4驱动元件(Indiana University,Bloomington,IN)，通过雌性A30P蝇与雄性elav-GAL4蝇交配，高度聚集性人α-突触核蛋白突变体(UAS-A30P由马萨诸塞州哈佛大学Mel Feany博士友好捐赠)将被表达在果蝇神经元中。30天后，A30P-α-突触核蛋白的表达诱导PD表型，例如见Feany&Bender,2000。使用elav-GAL4驱动将UAS-(β-分泌酶)BACE1-APP基因(Indiana University,Bloomington,IN)在神经元中表达建立AD模型。果蝇具有内源性APP直接同源和γ-分泌酶机械装置但是果蝇β-分泌酶具有低的活性并且果蝇APP在有害的Aβ肽对应的区域缺乏同源性，例如见Luo,Tully,&White,1992。然而，人BACE1的表达在3-4周内产生刺激AD发病的Aβ-样颗粒。

羽化后将蝇置于补充了对照、Lf5221、TFLA或益生菌制剂的培养基上。每3至4天更换一次瓶子以防止废物和霉菌的堆积。

生理学的测试

评估患有PD和AD的蝇的整个生命周期和运动性以检测它们的年龄对整体健康的影响。通过首先将10只蝇分到分离的小瓶中，然后每天计数各自处理组的活蝇数，计算果蝇的寿命。每个测试用5个单个的10只蝇的小瓶进行。使用负趋地性测试评估运动性。简单地说，将10只蝇轻度麻醉并转移到15厘米高的空瓶中。适应环境45分钟后，将蝇轻轻拍到瓶底，记录50％蝇达到瓶上10厘米标记所花费的时间。每个测试用三个独立的10只蝇的样本重复。

代谢测试

为评估AD和PD蝇的代谢活性，将进行如前文所述的总的葡萄糖和总的甘油三酯的测试

乙酰胆碱酯酶活性测定

使用改进的Ellman的方法评估蝇头部匀浆中的ACh活性，例如见Benabent,Vilanova,Sogorb,&Estevez,2014。在蛋白酶抑制剂存在的情况下，用200μL的冰冷Tris-EDTA-Triton X-100均质20只蝇头，然后以10000rpm离心2分钟以去除机体碎片。添加5μL匀浆至100μL的10mM硫代乙酰胆碱并且在37℃下孵育10分钟以进行酶反应。用50μL的6mM二硫化二苯并噻唑(2-硝基苯甲酸)使反应停止。再用50μL缓冲液稀释后，在410nm处测定吸光度，并将乙酰胆碱活性总量标准化为样品总蛋白。

总的淀粉样蛋白含量

使用硫磺素T(Tht)测定方案评估总的淀粉样蛋白含量，例如见Khurana et al.,2005。与ACh活性测定相似，20只果蝇头在含有蛋白酶抑制剂的Tris-EDTA-Triton X-100缓冲液中均质，离心以去除细胞碎片。通过稀释8mg Tht至10mL PBS,pH 7.0制备储备液。对工作溶液而言，将Tht储备液1:5稀释到PBS中，取2μL的样品匀浆加入198μL的工作Tht溶液中。在440nm激发光/482nm发射光下测量荧光，并且将淀粉样蛋白的总定量标准化为样品总蛋白。

多巴胺定量

将使用有某些修改的商业快速多巴胺ELISA试剂盒(LDN；Nordhom Germany)进行多巴胺定量。在加入洗脱板前，用测定缓冲液(1M HCl)在PBS中制备40个蝇头的匀浆。其余的程序按照制造商的说明进行。

结果

通过广泛的生理学参数(寿命和运动性)以及疾病的特定神经标志物来测量AD和PD的病理学。在AD蝇中，对照组蝇在第30天的存活率只有40％，而Lf5221和益生菌制剂处理的蝇存活率无显著下降(30天为30％)，而益生菌制剂显著提高存活率至60％(图4a；p<0.01)。在PD蝇类中观察到类似的趋势。对照组果蝇存活率为40％，而Lf5221处理后存活率无变化，益生菌制剂将存活率提高至60％(图4b；p<0.01)。运动性是衡量衰老果蝇整体身体健康的很好的指标。随着时间的推移，AD对照果蝇在第0、10、20和30天的负趋地性试验时间从6.4秒、7.5秒、8.2秒、12秒增加(图4c；p<0.01)。虽然从第20天开始，Lf5221和益生菌制剂组的负趋地时间均显著升高，但与Lf5221对照组相比，益生菌制剂组在第30天的负趋地时间显著降低(p<0.01)。在PD蝇中，在第0、10、20和30天，对照组完成负趋地性试验的时间也从5.7s、8.1s、10.1s和14.3s稳步增加(图4d；p<0.01)。Lf5221组在第30天和益生菌制剂组在第20天均有显著性升高(p<0.01)。在第10、20、30天，Lf5221组和益生菌制剂组的阴性趋地性时间显著低于对照组(p<0.01)。

为了测量AD的具体疾病病理学，我们测量了果蝇头部匀浆中随时间流逝Aβ斑块和ACh活性的水平。如所预期的，对照组中Aβ斑块的数量在第30天增加了30％(图4e；p<0.01)。第30天时，Lf5221组(26％)和益生菌制剂组(21％)均显著升高，Lf5221组显著低于对照组(p<0.05)，而益生菌制剂低于Lf5221组和对照组(p<0.01)。如所预期的，对照组的ACh活性在第20天和第30天显著降低(图4g；p<0.01)。与Lf5221和对照组相比，Lf5221处理组在第20天和第30天显著提高了ACh活性，而益生菌制剂在第20天和30天显著提高了ACh活性(p<0.01)。

为了测量PD的进展，我们测量了头部匀浆中的多巴胺水平。如所预期的，对照组的多巴胺总量从第0、10、20到30天分别从0.67、0.61、0.55稳步下降到0.52μg/mg蛋白(图4f；p<0.01)。到第30天，Lf5221和益生菌制剂治疗组的多巴胺水平均显著升高(p<0.01)。

评估衰老AD和PD蝇类中基本代谢参数的变化。在AD果蝇中，对照组果蝇的总葡萄糖水平在第30天上升到1.24(g/mg蛋白，与第0天相比增加了60％(图4h；p<0.01)。虽然Lf5221和益生菌制剂组在第30天也有显著升高，但益生菌制剂组的升高明显低于对照组和Lf5221组(p<0.05)。在第30天，PD蝇的总葡萄糖也显著增加到1.11μg/mg蛋白，与第0天相比增加了27％(图4i；p<0.01)。对照组果蝇血糖水平明显高于Lf5221组和益生菌制剂治疗组(p<0.05)。AD对照组果蝇的总甘油三酯水平在第30天增加了20％(图4j；p>0.05)。然而，与对照组和Lf5221组相比，益生菌制剂在第20天和第30天显著降低了总甘油三酯水平(p<0.05)。在PD对照组果蝇中，总甘油三酯在第10、20、30天显著增加，到第30天增加88％(图4k,p<0.01)。第30天时，Lf5221和益生菌制剂降低总甘油三酯水平显著低于对照组，其中益生菌制剂降低总甘油三酯水平比Lf5221更有效(p<0.01)。

通过测量氧化剂总数、过氧化反应和抗氧化酶活性来测量氧化应激水平。在AD果蝇中，从第0天到第30天，对照组果蝇的总氧化剂含量增加了30％(图4l；p<0.01)。在第30天，Lf5221处理的AD蝇的总氧化剂水平降低了5％，而益生菌制剂降低了11％：两者的降低都明显低于对照组果蝇的增加。对照组AD果蝇的超氧化物歧化酶活性显著降低36％，而Lf5221组(降低了41％)和益生菌制剂组(减低了38％)在第30天仍保持较低水平。相比之下，在对照组果蝇中，谷胱甘肽过氧化物酶活性在第30天相对没有变化(增加了9％)；然而，在第30天，Lf5221处理组的GPx活性略有提高(34％)，而益生菌制剂则大幅提高(257％)(图4l；p<0.01)。最后，对照组果蝇的LPO水平显著升高了38％。Lf5221治疗组的LPO水平也显著升高(62％)；然而，与对照组和lf5221处理的果蝇相比，益生菌制剂显著降低了LPO水平(降低了41％)(图4l；p<0.01)。

在PD果蝇中也发现了类似的效应。在对照组中，到第30天，总氧化剂增加了24％，Lf5221处理挽救了这一增加，益生菌制剂则减少了20％(图4m；p<0.01)。再次，在衰老的PD果蝇中，所有组的SOD水平均略有降低。第30天，对照组果蝇的GPx活性显著降低(15％)，但Lf5221活性增加(34％)，益生菌制剂提高了252％，非常有效(图4m,p<0.01)。最后，在第30天，对照组的LPO水平显著升高至37％，被益生菌制剂拯救(图4m；p<0.01)。

通过琼脂扩散试验直接测定抗菌剂的产生，测定免疫系统的活性。以抑菌圈直径作为抑菌圈记录。AD对照果蝇中，衰老果蝇抑菌圈从第10天开始明显下降，表明果蝇产生的抗菌剂减少(图4n；p<0.01)。相比之下，Lf5221处理过的果蝇只在第30天观察到减少抑菌圈而益生菌制剂处理过的果蝇没有减少抑菌圈，这表明益生菌治疗显著地提高抗菌剂的产生，因此衰老的AD果蝇中的免疫耐受性(图4n；p<0.01)。相似地，在PD果蝇中，对照组蝇的抑菌圈从第10天开始明显下降(图4o)；p<0.01)。Lf5221或益生菌制剂的处理将抑菌圈减少延迟到第30天(图4o；p<0.01)。还检测了几种免疫学基因表达以确定衰老的AD和PD果蝇的特异性免疫应答。对照组AD果蝇中Duox表达显著下降，IMD和AMPs抗菌肽A、防御素、双翅肽的表达显著升高(图4p；p<0.01)。益生菌制剂显著提高了Duox的表达，而Lf5221和益生菌制剂均降低了IMD的表达(图4p；p<0.05)。虽然益生菌制剂显著降低了防御素的表达，但益生菌治疗对AMPs的表达影响较小。在对照组PD果蝇中，Duox和IMD的表达显著降低，而AMPs的表达同样升高(图4q；p<0.01)。Lf5221的治疗只降低了蝇抗菌肽的表达，而益生菌制剂显著降低了IMD、防御素和蝇抗菌肽的表达(图4q；p<0.01)。随着年龄的增长，已知的是果蝇免疫系统的效率降低，导致致病负荷增加。这可以解释任意免疫基因(Duox和IMD)的减少，而病原体特异性因子(AMPs)的增加。

最后，对衰老的AD和PD果蝇中个体的线粒体ETC复合物的活性进行了评估。在对照组AD果蝇中，复合物1、2、3的活性明显下降(图4r；p<0.01)。Lf5221处理在第30天显著提高复合物3的活性(p<0.05)，而益生菌制剂提高了所有复合物的活性(图4r；p<0.05)。在对照组的PD果蝇中，所有的线粒体ETC复合物1到4都显著减少。Lf5221和益生菌制剂均显著提高了线粒体复合物1、2和4的活性，而益生菌制剂对ETC复合物2和3的活性提高更为有效(图4s；p<0.05)。

结论

AD和PD中许多典型的生理学变化，包括疾病标志物、代谢变化、免疫应激、氧化应激和线粒体复合物活性在内，都被给予本文所提供的实例性益生菌制剂积极地影响，所述实例性益生菌制剂提供了比单个的单独益生菌更有益的效果。

实施例5：与三果宝(TFLA)组合的实例性组合物

下列的实施例阐明了与三果宝(TFLA)组合的实例性益生菌制剂的效力。

在可选的实施方案中，制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒还包含三果宝(TFLA)，所述三果宝是在印度传统医学实践(阿育吠陀)中已知的多草本配方，其对消化不适有积极的作用。传统上，冷浸剂方式服用TFLA，将其粉末制剂混合在冷水中并空腹服用以增加胃肠道运输，缓解腹胀和增加营养吸收。TFLA的字面意思是“三种水果”并且配方中含有等量的余甘子(庵摩勒)、诃子(诃黎勒)和毗黎勒(毛诃子)。TFLA是富含抗氧化剂的草本配方和具有适应原特性的拉萨亚娜(返老还童剂)。最近，TFLA的民族医学主张已被研究人员证实，这些活性包括抗氧化、抗炎、维持血清胆固醇水平、镇痛、伤口愈合、顺势性、低血糖和化学预防作用。此外，TFLA作为胃肠道补药的传统使用包括缓解胃肠道紧张、便秘，减轻腹泻、IBD和IBS的症状、增加胃肠道蠕动，所有都表明TFLA可能具有益生元活性，并且它通过修改肠道菌群产生某些有益的影响。

基于TFLA广泛的生理学作用及其作为益生元制剂尚未开发的潜力，将TFLA-水提取物与本文所提供的实例性益生菌制剂相结合，创建新颖的合生素制剂(同时含有益生菌和益生元的产品)。测试这种实例性制剂，确定的是益生元剂的添加不影响益生菌制剂的体内活性。

我们测试如果植物配方的TFLA添加至本文所提供的实例性益生菌制剂而制备的新颖的合生素制剂对益生菌制剂的疗效有任何影响：结果表明这种合生素制剂没有影响原来的实例性益生菌制剂的效力,或增强其效力。

方法

三果宝和合生素制剂

三果宝的干燥成分(余甘子、毛诃子和诃子)获取自印度瓦拉纳西巴纳拉斯印度大学的阿育韦陀药房。每一成分都被单独称量，并以相等的比例(按重量)组合在一起，然后再用研钵和杵手工碾碎并研磨成细粉。由此得到的细粉用于所有的提取。提取方法是在室温下，将5g的三果宝粉末在100mL双蒸馏水中轻轻搅拌72小时。萃取后，溶剂相在40℃真空压力下过滤并旋蒸以完成干燥。记录干质量，在100mL双蒸馏水中复原，并保存在4℃，直到进一步处理。

为了制作果蝇的TFLA和合生素培养基，将上述的TFLA提取物处理为10X制剂，与上述的益生菌制剂一起加入到冷却的液体培养基中。所有生理学测试均按上述部分所述的进行。

结果

在AD和PD神经退行性变模型中，对TFLA和合生素制剂进行了相同的代谢、炎症和氧化应激联合测试。在糖尿病HSD代谢模型中，TFLA和合生素组的总体重分别降低了30％和22％(图5ai,p<0.01)。此外，TFLA和合生素制剂挽救了循环的葡萄糖水平(图4aii,p<0.05)和总的葡萄糖水平(图4iii；在HSD治疗的果蝇中p<0.01)。相似地，在肥胖的HFD代谢模型中，使用TFLA(8.5％)或合生素制剂(20％)的HFD治疗果蝇的体重增加显著减少(图5bi；p<0.01)。TFLA和合生素制剂也挽救了HFD处理的果蝇总的葡萄糖的增加(图5bii,p<0.01)和总的甘油三酯的升高(图5biii；p<0.01)。这些结果表明，TFLA在降低代谢应激标志物方面非常有效，与益生菌制剂联合使用并不会改变其对抗代谢冲击的疗效，甚至可以提高其作为合生素制剂的效力。

也在接受了TFLA或合生素制剂预处理，随后接受1.0x10¹⁰CFU/ml大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的急性口腔挑战的果蝇中进行了炎症标志物的评估，为了应对大肠杆菌应激，在对照组中，近70％的存活率降低均被TFLA(减少25％)和合生素制剂(减少20％)显著增加(图5ci；p<0.01)。在琼脂扩散测定中，TFLA和合生素制剂的抑菌圈也显著增加，与单独的TFLA组相比，合生素制剂有更大的抑菌圈(图5cii；p<0.01)。从典型的炎症基因表达来看，对照组的Duox表达在大肠杆菌感染后显著升高，而TFLA和合生素制剂均显著降低了这一影响(图ciii；p<0.01)。与IMD的表达相似，对照组IMD的强烈升高被TFLA和合生素制剂显著地降低(图civ)；p<0.01)。抗菌肽A、革兰氏阴性敏感的AMP也均被TFLA和合生素制剂显著地降低(图5cv；p<0.01)。最后，在对照的大肠杆菌处理组，革兰氏阴性敏感的AMP蝇抗菌肽的表达也极高，而均被TFLA和合生素治疗显著降低(图5c vi；p<0.01)。总的来说，在大肠杆菌口腔感染后，TFLA治疗具有较强的抗炎作用，且不影响合生素制剂中益生菌制剂的作用，甚至强化了益生菌制剂的作用。

也进行了革兰氏阳性病原体金黄色葡萄球菌的急性口腔感染。对照组中果蝇暴露于金黄色葡萄球菌后存活率显著降低了70％，TFLA处理后存活率显著降低到35％，而合生素制剂则降低到20％(数据未显示；p<0.01)。相似地，TFLA和合生素制剂通过琼脂扩散试验分别增加了72％和98％的清除直径(数据未显示，p<0.01)。在基因表达方面，金黄色葡萄球菌处理的对照组果蝇的duox表达显著升高，而在合生素制剂下则显著降低(数据未显示；p<0.01)。IMD的表达被金黄色葡萄球菌的表达中度升高，并被TFLA和合生素制剂进一步升高(数据未显示，p<0.01)。在对照果蝇中，AMP抗菌肽A的表达升高了180％，而TFLA治疗(增加43％)和合生素制剂(增加7％)均显著降低了该表达(数据未显示，p<0.01)。最后，被金黄色葡萄球菌处理后，革兰氏阳性反应AMP防御素显著升高了近300％，而TFLA和合生素制剂治疗完全挽救了该反应(数据未显示，p<0.01)。与大肠杆菌的口腔感染相似，金黄色葡萄球菌感染产生了强效的免疫应答，但TFLA和合生素制剂的治疗减弱了这种应答；与于益生菌制剂相似，这表明益生元补充剂不会影响益生菌制剂的效力。

通过TFLA或合生素制剂预处理后将果蝇暴露于过氧化氢而引入急性氧化应激。在暴露于过氧化氢后，对照组果蝇的存活率大大降低了近70％，而TFLA治疗组存活率降低了30％，而合生素制剂组存活率降低了25％(数据未显示；p<0.01)。对照组中总的氧化剂水平的升高也被TFLA治疗显著降低并被合生素治疗挽救(数据未显示；p<0.01)。过氧化氢应激下对照组中超氧化物歧化酶活性升高，其被TFLA预处理显著地降低，被合生素制剂预处理挽救(数据未显示；p<0.01)，这表明预处理可以保护果蝇不产生显著的抗氧化反应。使用过氧化氢处理的对照组中谷胱甘肽过氧化物酶也显著增加，而仅使用合生素制剂则显著减少(数据未显示；p<0.01)。最后，对照组的脂质过氧化水平显著升高了近300％，这种升高被TFLA预处理和合生素制剂完全挽救(数据未显示；p<0.01)。减少总氧化剂和抗氧化剂减少酶诱导表明与益生菌制剂相似，TFLA和合生素在一起，有更高的固有抗氧化剂防御并且TFLA与益生菌制剂的组合不妨碍益生菌制剂抗氧化应激的效力。

TFLA和合生素制剂的作用也在AD和PD的果蝇中进行了测试。在AD果蝇中，TFLA和合生素制剂均提高了衰老果蝇的存活率，并且合生素制剂比TFLA更有效(数据未显示；p<0.01)。相似地，在PD果蝇中，TFLA和合生素制剂均显著提高了果蝇的存活率，病且合生素制剂比单独的TFLA更有效(数据未显示；p<0.05)。测量运动性，衰老的AD果蝇逐渐丧失运动性，最明显的是在第30天。TFLA和合生素制剂分别显著提高了12％和39％的AD果蝇的运动性(数据未显示，p<0.05)。对照组中PD果蝇运动性下降在第10天逐渐明显，并持续恶化。TFLA和合生素制剂都将运动障碍延迟到第20天，与对照组相比，第20天和第30天显著提高了运动性(数据未显示；p<0.01)。

如所预期的，在对照组中AD蝇Aβ的水平随时间的流逝而增加。虽然有一些变化，但TFLA和合生素制剂都在第30天降低了总Aβ的积累，几乎达到了果蝇在第0天的水平(数据未显示；p<0.01)。相似地，对于乙酰胆碱酯酶的活性，正如所预测的，随着时间的推移，对照组AD果蝇的ACh活性降低，而TFLA和合生素制剂在第30天显著提高了ACh活性(数据未显示；p<0.01)。对照组PD果蝇的多巴胺水平从第10天开始显著降低，并持续下降到第30天。与对照组相比，两种合生素制剂都将多巴胺水平下降延迟至第30天，而且TFLA和合生素制剂都在第30天诱导了多巴胺水平的上升(数据未显示；p<0.05)。

最后，为了评估TFLA和合生素制剂在AD和PD的背景下如何影响肠-脑轴的机制，我们对相同的生理学标志物进行了评估。在对照的AD果蝇中，总葡萄糖水平显著增加了157％，而这一水平被合生素制剂显著降低(数据未显示；p<0.01)。相似地，在对照组AD果蝇中，总甘油三酯水平增加了120％，而采用合生素治疗则显著降低了这一水平(数据未显示；p<0.01)。在PD果蝇中，总葡萄糖水平显著增加127％，而TFLA或合生素制剂均未发生变化(数据未显示；p>0.05)。然而，在PD果蝇中，总甘油三酯显著升高187％，TFLA和合生素制剂显著降低，分别为143％和119％(数据未显示；p<0.01)，与TFLA治疗相比，合生素制剂更有效。

在使用TFLA或合生素制剂治疗的AD和PD果蝇中，对衰老果蝇中同样的炎症标志物组合进行了评估。在PD果蝇中，Duox的表达在第30天显著降低了50％(数据未显示；p<0.01)而合生素制剂治疗显著提高Duox表达。虽然TFLA和合生素制剂对其表达均无显著影响，但IMD在衰老的PD果蝇中升高。尽管在TFLA治疗后其表达显著下降，但在对照组中，随着时间的推移，Relish没有明显改变。在对照组衰老的PD果蝇中AMP表达明显升高。抗菌肽A的180％的增加不受TFLA或合生素制剂的影响(数据未显示；p>0.05)。然而，TFLA和合生素制剂完全挽救了相似的防御素升高(p<0.01)。最后，尽管合生素制剂显著降低了近200％的蝇抗菌肽表达增长，但TFLA未影响近200％的蝇抗菌肽表达增长。

在PD果蝇中，衰老对照蝇的Duox表达降低，并且不受TFLA或合生素制剂的影响(数据未显示；p>0.05)。在衰老对照蝇中，IMD的表达减少了约20％，而TFLA和合生素制剂显著升高(数据未显示；p<0.01)。与AD组相似的是，Relish的表达在年龄和治疗过程中都没有明显的变化。老年对照组中PD果蝇AMP表达升高。抗菌肽A几乎200％的升高被TFLA和合生素制剂治疗显著地降低(数据未显示；p<0.01)。相似地，防御素表达水平的升高仅被合生素制剂降低，而TFLA不能使其降低(p<0.01)。最后，TFLA和合生素制剂均显著降低了近300％的蝇抗菌肽表达升高(p<0.01)。总的来说，TFLA和合生素制剂对AD和PD果蝇疾病模型中受影响的免疫参数均有积极的影响，而且TFLA与益生菌制剂组合使用对其疗效并无负面影响，甚至在某些情况下还能提高效力。

考虑到氧化应激标志物，衰老的AD模型中对照组果蝇的总氧化剂增加了30％。TFLA和合生素制剂均显著降低了上述的升高，且合生素制剂比单独的TFLA治疗更有效(数据未显示；p<0.01)。在衰老对照果蝇中，超氧化物歧化酶的活性相对不变，TFLA或合生素制剂治疗均对其无影响。衰老对照组AD果蝇的谷胱甘肽过氧化物酶活性升高了近10％，而TFLA治疗显著降低(数据未显示；p<0.01)。最后，衰老对照AD果蝇的脂质过氧化水平升高了38％，而TFLA和合生素制剂均显著降低了脂质过氧化水平，其中合生素制剂在降低LPO水平方面略优于TFLA制剂(数据未显示；p<0.01)。在衰老的PD果蝇中，对照果蝇中总氧化剂增加的24％仅仅被合生素制剂降低(数据未显示；p<0.01)。与其相似的AD果蝇，对照组衰老蝇的SOD活性没有显著差异，无论是TFLA治疗还是合生素制剂治疗，对SOD活性的影响都不大。

对照组衰老PD果蝇中GPx活性略有降低，TFLA和合生素制剂治疗均使其显著升高，其中TFLA治疗对GPx活性的提高明显高于合生素制剂(数据未显示；p<0.01)。最后，对照组衰老PD果蝇中37％的脂质过氧化增加仅仅被合生素制剂显著降低，实际上完全降低LPO水平至对照组年轻时的水平(数据未显示；p<0.01)。TFLA益生元对几种氧化应激标志物均有显著影响，与益生菌制剂的组合并不影响制剂的作用疗效，甚至在某些参数上还有所增强。

AD和PD的线粒体ETC复合活性也受到TFLA和合生素制剂治疗的影响。对照组中衰老AD果蝇的ETC复合物1的活性在30天后降低57％，而与TFLA合生素而不是TFLA治疗相比，复合物1的活性显著提高(数据未显示；p<0.05)。在衰老的AD蝇中，ETC复合物2的活性也降低，未受到TFLA治疗的影响，在第30天被合生素制剂完全拯救(数据未显示；p<0.01)。在对照组衰老的AD果蝇中，ETC复合物3的活性降低了近50％，而TFLA和合生素制剂同等程度地提高了ETC复合物3的活性(数据未显示；p<0.01)。最后，随着时间的推移，AD果蝇中的ETC复合物4未受到TFLA和合生素制剂的影响(数据未显示；p>0.05)。在衰老的PD果蝇中，ETC复合物1的活性显著降低70％，而TFLA和合生素制剂治疗后，这种降低被显著增加(数据未显示；p<0.01)。在对照组PD果蝇中，ETC复合物2的活性降低了50％以上，TFLA和合生素制剂进一步提高了ETC复合物2的活性(数据未显示；p<0.01)。衰老的PD果蝇中ETC复合物3的活性有非常强的80％降低，仅合生素制剂使其提高(数据未显示；p<0.05)。最后，在衰老的PD果蝇中，ETC复合物4的活性降低了近60％，仅合生素制剂使其提高(数据未显示；p<0.05)。总的来说，AD和PD果蝇模型中ETC复合物活性的降低均被TFLA治疗和TFLA与益生菌制剂的组合所提高，从而使得合生素制剂不影响制剂的效力，还增加了制剂的效力。

结论

益生元植物产品TFLA与益生菌制剂的整体组合对实例性合生素制剂的效力没有任何影响，甚至在某些情况下还提高了其效力。

实施例6：用于增强寿命的实例性方法：黑腹果蝇通过肠-脑-轴交流延长寿命

下列的实施例描述了显示实例性组合物的效力的数据和本文所提供的用于增强(增加)寿命和改善衰老的方法

在本研究中，新的益生菌和合生素制剂显示了通过与慢性疾病管理相关的肠-脑-轴交流机制组合地延长黑腹果蝇的寿命。通过管理胰岛素抵抗和能量调节途径，益生菌和合生素制剂都挽救了代谢应激标志物。衰老和慢性疾病的发展是多因素的过程，涉及代谢障碍、炎症、氧化应激和线粒体动力学的累积效应，而且肠道菌群的变化与年龄相关的表型相关。

这两种制剂也改善炎症、氧化应激的升高和线粒体复合物完整性的损失。在几乎所有的测量途径中，合生素制剂都具有比其单个成分更强大的影响，表明其组合效应。肠道菌群对衰老的每一个关键危险因素的伴随作用，使其成为对抗神经退行性变、糖尿病、肥胖、心血管疾病和其他与年龄相关的慢性疾病的强大治疗工具。

本研究描述了新颖的益生菌和合生素制剂如何通过GBA机制影响黑腹果蝇寿命。目前的益生菌和合生素制剂在降低生理应激标志物、氧化应激、炎症和线粒体ETC复合物完整性方面表现出组合作用，因此把大多数主要的衰老机制作为目标。这一作用不仅有利于长寿，而且将预防与上述状态有关的许多与年龄相关的慢性疾病。

结果

益生菌和合生素制剂对衰老的黑腹果蝇的生理学代谢标志物具有有利的影响

从羽化后第一天开始，衰老果蝇分别暴露于益生菌、益生元、益生菌或合生素制剂中，30天内每10天检测一次果蝇的生理学代谢参数。如所预期的，未处理的对照组果蝇的总重量呈时间依赖性升高(图6a；F(3,18)＝3.24；p<0.05)。在所有组中都观察到这一趋势；然而，在第30天，与对照组、单个的益生菌和TFLA处理的组相比较，益生菌和合生素制剂组总重量显著降低(图6a)。相似地，衰老果蝇的总葡萄糖测量值也存在时间依赖性，在对照组果蝇中，总葡萄糖在第30天达到峰值，增加2.5倍(图6b；F(3,18)＝4.13,p<0.05)。每一种单个的益生菌和TFLA益生元都显示出相似的总葡萄糖水平的时间依赖性增加，但是在第30天，所有组的总葡萄糖水平都降低了。值得注意的是，益生菌和合生素制剂在第30天完全挽救了总葡萄糖的升高，显著低于Lp8826、Bi702255和TFLA处理组(p<0.01)。最后，在第30天，未治疗对照组的总甘油三酯水平(F(3,18)＝5.34,p<0.05)升高了1.7倍(图6c,p<0.01)。到第30天，Lf5221、Bi702255、益生菌和合生素制剂组的总甘油三酯水平下降，其中Lf5221和合生素制剂组的总甘油三酯水平完全下降到第0天蝇的水平。总体而言，益生菌制剂在降低果蝇代谢应激的所有生理学标志物方面效果最好，而合生素制剂显示了几乎相同的效果。

衰老的黑腹果蝇中胰岛素样信号受到益生菌和/或益生元治疗的积极影响

为了评估补充益生元或益生菌对代谢影响的潜在遗传调控机制，使用实时PCR对一组胰岛素信号基因的表达进行了评估。对照组蝇的胰岛素样肽(dilp)2表达(F(3,18)＝3.47,p<0.05)在第20、30天升高(图7a)；p<0.01)。在第20天，只有TFLA补充组降低了dilp2的表达，而在第30天，Bi702255和合生素制剂分别降低了33％和57％的dilp2表达(p<0.01)。值得注意的是，只有合生素制剂能够挽救dilp2的表达，其表达明显低于其他任何治疗组。相似地，对照组的dilp3表达(F(3,18)＝4.87,p<0.05)在第30天升高(图7b；p<0.01)，各组均显著降低。Lp8826和TFLA补充组可将dilp3表达恢复到第0天对照的水平，而益生菌和合生素制剂则进一步降低了dilp3的表达；在第30天显著低于Lf5221和Bi702255。对照组果蝇的胰岛素受体(InR)(F(3,18＝4.53,p<0.05)在第20天和第30天同样升高(图7c；p<0.01)。在第20天，只有益生菌制剂显著降低了InR的表达，而在第30天，Lp8826、Lf5221、益生菌和合生素制剂都显著降低了InR的表达(p<0.01)。值得注意的是，在第30天益生菌制剂降低InR的水平明显高于所有其他各组，而合生素制剂低于未加益生菌制剂的各组。

通过检测胰岛素受体的胰岛素信号通路下游，我们得到了相似但有趣的结果。衰老对照果蝇dAkt表达(F(3,18)＝4.82,p<0.05)在第10天至第30天升高(图7d；p<0.01)。在第30天，Lp8826、TFLA和合生素制剂补充组都显著降低了dAkt的表达(p<0.05)。值得注意的是，TFLA、益生菌和合生素制剂在第30天完全挽救了dAkt水平，而合生素制剂降低dAkt表达的效果大于Lf5221和Bi702255。dAkt的直接下游是dTOR(F(3,18)＝4.91,p<0.01)，其在对照组果蝇中的表达从第10天至第30天也同样升高(图7e；p<0.01)。在第30天，只有Lp8826组没有降低dTOR水平，而TFLA、益生菌和合生素制剂都完全挽救了表达。最后，受dAkt下调的转录因子dFOXO(F(3,18)＝4.12,p<0.01)在对照组衰老果蝇中从第10天至第30天出现下调(图7f；p<0.01)。只有益生菌和合生素制剂能提高dFOXO的表达水平，只有合生素制剂能将其表达完全挽救到第0天对照组的水平。总体而言，单个的益生菌和TFLA对衰老果蝇的胰岛素信号通路具有不同但积极的影响；然而，益生菌和合生素制剂在衰老果蝇中展示了挽救潜在的胰岛素信号失调的组合效应

衰老的黑腹果蝇的脂肪酸代谢得益于益生菌和合生素制剂的补充

为了确定衰老果蝇总甘油三酯升高的机制以及益生菌如何缓解这一作用，我们对几种脂肪生成和脂肪生成调节因子的表达进行了评估。乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和脂肪酸合酶(FAS)都是由转录因子甾醇调节元件结合蛋白(SREBP)激活的脂肪生成因子。ACC(F(3,18)＝4.12,p<0.05)(图8a)和FAS(F(3,18)＝3.91,p<0.05)(图3b)的表达均在第10天至第30天显著升高(p<0.01)，表明衰老对照果蝇脂肪生成升高。在第30天，Lf5221、TFLA、益生菌和合生素制剂降低ACC的表达，其中合生素制剂对ACC表达的影响大于益生菌制剂(p<0.05)。在第30天，只有TFLA、益生菌和合生素制剂降低了FAS的表达，其中TFLA和合生素制剂将FAS的表达挽救到第0天对照组的水平。SREBP表达(F(3,18)＝3.2,p<0.05)也呈相同趋势(图8c)。Lp826和Lf5221降低了第20天和第30天的升高(p<0.01)，而益生菌和合生素制剂在30天挽救了升高(p<0.01)。磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)是糖异生的主要调节因子，与脂肪生成基因一样(F(3,18)＝4.63,p<0.05)，在对照组果蝇中表达量在第20和30天增加(图8d；p<0.01)。在第30天，TFLA、益生菌和合生素制剂都降低了PEPCK的表达，TFLA和合生素制剂挽救了PEPCK的表达至第0天对照组的水平(p<0.01)。脂质储存液滴(LSD)2在脂肪体中表达，控制甘油三酯的积累。对照组果蝇LSD2表达(F(3,18)＝3.28,p<0.05)在第30天升高(图8e)；并且Lp8826、TFLA、益生菌和合生素制剂挽救了LSD2表达(p<0.01)。最后，E75是果蝇PPARγ负责脂肪形成和胰岛素敏感性的同源物的转录靶点。衰老对照组的E75表达(F(18)＝5.09,p<0.05)在第10天至第30天间显著降低(p<0.01)，第30天，Bi702255组降低，只有益生菌和合生素制剂组提高，而且合生素制剂的影响大于益生菌制剂(p<0.05)。

随着年龄增长而升高的炎症标志物通过组合的益生元和益生菌治疗而降低

琼脂扩散试验在营养琼脂平板上测量可分泌的免疫原性因子的数量及其对致病性菌苔的免疫原性。对照组果蝇对大肠杆菌的免疫原性显著降低(F(3,18)＝3.98,p<0.05)，清除直径从第0天至第30天减少了47％(图9a；p<0.01)。在第20天，TFLA、益生菌和合生素制剂都提高了清除率直径(p<0.01)，而在第30天，所有补充组均有积极效果。

在第20天和第30天，合生素制剂在提高清除直径方面效果最好，这支持了其组合效应。金黄色葡萄球菌平板的清除直径也出现了类似的趋势(F(3,18)＝4.12,p<0.05)，对照组果蝇的清除直径从第0天至第30天下降了56％(图9b；p<0.01)。所有补充组在第20天和第30天都产生了积极的效果；然而，无论是益生菌还是合生素制剂都比单个的益生菌或单独的TFLA有更大的影响。

在免疫遗传标志物的调控方面，双氧化酶(Duox)的表达在第10天至第30天在未处理的果蝇中降低(F(3,18)＝3.78,p<0.05)，双氧化酶(Duox)是在致病性损伤后刺激ROS释放的主要固有性免疫应答(F(3,18)＝3.78,p<0.05)(图9c；p<0.01)。在第30天，与第0天对照相比较，益生菌和合生素制剂治疗挽救了Duox的表达，但只有在第30天，与未处理的对照组相比，合生素制剂提高了Duox的表达。免疫缺陷(IMD)是另一种固有性免疫应答，但对革兰氏阴性菌稍微更敏感一些。第10天至第30天，对照组果蝇的IMD表达(F(3,18)＝4.71,p<0.05)降低(图9d；p<0.01)并且第30天时，只有合生素制剂使IMD表达提高。然而，由于基线表达的差异，Lp8826、TFLA、益生菌和合生素制剂在第30天都有效地挽救了IMD的表达(p>0.05)。Relish是IMD途径下游的细胞因子样因子(F(3,18)＝2.54,p>0.05)，其在对照组果蝇中的表达在第30天上调(图4e；p<0.01)。益生菌的影响是有限的和多样的，虽然在衰老的果蝇中益生菌和合生素制剂消除了任何变异的Relish表达。

抗菌肽(AMPs)是固有性免疫系统诱导的IMD和toll途径下游的效应分子。革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌损伤均可激活抗菌肽A转录(F(3,18)＝3.73,p<0.05)，在本模型中，在对照组衰老果蝇中，抗菌肽A转录在第10天至30天显著升高(图9f；p<0.01)。在第30天，Bi702255、TFLA和合生素制剂降低抗菌肽A的表达，并且合生素制剂将抗菌肽A的表达降低到第0天对照组水平(p<0.01)。防御素在toll途径和革兰氏阳性细菌损伤的下游被激活。与抗菌肽A一样，对照组衰老果蝇中防御素表达(F(3,18)＝4.13,p<0.05)升高(图9g)；除Lp8826外，所有补充组在第30天均降低。最后，被革兰氏阴性挑战的IMD下游激活的蝇(F(3,18)＝2.31,p>0.05)的抗菌肽在对照组衰老果蝇中也在第10天至30天升高(图9h；p<0.01)，不过任何益生菌和/或益生元治疗几乎没有影响。

年龄相关的氧化应激升高可以通过益生菌和/或益生元治疗得到缓解

氧化应激的逐渐积累是导致衰老的主要因素，在本模型中，我们观察到氧化剂的增加和相应的抗氧化酶活性的降低。对照组果蝇总氧化剂水平(F(3,18)＝3.78,p<0.05)在第20和30天显著升高，在第30天达到峰值，增加50％(图10a；p<0.01)。在第30天，只有益生菌或合生素制剂补充组可降低总氧化负荷，两组均显著高于单个的益生菌或TFLA的效果(p<0.05)。值得注意的是，Lf5221、Bi702255和TFLA在第20天都引起了总氧化剂的有益减少。超氧化物歧化酶(SOD)是转化有害程度较低的过氧化氢中的超氧化物阴离子所必需的。从第0天至第30天，对照组果蝇的SOD活性(F(3,18)＝3.92,p<0.05)降低了50％(图10b；p<0.01)，仅在第10、20、30天益生菌或合生素制剂对SOD活性影响显著(p<0.05)。TFLA制剂也提高了第10和20天的SOD活性；但是，比益生菌和合生素制剂提高的程度要小。相似地，对照组中衰老果蝇将过氧化氢转化为水的谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性(F(3,18)＝4.08,p<0.05)从第0天至第30天降低了42％(图10c；p<0.01)。在第30天，Lf5221，益生菌或合生素制剂具有有益的效果，与任何其他补充组相比，合生素制剂具有更显著的影响。最后，对照组果蝇的脂质过氧化(LPO)水平(F(3,18)＝5.31,p<0.01)从第0天至第30天显著升高26％(图10d；p<0.01)；在第30天，Lf5221、TFLA、益生菌和合生素制剂都降低了脂质过氧化(LPO)水平。再一次，与益生菌制剂和任何单个的疗法相比，合生素制剂的影响显著高于益生菌制剂和任何单个的疗法，是与第0天对照组相比较挽救了LPO水平(p<0.01)的唯一一组。显然，该合生素制剂对氧化应激标志物具有最强的有利的和始终一致的影响，这表明了它的组合作用。

氧化应激的升高是由于线粒体功能失调和抗氧化能力降低而增加ROS颗粒的产生的结果。为了测试线粒体的功能，我们在补充益生菌和/或益生元前后测试了衰老的果蝇中每一ETC复合物的活性。NADH辅酶Q还原酶(ETC复合物I)接受电子载体NADH上克雷布斯循环中的电子并将其转移到复合物II。在对照组果蝇中，ETC复合物I的活性(F(3,18)＝4.31,p<0.05)在第10、20、30天时降低，到第30天时降低了62％(图10e；p<0.01)。TFLA，益生菌和合生素制剂补充组在第30天提高了复合物I的活性，而且益生菌和合生素制剂完全挽救了复合物I的活性(p<0.01)。复合物II(琥珀酸脱氢酶)的活性(F(3,18)＝2.53,p>0.05)在第20和30天也降低(图10f；p<0.05)，尽管没有任何治疗在第30天改善复合物II的活性。然而TFLA和合生素制剂组ETC复合物II的活性降低至对照组第0天的水平(p>0.05)。复合物III(细胞色素bc1复合物)的活性(F(3,18)＝3.98,p<0.05)与第0天相比较在第30天，对照组也降低了76％(图10g；p<0.01)。在第30天，每个益生菌和/或益生元组都对复合物III的活性产生了有益的影响；然而，益生菌和合生素制剂将复合物III的表达挽救到对照组第0天的水平(p>0.05)。益生菌制剂的影响显著大于单个的益生菌，而合生素制剂的影响大于Bi702255。最后，在第30天，复合物IV(细胞色素c氧化酶)的活性(F(3,18)＝4.01,p<0.05)在对照组中同样降低了67％(p<0.01)，所有益生菌和/或益生元治疗均提高了这一效果(图11d；p<0.05)。Lf5221、Bi702255和TFLA治疗将复合物IV的活性拯救到对照组第0天的水平，然而，在第30天，与Lp8826或Lf5221相比，合生素制剂对复合物IV表达的影响显著高于Lp8826或Lf5221

改变肠道菌群以治疗神经系统疾病

我们设计了新颖的益生菌和合生素制剂以优化改变肠道菌群，引发对神经系统疾病的最大潜在影响。益生菌制剂包含3种益生菌种类，分别为植物乳杆菌NCIMB 8826、发酵乳杆菌NCIMB 5221和婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255，每一剂量为1.0x 10⁹CFU/ml，总剂量为3.0x 10⁹CFU/ml的果蝇培养基。

为了设计合生素制剂，将新近特征化富含多酚的三果宝水提取物、这种多草本制剂与益生菌制剂相结合。使用分离的乳杆菌和双歧杆菌菌株的体外分批培养物，体内果蝇模型以及人源化的胃肠道体外模型表征化三果宝的益生元活性，在每个模型中都证明了增加有益菌的种群数量，同时减少病原菌种类的种群数量。同时，已证明浓度为0.5％w/v的三果宝对果蝇无毒性，不引发免疫反应，甚至对果蝇寿命和运动性产生有益影响，这表明具有代谢有益效应。

最后，在这些生理学指标(寿命和运动性)测量中，与单个的益生菌或单独的三果宝相比，益生菌和合生素制剂显示出组合效应。

讨论

果蝇的肠道菌群随着年龄的增长而变化显著，大多数菌群都有很强的扩张，致病性变形菌属(Gammaproteobacteria spp.)和肠球菌属(Enterococcus spp.)²⁸均有不成比例的增加。这是果蝇中已知的一种现象，反映了衰老相关的免疫衰老和累积来源于促炎性致病有机体的肠道屏障功能障碍²⁹。这些变化与在衰老的人类身上观察到的年龄相关的变化类似^14,19。本研究中使用的益生菌和/或益生元剂的治疗，先前已被证明可以减少衰老果蝇的细菌负荷²⁸，具有免疫调节作用³⁰，调节代谢³¹，增强寿命²⁸，这表明了基于益生菌治疗剂治疗年龄相关疾病的潜力。

与常规饮食的果蝇相比较，合生素制剂使寿命延长了60％，而益生菌制剂使寿命延长了55％²⁸。还有一些其他的研究表明了益生菌补充的延长寿命的潜力^32-35，然而，本文所描述的是第一个研究，其证明了由于其延长寿命的效果，本文所述的新颖的合生素制剂对几种衰老标志物的同时和多方面的作用。

胰岛素样生长因子(IGF)-1的抑制和胰岛素信号被认为是限制热量摄入导致延长寿命的主要机制³⁶。

在本研究中，对照组中衰老果蝇的所有代谢障碍水平都被包括总重量、葡萄糖和甘油三酯水平在内的合生素制剂所挽救。先前的研究表明，dilps和胰岛素受体的下调可以延长果蝇的寿命³⁷，而这些因素是受饮食调节的³⁸。

在胰岛素信号途径方面，合生素治疗挽救了dAkt、dTOR的升高和dFOXO的降低，单个的益生菌和TFLA的作用是有益的，但作用是不同的。用其天然抑制剂雷帕霉素来抑制TOR信号，已经证明可以通过模拟限制热量的效果来延长酵母³⁹、线虫⁴⁰、果蝇⁴¹和小鼠⁴²的寿命。TOR信号的下游是转录因子的FOXO家族。通过限制热量激活AMPK也与FOXO表达升高和促长寿效应有关⁴³，包括同时抑制ROS产生⁴⁴、NF-κB诱导⁴⁵、衰老⁴⁶和预防凋亡⁴⁷，并促进线粒体自噬和自噬的保护机制⁴⁸。某些研究已经将人类FOXO3的多态性与长寿的增加联系起来^5,49，而在果蝇⁵⁰和小鼠⁵¹中FOXO3的过表达也能延长寿命。有趣的是，某些研究表明，多酚类物质的摄入，包括绿茶没食子肽、姜黄素和白藜芦醇，可以通过增加SOD、GPx和去乙酰化酶1的表达，降低NF-κB、TNF-α、ROS、炎症和氧化应激的机制^52,53，刺激FOXO表达，从而延长寿命。同样地，在研究中，FOXO的表达被合生素制剂上调。

与葡萄糖调节因子相似，许多潜在的脂肪生成因子也受到益生菌和合生素制剂的积极影响。存在着脂肪生成失调的改善，这表明在补充了合生素制剂的果蝇中FAS、SREBP和LSD2的表达有所恢复。在对照组中的衰老果蝇，脂肪生成性ACC和FAS基因的固有增加被益生菌和合生素制剂最显著地下调，糖异生PEPCK因子也是如此。这些变化可能与SREBP的转录调控有关，在益生菌和合生素制剂的作用下，SREBP的表达水平降低到幼蝇的水平。重要的是，SREBP调控受IlS途径控制，由Akt和TOR信号共同激活⁵⁴。对于年龄和年龄相关疾病的许多方面，脂肪酸脂肪生成的调节是重要的考虑因素，尤其是炎症，因为肥胖与促炎状态有内在地联系⁵⁵，而这种状态已知可以通过充足的益生菌和益生元治疗预防^56,57。

先前的研究表明，PPARγ介导反应是黑腹果蝇代谢应激模型中合生素作用的核心³¹。PPARγ在脂肪组织中高表达，是脂肪生成和脂肪形成的关键调节因子⁵⁸，也是主要的胰岛素增敏剂⁵⁹。还认为PPARγ在其他组织中的表达是调节它们的代谢和炎症反应⁶⁰使其成为许多衰老假说的中心⁶¹。在本研究中，对照组中衰老果蝇PPARγ靶标E75被显著下调，该效应仅在益生菌和合生素组有所改善，而且合生素组PPARγ表达随着时间的推移而增加。该效应将解释对脂肪生成因子和胰岛素敏感性的有益作用，这支持了合生素治疗在衰老的果蝇中高水平地调节代谢应激的观点，并解释了广泛的代谢效应。

衰老与免疫衰老有关，免疫衰老是由干细胞的衰竭、免疫系统再生能力的降低、抗原的积累和胸腺萎缩引起的⁶²。功能失调的免疫细胞使机体无法进行适当的免疫反应，导致损伤细胞的积累，释放促炎性细胞因子。慢性低级别的炎症(炎性衰老)与许多年龄相关的疾病有关，所述年龄相关的疾病如神经退行性变、心血管疾病、胰岛素抵抗、糖尿病、骨质疏松症、认知能力下降、痴呆、虚弱、癌症，以及重要的是，死亡(⁶³中的综述)。

老年人的肠道菌群反映了富含变形菌和缺乏产生丁酸盐的细菌2的促炎性体质。随着年龄的增长，胃肠道(GIT)上皮内层的完整性受损，导致细菌和细菌产物渗入宿主的血流，从而导致炎性衰老⁶⁴。所有这些因素都与肠道菌群有关⁶⁵，而年龄相关的菌群变异会降低肠道上皮的完整性，导致肠道不典型增生⁶⁶。促炎性环境还通过LPS-TLR4相互作用促进NF-κB的激活，以及促进幼稚T细胞向促炎性Th17细胞分化⁶⁷。慢性低级别的炎性衰老的逐渐积累可能是许多与年龄相关的慢性疾病的来源，因为炎症与ROS生成升高、线粒体功能障碍和代谢异常共病。

如前所述，衰老的果蝇中有促炎性致病有机体的上调，而这被合生素制剂下调²⁸。确实，衰老的果蝇更容易感染，免疫系统受损，如吞噬作用和黑化作用⁶⁸。在果蝇中也可以观察到免疫相关基因的普遍增加、细菌负荷的增加和感染后更持久的AMP激活，类似于在人类中观察到的慢性炎症状态⁶⁹。在本研究中，对照组中果蝇的固有性免疫功能存在年龄相关的下降。特别的是，针对革兰氏阳性(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性(大肠杆菌)挑战的活性免疫制剂都出现了下降，该效应受到所有益生菌治疗的显著影响，但在最大程度上地影响，是由益生菌和合生素制剂所造成的。这可能反映了衰老的果蝇对抗入侵的病原体进行免疫攻击的能力下降，如先前的注释⁷⁰所示。相比观察免疫基因表达的增加的其他的研究⁶⁸,对照组衰老蝇中所观察的Duox和IMD表达的减少，表明固有性免疫反应减弱并且支持在琼脂扩散试验中观察到的对致病性损伤的免疫力减弱。Duox和IMD处于果蝇固有性免疫系统的第一道防线并且受到入侵病原体的抗原识别的直接地调节。因此，可能的是脂肪体中核心免疫调节细胞的反应被受年龄影响的Duox和IMD产生所连累。这可能包括杰纳斯激酶/信号转换器转录激活因子(JNK/STAT)途径，该途径已被证明对果蝇的系统免疫应答具有竞争或合作作用⁷¹。

尽管在衰老的果蝇中IMD表达下降，但观察到AMP表达增加，特别是抗菌肽A、防御素和蝇抗菌肽，并显著受益于单个的益生菌、益生元以及益生菌和合生素制剂的补充。这已被观察到⁷²，并且与肠道屏障功能障碍直接相关，而肠道屏障功能障碍与果蝇的寿命有关⁷³。导致IMD信号与AMP表达差异的原因可能与AMP表达调控水平不同有关。衰老蝇中AMP表达升高与氧化应激升高相关⁷⁴。包括抗菌肽A在内的某些AMPs可被诸如AP-1和NF-κB蛋白以及HDAC活性的炎症因子共同调节⁷²。此外，AMPs还受到激素信号的影响，即20-羟基蜕皮素和保幼激素75，它们受衰老的影响有所不同。IlS也影响了AMP的表达⁶⁸，这可以解释益生菌治疗对衰老果蝇AMP表达的显著影响。确实，dFOXO被证明可以调节AMP的表达，尤其是在Toll和IMD途径有缺陷的情况下⁷⁶。

随着年龄的增长⁷⁷，线粒体随着形态改变、数量减少、蛋白数量缺失和mtDNA突变而逐渐丧失能量能力⁷⁸。线粒体自噬和线粒体分裂-融合周期的失调也会损害线粒体完整性，导致ROS生成升高和线粒体连续损伤⁷⁹。

本研究证实了线粒体功能的下降，因为随着时间的推移，对照组蝇的每一ETC复合物的活性都降低。线粒体在衰老过程中起着关键作用，而果蝇已经被确认为是研究年龄中的线粒体活动的强大模型⁸⁰。在小鼠和大鼠的各种组织中也观察到类似的现象，但仅观察到复合物I和IV的活性下降⁸¹，而复合物II和III的活性相对不变⁸²。与对照组相比较，TFLA、益生菌和合生素制剂能够在第30天提高ETC复合物1、3和4的活性，这对于说明益生菌治疗如何影响线粒体复合物的完整性并进而影响ROS颗粒的产生是非常重要的。

线粒体生物发生的关键调节因子之一是PGC-1转录共激活因子家族，其表达随着年龄而下降⁸³。PGC-1α的缺失与线粒体生物发生的减少、裂变-融合周期的减少和线粒体自噬功能障碍有关⁸⁴。营养剥夺是线粒体动力学的关键调制器，因为限制热量会降低AMP/ATP和NADH/NAD+比值，最终分别通过PGC-1α和SIRT1刺激线粒体的生物生成和活性。果蝇中的结果显示，PGC-1α同源性(dPGC-1/芦笋)的过表达足以增加线粒体活性，而且消化道中dPGC-1的组织特异性表达可延长寿命⁸³。支持这一点的是，E75，果蝇PPARγ靶标，在本研究中显示随着年龄的增长而下降，很可能代表PGC-1α等同物的下降。个体的益生菌治疗对E75表达的影响不大；然而，无论是益生菌制剂还是合生素制剂治疗，在第30天E75的表达均升高。这表明PPARγ可能是肠道菌群通过线粒体复合物完整性管理寿命的关键机制之一。

ROS的产生是健康的重要组成部分，但过多的ROS会引发疾病。免疫衰老加剧氧化还原应激，反之亦然，刺激ROS产生和炎症之间的正反馈循环⁸⁵。在目前的衰老模型中，ROS水平明显升高，对照组的果蝇总氧化剂和LPO水平升高，而SOD和GPx活性显著降低。益生菌和合生素制剂对抗氧化酶活性影响较小，但显著降低总氧化剂和脂质过氧化氢(LPO)的水平，其中合生素制剂对降低脂质过氧化氢(LPO)的水平影响更大。这在神经退行性变的背景下是非常重要的，因为在神经元细胞膜中有高水平的PUFA，而在阿尔茨海默病中LPO的水平与认知障碍的程度相关⁸⁶。

在本研究中，将含有三种生物活性益生菌的优化益生菌制剂，如本发明所提供的实例性制剂，与新颖的富含多酚的益生元三果宝组合，创建新颖的延长寿命的合生素制剂。这种合生素制剂对各种衰老标志物有组合效应，包括管理这些标志物的交叉调节的基本信号途径。通过了解肠道菌群和益生菌治疗如何与这些关键的衰老途径相互作用，可以在生命早期制定特定的制剂以预防包括心血管疾病、糖尿病、肥胖症、癌症，甚至神经退行性变在内的慢性疾病的发生。

材料和方法

益生菌的培养

三种益生菌菌株-植物乳杆菌NCIMB 8826(Lp8826)、发酵乳杆菌NCIMB 5221(Lf5221)和婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255(Bi702255)获取自NCIMB菌种保藏中心(Aberdeen,Scotland,UK)。在37℃下将细胞培养在获取自Sigma Aldrich(Oakville,ON,Canada)的Man-Rogosa-Sharpe(MRS)培养基的MRS-琼脂平板上或液体培养基中。经一轮液体培养后，用含20％(v/v)甘油的MRS培养基制备若干细菌储备液，并在-80℃保存。由于进行所有的实验都需要持续培养，为了保持培养物的纯度，每两周更新一次冻存菌。为准备每个单独的实验，使用1％(v/v)的接种物进行传代培养，在37℃孵育18小时，使用前立即取出。

益生菌和合生素制剂

三果宝的干燥成分(TFLA；余甘子、毛诃子和诃子)获取自印度瓦拉纳西巴纳拉斯印度大学的阿育韦陀药房。每一种成分都被单独称量，并以相等的比例(按重量)组合在一起，然后再用研钵和杵手工碾碎并研磨成细粉。在沸腾过程中，将5g的TFLA粉末与1L的果蝇培养基混合，使整个培养基中TFLA终浓度为0.5％。益生菌制剂中含有的益生菌总量为3.0x10⁹ CFU/ml，平均分配在Lp8826(1.0x109 CFU/ml)、Lf5221(1.0x109 CFU/ml)和Bi702255(1.0x109 CFU/ml)之间。合生素制剂包含所述益生菌制剂和添加0.5％的TFLA粉末。

果蝇喂养

从布卢明顿果蝇储备中心(印第安纳州大学，Bloomington Indiana)采购野生型黑腹果蝇(Oregon R)。将蝇喂养在没有激活的酵母培养物的标准的燕麦片-蔗糖-酵母培养基上，通过在蒸馏水中将燕麦片(83g)、蔗糖(50g)和酵母提取物(30g)煮沸30分钟制备所述的培养基。将果蝇保存在25℃12h:12h光照-黑暗循环的控制条件下。为制备接种益生菌和/或致病菌的果蝇瓶，将培养液过夜，4℃下3000x g离心10分钟。洗涤1次团粒，用0.85％(w/v)生理盐水再悬浮。用分光光度法测定菌落总数，并与MRS平板上菌落形成单位(CFUs)制备的标准曲线比较。接种培养基的制备方法是将浓缩的细菌培养物分开到冷却的液体培养基中，使其达到指定的最终浓度CFU/ml培养基。这是经验证的口腔接种果蝇的方法，因为细菌细胞在果蝇培养基中存活长达两周后，通过每日CFU计数可检测出浓度下降。然而，在实验过程中，果蝇每3至4天被转移到新的接种瓶中。

果蝇的代谢测量

体重是通过在麻醉时称量10只蝇，重复称量5次来评估的。葡萄糖的测量分别取自果蝇的血淋巴和全身匀浆，代表循环和总葡萄糖的水平。用细钨针穿刺麻醉果蝇提取血淋巴，将其置于位于大管中具有数个穿孔的小管中，以4000rpm离心10分钟。对于整个机体匀浆，首先使用Bradford法测定总蛋白含量，并将由此产生的代谢标志物量化与总蛋白含量进行标准化，以解释果蝇质量变化的原因。随后，匀浆在70℃热处理20分钟以去除任何复合物。使用葡萄糖(HK)检测试剂盒(Sigma,Oakvilla,ON,Canada)根据制造商的说明测量2μl的血淋巴或5μl的全身匀浆中的葡萄糖水平。根据制造商的说明，在10μl的匀浆中使用甘油三酯液体着色试验(Stanbio,TX,USA)测定全身甘油三酯。

代谢标志物的遗传变异

使用Trizol(ThermoFisher,MA,USA)，根据制造商的说明，从25只整只果蝇中提取RNA。使用高容量cDNA合成试剂盒(ThermoFisher,MA,USA)，根据制造商的说明，用ND-2000分光光度计(FisherScientific,Ottawa,ON,Canada)测量以1μg RNA合成的cDNA。使用SybrGreen(EvaGreen qPCR Mastermix,Diamed,Mississauga,Canada)实时定量PCR(Eco实时PCR系统,llumina,CA,USA)进行各种免疫因子基因的表达。引物、它们的序列和退火温度列于表3，根据核糖体蛋白Rp49水平，采用2^ddCT方法计算最终基因表达量。

表3：黑腹果蝇代谢标志物的引物序列

氧化应激标志物

在Tris-EDTA-Triton X-100缓冲液中对从25只蝇制备的新鲜果蝇匀浆检测氧化应激标志物，该缓冲液pH为7.4，通过细布过滤去除固体颗粒。使用2’-7’-二氯荧光素二乙酸(DCFA)(Sigma,Oakville,ON)，如前所述的⁹²测定总氧化剂。简单地说，将20μl的蝇匀浆与170μl的洛克缓冲液混合。然后，每孔加入10μl的1mM DCFA溶液，孵育3分钟后，荧光读取474nm激发光和530nm发射光。定量标准化为每个样品中蛋白的含量。

用黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶反应生成超氧化物自由基，以硝基四唑蓝(NBT)还原作为超氧化物生成的指标⁹³，测定SOD活性。简单地说，工作溶液由20mg/ml BSA的磷酸钾缓冲液110μl、过氧化氢酶(40U/ml)6.25μl、NBT6.25μl和黄嘌呤(1.8mM)50μl组成。工作溶液中加入7.5μl的匀浆和20μl的黄嘌呤氧化酶(XOD,5U/ml)，在37℃下暗处搅拌20分钟，使颜色显影。还原NBT的吸光度在570nm处记录，与SOD的标准曲线进行比较，标准化为样品中蛋白的含量。

GPx活性的评估基于谷胱甘肽(GSSG)的氧化，这是通过过量的谷胱甘肽还原酶(GR)持续供应。为了测量GPx的活性，在340nm处监测了共底物NADPH的随之降低，如之前所示⁹⁴。简单地说，GPx缓冲液中含有0.5M磷酸钠(pH 7.2)、100mM EDTA和1.1mM叠氮化钠。GPx测定缓冲液由1.33mM GSSH和1.33U/ml GPx缓冲液组成。测定溶液由GPx测定液160μl、NADPH(5mM)10μl、过氧化氢(0.5％)20μl和匀浆15μl组成。在340nm处监测吸光度3分钟，并且对于GPx活性对曲线的线性部分进行评估，并将定量标准化为样品中蛋白的含量。

脂质过氧化(LPO)水平被评估为改编自⁹⁵在有丁基羟基甲苯(BHT)存在的情况下结合的丙二醛(MDA)被水解。反应溶液包含3:1的乙腈:甲醇混合物中10mM的1-甲基-2-苯基吲哚。向120μl的这种溶液中加入20μl的样品和40μl的37％HCl，并在100℃下反应60分钟。在550nm处测定所得溶液的吸光度，与MDA标准溶液比较并且标准化为样品中总蛋白的含量。

琼脂盘扩散测定

为评估果蝇的直接抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长的能力，将从在含有益生菌和/或益生元疗法的培养基上喂养了10天的果蝇获得的血淋巴置于胰蛋白示亚硫酸盐环丝氨酸(TSC)-琼脂(Sigma,Oakville,ON)平板上的金黄色葡萄球菌或大肠杆菌的菌苔。用细针在胸腔部位刺穿50只蝇并且置于小的带有若干空洞的微量离心管中，再将其放入较大的微量离心管。在4℃下以3000x g离心刺穿的蝇20分钟以去除足够的血淋巴用于分析。用无菌盐水稀释血淋巴(20μl)至50μl并且用移液器吸取到位于刚涂满了100μl过夜的金黄色葡萄球菌或大肠杆菌溶液的营养琼脂平板的5mm无菌滤纸环。将带有血淋巴饱和滤纸的接种平板置于37℃下24小时，然后测量抑菌圈。每一处理都在单独的营养琼脂平板上重复三次。

炎症标志物

除了使用表4中列出的引物序列外，我们按照代谢标志物部分的描述评估了遗传炎症标志物的表达。

表4：黑腹果蝇炎症标志物的引物序列

线粒体电子传递链(ETC)复合物活性

通过将40只麻醉后的果蝇用预冷的光滑杵磨机(Corning,NY,USA)在冰上4mL冷冻低渗缓冲液(25mM K₂HPO₄和5mM MgCl₂)中匀浆，从果蝇中分离线粒体。使用细尼龙网过滤掉大块，在-80℃保存之前，剩余的分离物在干冰上快速冷冻。使用前，匀浆经过3次冻融循环以打开线粒体膜。

如前所述⁷⁵，通过测定从NADH向癸基泛醌转移的电子，评估ETC复合物I(NADH-泛醌氧化还原酶)的活性。测定缓冲液中含有磷酸钾缓冲液(50mM,pH 7.2)、牛血清白蛋白BSA(50mg/mL)、氰化钾(KCN；10mM)和NADH((10mM)和鱼藤酮(1mM)。为了启动反应，在150μL的测定缓冲液中加入25μL的匀浆和10μM的癸基泛醌。在两分钟内监测340nm处吸光度的变化，记录NADH还原的斜率，并且标准化为样品中总蛋白。

如前所述⁷⁵，ETC复合物II(琥珀酸-泛醌氧化还原酶)被测定为2,6-双酚羟基吲哚酚(DCPIP)的还原率。测定缓冲液中含有磷酸钾缓冲液(50mM,pH 7.6)、BSA(50mg/mL)、氰化钾(KCN,10mM)、琥珀酸盐(400mM)和DCPIP(0.015％w/v)。为了启动反应，在160μL的测定缓冲液中加入10μL的匀浆和65mM的吩嗪硫酸甲酯。在两分钟内测定600nm的还原速率，并将ETC复合物II的活性测量为DCPIP还原斜率的线性部分，并且标准化为样品中蛋白的含量。

ETC复合物III(NADH-细胞色素c氧化还原酶)的活性被测定为细胞色素c的抗霉素依赖还原性率。测定缓冲液中含有磷酸钾缓冲液(50mm,pH 7.2)，以及氧化细胞色素c(1mM)、KCN(10mm)、EDTA(5mM)、吐温-20(2.5％)和抗霉素A(1mg/mL)。为了启动反应，在测定缓冲液中加入20μL的样品匀浆和10μL的癸基泛醌(10mM)。在两分钟内550nm处在有和没有抗霉素A的情况下监测细胞色素c的还原并且将反应速率的差异作为抗霉素A敏感的复合物活性，并且标准化为样品中蛋白的含量。

最后，通过监测细胞色素c氧化的速率，测定复合物IV(细胞色素c氧化酶)的活性。测定缓冲液中含有补充了还原的细胞色素c(1mM)的磷酸钾缓冲液(50mM,pH 8.0)。在氧化的细胞色素c溶液中加入几粒二硫氰酸钠可使细胞色素c还原，直到红色变为橙色，大于550nm至565nm时吸光度大于6。反应初始时加入25μl的匀浆，3分钟内在550nm处记录还原速率。复合率被标准化为样品中总蛋白的含量。

统计

所有统计分析均使用[R]软件进行。所有实验均进行了5项独立的试验。体重和益生菌剂量曲线上的运动性变化通过Tukey事后比较法的单因素方差分析进行评估。代谢标志物和基因表达的意义通过Tukey事后比较法的双因素方差分析进行评估。如果p<0.05，则具有显著性，并且在p<0.01时评估。

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已描述了本发明的许多实施方案。然而，应理解的是可以在不偏离本发明的精神和范围的情况下进行各种修改。因此，其他实施例也在下列权利要求书的范围内。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.包含一种或多种益生菌的制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒，所述益生菌包含或由以下组成：

选自发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)NCIMB 5221、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NCIMB 8826和婴儿长双歧杆菌(Bifidobacteria longumspp.infantis)NCIMB 702255中至少两种菌株的任何组合。

2.如权利要求1所述的制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒，还包含益生元组合物，

其中任选地所述益生元组合物包含或由以下组成：三果宝或任何草本rasayana配方，所述草本rasayana配方由相对等份的三种不含籽的榄仁树属干果组成：庵摩勒(余甘子(Emblica officinalis))、毗黎勒(毛诃子(Terminalia bellirica))和诃黎勒(诃子(Terminalia chebula))，

以及任选地包含所述三果宝或所述草本rasayana的制剂或药物组合物为水性或基于水的制剂，

以及任选地所述制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒的约0.5％至50％为所述三果宝或所述草本rasayana。

3.如任一前述权利要求所述的制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒，其包含：

-发酵乳杆菌NCIMB 5221，

-植物乳杆菌NCIMB 8826，

-婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255，

-发酵乳杆菌NCIMB 5221和植物乳杆菌NCIMB 8826，

-植物乳杆菌NCIMB 8826和婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255，

-发酵乳杆菌NCIMB 5221和婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255，或者

-发酵乳杆菌NCIMB 5221、植物乳杆菌NCIMB 8826和婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255。

4.如任一前述权利要求所述的制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒，其中所述制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒中的活性益生菌由以下组成：

-发酵乳杆菌NCIMB 5221，

-植物乳杆菌NCIMB 8826，

-婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255，

-发酵乳杆菌NCIMB 5221和植物乳杆菌NCIMB 8826，

-植物乳杆菌NCIMB 8826和婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255，

-发酵乳杆菌NCIMB 5221和婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255，或者

-发酵乳杆菌NCIMB 5221、植物乳杆菌NCIMB 8826和婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255。

5.如任一前述权利要求所述的制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒，其中所述益生菌为活的或死的。

6.如任一前述权利要求所述的制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒，其中所述益生菌：

(a)以相对等比例存在；

(b)总数在约10⁵CFU/ml至10¹¹CFU/ml或在约10⁵CFU/gm至约3.0x 10¹¹CFU/gm；或者

(c)总数约3.0x 10⁹CFU/ml或约3.0x 10⁹CFU/gm，任选地具有以下相对比例：

-约1.0x 10⁹CFU/ml的发酵乳杆菌NCIMB 5221(Lf5221)，

-约1.0x 10⁹CFU/ml的植物乳杆菌NCIMB 8826(Lp8826)，和

-约1.0x 10⁹CFU/ml的婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255(Bi702255)。

7.如任一前述权利要求所述的制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒，其被制造或配制为溶液、悬浮液、乳液、粉末、锭剂、丸剂、糖浆、片剂、胶囊、明胶、气溶胶、栓剂、咀嚼胶、胶囊、小袋的形式。

8.如任一前述权利要求所述的制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒，其被制造或配制为可食用的材料、饮料或食品、任选地包含水、液体或固体乳制品、牛奶、炼乳、可饮用的酸奶、酸奶、发酵饮料、冰淇淋、奶酪、豆奶、蔬菜汁、果汁、运动饮料、甜品、果冻、糖果、婴儿食品、保健食品、膳食补充剂或添加剂。

9.如任一前述权利要求所述的制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒，其被制造或配制具有以下的单位剂量：

(a)总计在约10⁵CFU/ml至约10¹¹CFU/ml，或在约10⁵CFU/gm至约3.0x 10¹¹CFU/gm；或者

(b)总计约3.0x 10⁹CFU/ml或约3.0x 10⁹CFU/gm，任选地具有以下相对比例：

-约1.0x 10⁹CFU/ml的发酵乳杆菌NCIMB 5221(Lf5221)，

-约1.0x 10⁹CFU/ml的植物乳杆菌NCIMB 8826(Lp8826)，和

-约1.0x 10⁹CFU/ml的婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255(Bi702255)。

10.方法，其用于：

(a)在需要所述方法的个体中，治疗、改善、预防和/或缓解(例如减少其症状)代谢和氧化应激、炎症、衰老和/或神经退行性变，或减慢代谢和氧化应激、炎症、衰老和/或神经退行性变的发生或进展，或延长寿命；

(b)在需要所述方法的个体中，治疗、改善、预防和/或缓解(例如减少其症状)诸如糖尿病和肥胖症的代谢疾病，诸如炎症性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)的炎症性疾病；关节炎；诸如阿尔茨海默病和帕金森病的神经退行性疾病；包括抵抗氧化应激的氧化应激；和/或包括减少炎症的炎症，或减慢诸如糖尿病和肥胖症的代谢疾病，诸如炎症性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)的炎症疾病；关节炎；诸如阿尔茨海默病和帕金森病的神经退行性疾病；包括抵抗氧化应激的氧化应激；和/或包括减少炎症的炎症的发生或进展；或者

(c)在需要所述方法的个体中，降低血液的和总的葡萄糖水平、降低甘油三酯水平和管理胰岛素抵抗，

所述方法包括向需要所述方法的个体给予任一前述权利要求所述的制造品、制剂、药物组合物或试剂盒，

其中任选地所述个体为人类或动物，

以及任选地向所述个体每天给予约1至4个剂量或单位剂量的所述制造品、制剂、药物组合物或试剂盒，并且任选地对于儿科使用，减少单位剂量，任选地减少约10％至90％。

11.任一前述权利要求所述的制造品、制剂、药物组合物或试剂盒的用途，其用于：

(a)在需要所述用途的个体中，治疗、改善、预防和/或缓解(例如减少其症状)代谢和氧化应激、炎症、衰老和/或神经退行性变，或减慢代谢和氧化应激、炎症、衰老和/或神经退行性变的发生或进展，或延长寿命。

(b)在需要所述的个体中，治疗、改善、预防和/或缓解(例如减少其症状)诸如糖尿病和肥胖症的代谢疾病，诸如炎症性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)的炎症性疾病；关节炎；诸如阿尔茨海默病和帕金森病的神经退行性疾病；包括抵抗氧化应激的氧化应激；和/或包括减少炎症的炎症，或减慢诸如糖尿病和肥胖症的代谢疾病，诸如炎症性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)的炎症性疾病；关节炎；诸如阿尔茨海默病和帕金森病的神经退行性疾病；包括抵抗氧化应激的氧化应激；和/或减少炎症的炎症的发生或进展；或者

(c)在需要所述用途的个体中，降低血液的和总的葡萄糖水平、降低甘油三酯水平和管理胰岛素抵抗，

其包括向需要所述用途的个体给予任一前述权利要求所述的制造品、制剂、药物组合物或试剂盒，

其中任选地所述个体为人类或动物，

以及任选地向所述个体每天给予约1至4个剂量或单位剂量的所述制造品、制剂、药物组合物或试剂盒，并且任选地对于儿科使用，减少单位剂量，任选地减少约10％至90％。

12.用于如下用途的任一前述权利要求所述的制造品、制剂、药物组合物或试剂盒：

(a)在需要其的个体中，治疗、改善、预防和/或缓解(例如减少其症状)代谢和氧化应激、炎症、衰老和/或神经退行性变，或减慢代谢和氧化应激、炎症、衰老和/或神经退行性变的发生或进展，或延长寿命；

(b)在需要其的个体中，治疗、改善、预防和/或缓解(例如减少其症状)诸如糖尿病和肥胖症的代谢疾病，诸如炎症性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)的炎症疾病；关节炎；诸如阿尔茨海默病和帕金森病的神经退行性疾病；包括抵抗氧化应激的氧化应激；和/或包括减少炎症的炎症，或减慢诸如糖尿病和肥胖症的代谢疾病，诸如炎症性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)的炎症疾病；关节炎；诸如阿尔茨海默病和帕金森病的神经退行性疾病；包括抵抗氧化应激的氧化应激；和/或包括减少炎症的炎症的发生或进展；或者

(c)在需要其的个体中，降低血液的和总的葡萄糖水平、降低甘油三酯水平和管理胰岛素抵抗，

其包括向需要其的个体给予任一前述权利要求所述的制造品、制剂、药物组合物或试剂盒，

其中任选地所述个体为人类或动物，

以及任选地向所述个体每天给予约1至4个剂量或单位剂量的所述制造品、制剂、药物组合物或试剂盒，并且任选地对于儿科使用，减少单位剂量，任选地减少约10％至90％。

Claims (12)

1.包含一种或多种益生菌的制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒，所述益生菌包含或由以下组成：发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)NCIMB 5221、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NCIMB 8826和婴儿长双歧杆菌(Bifidobacteria longumspp.infantis)NCIMB 702255的任何组合。

2.如权利要求1所述的制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒，还包含益生元组合物，

其中任选地所述益生元组合物包含或由以下组成：三果宝，或任何草本rasayana配方，所述草本rasayana配方由相对等份的三种不含籽的榄仁树属干果组成：庵摩勒(余甘子(Emblica officinalis))、毗黎勒(毛诃子(Terminalia bellirica))和诃黎勒(诃子(Terminalia chebula))，

以及任选地包含所述三果宝或所述草本rasayana的制剂或药物组合物为水性或基于水的制剂，

以及任选地所述制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒的约0.5％至50％为所述三果宝或所述草本rasayana。

3.如任一前述权利要求所述的制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒，其包含：

-发酵乳杆菌NCIMB 5221，

-植物乳杆菌NCIMB 8826，

-婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255，

-发酵乳杆菌NCIMB 5221和植物乳杆菌NCIMB 8826，

-植物乳杆菌NCIMB 8826和婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255，

-发酵乳杆菌NCIMB 5221和婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255，或者

-发酵乳杆菌NCIMB 5221、植物乳杆菌NCIMB 8826和婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255。

4.如任一前述权利要求所述的制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒，其中所述制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒中的活性益生菌由以下组成：

-发酵乳杆菌NCIMB 5221，

-植物乳杆菌NCIMB 8826，

-婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255，

-发酵乳杆菌NCIMB 5221和植物乳杆菌NCIMB 8826，

-植物乳杆菌NCIMB 8826和婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255，

-发酵乳杆菌NCIMB 5221和婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255，或者

-发酵乳杆菌NCIMB 5221、植物乳杆菌NCIMB 8826和婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255。

5.如任一前述权利要求所述的制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒，其中所述益生菌为活的或死的。

6.如任一前述权利要求所述的制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒，其中所述益生菌：

(a)以相对等比例存在；

(b)总数在约10⁵CFU/ml至10¹¹CFU/ml或在约10⁵CFU/gm至约3.0x 10¹¹CFU/gm，

(c)总数约3.0x 10⁹CFU/ml或约3.0x 10⁹CFU/gm，任选地具有一下相对比例：

-约1.0x 10⁹CFU/ml的发酵乳杆菌NCIMB 5221(Lf5221)，

-约1.0x 10⁹CFU/ml的植物乳杆菌NCIMB 8826(Lp8826)，和

-约1.0x 10⁹CFU/ml的婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255(Bi702255)。

7.如任一前述权利要求所述的制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒，其被制造或配制为溶液、悬浮液、乳液、粉末、锭剂、丸剂、糖浆、片剂、胶囊、明胶、气溶胶、栓剂、咀嚼胶、胶囊、小袋或其任何等价的形式。

8.如任一前述权利要求所述的制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒，其被制造或配制为可食用的材料、饮料或食品、任选地包含水、液体或固体乳制品、牛奶、炼乳、可饮用的酸奶、酸奶、发酵饮料、冰淇淋、奶酪、豆奶、蔬菜汁、果汁、运动饮料、甜品、果冻、糖果、婴儿食品、保健食品、膳食补充剂或添加剂、或其任何等价物。

9.如任一前述权利要求所述的制造品、组合物、制剂、药物组合物或试剂盒，其被制造或配制具有以下的单位剂量：

(a)总计在约10⁵CFU/ml至约10¹¹CFU/ml，或在约10⁵CFU/gm至约3.0x 10¹¹CFU/gm；或者

(b)总计约3.0x 10⁹CFU/ml或约3.0x 10⁹CFU/gm，任选地具有以下相对比例：

-约1.0x 10⁹CFU/ml的发酵乳杆菌NCIMB 5221(Lf5221)，

-约1.0x 10⁹CFU/ml的植物乳杆菌NCIMB 8826(Lp8826)，和

-约1.0x 10⁹CFU/ml的婴儿长双歧杆菌NCIMB 702255(Bi702255)。

10.方法，其用于：

(a)在需要所述方法的个体中，治疗、改善、预防和/或缓解(例如减少其症状)代谢和氧化应激、炎症、衰老和/或神经退行性变，或减慢代谢和氧化应激、炎症、衰老和/或神经退行性变的发生或进展，或延长寿命；

(b)在需要所述方法的个体中，治疗、改善、预防和/或缓解(例如减少其症状)诸如糖尿病和肥胖症的代谢疾病，诸如炎症性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)的炎症性疾病；关节炎；诸如阿尔茨海默病和帕金森病的神经退行性疾病；包括抵抗氧化应激的氧化应激；和/或包括减少炎症的炎症，或减慢诸如糖尿病和肥胖症的代谢疾病，诸如炎症性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)的炎症疾病；关节炎；诸如阿尔茨海默病和帕金森病的神经退行性疾病；包括抵抗氧化应激的氧化应激；和/或包括减少炎症的炎症的发生或进展；或者

(c)在需要所述方法的个体中，降低血液的和总的葡萄糖水平、降低甘油三酯水平和管理胰岛素抵抗，

所述方法包括向需要所述方法的个体给予任一前述权利要求所述的制造品、制剂、药物组合物或试剂盒，

其中任选地所述个体为人类或动物，

以及任选地向所述个体每天给予约1至4个剂量或单位剂量的所述制造品、制剂、药物组合物或试剂盒，并且任选地对于儿科使用，减少单位剂量，任选地减少约10％至90％。

11.任一前述权利要求所述的制造品、制剂、药物组合物或试剂盒的用途，其用于：

(a)在需要所述用途的个体中，治疗、改善、预防和/或缓解(例如减少其症状)代谢和氧化应激、炎症、衰老和/或神经退行性变，或减慢代谢和氧化应激、炎症、衰老和/或神经退行性变的发生或进展，或延长寿命。

(b)在需要所述的个体中，治疗、改善、预防和/或缓解(例如减少其症状)诸如糖尿病和肥胖症的代谢疾病，诸如炎症性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)的炎症性疾病；关节炎；诸如阿尔茨海默病和帕金森病的神经退行性疾病；包括抵抗氧化应激的氧化应激；和/或包括减少炎症的炎症，或减慢诸如糖尿病和肥胖症的代谢疾病，诸如炎症性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)的炎症性疾病；关节炎；诸如阿尔茨海默病和帕金森病的神经退行性疾病；包括抵抗氧化应激的氧化应激；和/或减少炎症的炎症的发生或进展；或者

(c)在需要所述用途的个体中，降低血液的和总的葡萄糖水平、降低甘油三酯水平和管理胰岛素抵抗，

其包括向需要所述用途的个体给予任一前述权利要求所述的制造品、制剂、药物组合物或试剂盒，

其中任选地所述个体为人类或动物，

以及任选地向所述个体每天给予约1至4个剂量或单位剂量的所述制造品、制剂、药物组合物或试剂盒，并且任选地对于儿科使用，减少单位剂量，任选地减少约10％至90％。

12.用于如下用途的任一前述权利要求所述的制造品、制剂、药物组合物或试剂盒：

(a)在需要其的个体中，治疗、改善、预防和/或缓解(例如减少其症状)代谢和氧化应激、炎症、衰老和/或神经退行性变，或减慢代谢和氧化应激、炎症、衰老和/或神经退行性变的发生或进展，或延长寿命；

(b)在需要其的个体中，治疗、改善、预防和/或缓解(例如减少其症状)诸如糖尿病和肥胖症的代谢疾病，诸如炎症性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)的炎症疾病；关节炎；诸如阿尔茨海默病和帕金森病的神经退行性疾病；包括抵抗氧化应激的氧化应激；和/或包括减少炎症的炎症，或减慢诸如糖尿病和肥胖症的代谢疾病，诸如炎症性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)的炎症疾病；关节炎；诸如阿尔茨海默病和帕金森病的神经退行性疾病；包括抵抗氧化应激的氧化应激；和/或包括减少炎症的炎症的发生或进展；或者

(c)在需要其的个体中，降低血液的和总的葡萄糖水平、降低甘油三酯水平和管理胰岛素抵抗，

其包括向需要其的个体给予任一前述权利要求所述的制造品、制剂、药物组合物或试剂盒，

其中任选地所述个体为人类或动物，

以及任选地向所述个体每天给予约1至4个剂量或单位剂量的所述制造品、制剂、药物组合物或试剂盒，并且任选地对于儿科使用，减少单位剂量，任选地减少约10％至90％。

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