JP6986288B2 - 新規乳酸菌およびその応用 - Google Patents
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Description
本発明はプロバイオティクスおよびそれを含む組成物に関する。特に、本発明は新規乳酸菌ならびに、気分障害もしくは神経学的状態の改善および神経細胞のアポトーシスもしくは神経変性に関連する疾患の治療もしくは予防におけるその特定の使用に関する。
発酵食品は、乳酸菌(LAB)を含む様々な有用な細菌を含む。牛乳、パン、野菜、および他の食用植物材料を含む、発酵食品の製造において、LABの様々な菌株が使用されている。LABは発酵食品の生産に一般的に使用されている一群のグラム陽性菌である。食事および臨床応用におけるLABの利点が広く研究されてきた。LABは、低いpHおよびその発酵活動の間に生成される発酵生成物の作用を利用して、腐敗細菌の増殖を抑制するために、食品の保存のための発酵剤として利用されてきた。この目的のために、LABは、チーズ、ヨーグルトおよび他の乳汁由来の発酵乳製品などの、様々な異なる食料を調製するために使用されてきた。LABが摂取時にヒトや動物に価値ある特性を示すことが判明したことで、それは大きな注目を集めてきた。特に、乳酸桿菌(Lactobacillus)またはビフィズス菌(Bifidobacterium)属の特定の株は腸粘膜にコロニーを形成することができ、そしてヒトおよび動物の福祉の維持を助け得ることがわかっている。抗炎症活性および免疫調節活性は、LABのよく知られた特徴である。特許文献1は、微生物とそれらがコロニーを形成する宿主との相互作用を解明するための、そしてさらには、そのような株によって示されるプロバイオティック特性の基礎を解明するためのLactobacillus johnsonii株のDNA配列、特にそのゲノム配列の使用に関する。
本発明は、新規乳酸菌(LAB)、Lactobacillus fermentum(ラクトバチルス・ファーメンタム)PS150に関し、前記LABによって産生される生物活性タンパク質は、気分障害または神経学的状態を改善し、神経変性疾患を治療または予防するのに有利な効果を有する。
本発明は、驚くべきことに、新たな乳酸菌(LAB)、Lactobacillus fermentum PS150および、このLABにより産生される生物活性タンパク質が、気分障害または神経学的状態を改善し、そして神経変性疾患を治療または予防するのに有利な効果を有することを見出した。
本明細書において特に定義されていない用語は、本開示および文脈に照らし、当業者によってそれらに与えられるであろう意味に従って理解されるべきである。しかしながら、本明細書中で使用される場合、そうでないと明記されない限り、以下の用語は、以下の慣例に従って示される意味を有する。
CDS:コード領域;COG:オーソロググループクラスター;CRISPR:クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドローム反復;EF−Tu:伸長因子Tu;GO:遺伝子オントロジー;HGAP:階層的ゲノム構築法。
1つの側面において、本発明は、配列番号1〜3に示される核酸配列のいずれかを有する、Lactobacillus fermentum PS150(PS150)である、単離されたLABを提供する。配列番号1〜3の配列を以下に列挙する。
別の側面において、本発明は、配列番号4のアミノ酸配列を含む、PS150のEF−Tuタンパク質を提供する。
MAEKEHYERTKPHVNIGTIGHVDHGKTTLTAAITKVLAAKGLAKAEDYSDIDAAPEEKERGITINTAHVEYETEKRHYAHIDAPGHADYVKNMITGAAQMDGAILVVAATDGPMPQTREHILLARQVGVEYIVVFLNKTDLVDDDELVDLVEMEVRDLLSEYDFPGDDVPVVRGSALKALEGDPEQEQVVLHLLDVVDEYIPTPKRPTDKPFMMPVEDVFTITGRGTVASGRIDRGTVKIGDEVEIVGLKEDVIKSTVTGVEMFHKTLDLGEAGDNVGVLLRGVSHDQIERGQVLAEPGSIQTHKQFKGEVYVMTKEEGGRHTPFFSNYRPQFYFHTTDVTGTIELPDGVEMVMPGDNVTFTVELQKPVALEKGLKFTIREGGHTVGAGVVSEVLD
別の側面では、本発明は、PS150細胞、本発明のEF−Tuタンパク質または本発明のPS150のタンパク質画分、および場合により、食用担体または薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。本発明の組成物において、前記PS150細胞は、生きているか否かにかかわらず、細菌全体の形で使用され得る。好ましくは、細菌細胞は、生きている生細胞として存在する。
材料および方法
1.0 細菌株および増殖条件
Lactobacillus fermentum PS150は、マレーシア科学大学産業技術学部バイオプロセス技術学科(ペナン、マレーシア)の微生物株保存機関から入手したが、これは地元で購入された発酵ソーセージから以前に単離されたものである。使用に先立ち、細菌をde Man Rogosa Sharpe(MRS)(Biomark、インド)ブロス中、37℃で20時間インキュベートした。この特定の株はプロバイオティクスであり、その全体的な脳の健康増進効果に関する実証がなされる。
L.fermentum PS150のゲノムDNAは、Microbes Environ.,vol.22,no.3,pp.214−222,2007に従って単離、精製した。得られた精製DNAは、ゲノム配列決定の前に−20℃で保存した。
L.fermentum PS150のゲノムDNAは、2つの異なる次世代シークエンシングプラットフォーム(Pacbio RS IIおよびIllumina HiSeq 2000)を使用して配列決定した。Pacbioプラットフォームでは、C2−P4化学プロトコルにより、単一のSMRTセルのみを用いて、L.fermentum PS150のゲノムDNAの約10kbの挿入ライブラリーに対し、SMRTシークエンシングを行った。フィルタリング前の生のDNAシーケンスデータは489,633,442bpであり、平均読み取り長は3257bpである。生の配列データを次の基準に従ってフィルタリングした:最小サブリード長500bp、最小ポリメラーゼ読み取り品質0.8、最小ポリメラーゼ読み取り長100bp。フィルタリング後のデータセットは、2.5Mbpのゲノムに対して約166倍のカバレッジを有している。フィルタリングされたデータをそれから、染色体を組み立てることを目的として、SMRT portalver 2.3.0.140893に実装されているHGAP法(Nat.Methods,vol.10,no.6,pp.563−569,2013)にかけた。ドットプロット分析により、環状ゲノムであることが確認されたが、これは、報告されている他のLactobacillus fermentum株の染色体とも一致している。
ソフトウェアツールPROKKAを使用して、タンパク質コード遺伝子、tRNA、tmRNA、rRNA、およびCRISPERなどの反復領域のアノテーションを行った(Bioinformatics,vol.30,no.14,pp.2068−2069,2014)。各タンパク質コード遺伝子の遺伝子オントロジー(GO)の観点からの機能分類は、EggNOGオーソロググループクラスター(COG)のベストヒットを検索することによって行った(Nucleic Acids Res.,vol.42,no.D1,pp.D231−D239,2014)。予測されたタンパク質中のタンパク質ドメインは、Pfamデータベースに対してデフォルトのe値1を使用して同定した(Nucleic Acids Res.,vol.42,no.D1,pp.D222−D230,2014)。ゲノム内のプロファージ配列は、PHASTを用いて予測した(Nucleic Acids Res.,vol.39,no.suppl,pp.W347−W352,2011)。プロバイオティクス開発の文脈においては、抗生物質耐性が懸念事項であるため、包括的な抗生物質耐性データベースに対し、BLASTPを使用して、潜在的な耐性遺伝子の検索を行った(Antimicrob.Agents Chemother.,vol.57,no.7,pp.3348−3357,2013)。BLASTPのe値の閾値はカットオフとして1e−5未満に設定し、抗生物質耐性データベース中の遺伝子と60%以上の同一性を有するヒットを分析した。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)Mapperを使用して、L.fermentum PS150の関心のあるいくつかの代謝経路を再構築した。
L.fermentum PS150以外にも、ゲノムが解読されている株が他に4つある。BRIGソフトウェア[BMC Genomics,vol.12,no.1,p.402,2011]の参照株としてL.fermentum PS150を使用して、他の4つの既知の株のゲノムをそれにアライメントさせた。PHASTから予測された9つのプロファージ領域を1つのシークエンスとして連結し、それも参照に対してアライメントした。BLASTN同一性閾値の上限および下限は、それぞれ90%および70%に設定した。
EF−Tuの可変性分析では、235の細菌種から見つかったすべてのタンパク質をシャノンエントロピーの計算の入力として使用した[Bell Syst.Tech.J.,vol.27,no.July 1928,pp.379−423,1948]。シャノンエントロピー式は、タンパク質中のアミノ酸配列の可変性を推定する方法を提供する。所与の複数のタンパク質配列アラインメントについての、アラインメント列番号ごとのシャノンエントロピー(H)は以下のとおり:
Xはアライメント列番号であり、
Nはアミノ酸種の数およびギャップ記号(21)*であり、
piはN中のi番目の記号の頻度であり、
*ギャップを記号として含めるかどうかは場合によること点に注意。この分析では、ギャップは記号と見なされている。
7.1 細菌および上清の調製
Lactobacillus fermentum PS150は、発酵肉ソーセージからの単離株である。培養物は、マレーシア科学大学の微生物株保存機関(ペナン、マレーシア)から入手した。凍結乾燥されたストック培養物を凍結防止剤(ペクチン)の存在下で調製し、乾燥、低温(−20℃)で保存した。実験に使用する前に、凍結乾燥培養物を滅菌de Man Rogosa Sharpe(MRS)(Hi−Media、ムンバイ、インド)ブロス中で3回連続して活性化させた。継代培養の際は、培養物を滅菌MRSブロス中に播種し(10%v/v)、37℃で18時間インキュベートした。無細胞上清(CFS)を3500g、15分間(4℃)の遠心分離によって取得し、10MのNaOHでpH7.0に中和し、それから0.22mmフィルター(Sartorius Stedim、ゲッティンゲン、ドイツ)で濾過して滅菌し、直ちに使用するか、または必要になるまで−20℃で保存した。
神経芽細胞腫細胞株、SH−SY5Y細胞は、韓国の細胞株バンク(KCLB、ソウル、韓国)から購入した。細胞は、10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS;Gibco Life Technologies Inc、グランドアイランド、ニューヨーク州、米国)、100U/mLのペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco Life Technologies Inc、グランドアイランド、ニューヨーク州、米国)を添加した高グルコースダルベッコ変法イーグル培地(DMEM;Difco、デトロイト、ミシガン州、米国)中で維持した。補充培地を含むフラスコに培養物を播種し、5%CO2および95%空気の加湿雰囲気下、37℃で維持した。
SH−SY5Y細胞を1ウェルあたりの播種密度1×105細胞で96ウェル培養プレートに播種した。本試験のすべての細胞は、デキサメタゾン(Dex;Sigma−Aldrich、シュタインハイム、ドイツ)処置まで、10%血清培地中で維持した。細胞を24時間インキュベートし、処置前に培養プレートに付着させた。細菌のCFSの効果を調べるために、無血清培地中、25μMのDexで処置した100μLのSH−SY5Y細胞を含むウェルに20μLの細菌CFSを加えた。3−(4,5ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニル−テトラゾリウムブロマイド(MTT;Sigma−Aldrich、シュタインハイム、ドイツ)の還元を処置の48時間後に分析した。
8.1 生細胞および粗タンパク質調製物
8.1.1 Lactobacillus fermentum PS150生細胞
Lactobacillus fermentum PS150は、マレーシア科学大学産業技術学部バイオプロセス技術学科(ペナン、マレーシア)の微生物株保存機関から入手した。使用に先立ち、培養物をde Man Rogosa Sharpe(MRS)(Biomark、インド)ブロス中、37℃で20時間、3回活性化させた。L.fermentum PS150を一晩培養したものを4℃、8000gで30分間遠心分離して、細胞ペレットを得た。細胞ペレットが得られた後、リン酸緩衝生理食塩水(1.0M、pH7.4)を使用して、細胞ペレットを3回洗浄した。10%(v/v)のペクチン溶液を細胞ペレットに加えてから、−20℃で一晩凍結させる。次に、凍結細胞ペレットを−55℃で一晩凍結乾燥させた。得られた凍結乾燥細胞のCFU/gを、混釈平板法を用いて決定した。その後、凍結乾燥細胞を、9logCFU/ラット/日の投与量で各ラット用に調製した。調製物は、使用するまで−20℃で保存した。
L.fermentum PS150を一晩培養したものを4℃、8000gで30分間遠心分離して、無細胞上清を得た。上清を回収し、3.0M水酸化ナトリウム(NaOH)でpHを7.0に調整した。4℃で攪拌しながら、中和した無細胞上清に80%w/vの硫酸アンモニウムを添加することにより、粗タンパク質を沈殿させ、その後4℃で一晩放置した。沈殿した中和無細胞上清を4℃で30分間、10000gで遠心分離にかけた。得られたペレットを滅菌蒸留水で再懸濁し、0.22μM酢酸セルロースシリンジフィルターで濾過した。それから、得られた粗タンパク質画分を−20℃で一晩凍結させた後、−55℃で一晩凍結乾燥させた。凍結乾燥粗タンパク質は、各ラット用に300mg/kgの投与量で調製される。調製物は、使用するまで−20℃で保存した。
本試験は、マレーシア科学大学(USM)のバータムキャンパスにある先端医科歯科研究所(IPPT)のGLP認定動物研究センターで実施された。30匹の雄ウィスターラット(7〜8週齢、体重180〜200g)は、ペナンのUSMメインキャンパスの動物研究サービスセンターから入手した。到着後、ラットをウッドチップを敷いた標準的なポリプロピレン製靴箱ケージ中に収容し(1ケージあたり3匹)、標準的な実験室条件(12時間照明/12時間夜間サイクル(照明:0700〜1900)、温度19〜25℃、湿度30〜70%RH)下でそっとしておいた。実験期間中、ケージの敷物は2日に1回交換した。受領した動物には、1週間の検疫を課し、動物の病気またはシラミの存在を毎日監視した。動物に病気やシラミがないことを確認した後、慢性軽度ストレスのプロトコルおよび処置の前に、1週間の順化を行った。検疫および順化の期間中、すべてのラットに食物および水を自由に摂取させた。動物の体重は毎週測定し、監視した。
ラットを5つの群(1群あたりラット6匹(n=6))、すなわち、未処置の対照、ネガティブコントロール、ポジティブコントロール、生細胞処置群、およびタンパク質処置群に分けた。未処置対照群を除き、すべてのラットに慢性軽度ストレスプロトコル(表1)を適用した。未処置対照群では、すべての動物にいかなる処置も与えなかった。ネガティブコントロール群では、すべての動物に0.2mlのリン酸緩衝生理食塩水(1.0M、pH7.4)を毎日与えた。ポジティブコントロール群では、0.2mlのリン酸緩衝生理食塩水(1.0M、pH7.4)に懸濁した0.45mg/kgの用量のアルプラゾラム粉末をすべての動物に毎日与えた。生細胞処置群では、すべての動物に毎日9logCFU/ラット/日の生きたL.fermentum PS150を与えた。最後に、タンパク質処置群では、すべての動物に、前述のように調製した凍結乾燥タンパク質(300mg/kgラット/日)を毎日与えた。経口強制飼養は、2.25mmのボールを備えた1.5インチ、20ゲージのステンレス鋼供給針を使用して実施した。慢性軽度ストレスプロトコルは、表1に示されているように、いくつかのストレス要因期間と非ストレス要因期間から構成され、1週間全体を通して合計28日間のスケジュールとした。
28日間の慢性軽度ストレス介入後、すべてのラットを行動評価に付した。評価した行動評価には、モーリス水迷路(MWM)、高架式十字迷路(EPM)、T迷路、強制水泳試験(FST)、オープンフィールド試験(OFT)、およびオブジェクト認識が含まれる。実験はすべて、まばらな光だけで照らされた静かで暗い部屋で行った。
機器のセットアップ
使用したMWMの直径は210cmで、プールの高さは51cm、内面は非反射性であった。迷路を室内に置き、迷路の上にビデオカメラを設置して、動物の行動を捕捉して記録した。水迷路は19〜22℃の範囲の温度の水で満たし、ラットが温度ショック(低体温症または高体温症)を起こさないようにした。それから、直径10〜12cmの無色透明な円形のゴールまたはプラットフォーム(エスケーププラットフォームと呼ばれる)を水面下1〜2cmに沈め、ラットがそれに登るときに動物が転倒しないように安定性を確保した。
MWMのスタート地点は東、西、および南東に指定され、エスケーププラットフォームは北東に沈められる。これら3つのスタート地点を使用して、毎日、連続4回の試験を行った。簡単に説明すると、動物を最初のスタート地点に静かに置き、自由に泳がせてエスケーププラットフォームを探索させた。エスケーププラットフォームの探索を行うために、各動物に最大2分間を与えた。モーリス試験後、すべてのラットを清潔なタオルで完全に乾燥させてから、それぞれのケージに戻した。各動物が脱出位置を特定するのにかかった時間、脱出時間(秒)は、群ごとに6回の反復実験(n=6)の平均±標準誤差として表されている。
機器のセットアップ
高架式十字迷路(EPM)は4つのアーム、壁のない2つのオープンアーム、高さ40cm、長さ50cm、幅15cmの2つのクローズドアームから構成される。迷路の各アームには、高さ70cmの硬い金属製の脚が付いている。EPMは、明るい照明のある部屋の部屋の中央近くに設置した。オープンアームとクローズドアームの両方の照明レベルは同様に維持した。高架式十字迷路の上にビデオカメラを設置して、動物の行動を捕捉し、記録した。
動物をケージから取り出し、迷路から壁に向かって直面しているEPMの中央(つまり、オープンアームとクローズドアームの接合部)に置いた。EPM上での自由探索のために、各動物に5分間与えた。評価中、次の動物にアクセスする前にEPMを洗浄し、70%エタノールで乾燥させた。オープンアームの侵入数とオープンアームで過ごされた時間を観察し、時間を計り、記録した。オープンアームへの侵入数とオープンアームで過ごされた期間を記録し、群ごとに6回の反復実験からの平均±標準誤差として表示した(n=6)。
機器のセットアップ
強制水泳試験(FST)は、深さ68cm、直径40cmの黒い不透明な水泳用シリンダーにおいて実施した。シリンダーに水を30cmの深さまで満たし、ラットの脱出を防ぐために上部にスペースを残した。試験中の動物の行動を捕捉して記録するために、ビデオカメラを水泳用シリンダーの上に設置した。
各動物を水泳用シリンダー中の水に優しく入れ、5分間与えて、水泳用シリンダー中で自由に泳がせた。試験中、動物の行動を観察し、記録した。評価期間中、FST後にすべてのラットを清潔なタオルで完全に乾燥させてから、それぞれのケージに戻した。ラットの不動の期間を計測し、その後、群ごとに6回の反復実験(n=6)からの平均±標準誤差として表示した。
機器のセットアップ
明るい照明を備えた実験室の中央に配置した高さ32cm、幅38cm、長さ52cmの大きさの不透明な長方形の箱を使用して、オープンフィールド試験を実施した。動物の行動を捕捉するために、長方形の箱の上にビデオカメラを設置した。
各動物をケージからOFTに優しく移し、箱の中を自由に探索できるようにした。5分間のオープンフィールド試験中にラットの探索および不動の期間を観察した。評価期間中、各試験の合間中に箱を70%エタノールで洗浄した。探索および不動の期間は、群ごとに6回の反復実験(n=6)からの平均±標準誤差として表示した。
機器のセットアップと評価
データはすべて、IBM SPSS Statistics 20.0(IBM Co.、アーモンク、ニューヨーク州、米国)によって統計的に分析した。群平均間の統計的差異を分析するために、一元配置分散分析を実施した。有意性の統計的レベルはα=0.05に設定し、平均の多重比較はTukey検定によって評価した。特に明記しない限り、すべてのデータは3つの独立した実験の平均値(n=6)として示した。
実験の終わりに、二酸化炭素窒息を使用してラットを屠殺した直後に、血液サンプルを心臓穿刺により採取し、EDTAコーティングチューブに移した。採血後まもなく、断頭して脳を取り出した。ELISAおよび過酸化水素分析に使用した脳組織サンプルは、氷冷PBS中に保存した。
脳サンプルの均質化
4℃の1×リン酸緩衝生理食塩水(pH7.4)中に保存した抽出ラット脳を解剖の直後に処理した。脳組織サンプルを3つの領域(小脳、大脳、海馬)に分割した。それから、切片化した脳組織サンプルを氷冷条件下、70〜100Hzで10分間均質化した。均質化したサンプルはすべて、使用まで−20℃で保存した。
抗凝固性EDTAチューブ中に採取した血液を室温で10〜20分間インキュベートした後、3000rpmで20分間遠心分離した。上清を血漿サンプルとして回収し、1.5mlのマイクロ遠心チューブ中に保存し、すぐに分析できるように4℃に保った。余分な血漿サンプルは、使用まで−20℃で保管した。
酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)を実施して、いくつかのサイトカイン、重要な神経伝達物質、および神経発生に関連するバイオマーカーを定量化した。ELISAは、製造元の指示(R&D System Inc、米国)に従って実施した。
脳ホモジネートサンプル中の過酸化水素レベルは、製造元のプロトコルに従って、Amplex Redアッセイキット(Molecular Probes Inc.、ユージーン、オレゴン州、米国)を用いて評価した。
これらすべてのポジティブな発見に続いて、L.fermentum PS150のタンパク質画分を単離し、さらに特定した。タンパク質画分は、硫酸アンモニウム沈殿によって予備精製し、それから3段階のクロマトグラフィー処置により回収した。
粗タンパク質画分は、上に述べたようにして抽出した(8.1.2)。それから、粗タンパク質画分を75%アセトンを使用して脱塩し、遠心分離(7000g、30分、4℃)により塩を除去し、これを3回繰り返した。回収したペレットを脱イオン水に溶解させた。タンパク質含有量は、BSAを標準として用いて、Bradfordアッセイ(Bio−Rad、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国)を使用して推定した。
予め調合したHEPESランニングバッファーと酢酸トリスサンプルバッファー(AMR Incorporated)を含むGELFREE(商標)8100 Fractionation System(Expedeon、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国)を製造業者の指示に従って使用して、分子量に基づいてタンパク質を複数の画分に分離した。L.fermentum PS150タンパク質をサンプルバッファーに溶解して、質量範囲60〜300kDaのタンパク質を分離するように設計された5%酢酸トリスカートリッジの個々のローディングチャンバーに添加した。事前に定義した間隔で機器を自動的に一時停止させ、液体画分をピペットで除去した。それから、一連の操作を再開し、次のサイズに基づく画分を回収するプロセスを継続した。すべての画分が回収されるまで、このプロセスを繰り返した。
GELFREE(商標)8100 Fractionation Systemから12個の画分を回収した後、個々の各タンパク質画分の分子サイズを推定するため、10%SDS−PAGE(Bio−Rad)を使用して標準的な1DEを実施した。タンパク質の分離は、Criterion電気泳動装置(Bio−Rad)を使用して、トリス/グリシン/SDSランニングバッファー(Bio−Rad)中、110Vで80分間行った。ゲル中のタンパク質をクーマシーブリリアントブルータンパク質ゲル染料(Molecular Probes、ユージーン、オレゴン州、米国)を使用して染色し、タンパク質のバンドをChemiDoc XRSカメラとQuantity One 1D分析ソフトウェア(Bio−Rad)を使用して可視化した。
HiTrap Q HPカラムでの逆相高速液体クロマトグラフィー(RP−HPLC)によるタンパク質画分の最終精製工程。溶出は、溶媒A(25mMトリスHCl)により、0.8mL/分の流量で10分間行った。次に、0%〜100%の溶媒B(1MのNaClを含む25mMトリスHCl)の直線勾配溶出を70分間行った。溶出したピークを個別に回収し、上記(7.3)のようにして、デキサメタゾンに対する神経保護活性を確認した。
ペプチドの同定は、マレーシア科学大学の先進毒物分析サービス施設センターで遂行された。RP−HPLCからの目的の画分(0.2mg)を変性バッファー(6MグアニジンHCl/25mM重炭酸アンモニウム、pH8.5)で可溶化し、それから、1mg/mlのDTT/25mM重炭酸アンモニウム(新たに調製)をタンパク質溶液に添加し、55℃で30分間インキュベートした。その後、1mg/mLヨードアセトアミド/25mM重炭酸アンモニウム(新たに調製)を添加し、それから、アルミホイルで覆って、55℃で15分間インキュベートした。それから、15kDa分子カットオフのスピンカラムを3回(各回30分)使用して、還元し、アルキル化したタンパク質サンプルを25mM重炭酸アンモニウムでバッファー交換した。それから、トリプシンをサンプルに加え、37℃で18時間インキュベートした。凍結乾燥する前に、サンプルにギ酸を加えた。サンプルをMALDI−TOF質量分析で分析し、質量ピークを特定した。すべての可能な断片を生成し、それらに対応する分子量とペプチド配列を同定した。その後、PEAKS studioバージョン6.0を使用してデータ分析を実行し、L.fermentum PS150のゲノム中にコードされているすべてのタンパク質について、機能アノテーションのデータベースを使用して、潜在的な生理活性ペプチド配列の選択を行った。
L.fermentum PS150の伸長因子tu(EF−Tu)の3Dモデルは、Swiss−MODELを用いて構築した(Schwede 2003)。2つの理由から、Thermus thermophilusのEF−Tu(PDB ID:2C77)をテンプレートとして使用した:1)Protein Data Bank(PDB)には利用可能なlactobacillus由来EF−Tuの結晶構造が無いため、また、2)データベース中でT.thermophiles由来のEF−Tuが、L.fermentum PS150のEF−Tuに対して、最も高い配列同一性(74.81%)を示したため。インターフェロン−γ(IFNγ)およびインターフェロン−γ受容体(IFNγR;PDB ID:1FYH;解像度2.04A)の結晶構造は、Protein Data Bank(PDB)から入手した。さらに、IFNγ39(IFNγRの反応性を阻害することが知られているIFNγの最初の39個のアミノ酸に由来する合成ペプチド)もまた、本試験においてポジティブコントロールとして供するためにIFNγの結晶構造から得た。
Cluspro 2.0:タンパク質−タンパク質ドッキングジョブの登録の前に、すべての水分子とリガンドを除去した。Cluspro 2.0:タンパク質−タンパク質ドッキング(抗体モード)では、IFNγとIFNγRをそれぞれリガンドと受容体として登録した。生成されたすべてのコンフォメーションをBIOVIA Discovery Studio 4.5(Humphrey et al.1996)でさらに分析し、それらの二乗平均平方根偏差(RMSD)値を評価した。最も低い結合自由エネルギー、最も低いRMSD値、および最も多く存在するクラスターを有するコンフォメーションを、さらなる分析で比較するためのベンチマークコントロールとして使用した。選択したコンフォメーションのIFNγとIFNγRの相互作用性残基(TYR49、TRP82、GLU101、HIS205、VAL206、TRP207;Randal&Kossiakoff,2001)との間の相互作用をLigplot+ v1.4.5(Laskowski&Swindells,2011)を使用して可視化した。
Cluspro 2.0:タンパク質−タンパク質ドッキングジョブの登録の前に、すべての水分子とリガンドを除去した(Kozakov et al.,2013)。Cluspro 2.0:タンパク質−タンパク質ドッキング(抗体モード)では、IFNγ39とIFNγRをそれぞれリガンドと受容体として登録した。結合自由エネルギーが最も低く、最も多く存在するクラスターを有するコンフォメーションを使用して、以前に完成したベンチマークコントロールと比較した。選択したコンフォメーションのIFNγ39とIFNγRの相互作用性残基(TYR49、TRP82、GLU101、HIS205、VAL206、TRP207;Randal&Kossiakoff,2001)との間の相互作用をLigplot+ v1.4.5(Laskowski&Swindells,2011)を使用して可視化した。
Cluspro 2.0:タンパク質−タンパク質ドッキングジョブの登録の前に、すべての水分子とリガンドを除去した。Cluspro 2.0:タンパク質−タンパク質ドッキング(抗体モード)では、EF−TuとIFNγRをそれぞれリガンドと受容体として登録した。結合自由エネルギーが最も低く、最も多く存在するクラスターを有するコンフォメーションを使用して、以前に完成したベンチマークコントロールと比較した。選択したコンフォメーションのEF−TuとIFNγRの相互作用性残基(TYR49、TRP82、GLU101、HIS205、VAL206およびTRP207)との間の相互作用をLigplot+ v1.4.5(Laskowski&Swindells,2011,J.Chem.Inf.Model,51: 2778−2786)を使用して可視化した。
本発明において使用されるPS150の糖利用をAPI 50 CHLキット(bioMerieux、フランス)を使用して調査した結果を表2に示す。発酵試験は、PS150がLactobacillus fermentumと同様な生化学的特性を有することを指し示している。
TCAGGATGAACGCCGGCGGTGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGCGTTGGCCCAATTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAGCGGGGGACAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACGTTGTTCGCATGAACAACGCTTAAAAGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAGTGCAGGCGGTTTTCTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGAAACTGGATAACTTGAGTGCAGAAGAGGGTAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGACTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCCAACCCTAGAGATAGGGCGTTTCCTTCGGGAACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCGAACTCGCGAGGGCAAGCAAATCTCTTAAAACCGTTCTCAGTTCGGACTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGAGAACCTGCGGTTG
AAGACACCTTCTACGTGACCCCGTCTGTTTTGATGCGGACCCAAACGTCGCCAATGCAGGCCCGGATGCTGGAACAACACGACTTCTCCAAGGGGCCGTTGAAGATGATCTCACCGGGGAAGGTTTACCGCCGCGACACCGATGACGCTACCCACAGCCACCAATTCCACCAGGTTGAAGGAATCGTGGTCGGTGAACACGTCACGATGGCAGATTTAAAGGGGACCCTAGAGGCAGTGGCCCAAAACCTGTTTGGCGACCAGCTCAAGGTGCGTCTGCGCCCGAGTTACTTCCCGTTCACGGAACCGTCCGTCGAGGCCGACATCACTTGCTTTAATTGCCTGGGGGCCGGTTGCTCAATCTGTAAGGGGACTGGTTGGATCGAGGTGTTGGGGGCCGGC
細菌株間の染色体比較は、特定の株に特有のゲノムの特徴を明らかにし得る。L.fermentum PS150の染色体を別の4つの株、Lactobacillus fermentum 3872、Lactobacillus fermentum CECT 5716、Lactobacillus fermentum IFO 3956およびLactobacillus fermentum F6の全ゲノムと比較した。L.fermentum PS150の予測されるプロファージは連結して、比較に含めた。予想通り、新たなゲノムはプロファージ領域などにおいて明らかに異なっている。
ラットの行動の分析を4週間の慢性軽度ストレスプロトコルの後に実施した。高架式十字迷路は、げっ歯類で広く使用されている行動アッセイであり、薬剤とステロイドホルモンの抗不安効果の評価について実証されている。実験で使用した高架式十字迷路は、4本のアーム(2本のオープンアームと2本のクローズドアーム)で構成され、地面から50cmの高さに持ち上げられていた。ラットを迷路の4本のアームの接合部に、オープンアームに向けて置き、各アームの進入/滞在時間を5分間記録した。オープンアームでの活動(滞在時間および/または侵入)の増加は、抗不安行動を反映する。L.fermentum PS150およびタンパク質画分処置群は、ネガティブコントロール群と比較して、オープンアームへのラットの侵入数が有意に多いが(P<0.05;図1.(a))、未処置対照群、ポジティブコントロール群(抗鬱薬処置)、L.fermentumPS150処置群、およびタンパク質画分処理群の間に有意差はなかった(図1.(a))。さらに、L.fermentum PS150およびタンパク質画分で処置した際のクローズドアームで過ごした時間とオープンアームで過ごした時間の比率は、ネガティブコントロール群と比較して有意に低く(P<0.05;図1.(b))、一方、未処置対照群、ポジティブコントロール群(抗鬱薬処置)、L.fermentum PS150処置群、およびタンパク質画分処置群の間には、有意差は認められなかった(図1(b))。結果は、L.fermentum PS150およびL.fermentum PS150のタンパク質画分が、慢性軽度ストレスに起因する不安行動を正常化し、元の非不安状態に戻し得ることを指し示している。加えて、L.fermentum PS150およびタンパク質画分群はまた、アルプラゾラムと同様の抗不安効果を示し、市販の抗鬱薬と同様の効果も示した。
ストレスがしばしば、記憶やその他の認知機能に悪影響を与えることが十分に文書化されている。認知パフォーマンスを評価するために、モーリス水迷路を使用して記憶保持を評価し、新規オブジェクト認識テストを使用して学習および認識記憶にアクセスした。
これらすべてのポジティブな発見に続いて、さらにL.fermentum PS150のタンパク質画分を単離し、特定した。タンパク質画分は、硫酸アンモニウム沈殿によって予備精製し、それから3段階のクロマトグラフィー処置により回収した。HiTrap Q HPカラムでの逆相高速液体クロマトグラフィー(RP−HPLC)によるタンパク質画分の最終精製ステップは、5%、15%、20%、25%、30%、50%、55%、60%、および90%の溶媒B(1MのNaClを含む25mMトリスHCl)で溶出される9つの主要なピークの存在を明らかした(図10)。溶出されたピーク(それぞれ画分A、B、C、D、E、F、G、H、およびIと命名)を個別に回収し、デキサメタゾンに対する神経保護活性を確認した。
ATGGCAGAAAAAGAACATTATGAACGTACTAAGCCCCACGTTAACATCGGTACTATTGGCCACGTTGACCACGGGAAGACTACTTTAACCGCAGCTATCACCAAGGTATTGGCCGCTAAGGGCCTTGCCAAGGCAGAAGACTACTCTGATATCGATGCTGCTCCAGAAGAAAAGGAACGTGGTATCACTATCAACACTGCCCACGTTGAATACGAAACGGAAAAGCGTCACTACGCTCACATCGACGCTCCAGGGCACGCCGACTACGTTAAGAACATGATCACTGGGGCCGCTCAAATGGACGGTGCGATCTTAGTTGTTGCCGCAACTGATGGTCCGATGCCACAAACTCGTGAACACATCCTTCTGGCTCGCCAGGTCGGTGTTGAATACATCGTTGTCTTCCTTAACAAGACTGACCTTGTTGACGATGACGAACTGGTTGACTTAGTTGAAATGGAAGTTCGTGACCTTCTGTCCGAATACGACTTCCCTGGCGATGATGTTCCGGTTGTTCGTGGGTCCGCTCTTAAGGCCCTCGAAGGTGACCCAGAACAAGAACAAGTTGTTCTTCACCTTCTGGACGTCGTTGACGAATACATCCCAACTCCAAAGCGTCCTACTGACAAGCCATTCATGATGCCTGTCGAAGACGTCTTCACTATCACTGGTCGTGGTACTGTTGCTTCTGGTCGTATCGACCGTGGTACTGTTAAGATCGGTGACGAAGTTGAAATCGTTGGTTTGAAGGAAGACGTTATCAAGTCCACTGTTACCGGTGTTGAAATGTTCCACAAGACCCTTGATCTTGGGGAAGCCGGGGACAACGTCGGTGTCCTTTTACGTGGGGTTTCTCACGACCAAATCGAACGTGGTCAAGTTCTGGCAGAACCAGGCTCCATCCAAACGCACAAGCAATTCAAGGGTGAAGTCTACGTTATGACCAAGGAAGAAGGGGGCCGTCACACGCCATTCTTCTCCAACTACCGCCCACAATTCTACTTCCACACTACTGACGTTACTGGTACCATTGAACTCCCAGATGGTGTTGAAATGGTTATGCCTGGTGACAACGTTACCTTCACTGTTGAACTGCAAAAGCCAGTTGCCCTTGAAAAGGGTCTGAAGTTCACCATCCGTGAAGGTGGTCACACTGTTGGTGCCGGTGTGGTATCCGAAGTGCTCGACTA
シャノンエントロピーを使用して、EF−Tuタンパク質の可変性を推定した。21文字の系において、Hの範囲は0(つまり、高度に保存、アライメント列中に1文字のみ)から4.392(つまり、21文字すべてが等しく存在)である。タンパク質の3つの主要なドメイン(GTP EFTU、GTP EFTU D2、およびGTP EFTU D3)を有するタンパク質の全長にわたって、乳酸桿菌(Lactobacillus)属の235種のバクテリアと25種の細菌に関して、エントロピーを推定した。
BALB/cマウスに1日1回、連続14日間、109CFU/マウスのL.fermentum PS150を経口投与した。対照のマウスにはPBSのみを与えた動物を用いて、並行して試験した。ポジティブコントロール群には、DIPH−HCL(ジフェンヒドラミン塩酸塩、20mg/kg)を陽性対照として与えた。14日間の実験期間中、体重(BW)を毎日測定した。14日目に、ペントバルビタール誘発睡眠の持続時間をテストするため、PBS、PS150およびDIPH−HCLの胃内(i.g.)投与の30分後、ペントバルビタールナトリウム(50mg/kg)を各マウスに腹腔内(i.p.)注射した。各マウスの睡眠潜時と睡眠時間を観察した。ペントバルビタール注射から立ち直り反射の喪失までの経過時間を睡眠潜時として記録し、立ち直り反射の喪失から回復までの経過時間を睡眠時間として記録した。図13は、ペントバルビタール誘発睡眠試験における睡眠潜時(a)および睡眠時間(b)に対するPS150の効果を示している。結果は、PS150が睡眠潜時を短縮し、睡眠時間を延長できることを示している。
Claims (18)
- ブダペスト条約の下、2016年6月6日にDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託され、アクセッション番号DSM 32323が付与された、Lactobacillus fermentum PS150である、単離された乳酸菌(LAB)。
- 配列番号1〜3に示される核酸配列のいずれかを有する、請求項1に記載の単離されたLAB。
- 対象における気分障害もしくは神経学的状態を改善するため、および神経細胞のアポトーシスもしくは神経変性に関連する疾患を治療もしくは予防するための組成物であって、請求項1または2に記載のLAB細胞のタンパク質画分を含み、 かつ、配列番号4のアミノ酸配列を有するEF−Tuタンパク質を含む、組成物。
- 請求項1もしくは2に記載のLactobacillusfermentum PS150から成るLAB細胞、または、請求項1もしくは2に記載のLABのタンパク質画分を含み、かつ、配列番号4のアミノ酸配列を有するEF−Tuタンパク質、および食用担体もしくは薬学的に許容される担体を含む組成物であって、発酵ソーセージではない、組成物。
- 栄養製品、栄養補助食品、食品または医薬品である、請求項4に記載の組成物。
- 粉末、懸濁液、顆粒、錠剤、丸薬、カプセル、飲料、または乳製品である、請求項4に記載の組成物。
- 対象における気分障害もしくは神経学的状態を改善するため、および神経細胞のアポトーシスもしくは神経変性に関連する疾患を治療もしくは予防するための医薬の製造における、請求項1もしくは2に記載のLAB細胞、配列番号4のアミノ酸配列を有するEF−Tuタンパク質、請求項3に記載のタンパク質画分、または請求項4に記載の組成物の使用。
- LAB細胞が約105から約1013コロニー形成単位(cfu)の範囲の量である、請求項7に記載の使用。
- LAB細胞が約106から約1012cfuの範囲の量である、請求項7に記載の使用。
- タンパク質画分が約15mg/kgから約500mg/kgの範囲の量である、請求項7に記載の使用。
- タンパク質画分が約40mg/kgから約300mg/kgの範囲の量である、請求項7に記載の使用。
- EF−Tuタンパク質が約15μg/kgから約500μg/kgの範囲の量である、請求項7に記載の使用。
- 気分障害および神経学的状態が、不安、鬱、ストレス、睡眠障害、認知機能低下、認知機能障害(軽度認知機能障害(MCI)を含む)、記憶力低下、一般的な想起の問題、認知障害、または神経変性疾患である、請求項7に記載の使用。
- ストレスが慢性的な軽度のストレスである、請求項13に記載の使用。
- 気分障害および神経学的状態が、不安、鬱、ストレス、または睡眠障害である、請求項7に記載の使用。
- 神経変性疾患がアルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、認知症、筋萎縮性側索硬化症、脳卒中または統合失調症である、請求項13に記載の使用。
- 神経細胞のアポトーシスまたは神経変性に関連する疾患が、脳卒中、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ピック病、クロイツフェルトヤコブ病、パーキンソンALS認知症複合、ウィルソン病、多発性硬化症、進行性核上性麻痺、神経障害性疼痛関連双極性障害、皮質基底核変性症、統合失調症、注意欠陥多動性障害(ADHD)、認知症、筋萎縮性側索硬化症、網膜疾患、てんかん、卒中、一過性虚血発作、心筋虚血、筋虚血、脳への血流の長期の不通に関する外科的手法により引き起こされる虚血、頭部外傷、脊髄外傷、低酸素、または鬱である、請求項7に記載の使用。
- LAB細胞、EF−Tuタンパク質、タンパク質画分または組成物が、インドールアミン2,3−ジオキシゲナーゼ(IDO)の発現を低下させるか、トリプトファンのキヌレニンへの代謝回転速度を下げるか、セロトニンレベルを増やすか、または血漿コルチコステロン濃度を下げることができる、請求項7に記載の使用。
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