KR102007980B1 - 신규 유산균을 이용한 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents
신규 유산균을 이용한 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 새로운 유산균인 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산을 포함한 조성물에 관한 발명으로 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료와, 항당뇨 및 항비만에 우수한 효과를 가져 이를 이용한 다양한 약학적 조성물, 건강 식품 등을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 신규 유산균을 이용한 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
유산균은 대사에 의해 다양한 종류의 대사물질을 생성하고 이러한 대사물질 중에서는 장내 유해 세균의 증식 억제, 유해물질의 생성 억제, 염증 질환 개선, 심혈 질환 개선, 콜레스테롤의 저하 등 여러 유용한 기능을 하는 것으로 알려져 있어 유산균은 건강식품 및 의학적 제제의 제조를 위해 사용되어 왔다.
유산균은 종류에 따라 대사에 의해 체내에서 특정 해로운 물질을 분해하거나, 대사에 사용되는 물질에 따라 특정 물질도 생성할 수도 있고, 체내에서 특정 물질의 흡수율을 증가시키게 할 수도 있다. 예를 들어, 한국공개특허 제2004-0037011호에서 비만 또는 당뇨 예방을 위해 락토바실러스 루테리를 포함하는 식품 조성물을 개시하고 있고, 한국등록특허 제1426275호에서 여러 유산균을 혼합하여 포함한 항비만 조성물을 개시하고 있다.
5-아미노레불린산(5-aminolevulinic acid)은 포르피린(porphyrin)이 생합성되는 과정의 중간체로서, 포르피린은 테트라피롤(tetrapyrrol)고리 내에 고정된 금속 이온 복합체로 생체 내에서 중요한 기능을 수행하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 엽록소, 헤모글로빈 또는 미오글로빈은 포르피린을 모핵으로 하며 금속이온이 서로 다른 복합체에 해당한다. 5-아미노레불린산은 탈수효소인 5-아미노레불린산디하이드라타아제(5-aminolevulinic acid dehydratase)에 의해 탈수되어 이량체로서 포르포빌리노겐(porphobilinogen)이 생성되고 포르포빌리노겐이 유로포르피린(uroporphyrin)을 거쳐 프로토포르피린(protoporphyrin)으로 전환되는 것으로 알려져 있다.
5-아미노레불린산으로부터 생성되는 프로토포르피린은 여드름 치료제나 피부암의 광역동치료에 의용되는 성분으로 이용될 수 있어 5-아미노레불린산은 프로토포르피린의 생성을 위해 사용되고 있다. 그러나, 중간 생성물인 포르포빌리노겐은 불안정한 성질, 합성 및 정제의 어려움이 있어 고가의 화합물에 해당하고 포르포빌리노겐도 계속 전환이 진행되어 프로토포르피린으로 될 것으로 예상되므로 이에 대한 연구는 거의 없는 실정이다.
본 발명자들은 유산균의 새로운 용도 및 포르포빌리노겐을 포함한 피롤화합물의 새로운 용도를 연구하기 위해 새로운 유산균을 분리 및 동정하였다. 그리고, 5-아미노레불린산과 새로운 유산균을 함께 처리하던 중 새로운 유산균과 이의 대사물질이 놀랍게도 퇴행성 뇌질환, 당뇨 및 비만에 탁월한 효과가 있는 것을 확인하였고 본 발명에 이르게 되었다.
본 발명은 새로운 균주인 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)를 이용한 건강 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명은 새로운 균주인 락토바실러스 루테리 엘프를 이용한 질병 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 새로운 균주인 락토바실러스 루테리 엘프와 5-아미노레불린산(5-aminolevulinic acid)을 포함하는 건강 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명은 새로운 균주인 락토바실러스 루테리 엘프와 5-아미노레불린산을 포함하는 질병 치료용 조성물을 제공한다.
새로운 균주인 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료를 위한 건강 기능 식품 조성물을 제공한다.
새로운 균주인 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
새로운 균주인 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)를 포함하는 비만의 예방 또는 치료를 위한 건강 기능 식품 조성물을 제공한다.
새로운 균주인 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)를 포함하는 비만의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
새로운 균주인 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)를 포함하는 당뇨의 예방 또는 치료를 위한 건강 기능 식품 조성물을 제공한다.
새로운 균주인 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)를 포함하는 당뇨의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
새로운 균주인 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP) 및 5-아미노레불린산을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료를 위한 건강 기능 식품 조성물을 제공한다.
새로운 균주인 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP) 및 5-아미노레불린산을 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
새로운 균주인 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP) 및 5-아미노레불린산을 포함하는 비만의 예방 또는 치료를 위한 건강 기능 식품 조성물을 제공한다.
새로운 균주인 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP) 및 5-아미노레불린산을 포함하는 비만의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
새로운 균주인 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP) 및 5-아미노레불린산을 포함하는 당뇨의 예방 또는 치료를 위한 건강 기능 식품 조성물을 제공한다.
새로운 균주인 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP) 및 5-아미노레불린산을 포함하는 당뇨의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 새로운 균주인 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)를 포함하는 조성물은 섭취가 용이하고 부작용이 없다.
본 발명의 새로운 균주인 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)를 포함하는 조성물은 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료에 매우 효과적이다. 특히, 퇴행성 뇌질환 중 알츠하이머(alzheimer's disease)의 예방 및 치료에 매우 효과적일 수 있다.
본 발명의 새로운 균주인 락토바실러스 루테리 엘프를 포함하는 조성물은 당뇨의 예방 및 치료에 매우 효과적이다.
본 발명의 새로운 균주인 락토바실러스 루테리 엘프를 포함하는 조성물은 비만의 예방 및 치료에 매우 효과적이다.
본 발명의 새로운 균주인 락토바실러스 루테리 엘프는 공지의 락토바실러스 루테리보다 피롤계 화합물을 현저히 우수한 효율로 생산할 수 있다.
본 발명의 새로운 균주인 락토바실러스 루테리 엘프는 5-아미노레불린산으로부터 5-아미노레불린산의 대사물질인 포르포빌리노겐(porphobilinogen), 하이드록시메틸바이레인(hydroxymethylbilane), 포르피리노겐(porphyrinogen), 프리우로로포르피리노겐(preuroporphyrinogen), 우로포르피리노겐(uroporphyrinogen), 헵타-카복실레이트 포르피리노겐(hepta-carboxylate porphyrinogen), 헥사-카복실레이트 포르피리노겐(hexa-carboxylate porphyrinogen), 펜타-카복실레이트 포르피리노겐(penta-carboxylate porphyrinogen), 코프로포르피리노겐(coproporphyrinogen), 프로토포르피린(protoporphyrin), 프로토포르피리노겐(protoporphyrinogen), 헴(heme), 클로로필(chlorophyll) 및 이의 유도체 등 다양한 피롤계 화합물을 고효율로 생산할 수 있다. 특히, 5-아미노레불린산으로부터 포르포빌리노겐을 고효율로 생산할 수 있어 퇴행성 뇌질환, 당뇨 및 비만의 예방과 치료에 매우 효과적으로 이용할 수 있다.
도 1은 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)에 의한 체중변화를 보여준다.
도 2는 배경 공포 조건화(Contexture fear conditioning) 실험에서 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)에 의한 동결 시간(freezing time) 변화를 보여준다(WT-Cont; 일반 사료를 먹은 정상 마우스, WT-Elf; 락토바실러스 루테리 엘프를 먹은 정상 마우스, TG-Cont; 일반 사료를 먹은 알츠하이머 유발 마우스, TG-Elf; 락토바실러스 루테리 엘프를 먹은 알츠하이머 유발 마우스).
도 3은 정상 마우스(WT)와 알츠하이머 유발 마우스(TG)에서의 인산화된 타우 단백질(p-Tau), 타우 단백질(Tau), 베타-아밀로이드(Aβ), 후시냅스 밀도 단백질-95(postsynaptic density protein-95, PSD-95), 시냅토마이신(synaptophysin) 및 하우스 키핑 유전자인 GAPDH의 웨스턴 블랏(western blot) 결과를 보여준다.
도 4는 알츠하이머 유발 마우스에서 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)에 의한 베타-아밀로이드(Aβ)의 발현 변화를 보여준다.
도 5는 정상마우스와 알츠하이머 유발 마우스에서 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)에 의한 후시냅스 밀도 단백질-95(postsynaptic density protein-95, PSD-95)의 발현 변화를 보여준다.
도 6은 정상마우스와 알츠하이머 유발 마우스에서 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)에 의한 시냅토마이신(synaptophysin)의 발현 변화를 보여준다.
도 7은 정상마우스와 알츠하이머 유발 마우스에서 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)에 의한 인산화된 타우 단백질(p-Tau)의 발현 변화를 보여준다.
도 8은 정상마우스와 알츠하이머 유발 마우스에서 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)에 의한 타우 단백질(Tau)의 발현 변화를 보여준다.
도 9는 정상마우스와 알츠하이머 유발 마우스에서 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)에 의한 인산화된 타우 단백질(p-Tau) 및 타우 단백질(Tau)의 발현 변화비를 보여준다.
도 10은 정상마우스와 알츠하이머 유발 마우스에서 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)에 의한 신경교섬유질산성단백질(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)의 발현 변화를 보여준다.
도 11은 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)를 섭취한 정상마우스와 알츠하이머 유발 마우스 해마(Hippocampus)의 DG(Dentate gyrus)에서 신경교섬유질산성단백질(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)의 염색 상태를 보여준다(scale bar = 100 ㎛).
도 12는 알츠하이머 유발 마우스에서 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)에 의한 베타-아밀로이드(Aβ) 플라크의 변화를 보여준다.
도 13은 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)를 섭취한 알츠하이머 유발 마우스 해마(Hippocampus)의 DG(Dentate gyrus)에서 베타-아밀로이드(Aβ) 염색 상태를 보여준다(scale bar = 100 ㎛).
도 14는 실시예 10에 따른 CD3 T 세포의 빈도수 변화를 나타낸다.
도 15는 실시에 10에 따른 Th 림프구의 빈도수 변화를 나타낸다.
도 16은 실시예 10에 따른 CD4+ CD25+ 세포의 빈도수 변화를 나타낸다.
도 17은 실시예 10에 따른 Gr-1/CD11b 세포의 빈도수 변화를 나타낸다.
도 18은 실시예 10에 따른 NK세포 활성지표인 NKG2D의 빈도수 변화를 나타낸다.
도 19는 실시예 10에 따른 비장세포에서 IL-2 생산량 변화를 나타낸다.
도 20은 실시예 10에 따른 비장세포에서 IL-4 생산량 변화를 나타낸다.
도 21은 실시예 10에 따른 비장세포에서 IFN-γ 생산량 변화를 나타낸다.
도 22는 실시예 11에 따른 대식세포에서 산화질소의 생산량 변화를 나타낸다.
도 23은 실시예 11에 따른 총 림프구 세포의 변화를 나타낸다.
도 24는 실시예 12에 따른 간에서 시토크롬산화효소(COX)의 활성 변화를 나타낸다.
도 25는 실시예 13에 따른 뇌에서 시토크롬산화효소(COX)의 활성 변화를 나타낸다.
도 26은 실시예 14에 따른 마우스의 체중 변화를 나타낸다.
도 27은 실시예 15에 따른 글루코스 경구부하시험의 결과를 나타낸다.
도 28은 실시예 16에 따른 AMPK-α1 유전자의 발현 양상을 나타낸다.
도 29는 실시예 17에 따른 UCP-2 유전자의 발현 양상을 나타낸다.
도 30은 실시예 18에 따른 아디포넥틴 유전자의 발현 양상을 나타낸다.
도 31은 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)의 16S rRNA 유전자 염기 서열이다.
도 32는 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)의 계통수(Phylogenetic Tree)를 나타낸다.
도 2는 배경 공포 조건화(Contexture fear conditioning) 실험에서 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)에 의한 동결 시간(freezing time) 변화를 보여준다(WT-Cont; 일반 사료를 먹은 정상 마우스, WT-Elf; 락토바실러스 루테리 엘프를 먹은 정상 마우스, TG-Cont; 일반 사료를 먹은 알츠하이머 유발 마우스, TG-Elf; 락토바실러스 루테리 엘프를 먹은 알츠하이머 유발 마우스).
도 3은 정상 마우스(WT)와 알츠하이머 유발 마우스(TG)에서의 인산화된 타우 단백질(p-Tau), 타우 단백질(Tau), 베타-아밀로이드(Aβ), 후시냅스 밀도 단백질-95(postsynaptic density protein-95, PSD-95), 시냅토마이신(synaptophysin) 및 하우스 키핑 유전자인 GAPDH의 웨스턴 블랏(western blot) 결과를 보여준다.
도 4는 알츠하이머 유발 마우스에서 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)에 의한 베타-아밀로이드(Aβ)의 발현 변화를 보여준다.
도 5는 정상마우스와 알츠하이머 유발 마우스에서 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)에 의한 후시냅스 밀도 단백질-95(postsynaptic density protein-95, PSD-95)의 발현 변화를 보여준다.
도 6은 정상마우스와 알츠하이머 유발 마우스에서 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)에 의한 시냅토마이신(synaptophysin)의 발현 변화를 보여준다.
도 7은 정상마우스와 알츠하이머 유발 마우스에서 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)에 의한 인산화된 타우 단백질(p-Tau)의 발현 변화를 보여준다.
도 8은 정상마우스와 알츠하이머 유발 마우스에서 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)에 의한 타우 단백질(Tau)의 발현 변화를 보여준다.
도 9는 정상마우스와 알츠하이머 유발 마우스에서 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)에 의한 인산화된 타우 단백질(p-Tau) 및 타우 단백질(Tau)의 발현 변화비를 보여준다.
도 10은 정상마우스와 알츠하이머 유발 마우스에서 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)에 의한 신경교섬유질산성단백질(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)의 발현 변화를 보여준다.
도 11은 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)를 섭취한 정상마우스와 알츠하이머 유발 마우스 해마(Hippocampus)의 DG(Dentate gyrus)에서 신경교섬유질산성단백질(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)의 염색 상태를 보여준다(scale bar = 100 ㎛).
도 12는 알츠하이머 유발 마우스에서 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)에 의한 베타-아밀로이드(Aβ) 플라크의 변화를 보여준다.
도 13은 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)를 섭취한 알츠하이머 유발 마우스 해마(Hippocampus)의 DG(Dentate gyrus)에서 베타-아밀로이드(Aβ) 염색 상태를 보여준다(scale bar = 100 ㎛).
도 14는 실시예 10에 따른 CD3 T 세포의 빈도수 변화를 나타낸다.
도 15는 실시에 10에 따른 Th 림프구의 빈도수 변화를 나타낸다.
도 16은 실시예 10에 따른 CD4+ CD25+ 세포의 빈도수 변화를 나타낸다.
도 17은 실시예 10에 따른 Gr-1/CD11b 세포의 빈도수 변화를 나타낸다.
도 18은 실시예 10에 따른 NK세포 활성지표인 NKG2D의 빈도수 변화를 나타낸다.
도 19는 실시예 10에 따른 비장세포에서 IL-2 생산량 변화를 나타낸다.
도 20은 실시예 10에 따른 비장세포에서 IL-4 생산량 변화를 나타낸다.
도 21은 실시예 10에 따른 비장세포에서 IFN-γ 생산량 변화를 나타낸다.
도 22는 실시예 11에 따른 대식세포에서 산화질소의 생산량 변화를 나타낸다.
도 23은 실시예 11에 따른 총 림프구 세포의 변화를 나타낸다.
도 24는 실시예 12에 따른 간에서 시토크롬산화효소(COX)의 활성 변화를 나타낸다.
도 25는 실시예 13에 따른 뇌에서 시토크롬산화효소(COX)의 활성 변화를 나타낸다.
도 26은 실시예 14에 따른 마우스의 체중 변화를 나타낸다.
도 27은 실시예 15에 따른 글루코스 경구부하시험의 결과를 나타낸다.
도 28은 실시예 16에 따른 AMPK-α1 유전자의 발현 양상을 나타낸다.
도 29는 실시예 17에 따른 UCP-2 유전자의 발현 양상을 나타낸다.
도 30은 실시예 18에 따른 아디포넥틴 유전자의 발현 양상을 나타낸다.
도 31은 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)의 16S rRNA 유전자 염기 서열이다.
도 32는 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)의 계통수(Phylogenetic Tree)를 나타낸다.
이하에서 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다. 본 발명에 대한 설명 및 도면에서는 발명의 요지를 흐릴 수 있는 공지의 내용은 기재를 생략할 수 있고, 본 발명을 이해를 돕기 위해 도면 구성의 일부는 과장 또는 생략될 수 있으며, 본 명세서 따로 정의하지 않는 용어에 대하여는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해할 수 있는 의미로 해석되어야 할 것이다.
본 발명은 새로운 균주인 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP) 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 새로운 균주인 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP) 및 5-아미노레불린산을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 발명자들은 여성의 모유로부터 유산균 선별 배지를 이용하여 유산균만을 분리한 후, 내산성, 내담즙성, 항생제 내성이 우수한 균주를 선별한 뒤, 선별된 균주를 16S rRNA 염기서열에 기초한 분자 계통 분류학 분석을 수행하여 락토바실러스 루테리 균주를 분리 및 동정하였다. 그리고, 분리 및 동정한 유산균을 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)로 명명하고, 2016년 11월 22일에 한국생명공학연구원미생물자원센터에 기탁하여 KCTC13154BP를 부여받았다.
본 발명은 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)을 포함하는 질병 예방 또는 치료를 위한 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP)을 포함하는 질병 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP) 및 5-아미노레불린산(5-aminolevulinic acid, 이하 '5-ALA'은 같은 의미로 사용될 수 있다)을 포함하는 질병 예방 또는 치료를 위한 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP) 및 5-아미노레불린산(5-aminolevulinic acid, 이하 '5-ALA'은 같은 의미로 사용될 수 있다)을 포함하는 질병 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "치료"는 본 발명의 조성물을 사용하여 질병의 증세를 호전시키거나 경감시키는 등, 질병을 가지는 대상을 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 "예방"은 본 발명의 조성물을 사용하여 질병의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 질병은 퇴행성 뇌질환, 비만 및 당뇨에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명에서 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머(alzheimer's disease), 치매(deimentia), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴 무도병(Huntington’s chorea), 크로이츠펠드야콥 병(Creutzf- eldtjakob disease), 뇌에서 발생하는 인슐린 저항성에 의해 알츠하이머가 유발되는 제3형 당뇨병(type 3-diabete) 및 핑크 병(Pick's disease)으로부터 선택되는 하나 이상이다.
락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호 KCTC13154BP)는 여성의 모유에서 분리 및 동정한 균주로서 생체에 무해한 균주이다. 생체안전성이 좋고, 세포독성이 없으며 균주 섭취에 의한 부작용의 위험도 없다.
본 발명의 조성물은 락토바실러스 루테리 엘프 균주 그 자체를 포함하는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 락토바실러스 루테리 엘프의 사균, 락토바실러스 루테리 엘프의 건조균, 락토바실러스 루테리 엘프의 배양액(broth), 락토바실러스 루테리 엘프의 파쇄액, 락토바실러스 루테리 엘프의 추출물, 락토바실러스 루테리 엘프의농축물, 락토바실러스 루테리 엘프의 배양 배지, 락토바실러스 루테리 엘프가 포함된 배양 현탁액, 락토바실러스 루테리 엘프 배양액의 여과액 및 락토바실러스 루테리 엘프 배양액의 원심분리 후 균주를 제거한 여액에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 조성물은 특히 알츠하이머를 포함한 퇴행성 뇌질환의 치료 및 예방에 효과적이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 락토바실러스 루테리 엘프를 포함한 조성물은 베타아밀로이드(beta amyloid, Aβ) 및 후시냅스 밀도 단백질(postsynaptic density protein, PSD)을 감소시킬 수 있어 알츠하이머 치료 및 예방에 효과적일 수 있다. 그리고, 락토바실러스 루테리 엘프를 포함한 조성물은 베타아밀로드의 플라크 형성도 현저히 억제시킬 수 있다. 또한, 락토바실러스 루테리 엘프를 포함한 조성물은 타우 단백질의 인산화나 인산화된 타우 단백질의 감소에 직접적인 영향은 주지 않으나, 타우 단백질을 감소시킬 수 있어 알츠하이머의 치료 및 예방에 효과적일 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물은 알츠하이머의 주요 발병 요인인 베타아밀로이드 및 타우 단백질을 모두 감소시킬 수 있어 알츠하이머의 치료 및 예방에 매우 효과적일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 락토바실러스 루테리 엘프를 포함한 조성물은 알츠하이머 환자에서 발현이 증가하는 신경교섬유질산성단백질(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)의 발현 증가를 억제 시킬 수 있다. 이러한 효과 역시 본 발명의 락토바실러스 루테리 엘프를 포함한 조성물이 알츠하이머의 치료 및 예방에 효과적인 것을 보여준다.
본 발명의 새로운 균주인 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호 KCTC13154BP)는 그 자체로 피롤계 화합물의 생산성이 현저히 높다. 그리고, 5-아미노레불린산과 같이 피롤계 화합물을 생산할 수 있는 전구체 화합물을 대사하여 특정 피롤계 화합물을 고효율로 생산할 수 있다. 특히, 피롤계 화합물에서 포스포빌리노겐(phosphbilinogen, 이하 'PBG'는 같은 의미로 사용될 수 있다)의 함량을 현저히 향상시킬 수 있다. 포스포빌리노겐은 유산균의 기능적인 측면을 상승시킬 수 있어, 락토바실러스 루테리 엘프를 포함하는 조성물은 다른 유산균을 포함한 조성물보다 더 효과적으로 질병을 치료 및 예방 할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 락토바실러스 루테리 엘프는 공지의 락토바실러스 루테리보다 피롤계 화합물을 최소 6배 이상 더 생산할 수 있다.
본 발명에서 5-아미노레불린산은 5-아미노레불린산생성효소에 의해 글리신(glycine)과 석시닐(succinyl)-CoA로부터 생합성 된다고 알려져 있고, 화학식 C5H9NO3로 표현될 수 있으며 5-아미노레불린산 유도체도 사용될 수 있다. 5-아미노레불린산은 포르포빌리노겐합성효소에 의해 포르포빌리노겐(porphobilinogen)으로 전환되고 이로부터 다양한 물질로 전환될 수 있다. 예를 들어, 포르포빌리노겐에서 우로포르피리노겐(uroporphyrinogen) 중간체를 거쳐 프로토포피린IX(protoporphyrin IX)로 전환되고 나아가 헴(heme) 또는 엽록소(chlorophyll)로 전환될 수 있다.
본 발명은 5-아미노레불린산 및 이로부터 전환되는 다양한 생합성 화합물들을 신규 유산균인 락토바실러스 루테리 엘프의 대사를 통해 고효율로 수득할 수 있다. 그리고, 락토바실러스 루테리 엘프 및 이의 대사산물은 독성이나 부작용이 없어 락토바실러스 루테리 엘프나 특정 대사산물을 따로 분리할 필요가 없다. 즉, 락토바실러스 루테리 엘프 및 이의 대사산물을 그대로 포함하는 조성물을 섭취하여 다른 부작용 없이 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료 효과를 얻을 수 있다. 또한, 락토바실러스 루테리 엘프 및 이의 대사산물을 그대로 포함하는 조성물을 섭취하여 다른 부작용 없이 항비만 및 항당뇨 효과를 얻을 수 있다.
본 발명에서 신규 유산균인 락토바실러스 루테리 엘프는 5-아미노레불린산을 대사하여 5-아미노레불린산으로부터 전환될 수 있는 다양한 화합물을 대사산물로 생성할 수 있다. 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산으로부터 생성되는 대사산물을 포함하는 조성물은 퇴행성 뇌질환 치료, 항비만, 항당뇨 및 면역 증진에 특히 효과적인 것으로 나타났다.
본 발명의 조성물은 뇌 미토콘드리아의 COX(Cytochrome c oxidase) 활성을 증가시키기 때문에 알츠하이머를 포함한 퇴행성 뇌질환의 치료에 매우 효과적일 수 있다.
일반적으로 뇌에는 혈관뇌장벽(blood-brain barrier, BBB)이 존재하기 때문에 의약 조성물이 뇌에 도달하지 못하여 뇌에 작용할 수 없는 것이 대부분이다. 그러나, 본 발명의 일 실시예에 따르면 본 발명의 조성물 투여시 뇌 세포의 미토콘드리아에서 COX의 활성이 급격이 증가할 수 있어 본 발명의 조성물은 뇌에 직접적으로 작용할 수 있다. COX의 활성 정도는 퇴행성 뇌질환 중 특히 알츠하이머와 직접적으로 연관이 있는데, 알츠하이머 환자의 경우 일반인보다 COX의 활성 정도가 낮다. 특히, 해마에서 COX의 활성 정도가 30% 이상 감소하여 이로 인한 자유라디칼 증가로 뇌에 직접적인 이상을 일으켜 알츠하이머를 유발할 수 있다. 이외에도 알츠하이머 환자의 혈소판에서 COX 감소 및 활성산소의 증가가 일어난다. 그리고, 염증 작용시 발생하는 COX를 억제함으로서 인지기능 향상에 도움을 준다는 사실은 이미 널리 알려져 있다. 또한, COX 억제제들을 정신이상에 효과가 있는 것도 이미 확인되어 있다.
즉, 본 발명의 조성물은 뇌 미토콘드리아의 COX 활성을 직접 증가시킬 수 있어 알츠하이머를 포함한 퇴행성 뇌질환 치료 및 예방에 매우 효과적일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 락토바실러스 루테리 엘프를 포함한 조성물은 장기 기억을 증가시킬 수 있어 알츠하이머를 포함한 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료에 효과적일 수 있다. 또한, 기억력 결핍, 실어증, 실인증, 기억 장애 등과 같이 인지 장애(congnitive impairment)의 치료에도 효과적일 수 있다. 인지 장애는 알츠하이머, 알츠하이머성 치매, 노인성 치매 및 파킨슨 병과 같은 퇴행성 뇌질환에 의한 인지 결핍, 노화에 의한 인지 결핍, 외상 또는 정신적 충격에 의한 인지 결핍, 자폐나 주의력 결핍 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
그리고, 과체중이나 비만이 신경섬유농축제의 수준을 상승시키거나 뇌 플라크 형성 단백질을 형성하기 때문에 알츠하이머의 중요한 원인에 해당할 수 있어 항비만 효과를 가지는 조성물은 알츠하이머 치료 또는 예방에 보다 효과적일 수 있다.
또한, 비만과 당뇨는 함께 동반되기 쉬운데, 당뇨 중 뇌의 인슐린 저항성에 의해 발생하는 제3형 당뇨병(Type 3 Diabetes)은 알츠하이머의 발병과 매우 높은 연관성을 가진다. 즉, 알츠하이머의 주요 병인인 미토콘드리아 기능 장애, 산화 스트레스, DNA 손상, 베타 아밀로이드 침작외에도 역학적으로 뇌의 인슐린 결핍과 인슐린 저항성도 알츠하이머와 같은 퇴행성 뇌질환을 유발 할 수 있다. 따라서, 뇌의 인슐린 저항성에 의한 제3형 당뇨의 치료는 알츠하이머를 포함한 퇴행성 뇌질환을 치료 및 예방할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물은 체중 및 혈액의 글루코스 농도를 감소시킬 수 있고, 비만 및 당뇨와 연관성이 높은 AMPK-α1, UCP-2 및 아디포넥틴 유전자 발현을 현저히 증가시킬 수 있다. 이러한 효과는 본 발명의 조성물이 항비만 및 항당뇨에 효과적일뿐만 아니라, 알츠하이머를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 치료 및 예방에도 효과적인 것을 의미한다. 본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물은 뇌 미토콘드리아의 COX 활성 효소를 현저히 증가시킬 수 있어, 제3형 당뇨병 및 이로부터 유발되는 알츠하이머를 포함한 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료에 매우 효과적일 수 있다.
또한, 알츠하이머의 주요 원인인 베타 아밀로이드 응집체의 지속적인 형성 및 침착은 면역 계통의 만성적 활성화 및 소염 제거 기능의 장애를 일으킨다. 그리고, T 세포, B세포, NK세포 세 가지의 주요 면역 세포를 결여시키는 경우 베타 아밀로이드의 축적이 현저히 증가하는 등 면역 향상은 알츠하이머의 치료 또는 예방과 직접적인 관련이 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물은 T 림프구, B 림프구 및NK 세포의 증식과 활성을 증가시킬 수 있다. 그리고, T 림프구, B 림프구 및 NK 세포에 의한 다양한 사이토카인 생성이 증가할 수 있다. 또한, 대식세포의 활성도 증가시킬 수 있다. 구체적인 예를 들면, CD3 T 세포, Th 림프구, CD4+ CD25+ 세포, Gr-1/CD11b 세포, NK세포 및 대식세포의 증식과 활성을 향상시킬 수 있다. 그리고, 복강에서의 림프구 세포를 증가시킬 수 있다. 또한, 면역연관 세포에 의한 NKG2D, IL-2, IL-4 및 IFN-γ의 생산량을 증가시킬 수 있다. 이러한 효과는 본 발명의 조성물이 면역 향상뿐만 아니라 알츠하이머를 포함한 퇴행성 뇌질환의 치료 및 예방에도 효과적인 것을 의미한다. 이러한 뇌 미토콘드리아의 COX 활성 증가, 항당뇨, 항비만 및 면역 증진 효과와 알츠하이머 치료 및 예방과의 관계를 고려할 때, 본 발명의 조성물은 알츠하이머 치료에 매우 효과적일 수 있다.
본 발명에 따르면, 새로운 락토바실러스 균주인 락토바실러스 루테리 엘프는 다른 락토바실러스 루테리 종(species)들에 비해 피롤 화합물의 함량이 보다 높다. 그리고, 5-아미노레불린산으로부터 포스포빌리노겐을 포함한 피롤 화합물을 생산하는 특성이 다른 락토바실러스 루테리 종들보다 현저히 우수하다.
본 발명에서 유산균 대사에 의해 5-아미노레불린산으로부터 생성되는 대사물질에는 5-아미노레불린산, 포르포빌리노겐(porphobilinogen), 하이드록시메틸바이레인(hydroxymethylbilane), 포르피리노겐(porphyrinogen) 유도체 및 포르피린(porphyrin) 유도체가 포함된다. 예를 들어, 대사물질에는 5-아미노레불린산, 포르포빌리노겐(porphobilinogen), 하이드록시메틸바이레인(hydroxymethylbilane), 포르피리노겐(porphyrinogen), 프리우로로포르피리노겐(preuroporphyrinogen), 우로포르피리노겐(uroporphyrinogen), 헵타-카복실레이트 포르피리노겐(hepta-carboxylate porphyrinogen), 헥사-카복실레이트 포르피리노겐(hexa-carboxylate porphyrinogen), 펜타-카복실레이트 포르피리노겐(penta-carboxylate porphyrinogen), 코프로포르피리노겐(coproporphyrinogen), 프로토포르피린(protoporphyrin), 프로토포르피리노겐(protoporphyrinogen), 헴(heme) 및 클로로필(chlorophyll) 중에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 그리고, 우로포르피리노겐 및 코프로포르피리노겐 형태에 따라 I 내지 IV를 포함하고, 프로토포르피린은 자연계에 주로 존재하는 프로토포르피린 IX를 포함한다. 또한, 대사물질 각각의 유도체 또는 이의 염을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 락토바실러스 루테리 엘프 및 락토바실러스 루테리 엘프 대사에 의해 생성된 5-아미노레불린산의 대사물질을 모두 포함한 경우가 5-아미노레불린산을 첨가하지 않고 락토바실러스 루테리 엘프만을 동일 조건에서 대사 시킨 경우, 5-아미노레불린산만을 첨가한 경우, 경우보다 퇴행성 뇌질환 치료, 면역증진, 항비만 및 항당뇨와 관련된 효과가 우수할 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 루테리 엘프 및 락토바실러스 루테리 엘프 대사에 의해 5-아미노레불린산으로부터 생성된 대사물질을 포함하는 조성물에서 대사물질에 포함된 각각의 성분이 퇴행성 뇌질환 치료, 면역증진, 항비만 및 항당뇨 효과에 구체적으로 작용하는 기전은 명확하지 않다. 그러나, 락토바실러스 루테리 엘프에 의해 5-아미노레불린산으로부터 생성된 대사물질 일부 또는 전체가 락토바실러스 루테리 엘프와 함께 작용하여 상승효과를 일으키는 것으로 보인다. 예를 들어, 대사물질 중 하나로서 불안정한 것으로 알려져 있는 포르포빌리노겐은 락토바실러스 루테리 엘프에 의해 안정적이고 고효율로 생성될 수 있어, 이러한 특징이 본 발명 조성물에 의한 효과에 중요한 영향을 미치는 것 중 하나로 보인다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 고체/액체 등 형태를 자유롭게 할 수 있다. 그 형태로는 음료, 환제, 정제, 분말, 캡슐화 등의 형태로 이용하는 것이 바람직하다. 그리고, 건강기능식품에 다양한 형태의 식품 첨가물을 함께 포함하여 제조할 수 있다. 기능성 식품의 구체적인 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 유산균 자체 배양 또는 유산균에 5-아미노레불린산을 첨가한 후 통상의 유산균 배양 방식에 따라 제조할 수 있다. 사용하는 유산균의 종류에 따라 바람직한 배양을 위해 배양 조건이 조절될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법으로 예를 들면, 비활성 기체로 버블링(bubbling)하여 용존산소를 제거한 증류수를 준비하고 준비된 증류수에 5-아미노레불린산을 첨가한 후 pH를 8.5 내지 9.5로 조절하여 유산균을 첨가하며 이 후 25 내지 40에서 10 내지 24시간 동안 교반하고 교반 후 원심분리하여 유산균 및 유산균 대사에 의해 생성된 대사물질을 수득하는 제조방법이 될 수 있다. 여기에 추가적으로, 유산균 및 유산균 대사에 의해 생성된 대사물질을 수득한 후 동결 건조 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 유산균 및 유산균 대사에 의해 생성된 대사물질을 수득하는 것은 교반 후 원심분리하여 침전된 유산균 및 이의 대사물질을 수득하며, 따로 유산균을 제거하거나 대사물질만을 분리 또는 정제하지 않고 그대로 이용할 수 있다.
유산균 및 이의 대사물질을 수득하여 일정량의 수분을 제거하여 조성물을 제조할 수 있으나, 동결 건조 과정을 거쳐 보다 효과가 좋고 가공에 용이한 조성물을 제조할 수 있고 다양한 형태의 제제로 이용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 유효성분으로 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 포함될 수 있는 담체는 제재 시 통상적으로 이용되는 전분, 아카시아 러버, 물, 시럽, 셀룰로오스, 젤라틴, 미네랄, 오일, 활석, 다당류 등이나 이에 제한되는 것은 아니다. 담체 외에도 감미제, 향미제, 보존제, 습윤제 등이 추가로 포함될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 통상의 기술자가 약학적으로 허용되는 담체나 부형제 또는 이들을 혼합하여 제형화 시킬 수 있다. 제형의 형태는 제한되지 않으며 예를 들어, 용액, 유화형태, 분말, 과립, 정제, 캡슐이 있고, 여기에 안정화제나 분산제를 추가로 더 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 즉시 섭취 가능하여 건강 기능성 식품으로도 제조되거나 식품에 포함될 수 있다.
이하에서 본 발명을 실시하기 위한 실시예에 대하여 상세히 설명하며, 하기의 실시예는 본 발명을 실시하기 위한 바람직한 예시에 해당하는 것으로 본 발명이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
락토바실러스
루테리
엘프
(
Lactobacillus
reuteri
ELF)의 분리 및 동정
건강한 여성의 모유로부터 분리된 통성혐기성 균주를 1.5% 한천(agar)이 포함된 MRS 배지에 도말하여 37℃ 에서 24시간 배양한 후 순수 분리된 것을 확인하였다. 유산균 동정 및 분류를 위해 16S rRNA 유전자 염기 서열(서열번호 1)을 분석하였다. 루테리 표준 균주와 99% 이상의 rRNA 상동성을 나타내어 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)로 동정하였다. 동일한 16S rRNA 염기 서열을 가지는 락토바실러스 루테리 균주는 검색되지 않았다.
분리한 락토바실러스 루테리 엘프 균주의 16S rRNA 서열을 미국 국립 생물공학정보센터(NCBI, National Center for Biotechnology Information)에서 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 표준 균주의 유전정보 데이터 베이스와 염기서열의 상동성을 분석하였다. 분석법은 Jukes-Cantor model을 적용한 Neighbour-joining method에 준하여 Phylogenetic Tree를 작성하였다(도 32).
분리한 락토바실러스 루테리 엘프 균주를 락토바실러스 루테리 ATCC23272와 균학적 특성을 비교하여 [표 1]에 나타내었다. 락토바실러스 루테리 엘프는 동일종인 다른 락토바실러스 루테리 엘프에 비해 포스포빌리노겐을 포함한 피롤화합물을 더 많이 생산할 수 있었다.
| 균학적 특징 | 락토바실러스 루테리 엘프 | 락토바실러스 루테리 ATCC23272 |
| 피롤화합물 생산 | ≥1.7 | 1.0 |
| 루테린(Reuterin) 생산 | ≤0.8 | 1.0 |
| 운동성 | 없음 | 없음 |
| 모양 | 간균 | 간균 |
| 그람 염색 | 양성 | 양성 |
| 카탈라제 생산 | 음성 | 음성 |
| 옥시다제 생산 | 음성 | 음성 |
| D-글루코스 대사 | 가능 | 가능 |
| D-만노스 대사 | 가능 | 가능 |
| D-프럭토스 대사 | 가능 | 가능 |
| 락토오스 대사 | 가능 | 가능 |
| 이노시톨 대사 | 가능 | 가능 |
| 슈크로스 대사 | 가능 | 가능 |
| * 포스포빌리노겐 및 루테린의 생산량은 락토바실러스 루테리 엘프와 락토바실러스 루테리 ATCC23272를 동일한 배지에서 24시간 배양 한 후 측정. 생산량 비교는 락토바실러스 루테리 ATCC23272의 생산량을 1.0으로 하여 상대적으로 비교. | ||
발명자들은 상기 균주를 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)로 명명하였고, 이를 2016년 11월 22일 한국 생명 공학 연구원 미생물 자원 센터에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 13154BP).
락토바실러스
루테리
엘프의
배양 및 피롤 화합물의 분리
MRS 배지를 기본으로 하는 아래 [표 2]와 같이 구성된 배지를 준비하였다.
| 성분 | 함량(g) |
| Soy Peptone PR | 10 |
| Beef extract | 10 |
| Yeast extract | 5 |
| Lactose | 20 |
| Tween 80 | 1 |
| Citric acid | 2 |
| Sodium acetate | 5 |
| Magnessium sulfate | 0.1 |
| Manganese sulfate food additive | 0.05 |
| Dipottassium phosphate | 2 |
| Glutamic acid | 1 |
| 10% L-Carnithine base | 5 |
| Water | 1L |
배지를 멸균한 다음, Lactobacillus reuteri ELF(1.5*108 CFU/ml)을 1%(V/V) 접종한 뒤, 15~20 시간 배양하였다. pH는 6.5로 맞추고, 온도는 38℃를 유지하였다. 배양이 끝나면 배양액 20㎕를 꺼내어 2ml의 에를리히 시약(Ehrlich reagent)에 첨가하여 550nm 파장의 강한 붉은색 흡광을 UV로 확인하였다(흡광도(Absorbance) λ550 = 0.22). 원심분리를 통해 균을 분리하고, 여액을 다음의 방법에 따라 정제하여 피롤 화합물을 얻었다. 음이온교환수지 (Trilite, SAR20MB 삼양사) 200㎖를 컬럼에 준비하고, 25% 아세트산 나트륨(sodium acetate) 수용액을 충분히 흘려내려 음이온을 아세트산으로 포화시켰다. 이때, 용출액에 질산은 수용액을 떨어뜨렸을 때, 흰색 침전이 나오지 않을 때까지 계속하였다. 증류수로 컬럼을 세척하고 용출액의 pH가 7.5 이하가 되도록 하였다. 그리고, 준비된 여액을 컬럼에 가하였다. 이 후, 충분한 양의 증류수로 세척하고 이어서 1N 아세트산으로 다시 용출 시켰다. 용출되어 나온 1N 아세트산 용액을 동결 건조하여 정제된 370mg의 피롤 화합물을 얻었다.
락토바실러스
루테리
엘프외
공지의
락토바실러스
루테리의
배양 및
피롤화
합물의 분리
실시예 2와 동일한 방법에 따라 공지의 락토바실러스 루테리에서 피롤화합물을 분리하였다. 락토바실러스 루테리 균주는 공지의 균주인 ATCC23272를 분양 받아 사용하였다.
실시예 2와 같이 에를리히 시약 테스트를 했을 때, 흡광도는 λ550 = 0.06 으로 락토바실러스 루테리 엘프가 약 3배 이상의 피롤을 생산한다는 것을 알 수 있었다.
그러나 실제로 음이온 교환수지 정제를 통해 최종적으로 얻은 산물은 50mg에 불과하여 락토바실러스 루테리 엘프를 사용하여 얻은 피롤 화합물 양의 1/7에도 미치지 못하였다.
락토바실러스
루테리
엘프의
체중감소 효과 확인
비만대조군(high-fat diet, HFD)은 8 주령의 수컷 C57BL/6J 생쥐(대한바이오링크)를 항온(25±2℃), 항습(50±5%) 및 12시간 간격의 광주기(light on 07:00 ~ 19:00)로 조절되는 SPF환경에서 2 주간 기본사료(AIN-76A diet)와 물을 자유롭게 공급하면서 적응시킨 후, 체중이 약 24g 이상 되는 10 주령부터 고지방식이(#D12492 60 kcal fat, Research Diets Inc, USA)를 투여하여 생쥐 비만 병태모델을 제작하였다.
12kg의 마우스용 고지방식 사료(60% 지방 함량)(두열바이오, 한국)에 실시예 2에서 배양 후 원심분리로 분리한 락토바실러스 루테리 엘프 12g과 대사산물 피롤 300mg을 잘 혼합하였다. 마우스를 두 군으로 나눠 한쪽은 락토바실러스 루테리 엘프 및 그 대사 산물을 섞은 고지방식사료를, 다른 한쪽은 보통의 고지방식 사료를 먹이며 지속적인 체중의 변화를 관찰하였다. 양성 대조군으로는 245mg/kg의 가르시니아 캄보지아(Garsinia cambogia) 추출물을 사용하였다. 락토바실러스 루테리 엘프를 섞어 먹인 쥐에서는 양성 대조군인 가르시니아 캄보지아(Garcinia cambosia) 추출물과 유사한 효과가 나타났다(도 1).
배경 공포 조건화(
Contexture
fear conditioning) 실험
16주령 알츠하이머 유발 마우스 5XFAD(Tg6799: B6SJL genetic background) 마우스 10 마리를 제1그룹, 대조군으로 정상 마우스 10마리를 제2그룹으로 나누어 준비하였다. 제1 및 제2 그룹 각각에서 마우스 5마리에는 실시예 2에서 배양 후 원심분리한 락토바실러스 루테리 엘프를 일반 사료와 섞어 먹이고, 제1 및 제2그룹의 나머지 마우스 5마리는 락토바실러스 루테리 엘프를 섞지 않은 일반 사료를 섞어 먹였다. 모든 마우스는 5~7일 정도 사료를 자유롭게 먹고 활동할 수 있도록 한 후 실험을 진행하였다. 일반 사료(두열바이오, 서울) 12kg에 락토바실러스 루테리 엘프 12g을 균일하게 혼합하였고, 펠렛 형태로 만들어 마우스에게 먹이로 주었다. 모든 마우스가 섭취한 사료의 양은 동일하게 하였다.
배경 공포 조건화 실험은 다음과 같이 공지의 실험 조건을 적절히 변형하여 진행하였다. 4개의 표준 컨디셔닝 챔버를 사용하여 수행하였다. 각 챔버는 방음이 되는 격리 칸막이로 이루어졌고, 솔리드-스테이트 쇼크 스크램블러(solid-stat shock scrambler)가 연결된 스테인리스강 그리드 바닥을 구비하였다. 각 스크램플러는 FreezFrame 소프트웨어(Coulbourn Instruments, Allentown, PA)를 실행하는 윈도우 컴퓨터에 연결된 인터페이스를 통해 제어되는 전자 정전류 쇼크 소스에 연결되었다. 각 챔버의 천장에는 디지털 카메라를 설치하고 마우스의 행동을 분석하였다. 마우스 트레이닝(training)은 챔버 맥락(chamber context)에 대한 적응을 위해 마우스를 3분 동안 자유롭게 탐색하도록 두고, 컨디셔닝 챔버에 풋쇼크(footshock)(1.0Ma, 2초)를 1분 간격으로 3 내지 5회 가하였다. 마지막 풋쇼크를 가한 후 마우스를 30초 동안 챔버에 두었다. 해마 의존성 배경 공포 기억 형성(Hippocampus-dependent contextual fear memory formation) 및 리모트 메모리(remote memory) 안정화는 트레이닝 1일 및 30일 후에 각각 동일한 동일한 컨디셔닝 챔버에 마우스를 다시 넣었을 때 3분 동안 호흡과 운동이 없는 동결행동(freezing behavior)을 통해 평가하였다. 자동된 FreezeFrame 시스템은 비디오 신호를 4Hz로 디지털화하고 프레임 단위로 움직임을 비교하여 동결량을 기록하여, 동결 반응 시간(freezing time, %)로 환산하였다.
실험 결과, 알츠하이머가 유발된 유전자 변형 쥐는 동결 반응 시간이 매우 낮았으나, 락토바실러스 루테리 엘프를 혼합한 사료를 먹은 유전자 변형 쥐의 동결 반응이 정상 수준으로 회복하였다(도 2).
유전자변형
알츠하이머 마우스를 이용한
락토바실러스
루테리
엘프의
효과 확인
16주령 알츠하이머 유발 마우스 5XFAD(Tg6799: B6SJL genetic background) 마우스 10 마리를 제1그룹, 대조군으로 정상 마우스 10마리를 제2그룹으로 나누어 준비하였다. 제1 및 제2 그룹 각각에서 마우스 5마리에는 실시예 2에서 배양 후 원심분리한 락토바실러스 루테리 엘프 사료와 섞어 먹이고, 제1 및 제2그룹의 나머지 마우스 5마리는 락토바실러스 루테리 엘프를 섞지 않은 일반 사료를 섞어 먹였다. 일반 사료(두열바이오, 서울) 12kg에 락토바실러스 루테리 엘프 12g을 균일하게 혼합하였고, 펠렛 형태로 만들어 마우스에게 먹이로 주었다. 모든 마우스가 섭취한 사료의 양은 동일하게 하였다.
각 그룹의 마우스들을 한 달간 정도 사료를 먹여 키운 후 희생시키고, 측두엽 피질, 중뇌, 대뇌, 소뇌, 해마를 포함하도록 뇌를 적출하여 인산화된 타우(p-Tau), 타우(Tau), 아밀로이드 베타(Aβ), 후시냅스 밀도 단백질-95(postsynaptic density protein-95, PSD-95), 시냅토마이신(synaptophysin), 신경교섬유질산성단백질(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)의 발현을 측정하였다. GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 대조군으로 하여 발현 여부를 확인하였다.
단백질 발현 및 유전자 발현은 공지의 방법을 적절히 변형하여 확인하였다.
간단하게 설명하면 다음과 같다.
적출한 뇌 조직을 세척하고 버퍼와 함께 균질화하고, 단백질 농도를 정량한 후, 겔에 세퍼레이션 한 후 니트로셀룰로오스 막에 전사하였다. 전사 후, 각각의 단백질에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다.
해마 부위를 포함한 적출한 뇌 조직을 파라포름알데히드에 고정시키고 저온 동결시킨 다음 마이크로톰으로 슬라이스 하였다. 이 후, 뇌의 단면에 아밀로이드 베타 및 신경교섬유질산성단백질(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)에 대한 항체를 처리하고, 면역 현광 현미경으로 관찰하여 면역 염색 방법을 수행하였다. 신경교섬유질산성단백질(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)의 염색에는 1차 항체로 mouse monoclonal anti-neurofilament 160/200kD antibody (Zymed Lab. USA)를 사용하고 2차 항체로 fluoresceinisothiocyanate(FITC)를 사용하였다. 아밀로이드 베타의 염색에는 Thioflavin-s를 사용하였다.
적출한 뇌 조직에서 RNA를 추출하고, cDNA를 합성한 후 real-time PCR을 수행하여 각각의 단백질의 발현 정도를 확인하였다. 필요에 따라 GAPDH 유전자로 mRNA의 양을 정량화하였다.
실험 결과, 락토바실러스 루테리 엘프가 포함된 사료를 섭취한 알츠하이머 마우스에서 베타 아밀로이드 발현이 약 20% 정도 감소하였다(도 4). 그리고, 후시냅스 밀도 단백질-95(postsynaptic density protein-95, PSD-95) 발현도 락토바실러스 루테리 엘프가 포함된 사료를 섭취한 알츠하이머 마우스에서 약 15% 정도 감소하여 유의성 있는 효과가 나타났다(도 5). 반면, 시냅토마이신(synaptophysin)의 발현은 큰 변화가 없었다(도 6).
인산화된 타우 단백질(p-Tau)의 발현도 큰 변화가 없었다(도 7). 그러나, 락토바실러스 루테리 엘프가 포함된 사료를 섭취한 알츠하이머 마우스에서 타우 단백질의 발현이 약 25% 정도 감소하였다(도 8).
신경교섬유질산성단백질(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)의 발현은 알츠하이머 마우스에서 매우 증가하였다. 그러나, 락토바실러스 루테리 엘프가 포함된 사료를 섭취한 알츠하이머 마우스에서 GFAP의 발현은 약 30%가 감소하였다(도 10, 도 11).
티오플라빈 S(Thioflavin S)를 이용한 아밀로이드 플라크 측정 결과, 락토바실러스 루테리 엘프가 포함된 사료를 섭취한 알츠하이머 마우스에서 아밀로이드 플라크 형성이 약 50% 감소하였다(도 12, 도 13).
락토바실러스 루테리 엘프 ( Lactobacillus reuteri ELF) 및 5- 아미노레불린산 을 포함한 조성물을 제조 .
4L 배양기에 증류수 3,000㎖, 무수 소듐카보네이트(sodium carbonate, Na2CO3) 431g을 넣고 교반한 후 시스테인 염산염(Cystein hydrochlroride salt) 130g을 추가한다. 질소를 주입하여 버블링(bubbling)하면서 교반하여 용존산소를 제거한 후 5-아미노레불린산 200g을 넣고 용해시켰다. 염산 및 소듐카보네이트로 pH가 8.6~9.5 사이에 포함될 수 있도록 조절하였다. 유산균으로 실시예 2에 따라 분리한 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF) 400g을 넣고 교반하여 균일한 현탁액이 되게 하였다. 30에서 24시간 교반하여 배양하였다. 이 후 1M의 칼슘 락테이트(calcium lactate) 용액 1,000㎖를 추가하고 1시간 동안 교반한 후 원심분리(5,000rpm, 10분)하여 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산이 포함된 조성물을 침전시켜 얻었다. 수득한 조성물에는 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산과 함께 유산균의 대사에 의한 대사물질도 포함되어 있었다. 필요에 따라 얻은 침전물을 동결 건조하여 수분을 완전히 제거하여 포장 및 보관하였다.
락토바실러스
루테리
엘프
및 5-
아미노레불린산이
포함된 조성물에서 유산균의 대사에 의한 대사물질 농도 분석
에를리히 시약(Ehrlich reagent) 2㎖에 실시예 7의 배양액 20㎕를 첨가하였다. 유산균에 대사에 의한 5-아미노레불린산의 대사물질로 피롤(pyrrole)이 포함된 포르포빌리노겐 등이 형성된다면 550nm 파장에서 강한 흡광(붉은색)이 나타나게 되므로 이에 의한 흡광도 값을 측정하였다. 피롤에 비례하여 나타나는 흡광도 값을 통해 5-아미노레불린산의 대사물질의 농도를 측정하였다(흡광도(Absorbance) λ550 = 2.3, 0.45%).
유산균 및 5-
아미노레불린산이
포함된 조성물에서 유산균의 대사에 의한 대사물질 분석
음이온교환수지 (Trilite, SAR20MB 삼양사) 200㎖를 컬럼에 준비하고, 25% 아세트산 나트륨(sodium acetate) 수용액을 충분히 흘려내려 음이온을 아세트산으로 포화시켰다. 이때, 용출액에 질산은 수용액을 떨어뜨렸을 때, 흰색 침전이 나오지 않을 때까지 계속하였다. 증류수로 컬럼을 세척하고 용출액의 pH가 7.5 이하가 되도록 하였다.
실시예 7에 따라 동결 건조된 조성물 1g을 1N 아세트산(acetic acid) 10㎖에 분산시켰다. 원심분리(5,000rpm, 5분) 한 다음, 상등액을 pH 7로 맞춘 후 위의 컬럼에 통과시킨다. 충분한 양의 증류수로 세척하고, 1N 아세트산으로 다시 용출 시키고 통과되어 나온 1N 아세트산 용액을 동결 건조한다. 이 후 D2O를 용매로하여 사용하여 동결 건조된 물질을 녹여 1H NMR을 이용하여 대사물질을 확인하였다. 1H NMR 결과 피크가 5.8(s,1H), 4.3 (s,2H), 3.6 (s,2H), 2.7(t,2H), 2.5(t,2H)로 나타나 대사물질 중 하나가 포르포빌리노겐임을 확인하였다. 컬럼을 사용한 분석 이전의 1H NMR 결과는 포르포빌리노겐을 포함한 매우 다양한 대사물질을 함유하고 있어 매우 복잡한 피크를 나타내고 있었다.
면역 증진 효과 확인을 위해
PBMC
(Peripheral blood mononuclear cell)와 비장에서 T 림프구(T lymphocyte) 증식과 T 림프구 활성화에 따른 IL-2, IL-4, IL-10 및 IFN-γ를 측정하였다.
8주령의 Balb/c계 마우스(male)에 베히클 컨트롤 그룹(Vehicle control group), 5-아미노레불린산(5-aminolevulinic acid, 이하 'ALA'로 표현할 수 있음) 100 mg/kg, 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF, 이하 'LAB'로 표현할 수 있음) 100 mg/kg, 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산 혼합 시료(이하 'ALA+LAB'로 표현할 수 있음) 50 mg/kg, 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산 혼합 시료 100 mg/kg를 14일간(2주간) 경구 투여하였다.
실시예
10-1.
PBMC와
비장에서 활성 T 림프구의 형광
유세포
분석
투여 2주 후, 마우스에서 PBMC를 헤파린을 처리한 3㎖ 주사기로 심장천좌법을 통해 채혈하였다. 미리 준비한 10㎖의 ACK 용액(0.1Mm EDTA를 첨가한 탈염수(demineralized water)에 8.3g NH4Cl, 1g KHCO3를 혼합한 용액)에 혼합하여 실온에서 5분 동안 처리하여 적혈구를 제거하였다. 비장을 적출하여 100 메쉬(mesh)로 비장세포를 분리하여 D-PBS로 5분 간 1700rpm로 원심분리하고 세척한 후 셀 트레이너(cell strainer, FALCON)에 통과시켜 세포 이외의 분해되지 않은 조직이나 불순물을 제거하였다. 분리된 PBMC와 비장세포를 FACS 버퍼로 1%의 FBS(Fetal bovine serum)가 함유된 PBS를 사용하여 2회 세척한 후 셀 트레이너에 통과시켜 세포 이외의 불순물을 제거하였다. 각각의 시험관에 PBMC 세포를 5×105 세포로 조정한 후 4℃에서 면역형광염색(immunofluorescence staining)을 실시하였다. 각각에 anti-CD3e-PE, anti-CD25-FITC, anti-CD4-FITC, anti-CD69-FITC, anti-CD44-cy5.5-PE, anti-CTLA-4-FITC, anti-NK1.1-PE, anti-CD49b-FITC를 넣고 30분 간 얼음에서 반응시킨 후 3회 이상 PBS로 수세한 후 유세포분석기(flow cytometry)의 셀퀘스트(Cell Quest) 프로그램을 이용하여 CD4+ CD25+, CD44+ CD69+, CD49b+ NK1.1+, 그리고 CD25+ CTLA-4+의 활성세포 빈도(%)로 분석하였다.
분석결과 2주간 시료를 경구투여 후 PBMC에서 활성 Th 림프구 세포의 빈도수(%)는 음성대조군(NC)이 27.9%로 나타났고, 락토바실러스 루테리 엘프 투여군은 음성대조군에 비하여 약간 증가를 나타내었다. 그리고 5-아미노레불린산 투여군은 100mg/kg에서 음성대조군 보다 46.2% 이상 활성 Th 림프구 빈도수가 증가하였다. 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산 혼합 시료 투여군은 50 mg/kg과 100 mg/kg 투여군이 15%와 36.9%로 활성 Th 림프구 빈도수가 증가하였다(도 15의 C 및 D). CD3 T 세포의 빈도수는 대조군에 비하여 5-아미노레불린산 100mg/kg과 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산 혼합 시료 50mg/kg, 100mg/kg에서 증가를 하였으나(도 14의 A 및 B), CD19 B 세포는 그룹간 차이가 없었다. 그리고 CD4+ CD25+(도 16), 그리고 Gr-1/CD11b(도 17의 G 및 H) 세포의 빈도수는 대조군에 비하여 5-아미노레불린산 100mg/kg과 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산 혼합 시료 100mg/kg에서 유의성 있게 증가를 나타내었다. 또한 NK세포 활성지표인 NKG2D의 빈도수(도 18)는 대조군에 비하여 5-아미노레불린산 100mg/kg, 그리고 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산 혼합 시료 50mg/kg과 100 mg/kg 각각에서 현저하게 증가를 나타내었다. 즉, 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산을 포함한 혼합 시료를 투여한 쥐에서 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산과 함께 락토바실러스 루테리 엘프의 5-아미노레불린산 대사에 의한 대사물질에 의한 혼합 효과로 면역 증진 효과가 현저히 상승한 것을 확인할 수 있었다.
실시예
10-2. 배양한
비장세포에서
활성 T 세포의 활성물질인
IFN
-γ, IL-2, IL-4, IL-
10 측정
투여 2주 후, 마우스에 비장을 적출하여 100메쉬로 비장세포를 분리하였다. 측정에 앞서 측정 하루 전, anti-CD3 mAb 1㎍/㎖을 96웰-플레이트(well plate)에 코팅(coating)하여 4℃ 냉장고에서 오버나잇(overnight)한 다음 D-PBS로 2회 세척하였다. 분리한 비장세포는 ACK 용액으로 적혈구를 제거한 후 anti-CD3 mAb가 코팅된 각각의 웰에 5×105 세포씩 5% FBS-DMEM 배양액에서 48 시간 동안 배양한 후 2,000rpm으로 3분 간 원심분리한 후 200㎕의 배양 상층액을 얻었다. 배양 상층액 내의 IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-10의 수준측정은 ELISA(enzyme-linked immuno-sorbent assay)로 측정하였다. 각 웰에 배양 상층액 50㎕를 분주하고 2시간 동안 25℃ 실온에서 방치한 후 2회 세척완충용액으로 세척한 다음 IL-비오틴(biotin) 결합 항체(antibody biotin-IL conjugated)를 넣고 2시간 방치하였다. 다시 완충용액으로 2회 세척한 다음 아비딘(avidin)-HRP(horseradish peroxidase) 결합 항체(antibody Avidin-HRP conjugeted) 100㎕를 처리하고 1 시간 실온에서 방치한 후 다시 세척한다. TMB(tetrameyhylbenzidine) 기질을 100㎕씩 분주하고 암실에서 30분 간 방치한 후 100㎕의 스탑(stop) 용액을 처리하였다. 이 후, ELISA 리더(leader) 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.
측정결과, 대조군(NC)에 비하여 락토바실러스 루테리 엘프 투여군은 차이가 없었고, 5-아미노레불린산 100mg/kg 투여군에서 2배 이상 증가를 나타내었고, 5-아미노레불린산 및 락토바실러스 루테리 엘프 혼합 시료 50mg/kg, 100mg/kg 투여군에서 각각 2배, 2.57배 이상 증가를 나타내었다. 그리고, IL-2 생산량(도 19), IL-4생산량(도 20), 그리고 IFN-γ 생산량(도 21) 은 대조군(NC)에 비하여 락토바실러스 루테리 엘프 투여군, 그리고 5-아미노레불린산 100 mg/kg 투여군에서는 대조군에 비해 약간 증가를 나타내었고, 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산 혼합 시료 투여군은 투여농도 의존적으로 대조군에 비하여 약 2.1배 이상 통계학적으로 유의성 있게 현저한 증가를 나타내었다. 즉, 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산을 포함한 혼합 시료를 투여한 쥐에서 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산과 함께 락토바실러스 루테리 엘프의 5-아미노레불린산 대사에 의한 대사물질에 의한 혼합 효과로 면역 증진 효과가 현저히 상승한 것을 확인할 수 있었다.
면역 증진 효과 확인을 위해 대식세포(macrophage)에서 산화질소(Nitrogen oxide, NO)의 증가 정도를 측정하였다.
실시예
11-1. 대식세포에서 산화질소(NO) 생성 측정
Balb/c계 마우스에 베히클 컨트롤 그룹(Vehicle control group), 5-아미노레불린산(5-aminolevulinic acid) 100mg/kg, 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF) 100mg/kg, 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산 혼합 시료 50mg/kg, 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산 혼합 시료 100mg/kg를 14일간(2주간) 경구 투여하였다. 투여종료 3일 전에 프로테오즈 펩톤(proteose peptone, Difco) 10% 수용액 1.5 ㎖을 마우스 복강 내에 투여한 후 치사시키고 알코올로 복부를 소독하였다. 복부의 피부를 가위로 자르고 복막을 노출시킨 다음 냉각시킨 HBSS(Hanks' Balanced Salt Solution)을 주사기로 복강 내에 4.5㎖ 주입하고 30초간 복부를 마사지한 후 주사기로 회수하였다. 회수한 세포를 냉각시킨 다음 동일 HBSS용액으로 2회 세척한 후 냉각된 RPMI1640 배지에 현탁시키고, 트리판 블루(tryphan blue) 염색에 의해 살아있는 세포를 계산하여 2×106cells/㎖이 되도록 조정한 후 96 웰(well) 배양접시에 200㎕씩 분주하였다. CO2 배양기에서 1~2 시간 배양하여 대식세포를 부착시킨 다음 37℃의 HBSS 용액으로 3회 세척하여 부유세포를 제거하고 100 ㎕의 RPMI 1640 배지를 넣었다. CO2 배양기에서 72시간 배양 후 배양 상등액을 회수하여 냉동 보존 하였다. 배양상등액 100㎕를 취하고 증류수 2 ㎖과 25㎖ 강염산과 25㎖ 증류수의 혼합용액에 설퍼닐아미드(sulfanilamide) 0.5g을 용해한 그리스(Griese) 시약 I 200㎕를 혼합하였다. 그리고, 50㎖의 증류수에 N-1-나프틸렌 아마이드 하드로클로라이드(N-1-naphtylene amidehydrochloride) 0.06g를 용해한 Griese 시약 II 200 ㎕을 신속하게 넣고 교반 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
측정 결과, 산화질소 생산량이 대조군(NC)에 비하여 5-아미노레불린산 100 mg/kg, 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산 혼합 시료 50mg/kg 및 100mg/kg 각각의 투여군에서 통계학적으로 유의성 있게 증가를 나타났다. 그리고, 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산 혼합 시료의 경우 5-아미노레불린산 단독 처리보다 2배 이상의 현저한 효과가 나타났다(도 22). 즉, 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산을 포함한 혼합 시료를 투여한 쥐에서 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산과 함께 락토바실러스 루테리 엘프의 5-아미노레불린산 대사에 의한 대사물질에 의한 혼합 효과로 면역 증진 효과가 현저히 상승한 것을 확인할 수 있었다.
실시예
11-2. 복강
세포 군의
증식에 미치는 영향 측정
Balb/c계 마우스에 베히클 컨트롤 그룹(Vehicle control group), 5-아미노레불린산(5-aminolevulinic acid) 100mg/kg, 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF) 100mg/kg, 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산 혼합 시료 50mg/kg, 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산 혼합 시료 100 mg/kg를 14일간(2주간) 경구 투여하였다. 투여 종료 2일 전에 일전에 2% 스타치(starch) 생리 식염수 현탁액 0.5㎖을 마우스 복강 내에 주사하여 면역시킨다. 마우스를 치사시키고 알코올로 복부를 소독한 다음 복부의 피부를 가위로 자르고 복막을 노출시킨 다음 냉각시킨 HBSS을 주사기로 복강 내에 5㎖주입하고 30초간 복부를 마사지 한 후 주사기로 3 ㎖정도를 회수하였다. 회수한 세포를 냉각시킨 다음 동일 HBSS용액으로 2회 세척한 후 이 중에 존재하는 복강 세포 수를 직접현미경하에서 혈구 계산 판(hemocytometer)으로 측정하였다. 총 복강세포 수의 측정이 끝난 복강 세척액을 4℃에서 400g로 10분간 원심분리하여 세포침전물을 얻어 PBS로 현탁 하였다. 각각의 시험관에 복강 세포를 5×105 세포로 조정한 후 4℃에서 면역형광염색(immunofluorescence staining)을 실시하였다. 각각에 anti-CD11b-FITC, anti-CD3-cy5.5-PE, anti-CD4-FITC, anti-CD8-FITC, anti-CD14-PE를 넣고 30분간 얼음에서 반응시킨 후 3회 이상 PBS로 수세한 후 유세포분석기(flow cytometry)의 셀퀘스트(Cell Quest) 프로그램을 이용하여 CD11b+ CD14+,CD3+ CD4+,그리고 CD3+ CD8+의 활성세포 빈도(%)로 분석한 다음 총 세포 수를 적용하여 복강 세포군의 절대세포수(absolute number)를 산출하였다.
산출 결과 대조군에 비하여 락토바실러스 루테리 엘프, 5-아미노레불린산, 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산 혼합 시료 모두에서 림프구 세포가 증가하였다. 그러나, 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산 투여군에서 더 많은 림프구 증가가 나타났고, 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산 100mg/kg 투여군에서 특히 현저한 림프구 증가를 확인할 수 있었다(도 23). 즉, 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산을 포함한 혼합 시료를 투여한 쥐에서 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산과 함께 락토바실러스 루테리 엘프의 5-아미노레불린산 대사에 의한 대사물질에 의한 혼합 효과로 면역 증진 효과가 현저히 상승한 것을 확인할 수 있었다.
간 미토콘드리아의 COX 활성 효소 측정
Balb/c계 마우스에 베히클 컨트롤 그룹(Vehicle control group), 5-아미노레불린산(5-aminolevulinic acid) 100mg/kg, 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF) 100mg/kg, 및 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산 혼합 시료 100 mg/kg를 14일간(2주간) 경구 투여하였다. 투여 후 마우스 간의 미토콘드리아 내 COX(cyotochrome c oxidase) 활성도를 측정하기 위해 마우스 간세포에 COX activity assay kit(TA100, Toyo B Net)를 사용하여 단백질을 추출하여 측정하였다. 측정 결과 COX의 활성은 대조군, 락토바실러스 루테리 엘프 투여군(LAB)에서는 차이가 없었고, ALA는 2배 이상 증가하였으나 통계학적으로 유의성은 나타나지 않았다. ALA+LAB 투여군(p<0.01)에서는 4배 이상 통계학적으로 유의성 있게 COX활성이 증가한 것을 확인하였다(도 24). 즉, 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산을 포함한 혼합 시료를 투여한 쥐에서 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산과 함께 락토바실러스 루테리 엘프의 5-아미노레불린산 대사에 의한 대사물질에 의한 혼합 효과로 COX 활성 효과가 현저히 상승한 것을 확인할 수 있었다.
뇌 미토콘드리아의 COX 활성 효소 측정
정상대조군으로 C57bl/6J 마우스(Vehicle control group) 및 비만대조군(HFD control)을 준비하였다. 비만대조군(high-fat diet, HFD)은 8 주령의 수컷 C57BL/6J 생쥐(대한바이오링크)를 항온(25±2℃), 항습(50±5%) 및 12시간 간격의 광주기(light on 07:00 ~ 19:00)로 조절되는 SPF환경에서 2 주간 기본사료(AIN-76A diet)와 물을 자유롭게 공급하면서 적응시킨 후, 체중이 약 24g 이상 되는 10 주령부터 고지방식이(#D12492 60 kcal fat, Research Diets Inc, USA)를 투여하여 생쥐 비만(DIO) 병태모델을 제작하였다. 비만대조군에 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산 혼합 시료(ALA+LAB) 100 mg/kg, 200 mg/kg 각각을 14일간(2주간) 고지방식이를 투여하는 10주령부터 함께 투여하였다. 경구 투여가 끝난 후, 마우스 뇌의 미토콘드리아 내 COX(cyotochrome oxidase) 활성도를 측정하기 위해 마우스 뇌를 적출하여 COX activity assay kit(TA100, Toyo B Net)의 사용자 매뉴얼에 따라 뇌의 COX 활성을 측정하였다. 측정 결과 COX의 활성은 비만대조군이 정상대조군보다 감소하였고, ALA+LAB 투여군(p<0.01)에서는 정상대조군에 비해 1.5배 이상 통계학적으로 유의성 있게 COX활성이 증가한 것을 확인하였다(도 25).
즉, 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산을 포함한 혼합 시료를 투여한 쥐에서 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산과 함께 유산균의 5-아미노레불린산 대사에 의한 대사물질에 의한 혼합 효과로 COX 활성 효과가 현저히 상승한 것을 확인할 수 있었다. 그리고, 혼합 시료는 뇌의 혈관-뇌장벽에 영향을 받지 않고 직접 뇌 미토콘드리아의 COX 활성 증가에 영향을 줄 수 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해, 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산을 포함하는 혼합물이 뇌 미토콘드리아의 COX 활성 감소에 의한 퇴행성 뇌질환의 치료에 효과적임을 알 수 있었다.
비만대조군을 이용한 쥐의 체중 변화 확인
실시예 13과 동일하게 비만대조군(HFD)를 준비하고, 락토바실러스 루테리 엘프 및 5-아미노레불린산 혼합 시료(ALA+LAB) 100 mg/kg, 200 mg/kg 및 밀크씨술(milk thistle, MTS) 100 mg/kg을 각각 고지방식이를 투여하는 10주령부터 19주령까지 함께 투여하였다. 체중 변화는 ① 체중변화 : 매주 수요일 9시에 측정/기록, ② 총 체중 증가량 : Final body wt - initial body wt, ③ 1일 평균 체중 증가량 = Total body wt gain /days에 따라 측정하였다. 최종 19주령에서 비만대조군에 비하여 MTS(100 mg/kg)(p<0.001), ALA+LAB(200 mg/kg)(p<0.01)와 ALA+LAB(100 mg/kg)(p<0.01)에서는 유의성 있게 감소된 추이를 보였다(도 26).
비만대조군을 이용한 경구 부하 시험
글루코스 경구부하시험은 글루코스를 경구적(經口的)으로 섭취하면 간이나 조직에서의 처리능력이상으로 장관(腸管)에서 흡수되어, 혈당은 30~60분이면 최고치가 된다. 그리고 조직에 있어서 글루코스가 이용되어, 간에서의 글루코스방출이 억제되며, 또 인슐린분비항진, 성장호르몬분비억제등의 기구(機構)에 의해 혈당은 하강한다. 실시예 13과 같이 비만대조군을 준비한 후 글루코스와 함께 각각의 시험 시료를 함께 투여하였다. 경투 투여 결과(도 27) 비만대조군의 글루코스 경구부하시험 결과에서는 글루코스를 투여 후 30분에서 혈당이 3배이상 증가된 후 120분 경과 후에도 약간 감소하였으나, MTS(100 mg/kg)(p<0.05) 와 ALA+LAB(200 mg/kg)(p<0.05) 투여군은 30분, 60분, 120분에서 혈당은 통계학적으로 유의성 있게 현저하게 감소하였다. ALA+LAB(100 mg/kg) 투여군도 30분, 60분, 120분에서 혈당이 비만대조군에 비하여 감소하였다.
비만 및 당뇨의 표적 단백질인
AMPK
-
α1의
유전자의 발현 양상을 분석
구체적인 분석 방법은 실시예 14에 따른 체중 측정 후, 정상대조군, 지방대조군 및 시험 시료를 투여한 각각의 쥐의 간 조직을 RNAsolB (Tel-Test) 용액을 사용하여 각 조직으로부터 RNA를 추출한 뒤 One-step SYBR Green PCR kit(AB science)를 사용하여 cDNA 및 real-time PCR 분석을 하였다. 조직에 RNAzolB 500 ㎕를 넣고 homogenizer로 조직을 분쇄하여 여기에 chloroform (CHCl3) 50 ㎕를 첨가한 후 15초간 다시 혼합하였다. 이를 얼음에 15 분간 방치한 후 13,000 rpm에서 원심 분리한 후 약 200 ㎕의 상층액을 회수하여 2-propanol 200 ㎕와 동량 혼합 후 천천히 흔들고 얼음에서 15 분간 방치하였다. 이를 다시 13,000 rpm에서 원심 분리한 후 80% EtOH로 수세하고 3분간 vaccum pump에서 건조하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 diethyl pyrocarbonate (DEPC)를 처리한 20 ㎕의 증류수에 녹여 heating block 75 ℃에서 불활성화 시킨 후 first strand cDNA합성에 사용하였다. 역전사 (reverse transcription) 반응은 준비된 total RNA 3 ㎍을 DNase I (10U/㎕) 2U/tube를 37℃ heating block에서 30분간 반응한 후 75℃에서 10분 동안 변성시키고, 이에 2.5 ㎕ 10 mM dNTPs mix, 1 ㎕ random sequence hexanucleotides (25 pmole/ 25 ㎕), RNA inhibitor로서 1 ㎕ RNase inhibitor (20 U/㎕), 1 ㎕ 100 mM DTT, 4.5 ㎕ 5×RT buffer (250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2)를 가한 후, 1 ㎕의 M-MLV RT (200 U/㎕)를 다시 가하고 DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 하였다. 이 20 ㎕의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000 rpm에서 5초간 원심침강하여 37℃ heating block에서 45분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성한 다음, 95℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT를 불활성화 시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 polymerase chain reaction (PCR)에 사용하였다. Real time quantitative PCR은 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였다. 프라이머 서열은 정방향 프라이머(forward)로 5'-AAGCCGACCCAATGACATCA-3', 역방향 프라이머(reverse)로 5'-CTTCCTTCGTACACGCAAAT-3'를 사용하였다. 생쥐 비만모델에서 투여 시료에 따른 간에서 발현되는 AMPK-α1 mRNA 유전자 발현을 분석한 결과로, 비만대조군의 AMPK-α1 mRNA 유전자 발현의 RQ값을 1로 했을 때 실험군의 상대정향 값을 분석하였다. 비만대조군의 간에서 발현되는 AMPK-α1 mRNA이 정상대조군(C57bl)과 비슷한 AMPK-α1 mRNA 유전자 발현을 나타내었다. MTS 투여군도 비만대조군과 큰 차이가 없었다. 그러나 실험군인 ALA+LAB(200 mg/kg)(p<0.001)와 ALA+LAB(100 mg/kg)(p<0.001)등에서 통계학적으로 유의성 있게 5~3배 이상 증가를 나타내었다(도 28).
열생성
단백질
UCP
-2 유전자의 발현 양상 분석
실시예 14에 따른 체중 측정 후, 정상대조군, 지방대조군 및 시험 시료를 투여한 각각의 쥐의 간 주변 조직을 실시예 10과 같이 처리하고 PCR을 수행하였다. 사용 프로브는 5'-TTCAAATGAGATTGTGGGAAAAT-3'(sense), 5'-ACCGATACAGTACAGTACAGTA-3'(antisense)였다. 분석은 비만대조군 UCP-2 mRNA 유전자 발현의 RQ값을 1로 했을 때 실험군의 상대정향 값을 분석하였다(도 29). 비만대조군의 UCP-2 mRNA 유전자 발현이 정상대조군에 비하여 현저한 감소를 나타내었다. 실험군에서는 대조군에 비하여 실험군인 ALA+LAB(200 mg/kg)(p<0.01)와 ALA+LAB(100 mg/kg)(p<0.05)등에서 통계학적으로 유의성 있게 증가를 나타내었으나 MTS(100 mg/kg) 투여군은 비만대조군에 비하여 약간 증가하였으나 통계학적 유의성은 없었다.
아디포넥틴의
유전자 발현 양상 실험
지방세포에서 특이적으로 발현되고 간 조직에서 인슐린 민감도를 높이며 지방산 산화를 증가시켜 체중을 감소시키는 아디포넥틴(adiponectin)의 유전자 발현 양상을 분석하였다. 실시예 14에 따른 체중 측정 후, 정상대조군, 지방대조군 및 시험 시료를 투여한 각각의 쥐의 간 주변 조직을 실시예 16과 같이 처리하고 PCR을 수행하였다. 사용 프로브는 5'-TTCAAATGAGATTGTGGGAAAAT-3' (sense), 5'-ACCGATACAGTACAGTACAGTA-3' (antisense)였다. 분석은 비만대조군(DIO-NC)의 Adiponectin mRNA 유전자 발현의 RQ값을 1로 했을 때 실험군의 상대정향 값을 분석하였다. 비만대조군의 간에서 발현되는 Adiponectin mRNA이 정상대조군과 비슷한 Adiponectin mRNA 유전자 발현을 나타내었다. 대조군에 비하여 양성대조군인 MTS 투여군도 비만대조군과 큰 차이가 없었다. 그러나 ALA+LAB(200 mg/kg)(p<0.05)와 ALA+LAB(100 mg/kg)(p<0.01) 등에서 통계학적으로 유의성 있게 4~2배 이상 증가를 나타내었다(도 30).
<110> WEDEA
<120> Composition for preventing and treating degenerative brain
disease using novel lactic acid bacteria
<130> P17040980423
<150> KR 10-2016-0160188
<151> 2016-11-29
<160> 7
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1427
<212> DNA
<213> Lactobacillus reuteri
<400> 1
agtcgtacgc actggcccaa ctgattgatg gtgcttgcac ctgattgacg atggatcacc 60
agtgagtggc ggacgggtga gtaacacgta ggtaacctgc cccggagcgg gggataacat 120
ttggaaacag atgctaatac cgcataacaa caaaagccac atggcttttg tttgaaagat 180
ggctttggct atcactctgg gatggacctg cggtgcatta gctagttggt aaggtaacgg 240
cttaccaagg cgatgatgca tagccgagtt gagagactga tcggccacaa tggaactgag 300
acacggtcca tactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg ggcgcaagcc 360
tgatggagca acaccgcgtg agtgaagaag ggtttcggct cgtaaagctc tgttgttgga 420
gaagaacgtg cgtgagagta actgttcacg cagtgacggt atccaaccag aaagtcacgg 480
ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttatcc ggatttattg 540
ggcgtaaagc gagcgcaggc ggttgcttag gtctgatgtg aaagccttcg gcttaaccga 600
agaagtgcat cggaaaccgg gcgacttgag tgcagaagag gacagtggaa ctccatgtgt 660
agcggtggaa tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct gtctggtctg 720
caactgacgc tgaggctcga aagcatgggt agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc 780
atgccgtaaa cgatgagtgc taggtgttgg agggtttccg cccttcagtg ccggagctaa 840
cgcattaagc actccgcctg gggagtacga ccgcaaggtt gaaactcaaa ggaattgacg 900
ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gctacgcgaa gaaccttacc 960
aggtcttgac atcttgcgct aaccttagag ataaggcgtt cccttcgggg acgcaatgac 1020
aggtggtgca tggtcgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080
gcgcaaccct tgttactagt tgccagcatt aagttgggca ctctagtgag actgccggtg 1140
acaaaccgga ggaaggtggg gacgacgtca gatcatcatg ccccttatga cctgggctac 1200
acacgtgcta caatggacgg tacaacgagt cgcaagctcg cgagagtaag ctaatctctt 1260
aaagccgttc tcagttcgga ctgtaggctg caactcgcct acacgaagtc ggaatcgcta 1320
gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380
cacaccatgg gagtttgtaa cgcccaaagt cggtggccta accttta 1427
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AMPK-alpha1 forward primer
<400> 2
aagccgaccc aatgacatca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AMPK-alpha1 reverse primer
<400> 3
cttccttcgt acacgcaaat 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UCP-2 forward primer
<400> 4
ttcaaatgag attgtgggaa aat 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UCP-2 reverse primer
<400> 5
accgatacag tacagtacag ta 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Adiponectin forward primer
<400> 6
ttcaaatgag attgtgggaa aat 23
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Adiponectin reverse primer
<400> 7
accgatacag tacagtacag ta 22
Claims (5)
- 신규한 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP).
- 신규한 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP) 및 5-아미노레불린산을 포함하고,
상기 락토바실러스 루테리 엘프는 MRS 배지에서 배양되는 것인 알츠하이머 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 삭제
- 신규한 락토바실러스 루테리 엘프(Lactobacillus reuteri ELF)(수탁번호: KCTC 13154BP) 및 5-아미노레불린산을 포함하고,
상기 락토바실러스 루테리 엘프는 MRS 배지에서 배양되는 것인 알츠하이머 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물. - 삭제
Priority Applications (2)
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| US15/701,928 US10590496B2 (en) | 2016-11-29 | 2017-09-12 | Composition for preventing and treating degenerative brain disease using novel lactic acid bacteria |
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Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
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| KR20160160188 | 2016-11-29 |
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Family
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Family Applications (1)
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| KR101426275B1 (ko) | 2014-04-04 | 2014-08-06 | 주식회사한국야쿠르트 | 지방합성 억제 및 지방산화 촉진에 의한 체지방 감소 효능을 갖는 5종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 조성물 |
-
2017
- 2017-08-14 KR KR1020170103015A patent/KR102007980B1/ko active IP Right Grant
Also Published As
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