CN110475853A

CN110475853A - 新颖乳酸菌及其应用

Info

Publication number: CN110475853A
Application number: CN201780083423.6A
Authority: CN
Inventors: 梁敏慈; 蔡英杰; 马修·志远·颜; 萨维巴·雅赫亚; 蔡思冰; 王家欣; 刘伟义; 许智捷; 李一山
Original assignee: Bened Biomedical Co Ltd
Current assignee: Bened Biomedical Co Ltd
Priority date: 2017-01-13
Filing date: 2017-01-13
Publication date: 2019-11-19
Also published as: EP3568460A1; WO2018129722A1; US11434468B2; JP6986288B2; US20200087741A1; EP3568460A4; JP2020505031A

Abstract

本发明涉及一种益生菌及包含其之组合物。特定言之，本发明涉及一种新颖乳酸菌及其于改善情感障碍或神经病况及治疗或预防与神经元的细胞凋亡或神经退化有关的疾病方面之特定用途。

Description

新颖乳酸菌及其应用

技术领域

本发明系关于一种益生菌及包含其之组合物。特定言之，本发明系关于一种新颖乳酸菌及其于改善情感障碍或神经病况及治疗或预防与神经元的细胞凋亡或神经退化有关的疾病方面之特定用途。

背景技术

发酵食品含有各种有用的细菌，包括乳酸菌(LAB)。各种LAB菌株是用于制造发酵食物，包括乳品、面包、蔬菜及其他食用植物材料。LAB为一般用于生产发酵食物之革兰氏(Gram)阳性菌群组。已广泛地研究LAB于膳食及临床应用中的效益。LAB得益于其发酵活动期间之低pH及所产生之发酵产物抑制腐败菌生长之作用而用作用于保存食物的发酵剂。为此，LAB已用于自乳品制备多种不同食品(诸如奶酪(cheese)、酸乳(yogurt)及其他发酵乳制品)。受到大量关注的是，已发现LAB展示对人及动物在消化时之有价值的性质。特定言之，已发现乳杆菌属或双叉杆菌属(Bifidobacterium)之特定菌株能够定殖肠黏膜及辅助维持人及动物的健康。抗炎活性及免疫调节活性为LAB之熟知特征。US 7875421涉及约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)菌株之DNA序列之用途，特定言之，关于其用于阐明微生物与其所定殖的寄主之相互作用，及此外用于阐明由所述菌株所展示之益生菌性质的基础之基因组序列。

全球呈增长趋势之精神病症已经排在失能的主要原因。情感障碍为常见的慢性精神病。某人可被视作罹患情感障碍(mood disorder)(亦称为情感性障碍(affectivedisorder))，假如其情感的特征在于强度及/或类型均持续极端化。睡眠紊乱为具有急性情感障碍发作之患者的最常见症状之一，及具有情感障碍之患者展示甚至在缓解期间高于一般群体之睡眠紊乱率(Psychiatr Clin North Am.2006年12月；29(4):1009-32)。

参与压力反应之调节的主要生理系统之一为下视丘-垂体肾上腺。已知各种有压力的刺激来活化下视丘-垂体-肾上腺轴从而释放糖皮质激素于循环中。糖皮质激素为身体对压力反应之关键整合激素介体并推测于压力促进疾病之能力中起作用。乳酸菌已经由文件明确记录其在维持健康肠道方面之作用，然而，于肠外发生胃肠微生物相在缓解病症中之作用受到大量关注。

发明内容

本发明涉及一种新颖乳酸菌(LAB)(发酵乳杆菌PS150(Lactobacillus fermentumPS150))、及由所述LAB产生之生物活性蛋白质及其在改善情感障碍或神经病况及治疗或预防神经退化性疾病方面之有利效果。

本发明提供一种经单离之LAB，其为具有如经SEQ ID NO:1至3显示之核酸序列中任一者之发酵乳杆菌PS150(PS150)。本发明亦提供一种经单离之LAB，其已在2016年6月6日由德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)依布达佩斯条约(Budapest Treaty)寄存，且所给寄存编号为DSMZ 32323。

本发明亦提供一种蛋白质部分，其是从PS150细胞的细胞外蛋白质获得，且包含具有SEQ ID NO:4之氨基酸序列的EF-Tu蛋白质。出乎意料地，本发明首先确定EF-Tu蛋白质可有效改善情感障碍、神经病况及神经退化性疾病。

本发明亦提供一种组合物，其包含PS150细胞、本发明EF-Tu蛋白质或本发明PS150之蛋白质部分及视需要之食用载剂或医药上可接受之载剂。本发明组合物可呈适于投与(特定言之经口投与)之任何形式。所述任何形式包括例如固体、半固体、液体及粉末。

本发明亦提供一种本发明PS150细胞或包含其之组合物之用途，其用于制造用于改善情感障碍或神经病况，或治疗或预防与神经元的细胞凋亡或神经退化有关的疾病的制剂。在一个实例中，这些PS150细胞的量在约10⁵至约10¹³个菌落形成单位(cfu)范围内。本发明进一步提供一种本发明蛋白质部分或包含其之组合物之用途，其用于制造用于改善情感障碍或神经病况，或治疗或预防与神经元的细胞凋亡或神经退化有关的疾病的制剂。在一个实例中，所述蛋白质部分的量在约15mg/kg至约500mg/kg范围内。本发明进一步提供一种EF-Tu蛋白质或包含其之组合物之用途，其用于制造用于改善情感障碍或神经病况，或治疗或预防与神经元的细胞凋亡或神经退化有关的疾病的制剂。

情感障碍或神经病况之实例包括(但不限于)焦虑、抑郁、压力及脑认知。

图式简单说明

图1(a)及(b)显示进行慢性温和压力方案4周之后使用高架十字迷宫评估大鼠之焦虑行为；(a)高架十字迷宫上的大鼠中所观察到的进入开放臂中的次数；(b)闭合臂上所花时间与开放臂上所花时间之比。未治疗的对照组，其中大鼠以不受干扰方式留在笼中；阴性对照，其中使大鼠接受慢性温和压力并喂食200μL磷酸盐缓冲盐水(PBS；pH 7.4)；阳性对照，其中使大鼠接受慢性温和压力并提供200μL含有0.045mg/kg阿普唑仑(alprazolam)之PBS；发酵乳杆菌PS150组，其中使大鼠接受慢性温和压力并提供200μL含有1X 10⁹cfu活发酵乳杆菌PS150之PBS；发酵乳杆菌PS150之蛋白质部分组，其中使大鼠接受慢性温和压力并提供200μL含有300mg/kg蛋白质之PBS。误差杠表示平均值标准误差；n＝6。^ab不同组间大鼠进入EPM开放臂中的次数(a)及闭合臂上所花时间与开放臂上所花时间之比(b)之显著差异；P＜0.05。

图2显示于进行慢性温和压力方案4周之后使用空场测试测定大鼠之焦虑有关行为。于5分钟空场测试期间观察大鼠的探索及保持不动的持续时间。未治疗的对照组，其中大鼠以不受干扰方式留在笼中；阴性对照，其中使大鼠接受慢性温和压力并喂食200μL磷酸盐缓冲盐水(PBS；pH 7.4)；阳性对照，其中使大鼠接受慢性温和压力并提供200μL含有0.045mg/kg阿普唑仑之PBS；发酵乳杆菌PS150组，其中使大鼠接受慢性温和压力并提供200μL含有1X 10⁹cfu活发酵乳杆菌PS150之PBS；发酵乳杆菌PS150之蛋白质部分组，其中使大鼠接受慢性温和压力并提供200μL含有300mg/kg蛋白质之PBS。误差杠表示平均值标准误差；n＝6。^ab不同组间大鼠之探索及保持不动的持续时间之显著差异；P＜0.05。

图3显示于进行慢性温和压力方案4周之后使用强迫游泳测试于大鼠中所观察到的抑郁有关行为之测量。记录于5分钟强迫游泳测试期间大鼠花在保持不动的时间。未治疗的对照组，其中大鼠以不受干扰方式留在笼中；阴性对照，其中使大鼠接受慢性温和压力并喂食200μL磷酸盐缓冲盐水(PBS；pH 7.4)；阳性对照，其中使大鼠接受慢性温和压力并提供200μL含有0.045mg/kg阿普唑仑之PBS；发酵乳杆菌PS150组，其中使大鼠接受慢性温和压力并提供200μL含有1X 10⁹cfu活发酵乳杆菌PS150之PBS；发酵乳杆菌PS150之蛋白质部分组，其中使大鼠接受慢性温和压力并提供200μL含有300mg/kg蛋白质之PBS。误差杠表示平均值标准误差；n＝6。^ab不同组间大鼠花在保持不动上的时间之显著差异；P＜0.05。

图4显示进行慢性温和压力方案4周之后于大鼠中所观察到的血浆皮质酮含量之浓度。未治疗的对照组，其中大鼠以不受干扰方式留在笼中；阴性对照，其中使大鼠接受慢性温和压力并喂食200μL磷酸盐缓冲盐水(PBS；pH 7.4)；阳性对照，其中使大鼠接受慢性温和压力并提供200μL含有0.045mg/kg阿普唑仑之PBS；发酵乳杆菌PS150组，其中使大鼠接受慢性温和压力并提供200μL含有1X 10⁹cfu活发酵乳杆菌PS150之PBS；发酵乳杆菌PS150之蛋白质部分组，其中使大鼠接受慢性温和压力并提供200μL含有300mg/kg蛋白质之PBS。误差杠表示平均值标准误差；n＝6。^abcd不同组间大鼠之皮质酮含量之显著差异；P＜0.05。

图5显示进行慢性温和压力方案4周之后大鼠之血浆TNFα及介白素-10含量之比。未治疗的对照组，其中大鼠以不受干扰方式留在笼中；阴性对照，其中使大鼠接受慢性温和压力并喂食200μL磷酸盐缓冲盐水(PBS；pH 7.4)；阳性对照，其中使大鼠接受慢性温和压力并提供200μL含有0.045mg/kg阿普唑仑之PBS；发酵乳杆菌PS150组，其中使大鼠接受慢性温和压力并提供200μL含有1X 10⁹cfu活发酵乳杆菌PS150之PBS；发酵乳杆菌PS150之蛋白质部分组，其中使大鼠接受慢性温和压力并提供200μL含有300mg/kg蛋白质之PBS。误差杠表示平均值标准误差；n＝6。^abcd不同组间大鼠之血浆TNFα及介白素-10含量之比之显著差异；P＜0.05。

图6(a)及(b)显示进行慢性温和压力方案4周之后使用莫氏水迷宫测试(Morriswater maze)及新物件识别测试所观察到的大鼠之记忆及认知功能评估；(a)莫氏水迷宫测试中大鼠之逃避潜伏期；(b)新物件识别测试中大鼠之识别指数。未治疗的对照组，其中大鼠以不受干扰方式留在笼中；阴性对照，其中使大鼠接受慢性温和压力并喂食200μL磷酸盐缓冲盐水(PBS；pH 7.4)；阳性对照，其中使大鼠接受慢性温和压力并提供200μL含有0.045mg/kg阿普唑仑之PBS；发酵乳杆菌PS150组，其中使大鼠接受慢性温和压力并提供200μL含有1X 10⁹cfu活发酵乳杆菌PS150之PBS；发酵乳杆菌PS150之蛋白质部分组，其中使大鼠接受慢性温和压力并提供200μL含有300mg/kg蛋白质之PBS。误差杠表示平均值标准误差；n＝6。^ab不同组间大鼠之逃避潜伏期(a)及识别指数(b)之显著差异；P＜0.05。

图7(a)、(b)及(c)显示进行慢性温和压力方案4周之后大鼠之血浆吲哚胺-2,3-二加氧酶(IDO)(a)、色胺酸(b)及犬尿胺酸(c)。未治疗的对照组，其中大鼠以不受干扰方式留在笼中；阴性对照，其中使大鼠接受慢性温和压力并喂食200μL磷酸盐缓冲盐水(PBS；pH7.4)；阳性对照，其中使大鼠接受慢性温和压力并提供200μL含有0.045mg/kg阿普唑仑之PBS；发酵乳杆菌PS150组，其中使大鼠接受慢性温和压力并提供200μL含有1X 10⁹cfu活发酵乳杆菌PS150之PBS；发酵乳杆菌PS150之蛋白质部分组，其中使大鼠接受慢性温和压力并提供200μL含有300mg/kg蛋白质之PBS。误差杠表示平均值标准误差；n＝6。^abc不同组间血浆IDO(a)、色胺酸(b)及犬尿胺酸(c)浓度之显著差异；P＜0.05。

图8显示慢性温和压力方案4周之后大鼠之脑血清素浓度。未治疗的对照组，其中大鼠以不受干扰方式留在笼中；阴性对照，其中使大鼠接受慢性温和压力并喂食200μL磷酸盐缓冲盐水(PBS；pH 7.4)；阳性对照，其中使大鼠接受慢性温和压力并提供200μL含有0.045mg/kg阿普唑仑之PBS；发酵乳杆菌PS150组，其中使大鼠接受慢性温和压力并提供200μL含有1X 10⁹cfu活发酵乳杆菌PS150之PBS；发酵乳杆菌PS150之蛋白质部分组，其中使大鼠接受慢性温和压力并提供200μL含有300mg/kg蛋白质之PBS。误差杠表示平均值标准误差；n＝4。^ab不同组间脑血清素浓度之显著差异；P＜0.05。

图9(a)及(b)显示进行慢性温和压力方案4周之后大鼠全脑之单胺氧化酶-A(MAO-A)(a)及过氧化氢(b)之浓度。未治疗的对照组，其中大鼠以不受干扰方式留在笼中；阴性对照，其中使大鼠接受慢性温和压力并喂食200μL磷酸盐缓冲盐水(PBS；pH 7.4)；阳性对照，其中使大鼠接受慢性温和压力并提供200μL含有0.045mg/kg阿普唑仑之PBS；发酵乳杆菌PS150组，其中使大鼠接受慢性温和压力并提供200μL含有1X 10⁹cfu活发酵乳杆菌PS150之PBS；发酵乳杆菌PS150之蛋白质部分组，其中使大鼠接受慢性温和压力并提供200μL含有300mg/kg蛋白质之PBS。误差杠表示平均值标准误差；n＝4。^ab不同组间全脑MAO-A(a)及过氧化氢(b)浓度之显著差异；P＜0.05。

图10显示由发酵乳杆菌PS150所产生之蛋白质于分析型HiTrap Q HP柱上之逆相高效液相层析(RP-HPLC)洗脱曲线。以0.8mL/min之流速，利用80分钟内从0％变为100％溶剂B(含有1M NaCl之25mM Tris HCl)之线性梯度进行洗脱。

图11显示SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中于地塞米松(dexamethasone)诱导的神经毒性后之细胞存活率之百分比。阳性对照，其中SH-SY5Y细胞经未发酵之MRS处理；阴性对照，其中SH-SY5Y细胞经未发酵之MRS在地塞米松(25μM)的存在下处理；发酵乳杆菌PS150之蛋白质部分，其中SH-SY5Y细胞经发酵乳杆菌PS150之蛋白质部分在地塞米松(25μM)的存在下处理；部分A、B、C、D、E、F、G、H及I，其中SH-SY5Y细胞经通过HPLC收集之经纯化蛋白质部分处理。误差杠表示平均值标准误差；n＝6。^abc不同组间细胞存活率百分比之显著差异；P＜0.05。

图12显示自发酵乳杆菌PS150之粗蛋白质部分之经纯化部分A的SDS-PAGE凝胶影像。泳道1：蛋白质标记物；泳道2：PS150之粗蛋白质部分；泳道3：经纯化之蛋白质部分A。

图13(a)及(b)显示戊巴比妥(pentobarbital)诱导之睡眠测试中PS150对睡眠潜伏期(a)及睡眠持续时间(b)的影响。PBS组，其中对小鼠喂食200μL磷酸盐缓冲盐水(PBS；pH7.4)；DIPH-HCL组，其中对小鼠提供200μL含有20mg/kg盐酸苯海拉明(diphenhydraminehydrochloride)之PBS；PS150组，其中对小鼠提供200μL含有1X 10⁹cfu活发酵乳杆菌PS150之PBS。误差杠表示平均值标准误差；n＝10。^ab不同组间小鼠之睡眠潜伏期(a)及睡眠持续时间(b)之显著差异；P＜0.05。

具体实施方式

本发明惊人地发现一种新颖乳酸菌(LAB)(发酵乳杆菌PS150)，及由所述LAB产生之生物活性蛋白在改善情感障碍或神经病况及治疗或预防神经退化性疾病方面的有利效果。

定义

本文中未明确定义之术语应依由熟习此项技艺者根据揭示及内文对这些术语所指定的含义进行理解。然而，如本说明书中所使用，除非有相反指明，否则以下术语具有根据以下约定所指示的含义。

本文中列出的缩写词如下：

CDS：编码序列；COG：直系同源聚类；CRISPR：成簇的规律间隔的短回文重复；EF-Tu：延伸因子Tu；GO：基因本体；HGAP：分级基因组组装方法。

以连词"及"连接的项目群组不应解读成要求这些项目中之各个及每个项目存在在分组中，而应解读成"及/或"，除非另外明确说明。同样，以连词"或"连接的项目群组不应解读成要求于所述组中相互排他，而亦应解读成"及/或"，除非另外明确说明。此外，虽然本发明之项目、元件或组件可从而单数形式进行描述或主张，但亦设想多数于单数范畴内，除非明确说明单数的限制。

如本文中所使用，术语"一"、"一个"及"所述"应理解为意指单数及多数两者，除非另外明确说明。因此，"一"、"一个"及"所述"(及在适当的情况下其语法变化)是指一或多个。

术语"益生菌"于申请专利当时之技术水平中被公认为当以适量投与时赋予寄主健康效益之微生物。益生菌微生物必须满足与缺乏毒性、活力、黏着及有益效应有关的若干要求。这些益生菌特征为菌株依赖性，甚至在相同物种的细菌当中。

如本文中所使用，术语"医药上可接受"是指化合物、物质、组合物及/或剂型，其在合理的医学判断范围内，适合与个体(人类或非人类动物)之组织接触使用而无过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，符合合理的效益/风险比。各载剂、赋形剂等亦必须在与调配物之其他成分相容的意义上是"可接受的"。适合的载剂、赋形剂等可参见标准医药文本。

术语"食用载剂"是指适合与个体之组织接触使用的化合物、物质、组合物及/或剂型。各载剂亦必须在与调配物之其他成分相容的意义上是"可接受的"。

如本文中所使用，术语"有效量"为组合物中各菌株之在合理的医学判断范围内高到足以显著正向调节待治疗的病况但低到足以避免严重副作用(在合理的效益/风险比下)之菌落形成单位(cfu)的量。

如本文中所使用，术语"病症(disorder)"可与"疾病"或"病况(condition)"互换使用。

如本文中所使用，术语"情感障碍"是以DSM-IV-TR描述且为描述情感严重改变的一类疾病。于情感障碍下的疾病包括：严重抑郁症、双极症(欣快性躁狂、过度活动、过度自我吹嘘、不切实际的乐观)、持续性抑郁症(长持续性低度抑郁)、循环性情感症(双极症之温和形式)及SAD(季节性情感障碍)。

如本文中所使用，术语"神经病况"为描述神经损伤及疾病对脑功能在行为、记忆或认知方面的影响的一类疾病。于神经病况下的疾病包括(但不限于)压力(诸如慢性温和压力)、认知功能减退、认知受损(包括轻度认知受损(MCI))、记忆衰退、一般回忆问题、认知障碍或神经退化性疾病(诸如阿滋海默氏症(Alzheimer's disease)、杭丁顿氏舞蹈症(Huntington's disease)、帕金森氏症(Parkinson's disease)、痴呆、肌萎缩性侧索硬化症、中风或精神分裂症)。

术语"治疗"应理解为意指减轻或减少特定疾病或病况之至少一种征兆、症状、适应症或效应。如本文中所使用，"预防"应理解为限制、减少疾病或病况之发作速率或程度，或抑制疾病或病况之至少一种征兆或症状之发展。

如本文中所使用，术语"个体"为可自投与如本文所揭示化合物或组合物得益的任何动物。在一些实施例中，所述个体为哺乳动物，例如，人类、灵长类动物、狗、猫、马、牛、猪、啮齿动物(诸如(例如)大鼠或小鼠)。通常，所述哺乳动物为人类。

乳酸菌

在一个方面，本发明提供一种经单离之LAB，其为具有如经SEQ ID NO:1至3显示之核酸序列中任一者之发酵乳杆菌PS150(PS150)。SEQ ID NO:1至3之序列列于下文。

发酵乳杆菌PS150具有2,238,401bp之环状染色体且其GC含量为51％。预测总共有2,281个基因，其由2,206个蛋白质编码基因、59个tRNA、15个rRNA及一个tmRNA所组成。另外，发现两个成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)区，其可提供抗外源遗传成分之免疫。预测2,206个蛋白质编码基因中有465个为不具有其所属功能的假想蛋白。基于直系同源聚类(COG)功能分类，2005个蛋白质编码基因(即，所有预测编码序列(CDS)的91％)可归类为COG功能类别。2005个蛋白质编码基因中，有62％属于五个主要COG类别：447个CDS在类别S(功能未知)中，364个CDS在类别L(复制、重组及修复)中，162个CDS在类别E(氨基酸运输及代谢)中，140个CDS在类别J(转译、核糖体结构及生体合成)中及136个CDS在类别K(转录)中。此外，有九个已鉴定之原噬菌体区且有趣的是，其中四个经预测为完整原噬菌体。对抗生素抗性基因的研究揭示六个候选抗性基因，包括30S核糖体蛋白S12、麦芽糖O-乙酰基转移酶、半乳糖苷O-乙酰基转移酶、推定的乙酰基转移酶、氯霉素乙酰基转移酶及胸苷酸合成酶。在细菌菌株中的染色体比较可揭示对于某些菌株为独特的基因组特征。其显示本发明LAB具有独特的98个蛋白质编码序列。98个序列中有35个编码假想蛋白，此意指彼等具有未知的功能或可能错误地被预测为基因。剩余的63个基因具有预测之蛋白质产物，其包含三种于跨距小于15kb之基因簇中发现的推定醣基转移酶。98个序列中的代表性序列于SEQ IDNO:1至3中列出。

在一个实施例中，本发明提供一种经单离并纯化的乳酸菌，其为发酵乳杆菌PS150(PS150)，于2016年6月6日由德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen)依布达佩斯条约(Budapest Treaty)寄存，且所给寄存编号为DSMZ 32323。

发酵乳杆菌PS150为自发酵肉肠单离得的益生菌菌株。

PS150可有效改善情感障碍或神经病况，及治疗或预防神经退化性疾病。

PS150之蛋白质部分及自其纯化之EF-Tu蛋白质

在另一个方面，本发明提供PS150之EF-Tu蛋白质，其包含SEQ ID NO:4之氨基酸序列。

SEQ ID NO:4

在另一个方面，本发明提供一种蛋白质部分，其是从PS150细胞之细胞外蛋白质获得，且包含具有SEQ ID NO:4之氨基酸序列或其功能片段之EF-Tu蛋白质。

所述蛋白质部分为源自发酵乳杆菌PS150之细胞外蛋白质。单离发酵乳杆菌PS150之蛋白质部分并通过例如无凝胶(gelfree)分离及逆相高效液相层析纯化，且通过MALDI-TOF质谱分析鉴定。本发明惊人地发现具有约55kDa的分子量之经纯化蛋白质部分，其随后经鉴定为具有396个氨基酸残基(SEQ ID NO:4)之延伸因子Tu，展示在改善情感障碍或神经病况及神经退化性疾病方面之疗效。

发现编码EF-Tu之基因(称为tuf)为发酵乳杆菌PS150中的益生因子，赋予正面脑健康效应之所述重要基因的发现是通过自生物活性部分确定肽序列的同一性来达成，其中仅一个明显的命中(hit)与发酵乳杆菌PS150之预测蛋白质组具有100％同一性及1e^-5之BLASTP e-值。所述命中为EF-Tu且因此，进行关于其分子演化之详细研究从而鉴定可参与蛋白质-蛋白质相互作从而发挥所观察到健康效应之推定残基。

EF-Tu蛋白质为原核延伸因子中之一者及这些延伸因子为通过在核糖体之处转译合成新蛋白质之机制的一部分。出乎意料地，本发明首先确定EF-Tu蛋白质可有效改善情感障碍或神经病况及神经退化性疾病。因此，本发明提供一种用于治疗或预防神经退化性疾病之方法，其包括对个体投与有效量之EF-Tu蛋白质。在一个实施例中，所述EF-Tu蛋白质为来自PS150者。在另一个实施例中，所述EF-Tu蛋白质的量在约15μg/kg至约500μg/kg范围内。优选地，所述EF-Tu蛋白质的量在约15μg/kg至约400μg/kg、约15μg/kg至约350μg/kg、约15μg/kg至约300μg/kg、约15μg/kg至约250μg/kg、约15μg/kg至约200μg/kg、约15μg/kg至约150μg/kg、约15μg/kg至约100μg/kg、约15μg/kg至约50μg/kg、约50μg/kg至约500μg/kg、约100μg/kg至约500μg/kg、约150μg/kg至约500μg/kg、约200μg/kg至约500μg/kg、约250μg/kg至约500μg/kg、约300μg/kg至约500μg/kg、约350μg/kg至约500μg/kg或约400μg/kg至约500μg/kg范围内。

残基(40K、41G、42L、44K、46E、161E、185E、195D、327S、345E及360T)代表可为发酵乳杆菌PS150EF-Tu在其脑健康效应方面的关键区分因子之推定结合位点。

本发明EF-Tu蛋白质可经由吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)的刺激减少造成神经退化病理的TNF-α。此最终减小色胺酸至犬尿胺酸之转换率，并导致血清素产量增加。EF-Tu蛋白质亦减小血浆皮质酮浓度且因此可缓解焦虑、抑郁及压力。

组合物及应用

在另一个方面，本发明提供一种组合物，其包含PS150细胞、本发明EF-Tu蛋白质或本发明PS150之蛋白质部分及视需要之食用载剂或医药上可接受之盐。在本发明之组合物中，这些PS150细胞可呈可为活或非活的完整细菌之形式使用。优选地，细菌细胞是呈活的有生命力的细胞形式存在。

本发明组合物可呈适合投与(特定言之经口投与)之任何形式。所述任何形式包括(例如)固体、半固体、液体及粉末。

本发明组合物之实施例为营养组合物，包括食品，及特定言之乳制品。

所述组合物可为(例如)胶囊、锭剂、饮品、粉末或乳制品。视情况，可存在LAB之其他菌株。优选地，本发明营养组合物为婴儿食品、婴儿奶粉配方或较大婴儿配方。优选地，本发明组合物为营养或医药产品、营养补充物或医疗食品。

本发明营养组合物亦包括食品补充物及功能性食品。"食品补充物"表示由常用于食品中之化合物制成之产品，但其是呈锭剂、粉末、胶囊、药水(potion)之形式或通常与食品无关联之任何其他形式，且对人健康具有有益效应。"功能性食品"为亦对人健康具有有益效应的食品。特定言之，食品补充物及功能性食品可具有抗疾病之生理效应(预防性或治愈性)。

若根据本发明之组合物为膳食补充物，则其可照原样投与，可与适合的可饮用液体(诸如水、酸乳、牛奶或果汁)混合投与，或可与固体或液体食品混合投与。在所述内文中，膳食补充物可呈锭剂、丸剂、胶囊、含片、颗粒、粉末、悬浮液、小袋、锭片、甜食、棒、糖浆之形式及对应之投药形式(通常呈单位剂量形式)。优选地，包含本发明组合物之膳食补充物是呈以制备膳食补充物之习知方法制造的锭剂、含片、胶囊或粉末之形式投与。

本文中所述的组合物可为医药上可接受之组合物，其可包含一或多种医药上可接受之载剂、赋形剂、黏合剂、稀释剂或类似物。本发明组合物可经调配从而用于各种投药途径，例如，通过经口投与。彼等亦可与递送媒剂(诸如在一些囊封技术中)组合提供。

对于经口投与而言，粉末、悬浮液、颗粒、锭剂、丸剂、胶囊、胶囊锭及膜衣锭是可接受的固体剂型。这些可例如通过将一或多种本文所揭示化合物与至少一种添加剂(诸如淀粉或其他添加剂)混合而制备。适合的添加剂为蔗糖、乳糖、纤维素糖、甘露醇、麦芽糖醇、葡聚糖、淀粉、琼脂、藻酸盐、几丁质、甲壳素、果胶、黄蓍胶、阿拉伯胶、明胶、胶原蛋白、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物或甘油酯。视情况，口服剂型可包含其他成分从而促进投与，诸如无活性稀释剂、或润滑剂(诸如硬脂酸镁)、或防腐剂(诸如对羟基苯甲酸酯或山梨酸)、或抗氧化剂(诸如抗坏血酸、生育酚或半胱胺酸)、崩解剂、黏合剂、增稠剂、缓冲剂、甜味剂、矫味剂或芳香剂。锭剂及丸剂可进一步经相关技术中已知的适合包衣处理。

用于经口投与之液体剂型可呈医药上可接受之乳液、糖浆、酏剂、悬浮液及溶液之形式，其可包含无活性稀释剂，诸如水。医药调配物及组合物可使用无菌液体(诸如(但不限于)油、水、醇及这些之组合)制备成液体悬浮液或溶液。可添加医药上适合的表面活性剂、悬浮剂、乳化剂，供用于经口或非经肠投与。

在另一个方面，本发明提供一种改善情感障碍或神经病况或治疗或预防与神经元之细胞凋亡或神经退化有关的疾病之方法，其包括对个体投与有效量之本发明PS150细胞或含其之组合物。因此，本发明提供一种本发明PS150细胞或含其之组合物于制造用于改善情感障碍或神经病况或治疗或预防与神经元之细胞凋亡或神经退化有关的疾病的制剂中之用途。在一个实施例中，PS150细胞的量在约10⁵至约10¹³个菌落形成单位(cfu)范围内。优选地，PS150细胞的量为约10⁶至约10¹³cfu、10⁶至约10¹²cfu、约10⁶至约10¹¹cfu、约10⁶至约10¹⁰cfu、约10⁶至约10⁹cfu、约10⁶至约10⁸cfu、约10⁶至约10⁷cfu、约10⁷至约10¹³cfu、约10⁷至约10¹²cfu、约10⁷至约10¹¹cfu、约10⁷至约10¹⁰cfu、约10⁷至约10⁹cfu、约10⁷至约10⁸cfu、约10⁸至约10¹³cfu、约10⁸至约10¹²cfu、约10⁸至约10¹¹cfu、约10⁸至约10¹⁰cfu、约10⁸至约10⁹cfu、约10⁹至约10¹³cfu、约10⁹至约10¹²cfu、约10⁹至约10¹¹cfu或约10⁹至约10¹⁰cfu。更佳地，PS150细胞的量为约10⁶至约10¹²cfu。

在另一个其他方面，本发明提供一种改善情感障碍或神经病况或治疗或预防与神经元之细胞凋亡或神经退化有关的方法，其包括对个体投与有效量之本发明蛋白质部分或包含其之组合物。因此，本发明提供一种本发明蛋白质部分或包含其之组合物于制造用于改善情感障碍或神经病况或治疗或预防与神经炎之细胞凋亡或神经退化有关的疾病的制剂中之用途。在一个实施例中，所述蛋白质部分的量在约15mg/kg至约500mg/kg范围内。优选地，所述蛋白质部分的量在约15mg/kg至约500mg/kg、约15mg/kg至约400mg/kg、约15mg/kg至约300mg/kg、约15mg/kg至约200mg/kg、约15mg/kg至约100mg/kg、约40mg/kg至约500mg/kg、约40mg/kg至约400mg/kg、约40mg/kg至约300mg/kg、约40mg/kg至约200mg/kg、约40mg/kg至约100mg/kg、约80mg/kg至约500mg/kg、约80mg/kg至约400mg/kg、约80mg/kg至约300mg/kg、约80mg/kg至约200mg/kg、约80mg/kg至约150mg/kg、约100mg/kg至约500mg/kg、约100mg/kg至约400mg/kg、约100mg/kg至约300mg/kg或约100mg/kg至约200mg/kg范围内。更优选地，所述蛋白质部分的量在约40mg/kg至约300mg/kg范围内。

在另一个其他方面，本发明提供一种改善情感障碍、神经病况或治疗或预防与神经元之细胞凋亡或神经退化有关的疾病之方法，其包括对个体投与有效量之本发明EF-Tu蛋白质。因此，本发明提供一种EF-Tu蛋白质或包含其之组合物于自制造用于改善情感障碍、神经病况或治疗或预防与神经元之细胞凋亡或神经退化有关的疾病的制剂中之用途。在一个实施例中，所述EF-Tu蛋白质为来自PS150者。在另一个实施例中，所述EF-Tu蛋白质的给药量在约15μg/kg至约500μg/kg；优选地，约15μg/kg至约400μg/kg、约15μg/kg至约300μg/kg、约15μg/kg至约200μg/kg、约15μg/kg至约100μg/kg、约50μg/kg至约500μg/kg、约50μg/kg至约400μg/kg、约50μg/kg至约300μg/kg、约50μg/kg至约200μg/kg、约50μg/kg至约100μg/kg、约100μg/kg至约500μg/kg、约100μg/kg至约400μg/kg、约100μg/kg至约300μg/kg、约100μg/kg至约200μg/kg、约150μg/kg至约500μg/kg、约150μg/kg至约400μg/kg、约150μg/kg至约300μg/kg、约150μg/kg至约200μg/kg、约200μg/kg至约500μg/kg、约200μg/kg至约400μg/kg或约200μg/kg至约300μg/kg范围内。

所述情感障碍及神经病况包括(但不限于)焦虑、抑郁、睡眠紊乱、压力(诸如慢性温和压力)、认知功能减退、认知受损(包括轻度认知受损(MCI))、记忆衰退、一般回忆问题、认知障碍或神经退化性疾病(诸如阿滋海默氏症、杭丁顿氏舞蹈症、帕金森氏症、痴呆、肌萎缩性侧索硬化症、中风及精神分裂症)。

这些与神经元之细胞凋亡或神经退化有关的疾病可选自由下组成之群：中风(stroke)、阿滋海默氏症、杭丁顿氏舞蹈症、帕金森氏症、匹克症(Pick's disease)、库贾氏症(Creutzfeldt-Jakob's disease)、帕金森-ALS-痴呆复合症、威尔逊氏症(Wilson'sdisease)、多发性硬化症、进行性核上性麻痹、与神经性疼痛有关的双极症、皮质基底变性、精神分裂症、注意力不足过动症(ADHD)、痴呆、肌萎缩性侧索硬化症、视网膜疾病、癫痫症、中风(apoplexy)、暂时性缺血性发作、心肌缺血、肌缺血、因有关于延长暂停血流至脑部的手术技术所引起的缺血、头部损伤、脊髓损伤、缺氧及抑郁。

本发明细胞、蛋白质及蛋白质部分可降低吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)的表达，减小色胺酸至犬尿胺酸之转换率，增加血清素含量及减小血浆皮质酮含量。因此，本发明细胞、蛋白质及蛋白质部分可特定言之减缓焦虑、抑郁及压力。

通过下文呈现的实施例更详细地描述本发明，依图式简单说明进行。然而，毋庸赘言地，这些实施例是以说明本发明标的方式给出而不以任何方式构成对本发明的限制。

实例

材料及方法

1.0菌株及生长条件

发酵乳杆菌PS150是从马来西亚理科大学工业技术学院生物工程技术部培养物保藏所(culture collection of the Division of Bioprocess Technology,School ofIndustrial Technology,Universiti Sains Malaysia)(Penang，马来西亚)获得，事先从当地购买的发酵香肠单离得。于使用之前在37℃下将细菌培养在de Mann Rogosa Sharpe(MRS)(Biomark，印度)液体培养基中20小时。所述特定菌株为益生菌且已文献证实其总体脑健康促进效应。

2.0 DNA制备

依Microbes Environ，第22卷，第3期，第214-222页，2007单离并纯化得发酵乳杆菌PS150之基因组DNA。于基因组定序之前将所获得的经纯化DNA储存在-20℃下。

3.0基因组定序

使用两种不同的下代定序平台(其等为Pacbio RS II及Illumina HiSeq 2000)对发酵乳杆菌PS150之基因组DNA进行定序。于Pacbio平台上，以C2-P4化学方案仅使用单一SMRT细胞于来自发酵乳杆菌PS150之～10kb插入基因组DNA库上进行SMRT定序。经预筛选之原始DNA序列资料具有489,633,442bp，平均读段长度为3257bp。依以下标准筛选原始序列资料；最小子读段长度为500bp，最小聚合酶读段品质为0.8及最小聚合酶读段长度为100bp。2.5Mbp基因组之筛选后的资料库具有约166x覆盖率。出于染色体组装目的，经筛选之资料接着接受HGAP法(Nat.Methods，第10卷，第6期，第563至569页，2013)，如实施于SMRTportalver 2.3.0.140893上。Dotplot分析证实其为环状基因组，此与发酵乳杆菌染色体之其他公开的菌株一致。

于Illumina平台上，使用来自发酵乳杆菌PS150之500bp基因组DNA库从而进行配对端点(2x 100bp)定序。按照制造商方案(Illumina，"An Introduction to Next-Generation Sequencing Technology"，Illumina.Inc.，2011)进行库的制备。定序器产生总共20,522,464个读段，此意指其平均覆盖两百万个碱基对基因组中各碱基超过1000次。然而，需要筛选原始定序资料，使得仅品质序列资料通过从而用于后续分析。使用FASTQC(可得于http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/)作为序列品质检验工具，将每块序列品质标记为问题及因此每各配对端仅最后两百万个读段用作每块品质，因为这些读段良好。接着，使这些读段接受TRIMMOMATIC从而筛选除去低品质碱基。使用VELVET，选择使用VELVETOPTIMISER(S.Gladman及T.Seemann，"VelvetOptimiser"，2012)确定的kmer，组装经筛选之资料。所得组件具有262个重迭群。对这些重迭群排序并与通过Pacbio HGAP法使用MAUVE(Genome Res.，第14卷，第7期，第1394至403页，2004)生成的组件作比对。亦使用BWA软体(Bioinformatics，第25卷，第14期，第1754-60页，2009)将所筛选得的良好品质的序列资料与HGAP组装资料作比对。使用SAMTOOLS操纵比对文件从而产生已分类bam文件(Bioinformatics，第25卷，第16期，第2078至2079页，2009)。使用ARTEMIS(Bioinformatics，第16卷，第10期，第944至945页，2000)观察映射的读段。因为对于Illumina序列资料使用VELVET制得的组件包含比依HGAP法制得者更多的重迭群，故对于发酵乳杆菌染色体之后续分析仅使用经Pacbio组装之基因组。

4.0基因组注解

使用软体工具PROKKA从而标注蛋白质编码基因、tRNA、tmRNA、rRNA及重复区(诸如CRISPER)(Bioinformatics，第30卷，第14期，第2068-2069页，2014)。通过寻找EggNOG直系同源聚类(COG)(Nucleic Acids Res.，第42卷，第D1期，第D231至D239页，2014)中最佳的命中进行每一蛋白质编码基因之就基因本体(GO)而言的功能性分类。使用预设e值1针对于Pfam资料库(Nucleic Acids Res.，第42卷，第D1期，第D222-D230页，2014)鉴定预测蛋白中的蛋白质域。使用PHAST(Nucleic Acids Res.，第39卷增刊，第W347至W352页，2011)预测基因组中之原噬菌体序列。在益生菌开发的内文中，抗生素抗性成为问题且因此使用针对于全面抗生素抗性资料库之BLASTP(Antimicrob.Agents Chemother.，第57卷，第7期，第3348至3357页，2013)进行可能的抗性基因的寻找。将BLASTP e临限值设成小于1e^-5作为截止及分析与抗生素抗性资料库中的任何基因具有大于60％同一性之命中。使用KEGG(京都基因及基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes))映射器(Mapper)从而重建发酵乳杆菌PS150之少数受关注的代谢路径。

5.0发酵乳杆菌基因组之比较

除了发酵乳杆菌PS150之外，有四个亦具有解码之基因组的其他菌株。使用发酵乳杆菌PS150作为软体BRIG(BMC Genomics，第12卷，第1期，第402页，2011)的参考菌株，将其他四个已知菌株的基因组与其作比对。将自PHAST预测得的九个原噬菌体区串连成一个序列且亦将其与参考作比对。BLASTN同一性临限值上限及下限分别设为90％及70％。

6.0 tuf蛋白变异性分析

对于EF-Tu变异性分析而言，从235个细菌物种发现的所有蛋白质均用作用于计算Shannon熵(Bell Syst.Tech.J.，第27卷，1928年7月，第379至423页，1948)的输入。Shannon熵公式提供沿着蛋白质估计氨基酸序列之变异性的方法。对于给定的多蛋白质序列比对而言，每比对列号的Shannon熵(H)如下：

其中H为熵值，

X为比对列号，

N为氨基酸类型数目及间隔字元(21)*，

p_i为N中第i个字元之频率，

*表示间隔是否呈字元形式包含是视情况的。在所述研究中，间隔被视为字元。

另外，在乳杆菌属层级上，有25个具有可用基因组的不同物种。使用如上所述的相似方法得到这些25个物种中的tuf基因。这些蛋白质亦用作用于Shannon熵计算的输入。于计算熵之前，先使用MAFFT(Bioinformatics，第28卷，第23期，第3144至3446页，2012)比对这些蛋白质并接着使用CLUSTALX(Bioinformatics，第23卷，第21期，第2947至2948页，2007)从而人工方式检测。接着，依照发酵乳杆菌PS150EF-Tu上发现彼等的任何地方来移除间隔。最后，使用经修整的比对，通过使用订制的R指令码，来计算比对中每个位置的Shannon熵。

7.0细胞培养

7.1细菌及上清液制备

发酵乳杆菌PS150为发酵肉肠的单离物。培养基是从马来西亚理科大学微生物培养保藏所(Penang，马来西亚)获得。在抗冻剂(果胶)的存在下制备冻干储备培养物并储存在干燥及阴凉(-20℃)的地方。在用于实验之前，连续地于无菌de Man、Rogosa及Sharpe(MRS)液体培养基(Hi-Media，Mumbai，印度)中活化冻干培养物3次。在继代培养期间，将培养物培养(10％v/v)于经灭菌MRS液体培养基中并在37℃下培养18小时。通过以3500g离心15分钟(4℃)来获得无细胞上清液(CFS)，用10M NaOH中和至7.0之pH，并接着通过过滤通过0.22mm过滤器(Sartorius Stedim，德国)灭菌并立刻使用或储存在-20℃直至需要之时。

7.2人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞培养

神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞是购自韩国细胞系银行(Korea Cell LineBank，KCLB；Seoul，Korea)。将细胞维持在补充有10％经热灭活之胎牛血清(FBS；GibcoLife Technologies Inc，Grand Island，NY，USA)、100U/mL青霉素/链霉素(Gibco LifeTechnologies Inc，Grand Island，NY，USA)之高葡萄糖杜贝卡氏改良依格培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM；Difco，Detroit，MI，USA)中。将培养物接种于含有经补充之培养基之烧瓶中并在37℃下维持于5％CO₂及95％空气之增湿氛围中。

7.3细胞培养物处理及细胞存活率分析

将SH-SY5Y细胞以1X10⁵个细胞/孔之接种密度接种于96-孔培养板中。将所述研究中的所有细胞维持在10％血清培养基中直至地塞米松(dexamethasone)(Dex；Sigma-Aldrich，Steinheim，德国)处理。将细胞培养24小时从而允许在处理之前附着至培养板。为研究细菌CFS之效应，将20μL细菌CFS添加至含有100μL含在无血清培养基中之经25μM Dex处理之SH-SY5Y细胞之孔中。在处理48小时之后分析溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-四唑鎓(MTT；Sigma-Aldrich，Steinheim，德国)还原。

通过MTT之定量比色试验，如先前由Denizot及Lang(J Immunol Methods.1986年5月22日；89(2):271-7)所述，测量细胞存活率。MTT是用于评估神经元损伤。当活细胞吸收MTT时，其被细胞脱氢酶从黄色转化为紫色甲臜(formazan)结晶。简言之，在处理期结束时，将最终浓度为0.5mg/ml之10％MTT-标记试剂添加至各孔并再将板置于在37℃下具有5％CO₂及95％空气(v/v)之增湿培养箱中6小时的时间。然后，用二甲亚砜(DMSO；Sigma-Aldrich，Steinheim，德国)溶解不溶性甲臜。在570nm下使用微盘读取器(ThermoScientific，Waltham，MA，US)测量MTT还原之比色测定。将经未发酵MRS处理之对照细胞视作100％存活率。

8.0活体内研究

8.1活细胞及粗蛋白质制备

8.1.1发酵乳杆菌PS150活细胞

发酵乳杆菌PS150是从马来西亚理科大学工业技术学院生物工程技术部培养物保藏所(Penang，马来西亚)获得。在使用之前于37℃下在de Mann Rogosa Sharpe(MRS)(Biomark，印度)液体培养基中活化培养物20小时三次。使发酵乳杆菌PS150之过夜培养物接受于4℃下以8000g离心30分钟来得到细胞集结块。于得到细胞集结块后，使用磷酸盐缓冲盐水(1.0M，pH 7.4)清洗细胞团三次。添加10％(v/v)果胶溶液至所述细胞沉淀，再在-20℃冷冻过夜。接着在-55℃下将所述冷冻细胞团冷冻干燥过夜。使用倾注平板法(pourplate method)测定所得经冷冻干燥之细胞之CFU/g。此后，对于各个别大鼠，以9log CFU/大鼠/天之剂量制备经冷冻干燥之细胞。在使用之前，将这些制剂储存于-20℃下。

8.1.2自无发酵乳杆菌PS150细胞上清液提取之粗蛋白质

使发酵乳杆菌PS150之过夜培养物接受于4℃下以8000g离心30分钟来得到无细胞上清液。收集所述上清液并用3.0M氢氧化钠(NaOH)调整pH至7.0。通过在4℃下添加80％w/v硫酸铵至经中和之无细胞上清液中同时搅拌并接着在4℃下静置过夜来沉淀粗蛋白质。使经中和之无细胞上清液之沉淀接受在4℃下以10000g离心30分钟。用无菌蒸馏水再悬浮所得的集结块并通过0.22μM乙酸纤维素针筒过滤器过滤。接着使所得的粗蛋白质部分接受在-20℃下冷冻过夜，再在-55℃下冷冻干燥过夜。对于各个别大鼠，以300mg/kg之剂量制备经冷冻干燥之粗蛋白质。在使用之前，将这些制剂储存于-20℃下。

8.2动物

在马来西亚理科大学(USM)Bertam校区高级医疗及牙科学院(Advanced Medical&Dental Institute)(IPPT)的经GLP认证之动物研究中心进行所述研究。30只雄性Wistar大鼠(7至8周龄，重180至200g)是从USM主校区的动物研究及服务中心(Penang)获得。在到达时，将这些大鼠于标准实验室条件(十二小时光照/十二小时黑夜循环(光照：0700-1900，温度为19至25℃及湿度在30至70％RH内)下免打扰地(每个笼子3只动物)圈养在各基于木屑垫料的标准聚丙烯鞋盒笼中。在整个实验中，每两天一次更换笼子垫料。使所接收到的动物接受一周的隔离从而每天监测动物中疾病或虱的存在。一旦确保这些动物无任何疾病或虱，则使其等接受一周的适应，然后进行慢性温和压力方案及处理。在隔离及适应期间，所有大鼠可随意获取食物及水。每周测量并监测动物的体重。

8.3慢性温和压力方案

将这些大鼠分成五个组(每组6只大鼠(n＝6))，即，未处理的对照、阴性对照、阳性对照、活细胞处理组及蛋白质处理组。除了未处理的对照组之外，使所有大鼠接受慢性温和压力方案(表1)。在未处理的对照组中，所有动物不作任何处理。在阴性对照组中，所有动物每天喂食0.2ml磷酸盐缓冲盐水(1.0M，pH 7.4)。在阳性对照组中，所有动物每天喂食以0.45mg/kg之剂量悬浮在0.2ml磷酸盐缓冲盐水(1.0M，pH 7.4)中之阿普唑仑(alprazolam)粉末。在活细胞处理组中，所有动物每天喂食9log CFU/大鼠/天之活发酵乳杆菌PS150。最后，在蛋白质处理组中，所有动物每天喂食如前面所述制得的经冷冻干燥之蛋白质(300mg/kg大鼠/天)。使用具有2.25mm球之1.5英吋的20号不锈钢喂食针进行口腔强饲。慢性温和压力方案由如图1所显示的若干压力期及非压力期组成且整周进行时间表排定，总共28天。

表1.慢性温和压力方案之每周时间表。

¹空瓶：水瓶空一小时从而限制动物获取水

²再填充水：再填充水瓶从而允许动物获取水

³倾斜笼子：让笼子倾斜45°

⁴无压力：所述段时间期间未执行压力源

⁵用砂更换锯屑：用砂更换木屑垫料。

⁶空笼：所述段时间期间动物的笼子为空的，不含木屑。

⁷约束：将动物置于软包线网中从而约束其运动。

⁸社交互动：在所述段时间期间允许所有大鼠在较大笼子中互动。

⁹食物剥夺：从笼子移走食物

¹⁰限制食物：在所述段时间期间，对动物提供最少量的食物

¹¹外来房间：将动物转移至新的笼子

¹²重复冷压力：将10块小冰块置于动物笼子中且允许溶化30分钟

¹³红光：将笼子中的动物置于配备红光的房间

¹⁴湿笼：用无菌水润湿木屑垫料

¹⁵捕食者的声音：将动物暴露于捕食者的声音录音

¹⁶外来房间：将笼子中的动物从原来的房间置换至新的房间

¹⁷闪光灯：将动物暴露于使用电子装置播放的闪光灯视讯

¹⁸水剥夺：从笼子移走水瓶从而限制大鼠获取水

8.4行为评估

在28天慢性温和压力干预之后使所有大鼠接受行为评估。所评估的行为评估包括莫氏水迷宫(MWM)、高架十字迷宫(EPM)、T-迷宫、强迫游泳测试(FST)、空场测试(OFT)及物件鉴定。所有实验均在仅稀疏光线照射的安静且黑暗的房间内进行。

8.4.1莫氏水迷宫(MWM)

设备设置

所使用的MWM之直径为210cm，其中池高度为51cm，其中具有非反射性内表面。将所述迷宫置于具有设在迷宫顶部的视讯摄影机之室内从而捕捉并记录动物行为。将水迷宫充满温度在19至22℃范围内的水从而避免大鼠受到温度冲击(体温过低或体温过高)。然后，将具有10至12cm直径之无色且透明之圆形物件或平台(称为逃避平台)浸没水表面下方1至2cm并确保当大鼠爬上其时避免动物倾翻之稳定性。

逃避潜伏期评估

MWM的起始位置标在东、西及东南，同时逃避平台浸没在东北。连续四天每天使用此三起始位置进行试验。简言之，将这些动物轻柔地置于第一起始位置上并允许自由地游泳从而寻找逃避平台。给每只动物最长两分钟从而进行逃避平台的寻找。在莫氏测试之后于使彼等返回至其各自的笼子之前，用干净的毛巾彻底擦干所有大鼠。每只动物定位于逃避处所花的时间(逃避潜伏期(秒))表示为每组重复六次(n＝6)之平均值±平均值标准误差。

8.4.2高架十字迷宫(EPM)

设备设置

高架十字迷宫(EPM)由四个臂(两个开放臂没有壁及两个臂围封40cm高、50cm长及15cm宽的壁)组成。迷宫的各臂是与具有70cm高的结实金属腿连接。将EPM置于具有明亮照明的房间内，接近房间的中央。两开放及闭合臂之照明程度维持相似。将视讯摄影机设在高架十字迷宫上方从而捕捉并记录动物行为。

评估

将动物从其笼子中取出并置于EPM的中央(即，开放臂与闭合臂的结点)，背向迷宫面对壁。给每只动物5分钟从而自由地在EPM上探索。在整个评估中，于抓取下一只动物之前，用70％酒精清洁并干燥EPM。观察开放臂进入次数及花在开放臂中的时间，计时并记录。记录开放臂进入次数及花在开放臂上的持续时间且表示为每组重复六次(n＝6)之平均值±平均值标准误差。

8.4.3强迫游泳测试

设备设置

在深度为68cm及直径为40cm之黑色不透光游泳圆筒中进行强迫游泳测试(FST)。将所述圆筒填满水至30cm之深度，上方留一些空间从而防止大鼠逃避。视讯摄影机设在游泳圆筒上方从而在测试期间捕捉并记录动物的行为。

评估

将每只动物轻柔地置于游泳圆筒的水中并给定5分钟从而在游泳圆筒中自由地游泳。于整个测试中观察并记录动物行为。于整个评估中，在FST之后于使彼等返回至其各自的笼子之前，用干净的毛巾彻底擦干所有大鼠。记录大鼠保持不动之持续时间并接着表示为每组重复六次(n＝6)之平均值±平均值标准误差。

8.4.4空场测试

设备设置

使用置于提供有明亮光照的实验房间的中央之具有32cm高、38cm宽及52cm长之尺寸之不透光矩形箱进行空场测试。将视讯摄影机设在矩形箱上方从而捕捉动物行为。

评估

将每只动物轻柔地从其笼子转移至OFT中并允许自由地在箱内容探索。于5分钟的空场测试期间观察大鼠之探索及保持不动的持续时间。于整个评估中在每次测试的时间间隔期间用70％酒精清洁箱。探索及保持不动的持续时间表示为每组重复六次(n＝6)之平均值±平均值标准误差。

8.4.5新物件识别测试

设备设置及评估

在具有32cm高、38cm宽及52cm长之尺寸并置于实验房间中央之不透光矩形箱中进行新物件识别测试。所述行为评估涉及2个阶段，即，熟悉阶段及测试阶段。在熟悉阶段期间，将两个相同物件(形状、大小及重量相同)置于矩形箱中。将每只动物置于矩形箱中并给定2分钟从而在箱中自由地探索。然而，在测试阶段期间，一个旧物件改由具有形状之新物件(重量及大小相似)替代。同样地，将每只动物置于矩形箱中并给定2分钟从而在箱中自由地探索。于整个实验中将视讯摄影机设在矩形箱上方从而捕捉两个阶段中动物的行为。在每次测试的间隔期间，用液态皂、水清洁所述箱并干燥。熟悉阶段与测试阶段间之间所给定的时间间隔为一小时。探索新物件所花的时间依以下公式表示为识别指数：

识别指数＝(新物件上所花的时间)/(旧物件+新物件上所花的总时间)X 100％(Cogn Process，2012，13(2):93-110)

资料表示为每组重复六次(n＝6)之平均值±平均值标准误差。

8.4.6统计分析

通过IBM SPSS Statistics 20.0(IBM Co.，Armonk，NY，USA)统计分析所有资料。进行单向方差分析从而分析组平均值之间的统计差异。统计显著性水平设为α＝0.05，及通过Tukey检验评估多个平均值的比较。除非另外指出，否则所有资料表示为三次独立实验(n＝6)之平均值。

8.5血液收集及器官提取

在实验结束时，于使用二氧化碳窒息将大鼠杀死之后不久，通过心脏穿刺收集血液样本，并转移至涂覆EDTA之管中。在血液收集之后不久，依断头法移去脑。将用于ELISA及过氧化氢分析之脑组织样本保持于冰冷PBS中。

8.5.1生化分析

脑样本之均质化

于切除之后不久处理储存在4℃的1x磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)中的所提取大鼠脑。将脑组织样本切成3个区(小脑、大脑及海马区)。接着在冰冷条件下以70至100Hz均质化脑组织样本切片10分钟。在使用之前将所有经均质化之样本储存在-20℃。

血液样本

于室温下培养于抗凝血EDTA管中收集的血液10至20分钟，再以3000rpm离心20分钟。收集上清液作为血浆样本并储存于1.5ml微量离心管中，保持在4℃下从而用于即刻分析。在使用之前，将额外的血浆样本保持在-20℃。

酶联免疫吸附分析(ELISA)

进行酶联免疫吸附分析(ELISA)以量化与神经生成相关联的若干细胞介素、关键神经递质及生物标记。依制造商说明书(R&D System Inc,USA)进行ELISA。

简言之，将10μl经均质化之脑组织或血浆加载至孔底部上而不接触孔壁。添加40μl样本稀释缓冲液从而稀释这些样本。在37℃下培养经稀释之样本30分钟。此后，丢弃这些样本并用所提供的清洗缓冲液清洗五次。于随后，将50μl与辣根过氧化物酶(HRP)共轭的抗体添加至各孔。在37℃下再培养所述混合物30分钟。接着，丢弃所述混合物并用所提供的清洗缓冲液清洗五次。于随后，将50μl色原溶液A及50μl色原溶液B添加至各孔并通过轻柔振荡混合。接着在37℃下培养所述混合物15分钟。在所述步骤期间应避免光照曝露。接下来，添加50μl终止溶液至各孔从而终止反应。最后，使用Thermo Multiskan-GO ELISA板读取器读取在450nm下之吸光度O.D.。使用如上所提及的相同程序生成标准曲线。

脑中之过氧化氢(H₂O₂)测量

使用Amplex Red分析套组(Molecular Probes Inc.，Eugene，OR，USA)依制造商方案评估脑匀浆样本中的过氧化氢含量。

9.0鉴定来自发酵乳杆菌PS150之蛋白质

遵循所有这些阳性发现，单离发酵乳杆菌PS150之蛋白质部分并进一步鉴定。通过硫酸铵沉淀预纯化所述蛋白质部分并接着基于三步骤层析程序回收。

9.1蛋白质提取

如前面所述(8.1.2)提取粗蛋白质部分。接着使用75％丙酮使所述粗蛋白质部分进行脱盐，并通过离心(7000g，30分钟，4℃)移除盐，重复三次。将所收集的集结块溶解于去离子水中。采用Bradford分析法(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)，使用BSA作为标准品，估测蛋白质含量。

9.2无凝胶分离法

使用包含预调配的HEPES操作缓冲液及Tris乙酸盐样本缓冲液(AMRIncorporated)之GELFREE^TM 8100分离系统(Fractionation System)(Expedeon，SanDiego，CA，USA)，依制造商之说明书，依据分子质量，将蛋白质分为多个部分。将发酵乳杆菌PS150蛋白质溶解于样本缓冲液中，并加载至含有5％Tris-乙酸盐卡管之个别加载隔间中，其设计在于分离质量在60至300kDa范围内之蛋白质。仪器依预定的时间间隔自动暂停，并用吸移管移除液体部份。接着重新启动所述顺序，并继续所述制程，以便依据分子大小收集下一个部份。重复所述制程直到收集到所有部份。

在回收12个个别部份之后，收集这些部份，使用丙酮洗涤两次，并经过真空浓缩机移除丙酮。将各个别部份标准化为相同蛋白质含量(2.0μg/mL)，并在细胞培养处理中，使用前面述于7.3中的方法进行测试。

9.3. 1DE凝胶分析

为估计各个别蛋白质部分之分子大小，一旦从GELFREE^TM 8100分离系统回收得12个个别部分之后，则使用10％SDS-PAGE(Bio-Rad)进行标准1DE。在110V下于Tris/甘胺酸/SDS操作缓冲液(Bio-Rad)中，使用标准电泳设备(Bio-Rad)，进行蛋白质分离80分钟。使用Coomassie Brilliant Blue蛋白质凝胶染色剂(Molecular Probes，Eugene，OR，USA)染色凝胶中的蛋白质及使用ChemiDoc XRS Camera and Quantity One 1D分析软体(Bio-Rad)观察蛋白质谱带。

9.4逆相高效液相层析(RP-HPLC)

蛋白质部分之最后纯化步骤是通过逆相高效液相层析(RP-HPLC)于HiTrap Q HP柱上进行。在0.8mL/min之流速下用溶剂A(25mM Tris HCl)进行洗脱10分钟。接着，在70分钟内进行从0％变为100％溶剂B(含有1M NaCl之25mM Tris HCl)之线性梯度。个别地收集洗脱峰并如所述(7.3)检查抗地塞米松之神经保护活性。

9.5通过orbitrap LC/MS鉴定蛋白质部分

在马来西亚理科大学高级分析毒理学服务机构中心(Institutional Centre forAdvanced Analytical Toxicology Services,Universiti Sains Malaysia)实现肽鉴定。将所关注的来自RP-HPLC之部分(0.2mg)溶解于变性缓冲液(6M胍-HCl/25mM碳酸氢铵，pH8.5)中并接着添加1mg/ml DTT/25mM碳酸氢铵(新制)至蛋白质溶液并在55℃下培养30分钟。接着添加1mg/mL碘乙酰胺/25mM碳酸氢铵(新制)，然后用铝箔覆盖并在55℃下培养15分钟。然后，使用具有15kDa之截止分子量之旋转柱(spin-column)将经还原并烷基化之蛋白质样本与25mM碳酸氢铵缓冲交换3次(每次30分钟)。接着将胰蛋白酶添加至所述样本并在37℃下培养18小时。添加甲酸至所述样本，然后使其接受冷冻干燥。使样本接受MALDI-TOF质谱分析并鉴定质量峰。产生所有可能的片段并鉴定其对应之分子量及肽序列。于随后，使用PEAKS studio第6.0版进行资料分析及使用于发酵乳杆菌PS150基因组中编码之所有蛋白质之功能注解资料库来进行潜在的生物活性肽序列之选择。

9.6对接模拟

使用Swiss-MODEL(Schwede 2003)建构发酵乳杆菌PS150之延伸因子tu(EF-Tu)之3D模型。来自嗜热菌(Thermus thermophilus)(PDB ID:2C77)之EF-Tu用作模板，因为以下两个原因：1)蛋白质资料库(PDB)中不存在可用的乳杆菌衍生之EF-Tu晶体结构及2)嗜热菌衍生之EF-Tu显示与资料库中发酵乳杆菌PS150之EF-Tu的最高序列同一性(74.81％)。从蛋白质资料库(PDB)获得干扰素-γ(IFNγ)及干扰素-γ受体(IFNγR；PDB ID:1FYH；2.04A之解析度)之晶体结构。另外，IFNγ39(衍生自IFNγ之已知可抑制IFNγR反应性之头39个氨基酸之合成肽)亦衍生自IFNγ之晶体结构从而充作所述研究中的阳性对照。

分子对接-IFNγ至IFNγ受体

在Cluspro 2.0:蛋白质-蛋白质对接作业提交之前移除所有水分子及配位体。在Cluspro 2.0:蛋白质-蛋白质对接(抗体模式)中，IFNγ及IFNγR分别作为配位体及受体提交。进一步用BIOVIA Discovery Studio 4.5(Humphrey等人1996)分析所产生的所有构型从而评估其均方根差(RMSD)值。具有最低结合自由能、最低RMSD值及最密聚簇之构型用作用于进一步分析中之比较之基准对照。使用Ligplot+v1.4.5(Laskowski及Swindells，2011)从而观察IFNγ与所选构型之IFNγR上的相互作用残基(TYR49、TRP82、GLU101、HIS205、VAL206及TRP207；Randal及Kossiakoff，2001)间之相互作用。

分子对接-IFNγ39至IFNγ受体

在Cluspro 2.0:蛋白质-蛋白质对接作业提交(Kozakov等人，2013)之前移除所有水分子及配位体。在Cluspro 2.0:蛋白质-蛋白质对接(抗体模式)中，IFNγ39及IFNγR分别作为配位体及受体提交。具有最低结合自由能及最密聚簇之构型用于与如前面完成之基准对照作比较。使用Ligplot+v1.4.5(Laskowski及Swindells，2011)从而观察IFNγ39与所选构型之IFNγR上的相互作用残基(TYR49、TRP82、GLU101、HIS205、VAL206及TRP207；Randal及Kossiakoff，2001)间之相互作用。

分子对接-EF-Tu至IFNγ受体

在Cluspro 2.0:蛋白质-蛋白质对接作业提交之前移除所有水分子及配位体。在Cluspro 2.0:蛋白质-蛋白质对接(抗体模式)中，EF-Tu及IFNγR分别呈配位体及受体形式提交。具有最低结合自由能及最密聚簇之构型用于与如前面实施之基准对照作比较。使用Ligplot+v1.4.5(Laskowski及Swindells，2011，J.Chem.Inf.Model，51:2778-2786)从而观察EF-Tu与所选构型IFNγR上的相互作用残基(TYR49、TRP82、GLU101、HIS205、VAL206及TRP207)间之相互作用。

实例1 鉴定发酵乳杆菌PS150及染色体一般基因组特征

使用API 50 CHL套组(bioMerieux，France)研究用于本发明中之PS150之糖利用，及结果显示于表2中。发酵测试指示PS150具有类似于发酵乳杆菌之生物化学性质。

表2：发酵测试^a之结果

^a.+，阳性；－，阴性

将发酵乳杆菌PS150培养于特异性人工培养基中。通过经PCR扩增之DNA片段之直接定序来分析来自发酵乳杆菌PS150之16S rRNA及pheS基因。使用相关技术已知的方法进行基因组DNA提取、16S rDNA及pheS DNA之经PCR介导之扩增、PCR产物之纯化及经纯化之PCR产物之定序。

发酵乳杆菌PS150之16S rDNA序列(SEQ ID NO:5)

pheS基因序列(SEQ ID NO:6)

将所得序列放入线上由美国国家生物技术资讯中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的比对软体中，人工比对并与生物体之代表性16S rDNA序列进行比较。就比较而言，亦从线上由NCBI提供的资料库获得16S rDNA序列。作为所述分析的结果，下表3列出16S rDNA序列相较于发酵乳杆菌PS150之16S rDNA序列显示最高相似性值之其等生物体。

表3 16S rDNA序列相较于发酵乳杆菌PS150之16S rDNA序列显示最高类似相似性值之生物体

发酵乳杆菌PS150具有2,238,401bp之环状染色体及其GC含量为51％。预测总共2,281个基因，其是由2,206个蛋白质编码基因、59个tRNA、15个rRNA及一个tmRNA(表4)组成。另外，发现两个成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)区，其可提供抗外源遗传成分之免疫性。2,206个蛋白质编码基因中之465个被预测为不具有归属于彼等之功能的假想蛋白。基于直系同源聚类(COG)功能分类，2005个蛋白质编码基因(即，91％之所有预测编码序列(CDS))可指派给COG功能类别。2005个蛋白质编码基因中有62％属于五个主要COG类别：447个CDS在类别S(功能未知)中，364个CDS在类别L(复制、重组及修复)中，162个CDS在类别E(氨基酸运输及代谢)中，140个CDS在类别J(转译、核糖体结构及生体合成)中及136个CDS在类别K(转录)中。此外，鉴定九个原噬菌体区且有趣的是，其中四个经预测为完整原噬菌体。对抗生素抗性基因的研究显示六个候选抗性基因，包括30S核糖体蛋白S12、麦芽糖O-乙酰基转移酶、半乳糖苷O-乙酰基转移酶、推定的乙酰基转移酶、氯霉素乙酰基转移酶及胸苷酸合成酶。

表4：发酵乳杆菌PS150之预测基因组特征列表。

特征	计数
		基因	2281
CDS	2206
		tRNA	59
rRNA	15
		tmRNA	1
重复区(CRISPR)	2
		假想蛋白	465
原噬菌体区	9

与其他发酵乳杆菌菌株之染色体比较

在细菌菌株中的染色体比较可揭示对于某些菌株为独特的基因组特征。将发酵乳杆菌PS150之染色体与另外四个菌株发酵乳杆菌3872、发酵乳杆菌CECT 5716、发酵乳杆菌IFO 3956及发酵乳杆菌F6之完整基因组进行比较。将发酵乳杆菌PS150之预测原噬菌体串连并包含于比较中。如所预期，诸如在原噬菌体区中，新基因组为明显的差异。

进行研究从而找出介于菌株3872与PS150之间之非重迭区，此揭示98个蛋白质编码序列对于后一菌株为独特。98个序列中有35个编码假想蛋白，此意指彼等具有未知的功能或可能错误地被预测为基因。剩余的63个基因具有预测之蛋白质产物，其包含三种存于跨距小于15kb之基因簇中的推定醣基转移酶。

实例2 针对焦虑、抑郁及压力之缓解的分析

在慢性温和压力方案4周之后进行对大鼠行为的分析。高架十字迷宫为广泛使用的龋齿动物行为分析且其已被验证可评估药理药剂及类固醇激素之抗焦虑效应。用于实验中之高架十字迷宫由四个臂(两个开放臂及两个闭合臂)组成并自地面抬高50cm高。将大鼠置于迷宫四个臂的结点，面对开放臂，及记录各臂中之进入/持续时间5分钟。开放臂活动(持续时间及/或进入)的增加反映抗焦虑行为。经发酵乳杆菌PS150及蛋白质部分处理之组比阴性对照组大鼠进入开放臂的数目明显更多(P＜0.05；图1(a))，然而，未处理的对照组、阳性对照组(经抗抑郁药处理)、经发酵乳杆菌PS150处理之组及经蛋白质部分处理之组间之差异性是不明显的(图1(a))。此外，经发酵乳杆菌PS150及蛋白质部分处理的花在闭合臂上的时间与花在开放臂上的时间之比相较于阴性对照组明显更低(P＜0.05；图1(b))，然而，在未处理对照组、阳性对照组(经抗抑郁药处理)、经发酵乳杆菌PS150处理之组及经蛋白质部分处理之组中观察到不明显的差异(图1(b))。结果指示发酵乳杆菌PS150及发酵乳杆菌PS150之蛋白质部分可将慢性温和压力引起之焦虑行为标准化，恢复回至最初的非焦虑状态。另外，发酵乳杆菌PS150及蛋白质部分组亦显示与阿普唑仑之抗焦虑效应相似的抗焦虑效应，此指示与市售抗抑郁药相似的效应。

空场测试广泛用于评估探索行为及经验证用于测量与焦虑有关的行为。所述程序由使大鼠经历由围墙阻止从其逃避的未知环境组成。经发酵乳杆菌PS150及发酵乳杆菌PS150之蛋白质部分处理之组相较于阴性对照组显著增加大鼠之探索活动的持续时间(P＜0.05；图2)。未处理的对照组、阳性对照组(经抗抑郁药处理)、经发酵乳杆菌PS150处理之组及经蛋白质部分处理之组间大鼠之探索及保持不动活性不显著的差异(图2)。大鼠之探索行为的增加指示焦虑状态较少，而保持不动指示大鼠之焦虑行为。慢性温和压力引起大鼠之焦虑，但发酵乳杆菌PS150及发酵乳杆菌PS150之蛋白质部分可将慢性温和压力引起之焦虑行为标准化，恢复回至最初的非焦虑状态。另外，发酵乳杆菌PS150及蛋白质部分组亦显示与阿普唑仑之抗焦虑效应相似的抗焦虑效应，此指示与市售抗抑郁药相似的效应。

强迫游泳测试为用于研究龋齿动物之似抑郁行为之最常用试验之一。强迫游泳测试是基于以下假设：当将动物置于填充水的容器中时，其将先努力逃避但最终将呈现保持不动，保持不动可被视为反映行为绝望的量度。在强迫游泳测试中，游泳圆筒填充30cm深的水。通过评分300s测试之每5s时间期的主要行为来进行大鼠之抑郁评估。相比阴性对照组，经发酵乳杆菌PS150及蛋白质部分处理之组花在保持不动的时间显著更少(P＜0.05；图3)。未处理的对照组、阳性对照组(经抗抑郁药处理)、经发酵乳杆菌PS150及蛋白质部分处理之组间的大鼠花在保持不动的时间之无显著差异(图3)。自发酵乳杆菌PS150、蛋白质部分及抗抑郁药观察到相似的效应，其中将慢性温和压力引起之似抑郁行为标准化至未处理的对照组中之相同程度。发酵乳杆菌PS150及发酵乳杆菌PS150之蛋白质部分可将慢性温和压力引起之抑郁行为标准化，恢复回至最初的非抑郁状态。另外，发酵乳杆菌PS150及蛋白质部分亦显示与阿普唑仑之抗抑郁效应相似的抗抑郁效应，此指示与市售抗抑郁药相似的效应。

相较于阴性对照组及阳性对照组，发酵乳杆菌PS150及蛋白质部分组中之血浆皮质酮含量显著更低(P＜0.05；图4)。暴露于重复或长时间压力源引起慢性压力。慢性压力最终引起HPA轴失调，此导致血浆皮质酮含量增加。皮质酮含量之升高指示与焦虑及抑郁有关的行为。吾人的资料显示发酵乳杆菌PS150及发酵乳杆菌PS150之蛋白质部分将慢性温和压力引起之焦虑、抑郁及压力行为标准化，恢复回至最初的非压力状态，并可甚至发挥比阿普唑仑(市售抗抑郁药)之病理效应更佳的病理效应。

相较于阴性对照组，经发酵乳杆菌PS150处理之组及经蛋白质部分处理之组中血浆TNFα与介白素-10之比显著更低(P＜0.05；图5)。TNFα为促发炎性细胞介素，但介白素-10为抗炎性细胞介素。抑郁患者通常比彼等非抑郁者具有更高的TNFα含量但更低的IL-10含量，且TNFα:IL-10比与抑郁症状之严重度显著相关。吾人之本发明发现结果表明发酵乳杆菌PS150及发酵乳杆菌PS150之蛋白质部分将慢性温和压力引起之焦虑、抑郁及压力行为标准化，恢复回至最初的非压力状态，极有可能是通过细胞介素之调节。发酵乳杆菌PS150及发酵乳杆菌PS150之蛋白质部分亦具有与阿普唑仑相似的效应，此指示如市售抗抑郁药之相似压力减小效应。

实例3 针对脑认知之改善及神经元细胞凋亡之保护的分析

已有充分的文献记载压力通常对记忆及其他认知功能施加负面影响。为评估认知表现，使用莫氏水迷宫从而评估记忆保持，及使用新物件识别测试从而评估学习及鉴定记忆。

莫氏水迷宫是一广泛使用的任务且为行为生理学家及药理学家接受用于评估及比较龋齿动物之学习及记忆。所述实验中使用空间学习(最基本的莫氏水迷宫程序)。其背后的概念在于动物必须学会使用远端提示从而在从槽周边附近的不同随机位置开始时找到通往隐藏平台之直接路径。水迷宫的直径为210cm并具有为51cm高的具有非反射性内表面之侧面。逃避潜伏期(EL)为动物从起始象限移动直至在目标象限中找到隐藏平台所花的时间。经发酵乳杆菌PS150及蛋白质部分处理之组相较于阴性对照组显著缩短逃避潜伏期，然而阴性对照组相较于其他组显著增加逃避潜伏期(P＜0.05；图6(a))。未处理的对照组、阳性对照组、经发酵乳杆菌PS150处理之组及经蛋白质部分处理之组间观测到不显著的差异(图6(a))。相较于阴性对照大鼠，经发酵乳杆菌PS150及蛋白质部分处理之组在新物件识别测试中显著具有更高的识别指数(图6(b))，且效应类似于阳性对照大鼠(抗抑郁药组)及未处理的对照(无压力)大鼠之效应(P＜0.05)。吾人之本发明发现结果指示发酵乳杆菌PS150及蛋白质部分发酵乳杆菌PS150将大鼠之慢性温和压力引起之认知功能受损标准化(显著比阴性对照组更佳)。

TNF-α通过活化下视丘-垂体-肾上腺(HPA)轴，刺激吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)(其导致色胺酸耗尽)，通过神经元之免疫介导破坏，或麸胺酸之神经毒性释放，造成神经退化性疾病之致病。IDO为使色胺酸降解成犬尿胺酸之酵素，此涉及神经退化性疾病之病理生理学。若相较于阴性对照及阳性对照，发酵乳杆菌PS150及蛋白质部分组中血浆TNFα含量与介白素-10含量之比率较低，则亦观测到血浆IDO含量显著减低(P＜0.05；图7(a))。若相较于阴性对照组，发酵乳杆菌PS150及蛋白质部分组中侦测到较低的血浆IDO浓度，则亦观测到较高的血浆色胺酸含量(P＜0.05；图7(b))。吾人的资料显示相较于阴性对照组，发酵乳杆菌PS150及蛋白质部分组中较少量的色胺酸被降解成犬尿胺酸，同时血浆犬尿胺酸含量亦显著较低(P＜0.05；图7(c))。吾人的本发明发现结果指示发酵乳杆菌PS150及发酵乳杆菌PS150之蛋白质部分：(a)通过减少犬尿胺酸生成阻止神经退化(明显比阴性对照组更佳)及(b)使得神经退化恢复回至正常状态且与抗抑郁药一样良好(与阳性对照/阿普唑仑及未处理的对照组类似的效应)。

另一方面，色胺酸亦为血清素之前驱物。亦收集脑样本从而用于测量血清素含量。血清素为参与神经脉冲之传递及调节神经元之间的信号之神经传递质。吾人的本发明发现结果显示相较于阴性对照组，发酵乳杆菌PS150及蛋白质部分组中之脑血清素浓度显著提高(P＜0.05；图8)。结果与发酵乳杆菌PS150及蛋白质部分组中所观测到的血浆色胺酸含量之增加相一致。吾人之本发明发现结果指示发酵乳杆菌PS150及发酵乳杆菌PS150之蛋白质部分：(a)恢复由于大鼠之慢性温和压力而减少之脑中神经元之传递，从而导致更佳的认知(显著比阴性对照组更佳)及(b)发挥比市售抗抑郁药更佳的疗效(显著比阳性对照/阿普唑仑组更佳)。

于压力下，在大鼠脑中观测到变化的细胞凋亡特征。单胺氧化酶(MAO)为控制脑中神经传递质之含量之粒线体酵素，其中MAO-A是通过卡斯蛋白酶-3之活化及反应性氧物质之生成在细胞凋亡中发挥作用。过氧化氢因其作为凋亡细胞死亡之介体的角色而通常从凋亡细胞侦测到。根据慢性压力方案，相较于阴性对照大鼠，投与PS150之大鼠显示较低的脑MAO-A浓度(图9(a))(P＜0.05)。相较于阴性对照组，在投与PS150或蛋白质部分之大鼠中观测到较低的脑过氧化氢浓度之情况下，细胞凋亡特征之缓解是显然的(图9(b)，P＜0.05)。

行为及脑评估均指示PS150及PS150之蛋白质部分预防大鼠之由于慢性温和压力引起之脑损伤，具有与市售抗抑郁药相似的效能，获得标准化空间学习、长期记忆及认知功能，及预防神经退化及神经元细胞凋亡。

实例4 鉴定来自发酵乳杆菌PS150之基因及蛋白质

遵循所有这些阳性发现结果，进一步分离发酵乳杆菌PS150之蛋白质部分，并鉴定。通过硫酸铵沉淀预纯化蛋白质部分并接着基于三步骤层析程序回收。蛋白质部分通过在HiTrap Q HP柱上之逆相高效液相层析(RP-HPLC)之最终纯化步骤揭示在5％、15％、20％、25％、30％、50％、55％、60％及90％之溶剂B(含有1M NaCl之25mM Tris HCl)时洗脱的9个主峰(图10)。个别地收集洗脱峰(分别称为部分A、B、C、D、E、F、G、H及I)并检查抗地塞米松之神经保护活性。

细胞凋亡为可通过多种外部刺激(诸如压力之生物标记，皮质酮)增强之正常生理程式化细胞死亡。地塞米松(合成皮质酮)是用于评估发酵乳杆菌PS150之蛋白质部分之神经保护活性。资料显示仅部分A具有最盛行之神经保护作用(图11)。未经地塞米松处理之阳性对照细胞视为100％存活率。相较于两种经未发酵介质处理之细胞(存在或不存在地塞米松)，发酵乳杆菌PS150之蛋白质部分显示显著细胞保护效应。

经纯化之部分A显示于SDS-PAGE上之具有约55kDa之估算分子量之单谱带(图12)。对于蛋白质鉴定而言，使自HPLC收集之经纯化之蛋白质接受MALDI-TOF质谱分析。鉴定整个胰蛋白酶消化过程中所观测到的质量峰。产生所有可能的片段并鉴定其对应之分子量及肽序列。随后，使用PEAKS studio第6.0版进行资料分析及使用于发酵乳杆菌PS150之基因组中编码之所有蛋白质之功能注解资料库进行潜在的生物活性肽序列之选择。

就发酵乳杆菌PS150之注解基因组而言，将自质谱分析得到的所有肽序转化成细菌之经核苷酸转译之蛋白质序列。在所转化的150个肽当中，仅发现两个肽与来自细胞之蛋白质相同，且两个肽序列与发酵乳杆菌PS150之蛋白质中之一者100％相匹配。就所述匹配而言，蛋白质之序列经确定为SEQ ID NO:4之序列。所述蛋白质是经回译至具有SEQ ID NO:7之序列的核苷酸序列，从而得到其基因序列。

SEQ ID NO:7

所述生物活性蛋白质经鉴定为延伸因子Tu，其具有396个氨基酸残基。实际上，所述分子为于细胞质中之蛋白质合成中发挥重要作用之鸟苷核苷酸结合蛋白质。然而，已有充分的文献记载微生物之不同隔室中存在EF-Tu。已显示EF-Tu分子(最初被认为是受限于细菌之细胞质)亦与大肠杆菌膜相关联。最新的研究显示EF-Tu为可从细胞释放之与包膜相关联之蛋白质。

延伸因子Tu能够触发大鼠之免疫调节反应。在所述研究中，经蛋白质部分处理之大鼠诱导抗炎性免疫反应(TNF-α与IL-10之比减小；P＜0.05；图5)。通过减低TNF-α(此通过刺激吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)造成神经退化性发病)，血浆IDO浓度亦减小(P＜0.05；图7(a))。此最终使得色胺酸转化成犬尿胺酸之转化率减小(P＜0.05；图7(b)及(c))，并导致血清素生成增加。延伸因子Tu之免疫调节活性亦使得血浆皮质酮含量减小，此造成焦虑、抑郁及压力之缓解。

总言之，吾人的资料证实所述由发酵乳杆菌PS150产生之具有如上述SEQ ID NO:4之序列之生物活性蛋白质为免疫调节化合物，吾人的资料支持除了提高认知以外对于焦虑、抑郁及压力之缓解，均与更健康的脑功能有关。在此吾人提出益生菌生物活性化合物(诸如由发酵乳杆菌PS150产生之延伸因子)可发挥脑健康效益之证据。

实例5 发酵乳杆菌PS150之延伸因子Tu之蛋白质变异性分析

Shannon熵是用于估算EF-Tu蛋白质变异性。在21个字元系统中，H在0(即高度保守，仅单一字元在比对柱中)至4.392(即，所有21个字元平等地存在)范围内。针对来自乳杆菌属之跨整个蛋白质长度具有蛋白质之三个关键域(GTP EFTU、GTP EFTU D2及GTP EFTUD3)之235个细菌物种及25个细菌物种估算熵。

高变异性残基被归类为彼等具有超过平均熵临限值加两个标准偏差之熵者。使用平均值加两个标准偏差之值，因为对于大多数分布而言，大于其之值被视为极端值。因此，第一域GTP EFTU具有最多数目之可变残基，其次是最后一个域GTP EFTU D2，再次是GTPEFTU D3。特别受关注的是，当考虑所有235个细菌物种时具高变异性，但当仅包含来自乳杆菌属之物种时不具高变异性之残基。此处为符合所提及标准之残基的列表：40K、41G、42L、44K、46E、161E、185E、195D、327S、345E及360T。当考虑所有235个细菌物种时，所有这些残基具有高于2.63之熵，此意指各残基显示至少60％之理论最大变异性(4.392)之变异性。这些残基表示可为发酵乳杆菌PS150EF-Tu在其脑健康效应方面之关键辨别因子之推定结合位点。

蛋白质之结合位点通常是暴露的或彼等将处在构型变化中。为评估在前一段中侦测到的高变异性残基中任一者是否位于EF-Tu之3D蛋白质结构之暴露部分上，建构所述蛋白质之同源模型。将高变异性残基映射于同源模型化3D EF-Tu蛋白质质结构上揭示残基40K、41G、42L、44K、46E及327S位于分子之表面上。有趣地，注意到残基40K、41G、42L、44K及46E仅于残基43A及45A之处连续标点。事实上，残基43A及45A两者亦显示熵值分别为2.004及2.578之高变异性，但这些值低于截止临限值。虽然残基327S亦具高变异性，但其位置远离残基40至46。其他残基161E、185E、195D、345E及360T包埋于EF-Tu分子本身中。

实例6 PS150之睡眠促进效应

对BALB/c小鼠连续14天每天一次经口投与10⁹CFU/小鼠发酵乳杆菌PS150。从而仅提供PBS对动物平行测试对照小鼠。对阳性对照组提供DIPH-HCL(盐酸苯海拉明，20mg/kg)作为阳性对照。在十四天实验期间每天测量体重(BW)。在第十四天，于胃内(i.g.)投与PBS、PS 150及DIPH-HCL 30分钟之后，经腹膜内(i.p.)注射戊巴比妥钠(50mg/kg)至每只小鼠，从而测试戊巴比妥诱导之睡眠的持续时间。观测每只小鼠之睡眠之潜伏期及持续时间。戊巴比妥注射与翻正反射(righting reflex)损失之间的实耗时间记录为睡眠潜伏期，及翻正反射之损失与恢复之间的实耗时间记录为睡眠的持续时间。图13显示在戊巴比妥诱导之睡眠测试中PS150对睡眠潜伏期(a)及睡眠持续时间(b)的影响。结果显示PS150可缩短睡眠潜伏期时间及延长睡眠持续时间。

序列表

<110> 益福生医股份有限公司

<120> 新颖乳酸菌及其应用

<130> LV22817

<160> 7

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 486

<212> DNA

<213> 新颖序列

<400> 1

atgaggaaca atcaaagtaa cacgccgcta atttcagtga ttattcctgc atataaagtc 60

gaaaaatact tagcgttttg tgttgaatca gttgttgcac aaactttaac tggttatgaa 120

gtgattattg tcgatgatgg ctcaccagat aatactggag agatcacgga tcacttagcg 180

caacaatatg aagcggttaa ggtgattcat caagaaaacg caggagttag taccgcacgg 240

aatacgggga ttgacaacgc tcaagggaaa tatattactt ttattgatgg tgatgatttt 300

atcgctccga cttttctgga gtatatggtt aatatggtag agaaaaccca ttcggatttc 360

ggactggctc tagattgttt tacgaagaat gatgagaaac ctttggatca aactgaagat 420

aaagtgtatg ctccagaaaa ggcggtaagt ttgttgctat ccccacgtgt aattgttggc 480

tgttag 486

<210> 2

<211> 987

<212> DNA

<213> 新颖序列

<400> 2

atgaatgatg ttccatcacc gtactatgat gaaattatag aacggggttc aaaaatattc 60

attctgccgc caataaataa cgtttaccat cattatcagg aatgcaaaaa gatattacga 120

gatggggatt acgatgttgt ttgtgataac aacttgatta aatccatccc aatgatgctt 180

gctgctaaga aatgtggagt tcctgtacgg attttgcata gtcacaacac gaaattaagc 240

acaatcatca agaaggaatg gattacgaag ctcctattgc cattattgaa aagggaaatt 300

acagattatt gtgcatgcgg ccaactagct ggggaagcac tatttgggaa agctaagttt 360

acggttattc caaatgtaat ctcaccagaa acgaacacct ttgataaagt caagagagat 420

aaaatcagaa aagagcttgg cgttgacgat aaggttgttg tagggactgt tggtcggaca 480

tctatacaaa aaaaccctta tttcgcaatt gatgtaattg agaaggtaca ccaaagtaat 540

cctagtattg tttattggtg gattggtagt ggtgaactag atgatcaact gagagcgtac 600

gtagaaaaga aggggttagg taaggttgta tctttcctag gaagtaggga tgatgttcaa 660

gatctttacc aggcaatgga tgtattcttt ttaccctcgc tttttgaagg tttaccacta 720

actggagttg aagctcaagc aatggggtta ccgtcgattt tatcagctag cgttacagat 780

agattggtat ataccgatct ggtaaagtac gtatcgttgg atgaacctat cgaagaatgg 840

gaaaaagctt ttaaaaaagc gatcgaacgg attccacaaa ggagggcata tacagaagaa 900

cttaagcaga gcgtttattc agctgaagat gcgggaaaga atatgacaaa gatttacgag 960

gatcttctcg cctcaaaatt gcggtaa 987

<210> 3

<211> 1086

<212> DNA

<213> 新颖序列

<400> 3

atgattcgga tattacaatt accaaacact atttctcgag aaaatggtcg catgtcagta 60

attatgagta tatataggca catagataga accaagattc agtttgattt tgcggtatct 120

gagtctagtg gcgatactta tcttgatgaa attaaaaagc ttggaggcaa ggtatttgtg 180

attccatctg gcgaggtttc ctacaaaagt gttgtcaaga tggttaatat gctccttaag 240

aaaagagagt attcatttat acattatcac gcaatctcaa tttggggagt tgctctaaac 300

gttgcacatc ggcatggtgt aaagataatc acacacagtc atgcaacata ttttagcgat 360

ggatttatga agtcaattcg aaatcgaatc ttttctctaa atataaagtt atattcagat 420

aagttggcag ctgtttcccc agaagcgggt agaactttat ttggaaaaca acaatatata 480

tatataccaa atgtaattaa ttataaaaaa tatactttct cgcgtaataa tagagaaaaa 540

attcgtcggc aatataacat tgatgatggt gactttgtcg ttggtcatgt aggacgtctg 600

tcaaaacaaa aaaaccatca atttctgatc agagccttta gtctattaca tgcatcggcg 660

gaaaagtaca aattaatgct cgtgggtagt ggaccactcg aaaatgatct gaggacactt 720

gtaagtcaac tgaatattga aaggtcagtt atttttgttg gtgcaaagca agatgtaact 780

gcgttttatt cagcatttga cttgttctgg ttaccttcct tgtatgaggg attgcctacg 840

gttggattgg aagcgcaggc taacggtctt tcaatcattg caagtgatcg tatttcacct 900

gagctagcca ttgaaaatgt tattttttct ccaattaggc ataaaagcga tttacaaaaa 960

tggtgtcata tcactctgga gcgagattgg cctcgctcta cagatgtcat gcggacgatt 1020

gaacatagtc ggtataatta tcaacatgtc ttagatcaat ggaaaagcct atatgatatg 1080

aagtaa 1086

<210> 4

<211> 396

<212> PRT

<213> PS150之EF-Tu蛋白

<400> 4

Met Ala Glu Lys Glu His Tyr Glu Arg Thr Lys Pro His Val Asn Ile

1 5 10 15

Gly Thr Ile Gly His Val Asp His Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Ala

20 25 30

Ile Thr Lys Val Leu Ala Ala Lys Gly Leu Ala Lys Ala Glu Asp Tyr

35 40 45

Ser Asp Ile Asp Ala Ala Pro Glu Glu Lys Glu Arg Gly Ile Thr Ile

50 55 60

Asn Thr Ala His Val Glu Tyr Glu Thr Glu Lys Arg His Tyr Ala His

65 70 75 80

Ile Asp Ala Pro Gly His Ala Asp Tyr Val Lys Asn Met Ile Thr Gly

85 90 95

Ala Ala Gln Met Asp Gly Ala Ile Leu Val Val Ala Ala Thr Asp Gly

100 105 110

Pro Met Pro Gln Thr Arg Glu His Ile Leu Leu Ala Arg Gln Val Gly

115 120 125

Val Glu Tyr Ile Val Val Phe Leu Asn Lys Thr Asp Leu Val Asp Asp

130 135 140

Asp Glu Leu Val Asp Leu Val Glu Met Glu Val Arg Asp Leu Leu Ser

145 150 155 160

Glu Tyr Asp Phe Pro Gly Asp Asp Val Pro Val Val Arg Gly Ser Ala

165 170 175

Leu Lys Ala Leu Glu Gly Asp Pro Glu Gln Glu Gln Val Val Leu His

180 185 190

Leu Leu Asp Val Val Asp Glu Tyr Ile Pro Thr Pro Lys Arg Pro Thr

195 200 205

Asp Lys Pro Phe Met Met Pro Val Glu Asp Val Phe Thr Ile Thr Gly

210 215 220

Arg Gly Thr Val Ala Ser Gly Arg Ile Asp Arg Gly Thr Val Lys Ile

225 230 235 240

Gly Asp Glu Val Glu Ile Val Gly Leu Lys Glu Asp Val Ile Lys Ser

245 250 255

Thr Val Thr Gly Val Glu Met Phe His Lys Thr Leu Asp Leu Gly Glu

260 265 270

Ala Gly Asp Asn Val Gly Val Leu Leu Arg Gly Val Ser His Asp Gln

275 280 285

Ile Glu Arg Gly Gln Val Leu Ala Glu Pro Gly Ser Ile Gln Thr His

290 295 300

Lys Gln Phe Lys Gly Glu Val Tyr Val Met Thr Lys Glu Glu Gly Gly

305 310 315 320

Arg His Thr Pro Phe Phe Ser Asn Tyr Arg Pro Gln Phe Tyr Phe His

325 330 335

Thr Thr Asp Val Thr Gly Thr Ile Glu Leu Pro Asp Gly Val Glu Met

340 345 350

Val Met Pro Gly Asp Asn Val Thr Phe Thr Val Glu Leu Gln Lys Pro

355 360 365

Val Ala Leu Glu Lys Gly Leu Lys Phe Thr Ile Arg Glu Gly Gly His

370 375 380

Thr Val Gly Ala Gly Val Val Ser Glu Val Leu Asp

385 390 395

<210> 5

<211> 1540

<212> DNA

<213> 16S rDNA序列

<400> 5

tcaggatgaa cgccggcggt gtgcctaata catgcaagtc gaacgcgttg gcccaattga 60

ttgatggtgc ttgcacctga ttgattttgg tcgccaacga gtggcggacg ggtgagtaac 120

acgtaggtaa cctgcccaga agcgggggac aacatttgga aacagatgct aataccgcat 180

aacaacgttg ttcgcatgaa caacgcttaa aagatggctt ctcgctatca cttctggatg 240

gacctgcggt gcattagctt gttggtgggg taacggccta ccaaggcgat gatgcatagc 300

cgagttgaga gactgatcgg ccacaatggg actgagacac ggcccatact cctacgggag 360

gcagcagtag ggaatcttcc acaatgggcg caagcctgat ggagcaacac cgcgtgagtg 420

aagaagggtt tcggctcgta aagctctgtt gttaaagaag aacacgtatg agagtaactg 480

ttcatacgtt gacggtattt aaccagaaag tcacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg 540

taatacgtag gtggcaagcg ttatccggat ttattgggcg taaagagagt gcaggcggtt 600

ttctaagtct gatgtgaaag ccttcggctt aaccggagaa gtgcatcgga aactggataa 660

cttgagtgca gaagagggta gtggaactcc atgtgtagcg gtggaatgcg tagatatatg 720

gaagaacacc agtggcgaag gcggctacct ggtctgcaac tgacgctgag actcgaaagc 780

atgggtagcg aacaggatta gataccctgg tagtccatgc cgtaaacgat gagtgctagg 840

tgttggaggg tttccgccct tcagtgccgg agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga 900

gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca 960

tgtggtttaa ttcgaagcta cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatct tgcgccaacc 1020

ctagagatag ggcgtttcct tcgggaacgc aatgacaggt ggtgcatggt cgtcgtcagc 1080

tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgtt actagttgcc 1140

agcattaagt tgggcactct agtgagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggacg 1200

acgtcagatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacggtaca 1260

acgagtcgcg aactcgcgag ggcaagcaaa tctcttaaaa ccgttctcag ttcggactgc 1320

aggctgcaac tcgcctgcac gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg 1380

gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgagagt ttgtaacacc 1440

caaagtcggt ggggtaacct tttaggagcc agccgcctaa ggtgggacag atgattaggg 1500

tgaagtcgta acaaggtagc cgtaggagaa cctgcggttg 1540

<210> 6

<211> 401

<212> DNA

<213> 新颖序列

<400> 6

aagacacctt ctacgtgacc ccgtctgttt tgatgcggac ccaaacgtcg ccaatgcagg 60

cccggatgct ggaacaacac gacttctcca aggggccgtt gaagatgatc tcaccgggga 120

aggtttaccg ccgcgacacc gatgacgcta cccacagcca ccaattccac caggttgaag 180

gaatcgtggt cggtgaacac gtcacgatgg cagatttaaa ggggacccta gaggcagtgg 240

cccaaaacct gtttggcgac cagctcaagg tgcgtctgcg cccgagttac ttcccgttca 300

cggaaccgtc cgtcgaggcc gacatcactt gctttaattg cctgggggcc ggttgctcaa 360

tctgtaaggg gactggttgg atcgaggtgt tgggggccgg c 401

<210> 7

<211> 1190

<212> DNA

<213> 新颖序列

<400> 7

atggcagaaa aagaacatta tgaacgtact aagccccacg ttaacatcgg tactattggc 60

cacgttgacc acgggaagac tactttaacc gcagctatca ccaaggtatt ggccgctaag 120

ggccttgcca aggcagaaga ctactctgat atcgatgctg ctccagaaga aaaggaacgt 180

ggtatcacta tcaacactgc ccacgttgaa tacgaaacgg aaaagcgtca ctacgctcac 240

atcgacgctc cagggcacgc cgactacgtt aagaacatga tcactggggc cgctcaaatg 300

gacggtgcga tcttagttgt tgccgcaact gatggtccga tgccacaaac tcgtgaacac 360

atccttctgg ctcgccaggt cggtgttgaa tacatcgttg tcttccttaa caagactgac 420

cttgttgacg atgacgaact ggttgactta gttgaaatgg aagttcgtga ccttctgtcc 480

gaatacgact tccctggcga tgatgttccg gttgttcgtg ggtccgctct taaggccctc 540

gaaggtgacc cagaacaaga acaagttgtt cttcaccttc tggacgtcgt tgacgaatac 600

atcccaactc caaagcgtcc tactgacaag ccattcatga tgcctgtcga agacgtcttc 660

actatcactg gtcgtggtac tgttgcttct ggtcgtatcg accgtggtac tgttaagatc 720

ggtgacgaag ttgaaatcgt tggtttgaag gaagacgtta tcaagtccac tgttaccggt 780

gttgaaatgt tccacaagac ccttgatctt ggggaagccg gggacaacgt cggtgtcctt 840

ttacgtgggg tttctcacga ccaaatcgaa cgtggtcaag ttctggcaga accaggctcc 900

atccaaacgc acaagcaatt caagggtgaa gtctacgtta tgaccaagga agaagggggc 960

cgtcacacgc cattcttctc caactaccgc ccacaattct acttccacac tactgacgtt 1020

actggtacca ttgaactccc agatggtgtt gaaatggtta tgcctggtga caacgttacc 1080

ttcactgttg aactgcaaaa gccagttgcc cttgaaaagg gtctgaagtt caccatccgt 1140

gaaggtggtc acactgttgg tgccggtgtg gtatccgaag tgctcgacta 1190

PCT/RO/134表

Claims

1.一种经单离之乳酸菌(LAB)，其为具有如以SEQ ID NO:1至3显示之核酸序列中任一者之发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)PS150。

2.如权利要求1之经单离之LAB，其为发酵乳杆菌PS 150，其已于2016年6月6日由德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)依布达佩斯条约(Budapest Treaty)寄存，且指定寄存编号为DSMZ 32323。

3.一种蛋白质部分，其是从如权利要求1或2之LAB的细胞外蛋白质获得，并包含具有SEQ ID NO:4之氨基酸序列的EF-Tu蛋白质或其功能片段。

4.一种组合物，其包含如权利要求1或2之LAB细胞、具有SEQ ID NO:4之氨基酸序列的EF-Tu蛋白质或其功能片段、或如权利要求3之蛋白质部分，及视需要之食用载剂或医药上可接受之载剂。

5.如权利要求4之组合物，其为营养产品、膳食补充物、食品或医药产品。

6.如权利要求4之组合物，其为粉末、悬浮液、颗粒、锭剂、丸剂、胶囊、饮品或乳制品。

7.一种如权利要求1或2之LAB细胞、具有SEQ ID NO:4之氨基酸序列的EF-Tu蛋白质或其功能片段、如权利要求3之蛋白质部分或如权利要求4之组合物之用途，其用于制造用于改善个体之情感障碍或神经病况，及治疗或预防个体之与神经元的细胞凋亡或神经退化有关之疾病的药物。

8.如权利要求7之用途，其中这些LAB细胞的量在约10⁵至约10¹³个菌落形成单位(cfu)范围内。

9.如权利要求7之用途，其中这些LAB细胞的量在约10⁶至约10¹²个cfu范围内。

10.如权利要求7之用途，其中所述蛋白质部分的量在约15mg/kg至约500mg/kg范围内。

11.如权利要求7之用途，其中所述蛋白质部分的量在约40mg/kg至约300mg/kg范围内。

12.如权利要求7之用途，其中所述EF-Tu蛋白质的量在约15μg/kg至约500μg/kg范围内。

13.如权利要求7之用途，其中所述情感障碍及神经病况为焦虑、抑郁、压力、睡眠紊乱、认知功能减退、认知受损(包括轻度认知受损(MCI))、记忆衰退、一般回忆问题、认知障碍或神经退化性疾病。

14.如权利要求7之用途，其中所述压力为慢性温和压力。

15.如权利要求7之用途，其中所述情绪障碍及神经病况为焦虑、抑郁、压力或睡眠紊乱。

16.如权利要求13之用途，其中所述神经退化性疾病为阿滋海默氏症(Alzheimer'sdisease)、杭丁顿氏舞蹈症(Huntington's disease)、帕金森氏症(Parkinson'sdisease)、痴呆、肌萎缩性侧索硬化症、中风或精神分裂症。

17.如权利要求7之用途，其中与神经元的细胞凋亡或神经退化有关的所述疾病为中风(stroke)、阿滋海默氏症、杭丁顿氏舞蹈症、帕金森氏症、匹克症(Pick's disease)、库贾氏症(Creutzfeldt-Jakob's disease)、帕金森-ALS-痴呆复合症、威尔逊氏症(Wilson'sdisease)、多发性硬化症、进行性核上性麻痹、与神经性疼痛有关的双极症、皮质基底变性、精神分裂症、注意力不足过动症(ADHD)、痴呆、肌萎缩性侧索硬化症、视网膜疾病、癫痫症、中风(apoplexy)、暂时性缺血性发作、心肌缺血、肌缺血、因延长血流至脑部之暂停时间有关的手术技术所引起的缺血、头部损伤、脊髓损伤、缺氧或抑郁。

18.如权利要求7之用途，其中所述LAB细胞、所述EF-Tu蛋白质、所述蛋白质部分或所述组合物可降低吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)的表达，降低色胺酸形成犬尿胺酸之转换率，增加血清素含量或降低血浆皮质酮含量。