CN109715177A - 调节消化道微生物组以治疗精神病或中枢神经系统疾病 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过调节受试者消化道中产生的GABA的量来治疗受试者中精神病或中枢神经系统疾病的至少一种症状的方法。本发明还涉及培养细菌菌株、新型细菌菌株的方法。还公开了鉴定能够产生GABA的细菌菌株和工程改造菌株以产生GABA的方法。

Description

调节消化道微生物组以治疗精神病或中枢神经系统疾病

相关申请的交叉引用

本申请要求享有于2016年3月14日提交的美国临时申请号62/307，991的优先权和权益，其内容通过引用以其整体并入本文。

并入序列表

于2017年3月13日创建并且大小为7.6 MB的名称为“HOBE001001WOSeqList.txt”的文本文件的内容通过引用以其整体并入本文。

政府资助

本发明是在由美国国立卫生研究院授予的3R01HG005824-02S1下的政府支持下完成的。政府在本发明中具有某些权利。

发明领域

本发明涉及用于治疗受试者中疾病的至少一种症状的组合物和方法。在一些情况下，所述疾病是精神病症或中枢神经系统疾病。本发明教导了通过调节（例如增加）受试者体内内源性GABA的量治疗疾病。在一些实施方案中，本发明教导了调节（例如增加）由消化道中细菌在受试者消化道内产生的GABA的量。例如，本发明教导了向有需要的受试者施用能够（例如在人消化道内）产生GABA的细菌。

本发明还涉及培养先前未培养的细菌菌株的方法。例如，本发明教导了先前未培养的细菌菌株Evtepia gabavorous KLE1738。如本文先前所述，可以通过提供细菌生长和繁殖所需的生长因子培养新的、未培养的细菌菌株诸如 Evtepia gabavorous KLE1738。

还公开了鉴定能够产生某些生长因子的细菌菌株的方法。例如，本文描述了鉴定例如在生理相关条件（诸如在生理相关pH下），能够产生GABA的细菌菌株的方法。

发明背景

消化道微生物组影响某些胃肠道和代谢病症，诸如肠易激综合症（IBS）、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、腹腔疾病、肥胖、心脏病、I型和II型糖尿病和结肠癌。

目前微生物学研究不可避免地受到可培养的微生物的限制。据估计，在外部环境中，99%的细菌被认为是不可培养的。开发用于培养先前未培养或不可培养的细菌因此可以帮助扩展微生物学研究的范围。

发明概述

本发明提供了用于治疗疾病诸如精神病或中枢神经系统疾病的组合物和方法。在一些实施方案中，本发明教导了治疗性组合物，其包括一种或多种能够产生GABA的细菌（例如纯化的细菌）。所述细菌能够在生理相关条件下（包括在人消化道内）产生GABA。本发明还提供了治疗有需要的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗性组合物，所述治疗性组合物包含产生GABA的细菌。如本文先前所述，所述产生GABA的细菌可以在所述受试者的消化道中产生GABA。GABA可以扩散至受试者体内的其它系统中（例如循环和神经系统）。因此，内源性GABA可以作为神经递质起作用。在一些实施方案中，GABA增加的水平（例如在神经系统中）可以改善精神病或中枢神经系统疾病的症状。

在一些实施方案中，本发明还提供了用于鉴定在生理相关pH范围下在人中产生GABA的细菌的方法和这些细菌用于调节人中GABA水平以治疗精神病的应用。

本发明还涉及培养先前未培养的细菌物种的方法。例如，本发明教导了细菌物种KLE1738（先前称为Evtepia gabavorous）的分离和表征。E. gabavorous的生长需要生长因子GABA的存在，其可以由产生GABA的细菌诸如脆弱拟杆菌KLE1758提供。

在一个方面，本发明提供了治疗性组合物，其包含至少一种纯化的细菌群体，所述细菌群体由能够在有需要的受试者中产生GABA的细菌组成。

在一些实施方案中，所述至少一种细菌群体由包含与选自表1中所示的Seq. ID.No. 1-31之一的16S rDNA序列具有至少约95%同一性的16S rDNA序列的细菌组成。在一些实施方案中，所述至少一种纯化的细菌群体由选自以下的细菌组成：粪便拟杆菌（Bacteroides caccae） KLE1911; Bacteroides clarus KLE1930; Bacteroides doreiKLE1912; Bacteroides finegoldii KLE1931; 脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）KLE1958; Bacteroides massiliensis KLE1932; 椭圆形拟杆菌（Bacteroides ovatus）KLE1770; 粪便拟杆菌（Bacteroides stercoris） KLE1933; 多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron） KLE1934; 单形拟杆菌（Bacteroides uniformis） KLE1913; 普通拟杆菌（Bacteroides vulgatus） KLE1910; 解木聚糖拟杆菌（Bacteroides xylanisolvens）KLE1935; 青春双岐杆菌（Bifidobacterium adolescentis） KLE 1879; Blautia obeumKLE1914; Blautia wexlerae KLE1916; Butyricimonas virosa KLE1938; 产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens） KLE1937; 索氏梭菌（Clostridium sordellii） KLE1939;梭菌属（Clostridium sp.） KLE1862; 梭菌属 KLE1918; 粪芽孢菌属（Coprobacillus sp.） KLE1779; 粪球菌属（Coprococcus sp.）KLE1880; Dorea longicatena KLE1917; 迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta） KLE1926; 直肠真杆菌（Eubacterium rectale）KLE1922; Gordonibacter pamelaeae KLE1915; Oscillibacter sp. KLE1928; 吉氏拟杆菌（Parabacteroides distasonis） KLE2020; Parabacteroides merdae KLE1863; 活泼瘤胃球菌（Ruminococcus gnavus） KLE1940; Turicibacter sanguinis KLE1941或其组合。

在一些实施方案中，所述至少一种纯化的细菌群体由包含与选自表2中所示的Seq. ID. No. 32-274之一的16S rDNA序列具有至少约95%同一性的16S rDNA序列的细菌组成。在一些实施方案中，所述至少一种纯化的细菌群体由包含与选自表10中所示的Seq.ID. No. 305-2217之一的16S rDNA序列具有至少约95%同一性的16S rDNA序列的细菌组成。在一些实施方案中，所述至少一种纯化的细菌群体由含有编码选自以下的酶的DNA序列的细菌组成：谷氨酸脱羧酶；腐胺氨基转移酶；γ-氨基丁醛脱氢酶；精氨酸脱羧酶；精胺酶；鸟氨酸脱羧酶或其组合。在一些实施方案中，所述谷氨酸脱羧酶；腐胺氨基转移酶；γ-氨基丁醛脱氢酶；精氨酸脱羧酶；精胺酶；鸟氨酸脱羧酶或其组合由与表3中所示的Seq. ID.No. 275-304中任一的DNA序列具有至少70%相似的DNA序列编码。

在一些实施方案中，所述谷氨酸脱羧酶由在DNA序列上与表4中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因具有至少95%相似的DNA序列编码。在一些实施方案中，所述腐胺氨基转移酶由在DNA序列上与表5中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因具有至少95%相似的DNA序列编码。在一些实施方案中，所述γ-氨基丁醛脱氢酶由在DNA序列上与表6中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因具有至少95%相似的DNA序列编码。在一些实施方案中，所述精氨酸脱羧酶由在DNA序列上与表7中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因具有至少95%相似的DNA序列编码。在一些实施方案中，所述精胺酶由在DNA序列上与表8中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因具有至少95%相似的DNA序列编码。在一些实施方案中，所述鸟氨酸脱羧酶由在DNA序列上与表9中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID是基因具有至少95%相似的DNA序列编码。

在一些实施方案中，所述至少一种纯化的细菌群体由包含与选自以下的参考细菌具有至少约95%相似性的16S rDNA序列的细菌组成：大肠杆菌 MG1655; 大肠杆菌 Nissle1917或其组合。

在一些实施方案中，所述细菌群体由能够在生理相关pH下产生GABA的细菌组成。在一些实施方案中，所述细菌群体由能够在约4.5至约7.5的pH范围下产生GABA的细菌组成。在一些实施方案中，所述细菌群体由能够在人消化道内产生GABA的细菌组成。

在一些实施方案中，所述组合物为益生菌、益生元、胶囊、片剂、囊片、丸剂、糖锭、锭剂、粉剂、颗粒、医疗食物或其组合的形式。在一些实施方案中，所述组合物作为粪便移植物施用。

在一些实施方案中，所述细菌能够经由谷氨酸脱羧酶、腐胺氨基转移酶、γ-氨基丁醛脱氢酶、精氨酸脱羧酶、精胺酶和/或鸟氨酸脱羧酶的任意组合的表达产生GABA。

在一些实施方案中，所述治疗性组合物进一步包含对消耗GABA的细菌是细胞毒性或细胞抑制性的纯化的细菌菌株。在一些实施方案中，所述消耗GABA的细菌是Evtepiagabavorous或厚壁菌门细菌（Firmicutes bacterium）MGS:114。

在一些实施方案中，所述治疗性组合物进一步包含能够刺激产生GABA的细菌的生长或GABA产生水平的益生菌。

在一个方面，本发明提供了在有需要的受试者中治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗性组合物，所述治疗性组合物包含至少一种由能够在有需要的受试者中产生GABA的细菌组成的纯化的细菌群体。

在一个方面，本发明提供了治疗性组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途，所述治疗性组合物包含至少一种纯化的细菌群体，所述细菌群体由能够在有需要的受试者中产生GABA的细菌组成。

在一个方面，本发明提供了治疗性组合物用于治疗疾病的用途，所述治疗性组合物包含至少一种纯化的细菌群体，所述细菌群体由能够在有需要的受试者中产生GABA的细菌组成。

在一些实施方案中，所述疾病或病症是精神病或病症。在一些实施方案中，所述精神病或病症选自：抑郁、躁郁症、精神分裂症、焦虑、焦虑症、成瘾、社交恐惧症、难治性重度抑郁症（TR-MDD）、重度抑郁症及其亚型（抑郁型忧郁、典型抑郁症、紧张性忧郁症、产后抑郁症和季节性情绪病症）、神经病变性淀粉样病症（帕金森氏病、阿尔茨海默病和亨廷顿氏病）、站立性颤抖、拉福拉病、不宁腿综合征、神经性疼痛、疼痛病症、痴呆、癫痫、僵人综合症、经前焦虑症、自闭症谱系障碍、睡眠障碍、多动症（ADHD）及其组合。在一些实施方案中，治疗疾病或病症包括减轻所述疾病或病症的至少一种症状，诸如疲劳、失眠、运动障碍、压力、持续性焦虑、持续性沮丧、社交退缩、物质戒断、易怒、自杀倾向、自残倾向、不安、性欲低下、注意力地下、癫痫、失忆、发怒、情绪反应发作、混乱、疼痛和肌肉痉挛、食欲丧失、改变肠运动性或其组合。

在一些实施方案中，所述至少一种细菌群体由包含与选自表1中所示的Seq. ID.No. 1-31之一的16S rDNA序列具有至少约95%同一性的16S rDNA序列的细菌组成。 在一些实施方案中，所述至少一种纯化的细菌群体由选自以下的细菌组成：粪便拟杆菌 KLE1911;Bacteroides clarus KLE1930; Bacteroides dorei KLE1912; Bacteroides finegoldiiKLE1931; 脆弱拟杆菌KLE1958; Bacteroides massiliensis KLE1932; 椭圆形拟杆菌KLE1770; 粪便拟杆菌 KLE1933; 多形拟杆菌 KLE1934; 单形拟杆菌 KLE1913; 普通拟杆菌 KLE1910; 解木聚糖拟杆菌 KLE1935; 青春双岐杆菌 KLE 1879; Blautia obeumKLE1914; Blautia wexlerae KLE1916; Butyricimonas virosa KLE1938; 产气荚膜梭菌KLE1937; 索氏梭菌 KLE1939; 梭菌属 KLE1862; 梭菌属 KLE1918; 粪芽孢菌属KLE1779; 粪球菌属KLE1880; Dorea longicatena KLE1917; 迟缓埃格特菌 KLE1926; 直肠真杆菌 KLE1922; Gordonibacter pamelaeae KLE1915; Oscillibacter sp. KLE1928;吉氏拟杆菌 KLE2020; Parabacteroides merdae KLE1863; 活泼瘤胃球菌 KLE1940;Turicibacter sanguinis KLE1941或其组合。

一些实施方案中，所述至少一种纯化的细菌群体由包含与选自表2中所示的Seq.ID. No. 32-274之一的16S rDNA序列具有至少约95%同一性的16S rDNA序列的细菌组成。

在一些实施方案中，所述至少一种细菌群体由包含与表10中所示的Seq. ID. No.305-2217中任一具有至少约95%同一性的16S rDNA序列的细菌组成。

在一些实施方案中，所述至少一种纯化的细菌群体由含有编码选自以下的酶的DNA序列的细菌组成：谷氨酸脱羧酶；腐胺氨基转移酶；γ-氨基丁醛脱氢酶；精氨酸脱羧酶；精胺酶；鸟氨酸脱羧酶或其组合。

在一些实施方案中，所述谷氨酸脱羧酶；腐胺氨基转移酶；γ-氨基丁醛脱氢酶；精氨酸脱羧酶；精胺酶；鸟氨酸脱羧酶或其组合由与选自表3中所示的Seq. ID. No. 275-304之一的DNA序列具有至少70%相似的DNA序列编码。

在一些实施方案中，所述谷氨酸脱羧酶由与表4中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJID的基因的DNA序列具有至少95%相似的DNA序列编码。在一些实施方案中，所述腐胺氨基转移酶由与表5中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因的DNA序列具有至少95%相似的DNA序列编码。在一些实施方案中，所述γ-氨基丁醛脱氢酶由与表6中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因的DNA序列具有至少95%相似的DNA序列编码。在一些实施方案中，所述精氨酸脱羧酶由与表7中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因的DNA序列具有至少95%相似的DNA序列编码。在一些实施方案中，所述精胺酶由与表8中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因的DNA序列具有至少95%相似的DNA序列编码。在一些实施方案中，所述鸟氨酸脱羧酶由与表9中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因的DNA序列具有至少95%相似的DNA序列编码。

在一些实施方案中，所述细菌经基因工程改造以产生GABA。在一些实施方案中，所述细菌经工程改造以经由谷氨酸脱羧酶；腐胺氨基转移酶；γ-氨基丁醛脱氢酶；精氨酸脱羧酶；精胺酶；鸟氨酸脱羧酶或其组合的表达产生GABA。

在一些实施方案中，其中谷氨酸脱羧酶；腐胺氨基转移酶；γ-氨基丁醛脱氢酶；精氨酸脱羧酶；精胺酶；鸟氨酸脱羧酶或其组合由与选自表3中所示的Seq. ID. No. 275-304之一的DNA序列具有至少70%相似的DNA序列编码。

在一些实施方案中，所述谷氨酸脱羧酶由与表4中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJID的基因的DNA序列具有至少95%相似的DNA序列编码。在一些实施方案中，所述腐胺氨基转移酶由与表5中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因的DNA序列具有至少95%相似的DNA序列编码。在一些实施方案中，所述γ-氨基丁醛脱氢酶由与表6中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因的DNA序列具有至少95%相似的DNA序列编码。在一些实施方案中，所述精氨酸脱羧酶由与表7中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因的DNA序列具有至少95%相似的DNA序列编码。在一些实施方案中，所述精胺酶由与表8中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因的DNA序列具有至少95%相似的DNA序列编码。在一些实施方案中，所述鸟氨酸脱羧酶由与表9中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因的DNA序列具有至少95%相似的DNA序列编码。

在一些实施方案中，所述至少一种纯化的细菌群体由包含与选自以下的参考细菌具有至少约95%相似性的16S rDNA序列的细菌组成：大肠杆菌 MG1655; 大肠杆菌 Nissle1917或其组合。

在一些实施方案中，所述细菌群体由能够在生理相关pH下产生GABA的细菌组成。在一些实施方案中，所述细菌群体由能够在约4.5至约7.5的pH范围下产生GABA的细菌组成。在一些实施方案中，所述细菌群体由能够在人消化道内产生GABA的细菌组成。在一些实施方案中，所述组合物作为粪便移植物施用。在一些实施方案中，所述组合物作为益生菌施用。在一些实施方案中，所述细菌可以经由谷氨酸脱羧酶、腐胺氨基转移酶、γ-氨基丁醛脱氢酶、精氨酸脱羧酶、精胺酶、鸟氨酸脱羧酶及其组合的任意组合的表达产生GABA。

在一些实施方案中，所述至少一种细菌菌株对消耗GABA的细菌是细胞毒性或细胞抑制性的。在一些实施方案中，所述消耗GABA的细菌是Evtepia gabavorous或厚壁菌门细菌MGS:114。

在一些实施方案中，所述治疗受试者的方法进一步包括通过由测量受试者粪便中GABA的起始量确定受试者是否会从增加内源性GABA获益来鉴定需要治疗的受试者。在一些实施方案中，受试者粪便中GABA的起始量低于约8 μg/湿或干粪便。在一些实施方案中，受试者粪便中GABA的量在施用所述治疗性组合物后相对于起始量增加。

在一些实施方案中，所述治疗受试者的方法进一步包括通过由测量受试者粪便中产生GABA的细菌的起始量确定受试者是否会从增加内源性GABA获益来鉴定需要治疗的受试者。在一些实施方案中，如通过16S序列作图测量的，在受试者粪便中的产生GABA的细菌的起始量小于总细菌的约10%。在一些实施方案中，在施用所述治疗性组合物后，相对于受试者粪便中产生GABA的细菌的起始量，受试者粪便中的至少一种产生GABA的细菌增加。

在一些实施方案中，所述治疗受试者的方法进一步包括通过由测量受试者血液或血清中GABA的起始量确定受试者是否会从增加内源性GABA获益来鉴定需要治疗的受试者。在一些实施方案中，受试者血液或血清中GABA的起始量低于约10 μg/升血液。在一些实施方案中，受试者血液或血清中GABA的量在施用所述治疗性组合物后相对于起始量增加。

在一些实施方案中，所述治疗受试者的方法进一步包括通过由测量受试者脑中GABA的量确定受试者是否会从增加内源性GABA获益来鉴定需要治疗的受试者。在一些实施方案中，受试者脑中GABA的起始量低于约1.0 mM/kg。在一些实施方案中，受试者脑中GABA的量在施用所述治疗性组合物后相对于起始量增加。

在一些实施方案中，所述治疗受试者的方法进一步包括通过由测量受试者粪便中产生GABA的酶的表达的起始量确定受试者是否会从增加内源性GABA获益来鉴定需要治疗的受试者。在一些实施方案中，产生GABA的酶选自谷氨酸脱羧酶、腐胺氨基转移酶、γ-氨基丁醛脱氢酶、精氨酸脱羧酶、精胺酶、鸟氨酸脱羧酶或其组合。在一些实施方案中，酶表达的起始量通过qPCR测量。在一些实施方案中，在施用所述治疗性组合物后酶的表达相对于酶表达的起始量增加。

在一些实施方案中，所述治疗受试者的方法进一步包括通过由测量受试者脑中GABAergic应答的起始量确定受试者是否会从增加内源性GABA获益来鉴定需要治疗的受试者。在一些实施方案中，受试者脑中GABAergic的量在施用所述治疗性组合物后相对于起始量增加。在一些实施方案中，所述治疗性组合物包含能够刺激产生GABA的细菌的生长或GABA产生水平的益生元。

在一个方面。本发明提供了培养GABA依赖性细菌的方法，其包括将至少一种活的GABA依赖性细菌细胞放置在合适的基质上，并提供GABA来源。

在一些实施方案中，所述合适的基质是琼脂。在一些实施方案中，提供了GABA来源，所述GABA来源包含与另一种细菌菌株共培养，所述菌株能够产生GABA。在一些实施方案中，将GABA添加至基质。在一些实施方案中，所述GABA依赖性细菌是E. gabavorous。

在一个方面，本发明提供了鉴定在人肠道的生理相关pH下能够产生GABA的一种或多种细菌菌株的方法，其包括：

（a）将据信含有产生GABA的细菌的样品分散在基质中，所述基质对GABA至少部分可渗透，

（b）将加载了潜在产生GABA细菌的基质与GABA依赖性细菌接触；和

（c）通过观察在基质中潜在产生GABA细菌的周围形成的GABA依赖性细菌的菌落来鉴定产生GABA的细菌。

在一些实施方案中，所述基质经缓冲以维持在人胃肠道中发现的生理范围的pH。在一些实施方案中，所述GABA依赖性细菌是E. gabavorous。在一些实施方案中，所述pH是约4.5至约7.5。

本发明提供了用于治疗受试者中精神病或中枢神经系统疾病的组合物和方法，以及用于其的治疗性组合物。所述方法可以包括向受试者提供在生理相关pH下在受试者消化道中能够产生内源性GABA的一种细菌和/或多种细菌。本技术可以具有这样的优点：缓解精神病或中枢神经系统疾病的症状而不需要合成药物（抗抑郁药），所述合成药物可能具有不期望的副作用，或与已有的药物进行组合。另外地，本技术可以具有这样的优点：进一步改善受试者的消化健康，诸如改善肠道活动性和减少胃肠道疼痛。本技术另外的特征和优点将在阅读下文的发明详述后对本领域技术人员变得显而易见。

附图简述

图1A显示了共培养测定，以生长和鉴定先前不能培养的细菌。

图1B显示了在辅助细菌脆弱拟杆菌KLE1758的存在下Evtepia gabavorousKLE1738的生长。

图2A显示了在来自脆弱拟杆菌的上清液的存在下Evtepia gabavorous KLE1738的生长。

图2B显示了在空载体的存在下Evtepia gabavorous KLE1738的生长不足。

图2C显示了在来自脆弱拟杆菌KLE1758的上清液的大多数极性级分存在下Evtepia gabavorous KLE1738的生长。

图2D显示了在空载体的存在下Evtepia gabavorous KLE1738的生长不足。

图2E显示了在来自脆弱拟杆菌KLE1758的上清液的存在下Evtepia gabavorousKLE1738的生长的近视图。

图2F显示了在空载体（细菌媒介）的存在下Evtepia gabavorous KLE1738的生长不足的近视图。

图2G显示了E. gabavorous KLE1738的潜在生长因子的表格，绿色指示了诱导生长。

图3显示了E. gabavorous KLE1738的提出的GABA代谢。

图4a显示了仅在pH 5.5和以下才观察到脆弱拟杆菌KLE1758的GABA产生，这突出了酸性pH在某些细菌菌株或物种的GABA产生上的重要性。

图4B显示了鉴定产生GABA细菌的测定，其能够使用需要GABA的E. gabavorousKLE1738在4.5至7.5的pH下产生GABA。培养基被强烈缓冲以维持期望范围的pH并且鉴定在人消化道的生理相关pH下能够产生GABA的细菌的菌株。

图4C显示了通过本文方法鉴定的GABA生产者的系统发生树，其能够在约4.5至约7.5的pH下产生GABA。

图5显示了使用实施例7中所述的筛选鉴定的几种菌株的GABA产生能力。突出了生物在一个pH范围内产生GABA的能力。

图6A显示了在已经工程改造以表达谷氨酸脱氢酶gadA的大肠杆菌存在下E.gabavorous KLE1738的生长。

图6B显示了在已经工程改造以表达谷氨酸脱氢酶gadB的大肠杆菌存在下E.gabavorous KLE1738的生长。

图6C显示在已知产生GABA的脆弱拟杆菌KLE1758存在下E. gabavorous KLE1738的生长。

图6D显示了在已经工程改造以表达谷氨酸脱氢酶gadC的大肠杆菌存在下E.gabavorous KLE1738的生长。

图6E显示了在空载体的存在下E.gabavorous KLE1738不存在生长。

发明详述

本发明涉及用于治疗或减少受试者中疾病的症状的组合物和方法。所述疾病可以是精神病症或中枢神经系统疾病。在鉴定受试者具有精神病或中枢神经系统疾病后，所述方法可以包括确定受试者是否将从内源性GABA的增加中获益，例如通过测量受试者粪便、血液血清或其他体液中GABA的量、测量脑中不同区域GABA的水平、测量脑中不同区域GABAergic应答、测量粪便中产生GABA的酶的活性或通过测量受试者粪便中产生GABA的细菌的量。所述方法可以进一步包括向受试者施用产生GABA的细菌或可以在受试者消化道中（例如在消化道的生理相关pH下）产生GABA的细菌。

一些细菌从γ-氨基丁酸产生GABA以维持胞内pH内稳态，以便克服酸性压力。如本文先前所述，通过微生物（例如细菌）在人消化道中产生GABA可以影响受试者的健康。例如，在人消化道中由细菌产生的GABA可以作为神经递质起作用，以治疗精神病、中枢神经系统疾病或改善受试者的胃肠道健康。

定义

如本文所用“施用”涵盖了实施方案，其中一个人指导另一个人以某种方式和/或为了某种目的消耗细菌或细菌组合物，并且还是这样的情况，其中使用者独立地以某种方式和/或某种目的或以对得自第二个人的指示的变化使用细菌或细菌组合物。在实施方案的非限制性实例中，一个人指导另一个人以某种方式和/或某种目的消耗细菌或细菌组合物，其包括当医生为患者对行为过程和/或治疗开处方，当父母命令未成年使用者（诸如儿童）消耗细菌或细菌组合物，当训练员建议使用者（诸如运动员）遵循具体行为和/或治疗，和当制造者、经销商或销售者推荐终端使用者使用的条件，例如通过广告或包装上的标签或以其它与产品的销售或市场相关联的材料提供。

术语“分离的”涵盖了这样的细菌或其它实体或物质，其已经（1）从当最初产生时（在自然中，诸如人粪便，或实验环境中，诸如由人工生长培养基组成的培养皿）与其结合的至少一些组分相分离，和/或（2）通过人工产生、制备、纯化和/或制造。分离的细菌可以从最初结合的分离了至少约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%或更多的其它组分。在一些实施方案中，分离的细菌可以是大于约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或大于约99%纯的。如本文所用，如果物质基本不含其它组分（诸如其它细菌物种），则其是“纯的”。术语“纯化”指的是已经从当最初产生或生成时（在自然中或实验环境中）或在其最初产生后的任何时间与其结合的至少一些组分相分离的细菌或其他材料，如细菌培养领域技术人员所认识的。如果细菌或细菌群体在产生时或产生后被分离，诸如从含有细菌或细菌群体的材料或环境被分离，则其可以被视为是纯化的，且纯化的细菌或细菌群体可以含有至多达约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%或高于约90%的其它材料并且仍被视为是“被分离的”。在一些实施方案中，纯化的细菌或细菌群体可以是大于约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或大于约99%纯的。在本文提供的细菌组合物的情况下，在所述组合物中存在的一种或多种细菌类型可以独立地从含有所述细菌类型的材料或环境中产生的和/或存在的一种或多种其它细菌中纯化。细菌组合物和其细菌组分通常从剩余的栖息地产物中纯化。

如本文所用，“益生菌”被理解为意为“活的微生物，其在以充足量施用时赋予宿主健康益处”，如目前有世界卫生组织所定义的。

如本文所用，“益生元”被理解为意为在组合物中和/或在胃肠道微生物区的活动中允许特定的变化的成分，其可以（或不可以）赋予宿主益处。

如本文所用，“医疗食品”被理解为意为“配制为被在医生监管下肠内消耗或施用的食物，并且其意图用于疾病或状况（基于被认可的科学原理，通过医学评估所建立的不同的营养需求）的特定的膳食管理”，如孤儿药法案(21 U.S.C. 360ee (b) (3))5(b)所定义的。

如本文所用，“起始量”被理解为意为物质的量，例如在将产生GABA的细菌施用至受试者前样品的等分试样中的GABA。起始量可以按照浓度测量。例如，起始量可以按照微克物质/毫升样品测量，例如微克GABA/毫升血液或血清（µg GABA/mL血液或血清）。起始量还可以例如按脑的区域（诸如在施用产生GABA的细菌前前额皮质）中GABA的量被测量。GABA的量可以按照毫摩尔GABA/kg组织（mmol GABA/kg脑组织）来表示。起始量还可以例如按在施用产生GABA的细菌至受试者前受试者粪便样品中GABA的量被测量。GABA的量可以按毫克GABA/克粪便（µg GABA/g粪便）来表示。起始量还可以是粪便中产生GABA的酶的表达水平（读数的对数变化），如通过qPCR或其他合适的方法测量的。除非另有说明，在湿或干时（即不主动干燥，且在粪便产生的一小时内）将粪便称重。例如，可以在粪便产生45分钟内、30分钟内、15分钟内、10分钟内或5分钟内将粪便称重。

如本文所用，“GABAergic应答”意为给定的器官（例如脑或迷走神经）对其暴露的不同浓度的GABA、产生GABA的细菌或益生元的应答。GABAergic应答可以包括GABA浓度以及不同的 GABAA、GABAB和/或GABAC受体的表达水平和/或活性的变化。

“产生GABA的细菌”被理解为意为可以产生可测量（如通过LC/MS、ELISA或其它合适的分析测定检测的）量的GABA的细菌。在一些实施方案中，产生GABA的细菌可以在人的生理条件下产生GABA，例如在人消化道的pH和温度下。

人肠道的“生理相关pH”被理解为意为存在于体内的pH范围。例如，人消化道的生理相关的pH范围可以在约4.5至约7.5的范围内。

术语“消化道”被理解为指的是人胃肠道，也被称为消化道（alimentary canal）。消化道包括口、咽、食管、胃、小肠（十二指肠、空肠、回肠）、大肠（盲肠和结肠）和直肠。

如本文所用的，“细菌（bacteria）”或“细菌菌株”被理解为意为细菌的物种。“细菌（bacterium）”被理解为给定物种的单个细菌细胞。

关于受试者的术语“治疗”指的是改善受试者病症的至少一种症状。治疗包括治愈、改善或至少部分缓解所述病症。

术语“EMBL/GenBank/DDBJ ID”指的是登录号，当用于数据库诸如欧洲分子生物学实验室（EMBL）、GenBank或日本DNA序列资料库（DDBJ）的输入时，经由他们相应的互联网网站，能够获得信息，诸如基因的核苷酸序列和在编码其基因组中所述序列的细菌。在本申请中使用EMBL/GenBank/DDBJ ID作为获得序列信息的便利工具。

γ-氨基丁酸（GABA）

术语“GABA”被理解为意为γ-氨基丁酸。GABA具有化学结构：

。

GABA是哺乳动物中枢神经系统中的主要抑制性神经递质。其在降低神经系统的神经元兴奋性中起主要作用。由于流出和半衰期限制，GABA是一种难以治疗性递送的化合物。例如，在啮齿动物中，GABA的脑流出速率比流入速率高17倍。另外，GABA在小鼠中仅具有仅17分钟的半衰期。因此，因为GABA在体内的短半衰期，经口的GABA补充是低效的，因为其可能需要频繁的给药，即使是使用缓释胶囊。

本发明提供了递送一种或多种可以在肠道中产生GABA的细菌的治疗性组合物，以在系统循环（例如在神经系统中）中持续递送GABA。内源性产生的GABA还可以直接活化迷走神经受体。这可以缓解GABA固有的半衰期。

在一些实施方案中，微生物组可以影响脑中的GABA水平和GABAergic应答。例如，无菌动物可以具有基本上降低的GABA腔内和血清水平。不希望受到理论的束缚，这提示了微生物组在调节该重要的神经递质水平中是重要的。如本文先前所述，通过微生物组干涉（例如使用 本文所述的方法和组合物）的GABAergic调节可以具有治疗潜力。

在一些实施方案中，GABA可以在精神病或中枢神经系统疾病中起作用。例如，在一些实施方案中，低水平的GABA可以与抑郁、躁郁症、精神分裂症、焦虑、焦虑症、成瘾、社交恐惧症、难治性重度抑郁症（TR-MDD）、重度抑郁症及其亚型（抑郁型忧郁、典型抑郁症、紧张性忧郁症、产后抑郁症和季节性情绪病症）、神经病变性淀粉样病症（帕金森氏病、阿尔茨海默病和亨廷顿氏病）、站立性颤抖、拉福拉病、不宁腿综合征、神经性疼痛、疼痛病症、痴呆、癫痫、僵人综合症、经前焦虑症、自闭症谱系障碍、睡眠障碍、多动症（ADHD）相关。如本文先前所述，本发明提供了增加受试者中内源性GABA的量可以减少受试者中精神病或中枢神经系统疾病的水平。

在一些实施方案中，通过消化道细菌产生的GABA可以经由迷走神经（连接肠道和外周和中枢神经系统）在精神病或中枢神经系统疾病中起作用。

在一些实施方案中，通过消化道细菌产生的GABA可以经由影响宿主中全身GABA的循环水平（其可以影响外周和中枢神经系统）在精神病或中枢神经系统疾病中起作用。

通过微生物产生GABA的方式

细菌可以使用多种不同途径产生GABA。下文示出了细菌和其它微生物可以用于产生GABA（例如，在体内）的示例性途径。如下文所述，本文所述的任何GABA产生途径均可以在给出的细菌中自然发生。可选地，可以将必须的酶或酶组添加至细菌的DNA序列以使得细菌能够产生GABA。

谷氨酸途径

在一些实施方案中，微生物可以使用谷氨酸脱羧酶（例如谷氨酸脱羧酶EC 4.1.1.15）产生GABA。在一些实施方案中，谷氨酸脱羧酶能够直接将谷氨酸转化至GABA。

腐胺至4-氨基丁醛途径

在一些实施方案中，微生物可以使用腐胺至4-氨基正丁醛途径产生GABA。微生物可以将4-氨基丁醛转化至GABA。在一些实施方案中，可以使用腐胺氨基转移酶（例如腐胺氨基转移酶EC 2.6.1.82）将腐胺转化至4-氨基丁醛。在γ-氨基丁醛脱氢酶（例如γ-氨基丁醛脱氢酶(EC 1.2.1.19)）存在下，4-氨基丁醛随后可以被转化至GABA。

精氨酸至胍丁胺至腐胺途径

在一些实施方案中，微生物可以使用精氨酸至胍丁胺至腐胺途径产生GABA。一旦产生腐胺，其可以如上文所述（例如使用腐胺至4-氨基丁醛途径）被转化至GABA。在一些实施方案中，精氨酸脱羧酶（例如精氨酸脱羧酶（EC 4.1.1.19）可以将精氨酸转化至胍丁胺。随后可以使用胍丁胺酶（例如胍丁胺酶（EC 3.5.3.11））将胍丁胺转化至腐胺。

L-鸟氨酸至腐胺途径

在一些实施方案中，鸟氨酸脱羧酶（例如鸟氨酸脱羧酶（EC 4.1.1.17）可以将鸟氨酸转化至腐胺。一旦产生腐胺，其可以如上文所述（例如使用腐胺至4-氨基丁醛途径）被转化至GABA。

细菌菌株

本发明提供了细菌菌株（例如纯化的菌株）和包含其的治疗性组合物，用于施用至有需要的受试者。细菌可以是天然存在的，或者可以是经工程改造的（例如通过菌株过程改造或选择）以产生GABA。在一些实施方案中，可以将产生GABA细菌的一种菌株施用至受试者。在一些实施方案中，可以将产生GABA细菌的多种菌株施用至有需要的受试者。在一些实施方案中，一种或多种细菌（例如纯化的细菌）可以协同作用。例如，多种细菌可以协同作用以产生高水平的GABA。在一些实施方案中，一种或多种细菌还可以帮助减少人消化道中消耗GABA的细菌的数量。因此，可以将本文教导的产生GABA细菌的任一种或任意组合施用至有需要的受试者。

在一些实施方案中，本文教导的细菌可以在生理相关的条件下产生GABA，诸如在人消化道的条件下。在一些实施方案中，本文教导的产生GABA的细菌可以在约4.5至约7.5的与人消化道相关的pH下产生GABA。例如，所述pH可以是约4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5或为约4.5至7.5之间的任何值。

在生理相关的pH下产生GABA的能力是重要的，因为所述pH限制了很多细菌的GABA产生。例如，大肠杆菌不能在高于4.5的pH下产生GABA。另外，不希望受到理论的束缚，其可以使用谷氨酸至GABA的转化与GABA输出偶联（例如，作为中和胞内环境的方式）。因此本发明的细菌能够在与宿主环境相关的pH下产生GABA，诸如在更中性的大肠中（例如在约pH4.5至约pH7.5）。在一些实施方案中，本文教导的细菌还可以在存在于人消化道的其它相关条件下产生GABA。即，本文教导的所述产生GABA的细菌可以在不存在氧气、营养竞争性的和变动的环境下、以及在无光下产生GABA。

天然菌株

在一些实施方案中，所述产生GABA的细菌可以通过具有与具有Seq. ID. No.1-31的表1中所列的参考细菌的16S序列基本相似的16S核酸序列来鉴定。 在一些实施方案中，所述产生GABA的细菌可以与表1中给出的16S序列具有至少90%16S序列相似性（例如至少91%相似性、至少92%相似性、至少93%相似性、至少94%相似性、至少95%相似性、至少96%相似性、至少97%相似性、至少98%相似性、至少99%相似性、至少99.5%相似性、至少99.9%相似性或100%相似性）。

在一些实施方案中，产生GABA的细菌可以通过生物的NCBI分类单元ID鉴定，他们通过16S序列而密切相关。这些细菌包括属于相同的NCBI分类单元如下分配的那些：粪便拟杆菌 KLE1911; Bacteroides clarus KLE1930; Bacteroides dorei KLE1912;Bacteroides finegoldii KLE1931; 脆弱拟杆菌KLE1958; Bacteroides massiliensisKLE1932; 椭圆形拟杆菌 KLE1770; 粪便拟杆菌 KLE1933; 多形拟杆菌 KLE1934; 单形拟杆菌 KLE1913; 普通拟杆菌 KLE1910; 解木聚糖拟杆菌 KLE1935; 青春双岐杆菌 KLE1879; Blautia obeum KLE1914; Blautia wexlerae KLE1916; Butyricimonas virosaKLE1938; 产气荚膜梭菌 KLE1937; 索氏梭菌 KLE1939; 梭菌属 KLE1862; 梭菌属KLE1918; 粪芽孢菌属 KLE1779; 粪球菌属KLE1880; Dorea longicatena KLE1917; 迟缓埃格特菌 KLE1926; 直肠真杆菌 KLE1922; Gordonibacter pamelaeae KLE1915;Oscillibacter sp. KLE1928; 吉氏拟杆菌 KLE2020; Parabacteroides merdaeKLE1863; 活泼瘤胃球菌 KLE1940; Turicibacter sanguinis KLE1941，及其组合。

表1.产生GABA的细菌的菌株名称以及它们相应的Seq.ID No.

菌株	Seq. ID No.
		粪便拟杆菌 KLE1911	1
Bacteroides clarus KLE1930	2
		Bacteroides dorei KLE1912	3
Bacteroides finegoldii KLE1931	4
		脆弱拟杆菌KLE1958	5
Bacteroides massiliensis KLE1932	6
		椭圆形拟杆菌 KLE1770	7
粪便拟杆菌 KLE1933	8
		多形拟杆菌 KLE1934	9
单形拟杆菌 KLE1913	10
		普通拟杆菌 KLE1910	11
解木聚糖拟杆菌 KLE1935	12
		青春双岐杆菌 KLE 1879	13
Blautia obeum KLE1914	14
		Blautia wexlerae KLE1916	15
Butyricimonas virosa KLE1938	16
		产气荚膜梭菌 KLE1937	17
索氏梭菌 KLE1939	18
		梭菌属 KLE1862	19
梭菌属 KLE1918	20
		粪芽孢菌属 KLE1779	21
粪球菌属KLE1880	22
		Dorea longicatena KLE1917	23
迟缓埃格特菌 KLE1926	24
		直肠真杆菌 KLE1922	25
Gordonibacter pamelaeae KLE1915	26
		Oscillibacter sp. KLE1928	27
吉氏拟杆菌 KLE2020	28
		Parabacteroides merdae KLE1863	29
活泼瘤胃球菌 KLE1940	30
		Turicibacter sanguinis KLE1941	31

本文还公开了预期能够产生GABA的细菌（例如在生理相关条件和/或在人消化道中）。如果细菌在它们的基因组中编码具有涉及GABA生物合成的酶，则将它们鉴定为产生GABA的细菌的候选。在一些实施方案中，所述预期能够产生GABA的细菌可以通过具有与具有Seq. ID. No. 32-274的表2中所列的参考细菌的16S序列基本相似的16S核酸序列来鉴定。 在一些实施方案中，所述预期产生GABA的细菌可以与具有Seq. ID. No.32-274的表2中给出的16S序列具有至少90%16S序列相似性（例如至少91%相似性、至少92%相似性、至少93%相似性、至少94%相似性、至少95%相似性、至少96%相似性、至少97%相似性、至少98%相似性、至少99%相似性、至少99.5%相似性、至少99.9%相似性或100%相似性）。

表2.预期产生GABA的细菌名称以及它们相应的Seq.ID No.

物种	Seq. ID No.
		软弱贫养菌	32
Acetobacter okinawensis	33
		砷氧化无色杆菌	34
木糖氧化无色杆菌	35
		食酸菌属	36
食酸菌属	37
		食酸菌属	38
食酸菌属	39
		食酸菌属	40
Actinoplanes friuliensis	41
		肠棕气单胞菌	42
嗜水气单胞菌	43
		Afipia birgiae	44
克利夫兰阿菲波菌	45
		阿菲波菌属	46
Agrobacterium albertimagni	47
		土壤杆菌属	48
根癌土壤杆菌	49
		Akkermansia muciniphila	50
粪产碱菌	51
		Alicycliphilus denitrificans	52
Alistipes finegoldii	53
		Alistipes indistinctus	54
Alistipes onderdonkii	55
		Alistipes putredinis	56
Alistipes shahii	57
		Aquamicrobium defluvii	58
Arenimonas donghaensis	59
		节细菌属	60
固氮螺菌属	61
		Bacillus bataviensis	62
蜡状芽孢杆菌	63
		蜡状芽孢杆菌	64
内生芽胞杆菌	65
		韦氏芽孢杆菌	66
Bacteroidaceae bacterium	67
		Bacteroides acidifaciens	68
粪便拟杆菌	69
		Bacteroides cellulosilyticus	70
Bacteroides dorei	71
		埃氏拟杆菌	72
Bacteroides finegoldii	73
		脆弱拟杆菌	74
Bacteroides gallinarum	75
		Bacteroides intestinalis	76
Bacteroides massiliensis	77
		Bacteroides oleiciplenus	78
椭圆形拟杆菌	79
		Bacteroides rodentium	80
Bacteroides salyersiae	81
		Bacteroides sartorii	82
拟杆菌属	83
		拟杆菌属	84
拟杆菌属	85
		拟杆菌属	86
粪便拟杆菌	87
		多形拟杆菌	88
单形拟杆菌	89
		普通拟杆菌	90
解木聚糖拟杆菌	91
		Barnesiella intestinihominis	92
西西布哈加瓦氏菌	93
		青春双岐杆菌	94
角双歧杆菌	95
		齿双岐杆菌	96
反刍双歧杆菌	97
		芽球菌属	98
支气管炎博德特菌	99
		创口博德特菌	100
Bosea sp.	101
		慢生根瘤菌属	102
波茨坦短芽孢杆菌	103
		缺陷短波单胞菌	104
Brevundimonas naejangsanensis	105
		流产布鲁氏菌	106
羊布鲁氏杆菌	107
		沙林鼠种布鲁氏菌	108
鼻疽伯克霍尔德氏菌	109
		多噬伯克霍尔德氏菌	110
鸡骨杆菌	111
		新月柄杆菌	112
柄杆菌属	113
		产黄纤维单胞菌	114
纤维菌属	115
		纤维化纤维细菌	116
Cetobacterium somerae	117
		无丙二酸柠檬酸杆菌	118
Cloacibacillus evryensis	119
		丙酮丁醇梭杆菌	120
产气荚膜梭菌	121
		Comamonas granuli	122
变异棒杆菌	123
		巴塞尔贪铜菌	124
贪铜菌属	125
		Dechloromonas agitata	126
Deinococcus geothermalis	127
		鹤羽田戴尔福特菌	128
脱硫脱硫弧菌	129
		脱硫弧菌属	130
核黄素德沃斯氏菌	131
		埃格特菌属	132
粘着剑菌	133
		酪黄肠球菌	134
黄色肠球菌	135
		大肠杆菌	136
粘液真杆菌	137
		缠结优杆菌	138
隐藏真杆菌	139
		牙周梭杆菌	140
碳酸盐小单孢菌	141
		Gordonia terrae	142
Gordonibacter pamelaeae	143
		Halomonas stevensii	144
铁达尼盐单胞菌	145
		Hoeflea sp.	146
Intrasporangium calvum	147
		Janibacter hoylei	148
Kaistia granuli	149
		Kineococcus radiotolerans	150
Lactobacillus coleohominis	151
		胚牙乳杆菌	152
罗伊氏乳杆菌	153
		格氏乳球菌	154
乳酸乳球菌	155
		Lautropia mirabilis	156
Leucobacter salsicius	157
		华北藤黄色单胞菌	158
Magnetospirillum magnetotacticum	159
		解脂海杆菌	160
Marmoricola sp.	161
		Megasphaera micronuciformis	162
巨球菌属	163
		中间根瘤菌属	164
Methanobrevibacter arboriphilus	165
		耐辐射甲基杆菌	166
甲基杆菌属	167
		细杆菌属	168
桔橙小单孢菌	169
		Mogibacterium Mogibacterium	170
摩氏摩根菌	171
		耻垢分枝杆菌	172
分支杆菌属	173
		分支杆菌属	174
Mycobacterium vanbaalenii	175
		干燥奈瑟氏球菌	176
Neorhizobium galegae	177
		Nocardia rhamnosiphila	178
Nocardiopsis alkaliphila	179
		甘家湖拟诺卡氏菌	180
线团拟诺卡氏菌	181
		栅栏拟诺卡氏菌	182
Novosphingobium nitrogenifigens	183
		中间苍白杆菌	184
Odoribacter laneus	185
		内脏拟杆菌	186
骚动厄氏菌	187
		栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌	188
Pantoea vagans	189
		吉氏拟杆菌	190
Parabacteroides goldsteinii	191
		Parabacteroides johnsonii	192
Parabacteroides merdae	193
		副拟杆菌属	194
副拟杆菌属	195
		脱氮副球菌	196
副球菌属	197
		Paracoccus yeei	198
Parvimonas Parvimonas	199
		胡萝卜软腐病坚固杆菌	200
叶杆菌属	201
		单胞菌属	202
Porphyromonas bennonis	203
		奇异变形杆菌	204
产碱普罗威登斯菌	205
		Providencia burhodogranariea	206
雷氏普罗威登斯菌	207
		Pseudacidovorax intermedius	208
假交替单胞菌属	209
		假苍白杆菌属	210
绿脓假单胞菌	211
		产碱假单胞菌	212
Pseudomonas chloritidismutans	213
		绿针假单胞菌	214
日本假单胞菌	215
		Pseudomonas knackmussii	216
门多萨假单胞菌	217
		蒙氏假单胞菌	218
食油假单胞菌	219
		恶臭假单胞菌	220
Pseudomonas savastanoi	221
		假单胞菌属	222
假单胞菌属	223
		假单胞菌属	224
假单胞菌属	225
		假单胞菌属	226
假单胞菌属	227
		假单胞菌属	228
假单胞菌属	229
		假单胞菌属	230
施氏假单胞菌	231
		产黄假单胞菌	232
丁香假单胞菌	233
		假诺卡氏菌属	234
青枯雷尔氏菌	235
		植生拉乌尔菌	236
豌豆根瘤菌	237
		根瘤菌属	238
Rhodococcus defluvii	239
		食吡啶红球菌	240
小梭文肯菌	241
		Robinsoniella sp.	242
颈玫瑰单胞菌	243
		玫瑰单胞菌属	244
肠道沙门氏菌	245
		科氏血杆菌	246
希瓦氏菌	247
		希瓦氏菌属	248
动胶菌样申氏菌	249
		阿拉斯加鞘氨醇盒菌	250
Starkeya novella	251
		嗜麦芽寡养单胞菌	252
嗜根寡养单胞菌	253
		嗜热链球菌	254
暗黑橄榄色链霉菌	255
		天蓝黄链霉菌	256
Streptomyces olindensis	257
		龟裂链霉菌	258
Streptomyces roseoverticillatus	259
		链霉菌属	260
链霉菌属	261
		链霉菌属	262
链霉菌属	263
		链霉菌属	264
链霉菌属	265
		链霉菌属	266
丰加链霉菌	267
		肿痂链霉菌	268
互养菌属.	269
		坦纳菌属	270
Thauera terpenica	271
		Variovorax paradoxus	272
贪噬菌属	273
		地毯草黄单胞菌	274

经工程改造的菌株

在一些实施方案中，细菌可以经工程改造以产生GABA(例如在人消化道的条件下)。可以使用分子生物学技术将细菌工程改造、或者可以使用在人消化道中产生GABA的选择方法将细菌进化。

如上文先前所述，GABA可以通过多种途径在微生物细胞中产生。例如，GABA可以通过谷氨酸途径、腐胺至4-氨基丁醛途径、精氨酸至胍丁胺至腐胺途径、L-鸟氨酸至腐胺途径或途径的组合产生。在一些实施方案中，细菌可以经工程改造以含有一种或多种上述途径中的酶，其能够使得细菌产生GABA或GABA所需的前体。

多种不同的宿主细菌可以经改造以产生GABA。例如，在一些实施方案中，大肠杆菌Nissle 1917可以经基因修饰或通过进化选择产生GABA。在一些实施方案中，细菌（例如 大肠杆菌 Nissle 1917）可以经修饰以表达或过表达谷氨酸脱羧酶A或谷氨酸脱羧酶B。还可以使得细菌通过本文所述的一种或多种其它途径产生GABA。

因此，在一些实施方案中，可以以其基因组中编码的特定酶来鉴定经工程改造的产生GABA的菌株。例如，所述酶可以是谷氨酸脱羧酶（EC 4.1.1.15）；腐胺氨基转移酶（EC2.6.1.82）；γ-氨基丁醛脱氢酶（EC 1.2.1.19）；精氨酸脱羧酶（EC 4.1.1.19）；胍丁胺酶（EC 3.5.3.11）；鸟氨酸脱羧酶（EC 4.1.1.17）；或其组合。在一些实施方案中，所述产生GABA的菌株可以经工程改造以含有与表3中所列的代表性序列具有至少50%相似性的酶（例如至少60%相似性、至少70%相似性、至少80%相似性、至少90%相似性、至少91%相似性、至少92%相似性、至少93%相似性、至少94%相似性、至少95%相似性、至少96%相似性、至少97%相似性、至少98%相似性、至少99%相似性、至少99.5%相似性、至少99.9%相似性或100% 相似性）。酶类别如通过它们的酶学委员会（EC）编号所鉴定的，列于表3中

表3.涉及GABA生产途径的酶，以及各种酶类别的代表性序列的Seq. ID No.

酶	Seq ID No.
		谷氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.15)	275-279
腐胺氨基转移酶(EC 2.6.1.82)	280-284
		γ-氨基丁醛脱氢酶(EC 1.2.1.19)	285-289
精氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.19)	290-294
		胍丁胺酶(EC 3.5.3.11)	295-299
鸟氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.17)	300-304

谷氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.15)的代表性实例在下文表4中给出，并且通过它们的EMBL/GENBANK/DDBJ ID编号鉴定。表10中给出的任意细菌可以使用表3或表4中所示任意版本的谷氨酸脱羧酶经工程改造。例如，所述细菌可以使用与表4中给出的任意版本的谷氨酸脱羧酶具有至少50%核苷酸相似性的版本的谷氨酸脱羧酶经工程改造（例如至少60%核苷酸相似性、至少70%核苷酸相似性、至少80%核苷酸相似性、至少90%核苷酸相似性、至少91%核苷酸相似性、至少92%核苷酸相似性、至少93%核苷酸相似性、至少94%核苷酸相似性、至少95%核苷酸相似性、至少96%核苷酸相似性、至少97%核苷酸相似性、至少98%核苷酸相似性、至少99%核苷酸相似性、至少99.5%核苷酸相似性、至少99.9%核苷酸相似性或100%核苷酸相似性）。

表4.通过EMBL/GENBANK/DDBJ ID编号的谷氨酸脱氢酶的代表性实例

。

腐胺氨基转移酶(EC 2.6.1.82)的代表性实例在下文表5中给出，并且通过它们的EMBL/GenBank/DDBJ ID编号鉴定。表10中给出的任意细菌可以使用表3或表5中所示任意版本的腐胺氨基转移酶(EC 2.6.1.82) 经工程改造。例如，所述细菌可以使用与表5中给出的任意版本的腐胺氨基转移酶具有至少50%核苷酸相似性的版本的腐胺氨基转移酶经工程改造（例如至少60%核苷酸相似性、至少70%核苷酸相似性、至少80%核苷酸相似性、至少90%核苷酸相似性、至少91%核苷酸相似性、至少92%核苷酸相似性、至少93%核苷酸相似性、至少94%核苷酸相似性、至少95%核苷酸相似性、至少96%核苷酸相似性、至少97%核苷酸相似性、至少98%核苷酸相似性、至少99%核苷酸相似性、至少99.5%核苷酸相似性、至少99.9%核苷酸相似性或100%核苷酸相似性）。

表5.通过EMBL/GENBANK/DDBJ ID编号的腐胺氨基转移酶的代表性实例

。

γ-氨基丁醛脱氢酶（EC 1.2.1.19)的代表性实例在下文表6中给出，并且通过它们的EMBL/GENBANK/DDBJ ID编号鉴定。表10中给出的任意细菌可以使用表3或表6中所示任意版本的γ-氨基丁醛脱氢酶(EC 1.2.1.19) 经工程改造。例如，所述细菌可以使用与表6中给出的任意版本的γ-氨基丁醛脱氢酶具有至少50%核苷酸相似性的版本的γ-氨基丁醛脱氢酶经工程改造（例如至少60%核苷酸相似性、至少70%核苷酸相似性、至少80%核苷酸相似性、至少90%核苷酸相似性、至少91%核苷酸相似性、至少92%核苷酸相似性、至少93%核苷酸相似性、至少94%核苷酸相似性、至少95%核苷酸相似性、至少96%核苷酸相似性、至少97%核苷酸相似性、至少98%核苷酸相似性、至少99%核苷酸相似性、至少99.5%核苷酸相似性、至少99.9%核苷酸相似性或100%核苷酸相似性）。

表6.通过EMBL/GENBANK/DDBJ ID编号的γ-氨基丁醛脱氢酶的代表性实例

。

精氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.19)的代表性实例在下文表7中给出，并且通过它们的EMBL/GENBANK/DDBJ ID编号鉴定。表10中给出的任意细菌可以使用表3或表7中所示任意版本的精氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.19) 经工程改造。例如，所述细菌可以使用与表7中给出的任意版本的精氨酸脱羧酶具有至少50%核苷酸相似性的版本的精氨酸脱羧酶经工程改造（例如至少60%核苷酸相似性、至少70%核苷酸相似性、至少80%核苷酸相似性、至少90%核苷酸相似性、至少91%核苷酸相似性、至少92%核苷酸相似性、至少93%核苷酸相似性、至少94%核苷酸相似性、至少95%核苷酸相似性、至少96%核苷酸相似性、至少97%核苷酸相似性、至少98%核苷酸相似性、至少99%核苷酸相似性、至少99.5%核苷酸相似性、至少99.9%核苷酸相似性或100%核苷酸相似性）。

表7.通过EMBL/GENBANK/DDBJ ID编号的精氨酸脱羧酶的代表性实例

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胍丁胺酶(EC 3.5.3.11)的代表性实例在下文表8中给出，并且通过它们的EMBL/GENBANK/DDBJ ID编号鉴定。表10中给出的任意细菌可以使用表3或表8中所示任意版本的胍丁胺酶(EC 3.5.3.11) 经工程改造。例如，所述细菌可以使用与表8中给出的任意版本的胍丁胺酶具有至少50%核苷酸相似性的版本的胍丁胺酶经工程改造（例如至少60%核苷酸相似性、至少70%核苷酸相似性、至少80%核苷酸相似性、至少90%核苷酸相似性、至少91%核苷酸相似性、至少92%核苷酸相似性、至少93%核苷酸相似性、至少94%核苷酸相似性、至少95%核苷酸相似性、至少96%核苷酸相似性、至少97%核苷酸相似性、至少98%核苷酸相似性、至少99%核苷酸相似性、至少99.5%核苷酸相似性、至少99.9%核苷酸相似性或100%核苷酸相似性）。

表8.通过EMBL/GENBANK/DDBJ ID编号的胍丁胺酶的代表性实例

。

鸟氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.17)的代表性实例在下文表9中给出，并且通过它们的EMBL/GENBANK/DDBJ ID编号鉴定。表10中给出的任意细菌可以使用表3或表9中所示任意版本的鸟氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.17) 经工程改造。例如，所述细菌可以使用与表9中给出的任意版本的鸟氨酸脱羧酶具有至少50%核苷酸相似性的版本的鸟氨酸脱羧酶经工程改造（例如至少60%核苷酸相似性、至少70%核苷酸相似性、至少80%核苷酸相似性、至少90%核苷酸相似性、至少91%核苷酸相似性、至少92%核苷酸相似性、至少93%核苷酸相似性、至少94%核苷酸相似性、至少95%核苷酸相似性、至少96%核苷酸相似性、至少97%核苷酸相似性、至少98%核苷酸相似性、至少99%核苷酸相似性、至少99.5%核苷酸相似性、至少99.9%核苷酸相似性或100%核苷酸相似性）。

表9.通过EMBL/GENBANK/DDBJ ID编号的鸟氨酸脱羧酶的代表性实例

。

多种微生物(例如细菌）可以经工程改造以产生GABA（例如通过工程改造如表2所示的一种或多种酶）。例如，表10中所示的任意细菌可以经工程改造以产生GABA。换句话说，具有与下文表10中所示的至少50%相似的16S rDNA核苷酸序列的细菌可以经工程改造（例如使用表3-9中的一种酶）以产生GABA。细菌可以具有与表10中给出的16S rDNA核苷酸序列至少60%相似、至少70%相似、至少80%相似、至少90%相似、至少91%相似、至少92%相似、至少93%相似、至少94%相似、至少95%相似、至少96%相似、至少97%相似、至少98%相似、至少99%相似、至少99.5%相似、至少100%相似的16S rDNA序列。

如实施例8中所示，大肠杆菌经工程改造以过表达谷氨酸脱羧酶，不希望受到理论的束缚，其导致通过经工程改造的大肠杆菌的GABA的表达。如图6所示，经工程改造的大肠杆菌能够诱导E. gabavorous KLE1738的生长。可以通过肠上皮细胞和通过一些细菌例如大肠杆菌和单增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes），通过谷氨酸的脱羧作用产生GABA。在大肠杆菌中，谷氨酸的脱羧作用可以作为降低胞内pH的机制起作用，并且因此在一些实施方案中GABA产生通常发生在低pH。

如实施例8中所示，大肠杆菌中谷氨酸脱羧酶（例如gadA或gadB）的表达，例如过表达，导致诱导E. gabavorous KLE1738生长至与脆弱拟杆菌KLE 1758观察到的水平。例如，图6A显示了在经工程改造以表达谷氨酸脱氢酶gadA的大肠杆菌存在下诱导的E.gabavorous KLE1738。相似地，图6B显示了在经工程改造以表达谷氨酸脱氢酶gadB的大肠杆菌存在下诱导的E. gabavorous KLE1738。如图6C所示，E. gabavorous KLE1738的生长与在脆弱拟杆菌KLE 1758存在下观察到的在性质上相似。相比之下，如图6D所示，当大肠杆菌经工程改造以表达gadC（一种GABA反向转运蛋白）时，没有观察到E. gabavorousKLE1738的生长。相似地，在空载体存在下没有观察到E. gabavorous KLE1738的生长（图6E）。不希望受到理论的束缚，实施例8的结果证明细菌可以经工程改造以产生GABA（例如经由谷氨酸脱羧酶的表达或过表达）。在一些实施方案中，细菌（例如大肠杆菌）可以经工程改造以在人消化道内产生GABA。

在一些实施方案中，本发明还提供了损害一种或多种GABA产生抑制蛋白（例如gadX或gadW）。在一些实施方案中，这些抑制蛋白可以调节大肠杆菌中GABA产生的pH限制，这是一种增加天然GABA产生的方式。这可以通过例如基因缺失、插入或置换来实现，如分子生物学领域的技术人员已知的。

改变KLE1738的生长培养基的pH不会改变GABA依赖性表型。不希望受到理论的束缚，这提示经工程改造的细菌过表达谷氨酸脱羧酶是一种产生GABA以及诱导E.gabavorous生长的有效方式。

除了大肠杆菌，其它细菌可以经工程改造以产生GABA（例如在生理相关pH，诸如在4.5至7.5）。例如，表10所示的任何细菌可以经工程改造以产生GABA（例如在生理相关pH，诸如在4.5至7.5）。例如，细菌可以经工程改造以含有编码表3-9中所示的一种或多种酶的DNA。表10中所示的还有所列细菌的16S核苷酸序列的序列ID编号。在一些实施方案中，所述经工程改造以产生GABA的细菌可以与表10中给出的16S序列具有至少90%16S序列相似性（例如至少91%相似性、至少92%相似性、至少93%相似性、至少94%相似性、至少95%相似性、至少96%相似性、至少97%相似性、至少98%相似性、至少99%相似性、至少99.5%相似性、至少99.9%相似性或100% 相似性）。

表10.能够经工程改造以产生GABA的细菌

。

治疗性组合物

可以将本文所述的任何产生GABA的细菌（例如天然细菌或经工程改造的细菌），或其组合（包括天然细菌和经工程改造的细菌的组合）掺入治疗性组合物。例如，可以向有需要的患者施用所述治疗性组合物以治疗或缓解精神病或中枢神经系统疾病的症状。

菌株的纯化

在一些实施方案汇总，在掺入治疗性组合物之前将细菌纯化。例如，细菌可以是经纯化的，从而细菌群体基本上不含有其它细菌（例如在组合物中含有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%或至少98%、至少99%的特定细菌菌株或期望的菌株）。

在一些实施方案中，所述治疗性组合物是益生菌或医疗食品，其包含至少一种产生GABA的细菌菌株。所述菌株可以以例如益生菌、胶囊、片剂、囊片、丸剂、糖锭、锭剂、粉剂、颗粒施用。所述菌株还可以被配置为医疗食品。产生GABA的细菌还可以作为粪便移植物或栓剂施用。

在一些实施方案中，所述治疗剂的剂量可以含有期望的细菌物种的1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹ 或大于1×10¹¹个集落形成单位(CFU)。例如，期望的细菌物种可以是产生GABA的细菌，能够抑制消耗GABA的细菌生长的细菌或其组合。

在一些实施方案中，所述治疗性组合物或剂量单位包含药物可接受的制剂，其包括肠溶衣或从胃酸幸存并且能够递送至小肠或大肠的类似物、益生元（诸如但不限于氨基酸（包括精氨酸、谷氨酸和鸟氨酸））、生物素、低聚果糖、低聚半乳糖、半纤维素（例如阿拉伯糖基木聚糖、木聚糖、木葡聚糖和葡甘露聚糖)、菊粉、几丁质、乳果糖、甘露寡糖、富低聚果糖菊粉、树胶（例如瓜尔豆胶、阿拉伯树胶和carregenaan）、低聚果糖、低聚葡糖（oligodextrose）、塔格糖、抗性麦芽糊精（例如抗性淀粉）、反式低聚半乳糖、果胶（例如xylogalactouronan、柑橘果胶、苹果果胶和鼠李半乳糖醛酸聚糖-I）、膳食纤维（例如大豆纤维、甜菜纤维、豌豆纤维、玉米纤维和燕麦纤维）、木低聚糖、聚胺类（诸如但不限于 亚精胺和腐胺）、有效量的抗菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂或抗寄生虫剂或以上的任意组合。例如，所示治疗性组合物还可以是含有一种或多种产生GABA的细菌的纯化菌株的酸奶的形式。

疾病适应症

在上文任何方面的一个或多个实施方案中，可以通过施用本文所述的治疗性组合物治疗的精神病或中枢神经系统疾病选自抑郁、躁郁症、精神分裂症、焦虑、焦虑症、成瘾、社交恐惧症、重度抑郁症、难治性重度抑郁症（TR-MDD）、重度抑郁症及其亚型（抑郁型忧郁、典型抑郁症、紧张性忧郁症、产后抑郁症和季节性情绪病症）、神经病变性淀粉样病症（帕金森氏病、阿尔茨海默病和亨廷顿氏病）、站立性颤抖、拉福拉病、不宁腿综合征、神经性疼痛、疼痛病症、痴呆、癫痫、僵人综合症、经前焦虑症、自闭症谱系障碍、睡眠障碍和多动症（ADHD）。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括减轻受试者中的选自以下精神病或中枢神经系统疾病的至少一种症状:疲劳、失眠、运动障碍、压力、持续性焦虑、持续性沮丧、社交退缩、物质戒断、易怒、自杀倾向、自残倾向、不安、性欲低下、注意力地下、癫痫、失忆、发怒、情绪反应发作、混乱、疼痛和肌肉痉挛。

治疗方法

本文所述的治疗性组合物可以施用至有需要的患者，例如用于治疗精神病或中枢神经系统疾病。在一些实施方案中，所述治疗方法可以包括首先诊断可以通过本文所述的治疗性组合物的治疗获益的患者。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向患者施用本文所述的治疗性组合物。

患者诊断

在一些实施方案中，鉴定患有精神病或中枢神经系统疾病的受试者的方法可以通过受训的心理学家、精神病学家或神经学家实施。例如，心理学家、精神病学家或神经学家可以诊断患有精神病或中枢神经系统疾病的受试者，其评估受试者关于精神病或中枢神经系统疾病的症状的表现。本领域技术人员将明白精神病也可以辅以精神障碍诊断与统计手册(DSM-5)（美国精神病学会）来对受试者进行鉴定。

在一个或多个实施方案中，鉴定患有精神病或中枢神经系统疾病的受试者的方法可以包括诊断患有精神病或中枢神经系统疾病的受试者。在一些实施方案中，使用fMRI鉴定或诊断精神病或中枢神经系统疾病。在一些实施方案中，可以使用标准心理学和神经学问卷或以本领域专家已知的其它方法鉴定精神病或中枢神经系统疾病。

在一些实施方案中，需要使用本文所述的治疗性组合物治疗的受试者可以通过受试者血液、血清、粪便或其它体液中鉴定的低水平GABA而鉴定。在一些实施方案中，受试者粪便的GABA的量（例如受试者粪便中GABA的起始量）低于约8 µg GABA/克粪便。可以使用粪便的湿或干重通过LC/MS或本领域已知的其它技术测量GABA的量。在一些实施方案中，受试者血液或血清中GABA的量（例如受试者血液或血清中GABA的起始量）低于约10 µg/L +/- 5µg/L GABA/克血液或血清（例如通过LC/MS测量）。在一些实施方案中，前额皮质或脑的其它区域中GABA的量低于约1.0 mM/kg，如通过质子核磁共振（PMR）或其它类似技术测量。

在一些实施方案中，受试者消化道中产生GABA的细菌的百分比（例如起始量）表示为总16S序列的约10%，如通过使用如16S rDNA基因Illumina测序或定量PCR的方法通过测序测量的。在一些实施方案中，受试者消化道中产生GABA的细菌的百分比表示为在受试者消化道中测量的总16S序列的约9%、约8%、约7%、约6%、约5%、约4%、约3%、约2%、约1%或小于约1%。

受试者血液、血清、脑区域或粪便中的GABA起始量的测定可以帮助鉴定可以从通过施用产生GABA的细菌的治疗中获益的受试者。在一些实施方案中，在血清或血液中具有低于10 µg/L GABA的GABA起始量的受试者可以从施用产生GABA的细菌中获益。在一些实施方案中，在血清或血液中具有低于100 µg、低于50 µg、低于25 µg、低于20 µg、低于15 µg、低于10 µg、低于9 µg、低于8 µg、低于7 µg、低于6 µg、低于5 µg、低于4 µg、低于3 µg、低于2 µg、低于1 µg、低于0.5 µg、低于0.1 µg、低于0.01 µg、低于10 ng或低于1 ng或低于0.1ng/L血液或血清的GABA起始量的受试者可以从施用产生GABA的细菌中获益。

在一些实施方案中，在脑中、在脑区域中诸如前额皮质（或脑的其它区域）具有约1.0 mM/kg的GABA起始量的受试者可以从施用产生GABA的细菌中获益。在一些实施方案中，在脑中、在脑区域中诸如前额皮质（或脑的其它区域）具有低于100 mM、低于50 mM、低于25mM、低于20 mM、低于15 mM、低于10 mM、低于9 mM、低于8 mM、低于7 mM、低于6 mM、低于5mM、低于4 mM、低于3 mM、低于2 mM、低于1 mM、低于0.5 mM、低于0.1 mM或低于0.01 mM或低于0.001 mM GABA的GABA起始量的受试者可以从施用产生GABA的细菌中获益。

在一些实施方案中，在粪便中具有低于8 µgGABA/克粪便（湿或干重）的GABA起始量的受试者可以从施用产生GABA的细菌中获益。在一些实施方案中，在粪便中具有低于100µg、低于50 µg、低于25 µg、低于20 µg、低于15 µg、低于10 µg、低于9 µg、低于8 µg、低于7µg、低于6 µg、低于5 µg、低于4 µg、低于3 µg、低于2 µg、低于1 µg、低于0.5 µg、低于0.1 µg、低于0.01 µg、低于10 ng或低于1 ng或低于0.1 ng/克粪便的GABA起始量的受试者可以从施用产生GABA的细菌中获益。

在上文任何方面的一些实施方案中，例如如上文任何方面的步骤（b）所测量的，相对于受试者粪便中GABA的起始量，受试者粪便中的GABA的量增加了百分之0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000、2000、3000、4000、5000或更高。在一些实施方案中，例如如上文任何方面的步骤（b）所测量的，相对于受试者血液或血清中GABA的起始量，受试者血液或血清中的GABA的量增加了百分之0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000、2000、3000、4000、5000或更高。在一些实施方案中，例如如上文任何方面的步骤（b）所测量的，相对于受试者脑中GABA的起始量，受试者脑（诸如但不限于前额皮质）中的GABA的量增加了百分之0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000、2000、3000、4000、5000或更高。在一些实施方案中，例如如上文任何方面的步骤（b）所测量的，相对于受试者粪便中产生GABA的细菌的起始量，受试者粪便中至少一种产生GABA的细菌的量增加了百分之0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000、2000、3000、4000、5000或更高。在一些实施方案中，如通过qPCR或本领域技术人员已知的一些其它合适的方法测量的，相对于受试者粪便中产生GABA的酶的表达的起始水平，受试者粪便中至少一种产生GABA的酶的表达水平增加了百分之0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000、2000、3000、4000、5000或更高。

在本发明的一些实施方案中，消耗GABA的细菌的量可以减少，例如在受试者的粪便、血液血清等中减少。消耗GABA的细菌可以是例如Evtepia gabavorous或厚壁菌门细菌MGS:114。在一些实施方案中，消耗GABA的细菌可以减少百分之0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000、2000、3000、4000、5000或更高。

因此，本发明提供了治疗精神病或中枢神经系统疾病，其包括向受试者施用产生GABA的细菌，或刺激产生GABA的细菌的生长或GABA产生能力的益生元。

培养消耗GABA的细菌的方法

在一些实施方案中，本发明提供了培养需要GABA用于生存和繁殖的细菌的方法。在一些情况中，这些细菌先前未被培养或不能培养。在一些情况中，通过补充内源性GABA至生长培养基来培养所述细菌。在一些实施方案中，通过将细菌与能够产生GABA的不同细菌（如上文所述的细菌）共培养来培养所述细菌。

在一些实施方案中，所述先前未培养的细菌是E. gabavorous。可以在合适的基质，诸如琼脂上培养E. gabavorous。在一些实施方案中，所述琼脂可以含有添加的GABA。在一些实施方案中，本发明提供了培养E. gabavorous的方法，其包括将E. gabavorous与另一种细菌菌株共培养，所述菌株能够产生GABA（例如在生理相关且在人胃肠道中发现的条件（例如pH小于约4.5至约7.5）下）。

不希望受到理论的束缚，一些先前不能培养的细菌（例如E. gabavorous）可能能够在接近产生细菌生存或生长所需的生长因子的可培养生物下生长。因此，本发明教导了在作为必需生长因子的GABA的存在下发现和培养E. gabavorous。

E. gabavorous被鉴定为在空间上接近脆弱拟杆菌KLE1758的延后生长的集落。发现在衍生自脆弱拟杆菌KLE1758的上清液的存在下诱导了E. gabavorous KLE1738的生长。经由HPLC和NMR对脆弱拟杆菌KLE1738上清液的化学分析揭示GABA是E. gabavorous的必需生长因子。

如图1和实施例2所示，E. gabavorous最初被发现是因为其在脆弱拟杆菌KLE1758存在下生长。提出脆弱拟杆菌KLE1758产生了对E. gabavorous的生长和存活必需的生长因子。图1A显示了在使用人粪便处理后含有细菌集落的琼脂平板的图片。右上的插页显示了KLE1758的集落与1738的近视图，其生长非常接近。图1B显示了KLE1758的集落能够在没有其它细菌的琼脂平板上支持多个KLE1738集落。不希望受到理论的束缚，脆弱拟杆菌KLE1758可以支持E. gabavorous KLE1738的生长。不希望受到理论的束缚，脆弱拟杆菌KLE1758和E. gabavorous KLE1738可以以共生关系共存，其中E. gabavorous KLE1738可以消耗由脆弱拟杆菌KLE1758产生的GABA。

如图2和实施例3-4所示，发现来自培养48小时的脆弱拟杆菌KLE1758的上清液支持了E. gabavorous KLE1738的生长，而标准琼脂则没有。在对KLE1758上清液进行一系列纯化和分离步骤后，发现GABA对于E. gabavorous KLE1738的生长起作用。图2A显示E.gabavorous KLE1738在存在E. gabavorous KLE1738的上清液下生长。但是，图2B显示E.gabavorous KLE1738没有在标准琼脂上的无菌载体的存在下生长。在脆弱拟杆菌KLE1758的第一级分消耗培养基后，发现大多数极性片段能够诱导E. gabavorous KLE1738的生长（图2C），但是较少的极性片段不能诱导生长（图2D）。图2E和图2F显示了近视图，其证明脆弱拟杆菌KLE1758上清液的大多数极性级分能够诱导E. gabavorous KLE1738的生长（图2E），而少部分极性片段则不能（图2F）。如图2G所示，仅GABA被鉴定为能够诱导E. gabavorousKLE1738的生长。

E. gabavorous KLE1738的16S核苷酸序列在Seq.ID No. 2286中给出。

如实施例5所示鉴定了E. gabavorous KLE1738的基因组序列。在包含SEQ.ID No.1-2288的所附序列表中给出了E. gabavorous的标注的基因组（2，500，009 bp），并且是在SEQ ID Nos. 2218-2285给出。不希望受到理论的束缚，所述基因组揭示了没有常规糖类或其它碳源的代谢的明显插入位点。

不希望受到理论的束缚，发现常规糖类或其它碳源的转运系统也不完整。不希望受到理论的束缚，它们的缺失提示了功能的缺失。预期E. gabavorous具有有限的转运蛋白，包括用于甲硫氨酸、支链氨基酸、二肽、寡肽和胆碱/甜菜碱的那些，如表10中所预期的。

表10：E. gabavorous中预测的转运系统

分类	子系统	作用
			氨基酸和衍生物	多胺代谢	ABC 转运蛋白，周质亚精胺腐胺结合蛋白 PotD (TC 3.A.1.11.1)
氨基酸和衍生物	多胺代谢	亚精胺腐胺 ABC 转运蛋白通透酶组分PotB (TC 3.A.1.11.1)
			氨基酸和衍生物	多胺代谢	亚精胺腐胺 ABC 转运蛋白通透酶组分 PotC (TC 3.A.1.11.1)
氨基酸和衍生物	甲硫氨酸生物合成	甲硫氨酸ABC转运蛋白 ATP-结合蛋白
			氨基酸和衍生物	甲硫氨酸生物合成	甲硫氨酸ABC转运蛋白 通透酶 蛋白
氨基酸和衍生物	甲硫氨酸生物合成	甲硫氨酸ABC转运蛋白 底物-结合蛋白
			氨基酸和衍生物	甲硫氨酸降解	甲硫氨酸ABC转运蛋白 ATP-结合蛋白
氨基酸和衍生物	甲硫氨酸降解	甲硫氨酸ABC转运蛋白 通透酶蛋白
			氨基酸和衍生物	甲硫氨酸降解	甲硫氨酸ABC转运蛋白 底物-结合蛋白
基于集簇的子系统	PhoR-PhoB双组分调节系统	磷酸 ABC 转运蛋白， 周质磷酸-结合蛋白 PstS (TC 3.A.1.7.1)
			膜转运	ABC转运蛋白二肽(TC 3.A.1.5.2)	二肽-结合ABC 转运蛋白， 周质底物-结合组分(TC 3.A.1.5.2)
膜转运	ABC转运蛋白寡肽(TC 3.A.1.5.1)	寡肽 ABC 转运蛋白， 周质寡肽-结合蛋白 OppA (TC 3.A.1.5.1)
			膜转运	ABC转运蛋白支链氨基酸(TC 3.A.1.4.1)	支链氨基酸ABC 转运蛋白，氨基酸-结合蛋白 (TC 3.A.1.4.1)
磷代谢	高亲和力磷酸转运蛋白和PHO调节子控制	磷酸ABC 转运蛋白， 周质磷酸-结合蛋白 PstS (TC 3.A.1.7.1)
			磷代谢	磷酸代谢	磷酸ABC 转运蛋白， 周质磷酸-结合蛋白 PstS (TC 3.A.1.7.1)
应激反应	胆碱和甜菜碱摄取和甜菜碱生物合成	L-脯氨酸甘氨酸甜菜碱ABC转运系统 通透酶蛋白ProV (TC 3.A.1.12.1)
			应激反应	胆碱和甜菜碱摄取和甜菜碱生物合成	甘氨酸甜菜碱ABC 转运系统， 甘氨酸-甜菜碱-结合蛋白OpuAC
应激反应	胆碱和甜菜碱摄取和甜菜碱生物合成	甘氨酸甜菜碱ABC 转运系统， 通透酶 蛋白OpuAB
			应激反应	胆碱和甜菜碱摄取和甜菜碱生物合成	L-脯氨酸甘氨酸甜菜碱结合ABC 转运蛋白 蛋白ProX (TC 3.A.1.12.1)
硫代谢	链烷磺酸同化	ABC-型硝酸/磺酸/碳酸氢盐转运系统， ATP酶组分
			硫代谢	链烷磺酸同化	链烷磺酸ABC 转运蛋白 ATP-结合蛋白

不希望受到理论的束缚，不像丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸等，这些氨基酸通常不能作为单一碳源支持细菌生长。这通过E. gabavorous不能在所述测试的氨基酸上生长而得到支持。

不希望受到理论的束缚，提出E. gabavorous的代谢途径与氨基丁酸梭菌（Clostridium aminobutyricum）相似，如在图3中所示，因为在E. gabavorous基因组中鉴定了该途径中的所有酶（表11）。

表11. E. gabavorous GABA发酵途径中的酶，通过RAST预测

酶#	叠连群	起始	结束	长度(bp)	功能
						1	KLE1738_5	26729	28084	1356	γ-氨基丁酸:α-酮戊二酸氨基转移酶(EC 2.6.1.19)
2	KLE1738_5	25576	26688	1113	NAD依赖性4-羟基丁酸脱氢酶 (EC 1.1.1.61)
						3	KLE1738_2	195690	197033	1344	4-羟基丁酸:乙酰辅酶A 辅酶A转移酶 (EC 2.8.1.-)
3	KLE1738_28	9343	10665	1323	4-羟基丁酸:乙酰辅酶A 辅酶A转移酶 (EC 2.8.1.-)
						3	KLE1738_5	24249	25547	1299	4-羟基丁酸:乙酰辅酶A 辅酶A转移酶 (EC 2.8.1.-)
3	KLE1738_7	87690	86401	1290	4-羟基丁酸:乙酰辅酶A 辅酶A转移酶 (EC 2.8.1.-)
						4	KLE1738_5	22352	23902	1551	4-羟基丁酰辅酶A脱水酶(EC 4.2.1.-) / 乙烯乙酰辅酶A δ-异构酶(EC 5.3.3.3)
5	KLE1738_6	2958	2092	867	烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)
						5	KLE1738_11	1132	356	777	烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)
6	KLE1738_6	4710	5762	1053	3-羟基丁酰基辅酶A脱氢酶 (EC 1.1.1.35)
						6	KLE1738_8	87921	88769	849	3-羟基丁酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.1.1.35)
7	KLE1738_14	4910	6139	1230	乙酰辅酶A乙酰转移酶 (EC 2.3.1.9)
						7	KLE1738_19	28638	27382	1257	乙酰辅酶A乙酰转移酶 (EC 2.3.1.9)
8	KLE1738_13	26709	25738	972	磷酸乙酰转移酶(EC 2.3.1.8)
						9	KLE1738_1	119924	121141	1218	乙酸激酶(EC 2.7.2.1)
1b	KLE1738_30	8650	9999	1350	NADP-特异性谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.4)
						5b	KLE1738_6	4303	3083	1221	丁酰辅酶A脱氢酶(EC 1.3.8.1)
6b	KLE1738_1	158124	159767	1644	乙酰辅酶A；乙酰乙酰基辅酶A转移酶 (EC 2.8.3.8)

研究了脆弱拟杆菌KLE1758产生GABA的能力的pH依赖性。如实施例6所示，脆弱拟杆菌KLE1758在多个pH值下生长，并使用LCMS分析来自生长物的上清液。如图4A所示，相比于谷氨酸，GABA主要在相对较低的pH（例如约5.5或以下）下产生。

因此，发现脆弱拟杆菌KLE1758可以在低pH下产生GABA，而发现其在相对高pH下主要产生谷氨酸。如实施例6和图4A所示，在约5和约5.5的pH下，脆弱拟杆菌KLE1758产生比谷氨酸相对更多的GABA。但是在约6和约6.5的pH下，发现脆弱拟杆菌KLE1758主要产生谷氨酸和相对低量的GABA。

GABA生产者的生物学筛选

本发明还教导了鉴定可以产生GABA的细菌的方法。鉴于E. gabavorous生长对于GABA的严格需求，本发明提供了使用例如E. gabavorous和/或其他GABA依赖性细菌生长作为生物测定来筛选能够产生GABA的细菌的方法。重要的是，通过使用缓冲培养基（例如缓冲琼脂），本文所示的所述测定技术可以用于鉴定在不同pH值（例如在约5.5至约7.5）下能够产生GABA的细菌。

如实施例7所示，可以将被认为含有产生GABA的细菌的样品（例如人粪便样品）与熔化的琼脂混合。可以随后使用E. gabavorous的稀释溶液对含有细菌样品的琼脂划线。如本文所示，E. gabavorous不能在缺乏GABA下生长，并且因此任何形成集落的E.gabavorous将必需在空间上接近GABA生产者生长。

因为GABA由几种细菌产生，包括大肠杆菌（仅在非常低的pH（例如在与人消化道不相关的pH下）下发生），因此本文所示的测定方法适用于控制培养基的pH，使得能够鉴定在约4.5至约7.5的pH下能够产生GABA的生物。不希望受到理论的束缚，在约4.5至约7.5的pH是人消化道中的相关pH。因此，可以在这些pH值下产生GABA的细菌在一些实施方案中能够在人消化道中产生GABA。

换句话说，通过控制生长培养基的pH（例如通过缓冲培养基琼脂），本发明可以允许将能够在生理相关pH（例如约4.5至约7.5）下产生GABA生产者从在生理相关pH下不能产生GABA的细菌（例如仅能够在约4.5的低pH下产生相当数量的GABA的细菌）中区分出来。

使用该方法，鉴定了来自多个属的多个代表，包括但不限于拟杆菌属、双歧杆菌属、Blautia、粪球菌属、Gordonibacter、Dorea和梭菌属。图4B显示了在产生GABA的细菌存在下显示E. gabavorous生长的代表性琼脂平板。图4C显示了使用该方法鉴定的产生GABA的细菌的系统发生树。

图5显示了使用本文所述的技术鉴定的GABA生产者的某些菌株的GABA产生能力。如图5所示，GABA生产者中的8种菌株在换种培养基（例如，约pH4.5至约pH5.0；和约pH6.5至约pH7.0）中生长。使用实施例6所述的方法，研究了产生GABA的细菌在不同pH值下的GABA产生能力。如图5所示，某些细菌（例如B. dorei KLE1912）在较低pH（例如约4.5至约5.0）下产生相对类似量的GABA。相比之下，某些细菌取决于pH产生不同量的GABA（例如B. vulgatusKLE1910和B. ovatus KLE1770）。值得注意的是，如B. vulgatus KLE1910和B. ovatusKLE1770所示，发现一些细菌在较低pH下比在较高pH下产生相对更多的GABA，而一些细菌在较高pH下比在较低pH下产生相对更多的GABA。

在鉴定能够产生GABA的细菌的方法的一些实施方案中，基质是琼脂。在一些实施方案中，使基质与E. gabavorous接触的步骤包括使用E. gabavorous的稀释溶液对琼脂划线。随后通过E. gabavorous的生长诱导鉴定产生GABA的集落。如上文所述，E. gabavorous生长被用于确定细菌菌株是否产生GABA。但是，本领域技术人员将理解任何严格需要GABA用于生长和存活的细菌均可以如上文所述用于鉴定可以产生GABA的细菌。

实施例

本发明进一步通过以下实施例和合成实例进行阐述，其不应被理解为将本发明的范围或精神限制在本文所述的特定程序中。应当理解为提供实施例以阐述某些实施方案并且从而不意图限制本发明的范围。应进一步理解的是可以对本领域技术人员表现出多种其它实施方案、修改和其等效物的手段，而不背离本发明的精神和/或所附权利要求的范围。

除非另有说明，全部材料从商业供应商获得并且在没有进一步纯化下使用。从Sigma-Aldrich (Milwaukee， WI)获得无水溶剂并直接使用。

除非另外指明，否则使用常规细菌引物27F (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)（如Seq ID No. 2287所示）和492R (5′- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′) (如Seq ID No. 2288所示)执行PCR，以扩增16S rRNA基因。PCR反应混合物为12.5 µL GoTaq Master Mix(Promega)、1 µL 10 µM 27F和1492R引物、9.5 µL Nuclease Free Water (Promega)和在100 µL无菌蒸馏水中重悬的1 µL 集落。扩增条件为一次95℃ 5分钟循环；30次95℃ 30s，55℃ 30s， 72℃ 90s 循环；和最终的一次72℃ 7分钟循环。随后在加载饱和溴乙锭的0.8%琼脂糖凝胶上使用凝胶电泳确认PCR扩增反应。成功的PCR使用pplied Biosystems 3730xlDNA分析仪使用27F引物通过Macrogen Corporation测序。使用DNA Baser(www.DnaBaser.com)执行序列质量控制，其中将末端切平直到在18碱基窗口出现超过75%的良好碱基（通过具有QV得分高于25进行限定）。使用EzTaxon服务器实施系统发生邻居的鉴定和配对序列相似性的计算。

实施例1：人粪便收集

使用商购可得的粪便收集容器收集来自健康人供体的粪便样品。在收集的5分钟内，将1克粪便重悬于9 mL在PBS中的无菌20%甘油中，并且使用涡旋均质化30秒。将该混合物的1mL等分试样加载至冻存管并且在-80℃保存用于培养。

实施例2：来自人粪便样品的辅助者-未培养对的培养

全部培养工作在Coy Anaerobic Vinyl室内以5%氢气、10%CO₂、85%氮气的环境下执行。厌氧地在PBS中制备解冻的粪便样品的系列稀释并且在具有2.5%酵母提取物的1XFastidious Anaerobic Agar (Accumedia)（FAAy）平板上进行珠分散(7-10 珠子/平板)。平板在37℃厌氧下温育一周，并且通过使用不同颜色的记号笔在平板外标点来跟踪集落每天的外观。在一周结束时，在PBS中制备延后形成的集落（在4-7天后出现）的系列稀释，并且在FAAy平板上进行珠分散。邻近的（< 2 cm）、早期形成的集落（在1-3天形成）在PBS中以高密度重悬。将5µL该悬液与其相应的分散候选依赖物点样至平板上，并且在室内温育至多达一周。围绕点样的辅助者的依赖性生物的诱导指示了阳性结果。

稀释来自健康人供体的粪便样品并且分散铺板至富集培养基，并且持续一周每天注意新形成的集落。将延后形成的集落（3-7天）稀释并且在营养琼脂平板上分散，并且将邻近的早期形成的集落（1-2天）的大块接种物点样，如图1A所示。使用该方法，鉴定了多种辅助者-未培养对，其中分散铺板的未培养的分离物在点样的可培养辅助者周围形成了生长梯度。

一种分离物，E. gabavorous KLE1738 (通过16S rRNA序列与Flavonifractorplautii ATCC 29863 93.22%相似)，依赖于脆弱拟杆菌KLE1758 (通过16S rRNA序列与脆弱拟杆菌ATCC 25852 100%相似)生长(图1B)。E. gabavorous是一种梭状芽胞杆菌纲的革兰氏阳性生物。

实施例3：确定GABA为E. gabavorous的生长因子

如图2A和2B所示在富集培养基中生长的48-小时培养的脆弱拟杆菌KLE1758诱导E.gabavorous的生长，其能够进行生长因子的生物测定驱动的纯化。使用乙酸乙酯将上清液以溶剂分离，并且水中残留级分诱导了E. gabavorous的生长。随后使用HP-20柱层析纯化水级分，并且如图2C所示大多数极性级分诱导E. gabavorous的生长。随后通过制备型HPLC进一步将活性级分分级。HPLC产生了一种活性级分，并且NMR显示器含有10种化合物，主要为GABA、苏氨酸、乳酸、缬氨酸、谷氨酰胺、丙二酸、琥珀酸和丙氨酸。将全部化合物点在分散有E. gabavorous的平板上，并且仅GABA导致了诱导生长，如图2E-F所示。化合物通过NMR分析鉴定，其包括¹H、¹³C、¹H-¹H COSY、TOCY、HSQC和HMBC NMR实验，以鉴定级分的组成成分。全部NMR实验在装配有间接监测探针的Varian INOVA 600 MHz NMR分光计上实施。

实施例4：测试用于诱导E. gabavorous的其它化合物

如图2G所示测试多种化合物诱导E. gabavorous生长的能力。取决于在水中的溶解度，在图2G所示的浓度下制备各种化合物的储备液（除了ATCC矿物和维生素混合物，均购自Sigma）。随后将5µL的储备液点在分散有E. gabavorous的FAAy平板上，并且厌氧诱导1周并且观察任何生长。除了GABA没有化合物诱导生长。

实施例5：全基因组测序和标注

从具有1.0 mg/mL GABA的FAAy平板上厌氧生长48小时的E. gabavorous的细胞分离DNA用于使用PowerSoil® DNA Isolation 试剂盒 (Mo Bio， San Diego， CA)以制造商说明书进行基因组测序，产生了约5.0 µg高质量DNA。通过在马萨诸塞州波士顿的塔夫茨大学的Genomic Core执行基因组测序和从头组装。在Illumina MiSeq 上使用以双端250个碱基形式的MiSeq V2 500循环化学将E. gabavorous基因组测序。简而言之，将100 ng基因组DNA在Covaris M220上剪切至大约600碱基的平均片段大小。使用所述片段DNA作为输入，使用Illumina TruSeq Nano DNA Sample Preparation 试剂盒根据生产商说明制备测序文库。使用CASAVA在来自MiSeq的原始数据上执行碱基识别和多路处理并且生成fastq文件。使用以自定义参数优化管道的Edena V3.131028执行基因组的从头组装。通过叠连群统计的估计，报道最佳组装的基因组。组装产生了68个叠连群（n），全部叠连群具有超过200个碱基（n:200）的序列长度。7个叠连群具有比N50 (119748)更高的值并且最小叠连群长度为355 (min)。N20、N50和N20分别为33403、119748和204670。最大叠连群长度（max）为344080，并且估计基因组大小为2500009。使用RAST服务器和KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes) 数据库的KAAS (KEGG Automatic Annotation Server)分析工具标注草案基因组。使用RAST标注E. gabavorous的基因组，并且使用RAST比较CAG:113和E.gabavorous的基因组。

实施例6：脆弱拟杆菌中谷氨酸和GABA生产的定量

使用荧光团辅助检测，通过HPLC测定脆弱拟杆菌 KLE1758上清液中所含的谷氨酸和GABA的绝对量。具体地，根据生产商方案通过与AccQ试剂(Waters)的反应将游离胺标记用于分析。从通过将GABA（2.0mg）溶解于水(200 µL)中、(Glu)(10.2 mg)溶解于水(1020 µL)和磺丙氨酸(CSA)(16.9 mg)溶解于水(1690 µL)制备的储备溶液（10 mg/mL）生成标准曲线。将这些进行系列稀释以生成浓度梯度。具体地，将储备液制备为0.1mg/mL、0.05 mg/mL、0.01 mg/mL和0.001 mg/mL的终浓度。将给定储备溶液的等分试样添加至AccQ反应缓冲液(最终25 µL)，随后添加乙腈溶解的AccQ试剂(25 µL)。其在55-60℃反应10分钟，并且随后直接转移至装配有玻璃插入物的LCMS小瓶。氨基酸的反应浓度为20 ng/µL、10 ng/µL、5ng/µL、2.5 ng/µL、1 ng/µL、0.5 ng/µL、1 ng/µL和0 ng/µL（对照）。将这些样品注射(10 µL)至Agilent LCMS在随后的时间进程中使用溶剂A(水/0.1%甲酸)和B(乙腈/0.1%甲酸)的梯度：1) 0-40分钟2% B至98% B的线性梯度；2) 40-45分钟等度98% B；3) 45-45.5分钟98%B至2 % B的线性梯度；4) 45.5-55分钟等度2% B。在9.5分钟洗脱CSA-AccA衍生物，在12.1分钟洗脱Glu-AccQ衍生物和在12.5分钟洗脱GABA-AccQ 衍生物。使用曲线下面积（提取离子(EIC)模式(GABA-AccQ为m/z = 274，Glu-AccQ为318和CSA-AccQ为340)）开发通过相对注射的原Glu、CSA或GABA（按ng）的量的作图面积的标准曲线。使用对每个测试浓度平均两次运行以生成标准曲线。在GABA和Glu的情况下，将CSA添加至全部反应至2.5 µg/mL的终浓度，并用作内部标准。

脆弱拟杆菌 KLE1758的一式三份的培养物在BHIych 中无菌地生长48小时，将细胞离心，并且通过0.2 µm滤器过滤上清液。将样品在4 ℃保存直到用于分析。为了分析所述样品，将每个样品的等分试样(2 µL)添加至AccQ反应缓冲剂(16 µL)中，CSA内部标准(缓冲液中2 µL 50 µg/mL溶液)，随后添加AccQ试剂(20 µL)。将这些样品在55℃加热10分钟，并且随后直接转移至装有玻璃插入物的LCMS小瓶。将每个样品的等分试样(10 µL)注射至LCMS，并且根据使用校准曲线的相同的注射程序分离。总的EIC曲线下面积表示使用ChemStation软件(Agilent)测定的GABA、Glu和CAS。每次注射代表原培养基浓度的25%，因此测定样品的总量（按ng）要乘以4倍以测定原浓度（按ng/µL = µg/mL）。将全部面积归一化为内部标准的曲线下面积（CAS），在整个实验过程中将其保持在恒定浓度。结果在图4A中给出。

实施例7：使用E. gabavorous对GABA生产者的共培养筛选

GABA分泌可以允许细菌在酸压力下存活。谷氨酸的脱羧作用产生GABA，其以质子化形式从细胞输出，碱化细胞质。大肠杆菌以及一些乳杆菌属和双歧杆菌属菌株显示产生GABA，但是这些生物通常在人肠道中以低丰度存在，并且在大肠杆菌的情况中，其依赖于低pH（例如约4.2和以下）。脆弱拟杆菌，E. gabavorous的辅助者，是常见的消化道细菌，但发现其与大肠杆菌类似，仅在低于约5.5的pH下观察到通过脆弱拟杆菌KLE1758的GABA产生，如图4A所示。在各pH值下，在左侧栏显示了GABA，并且在右侧栏显示了谷氨酸。不希望收到理论的束缚，因此认为其可用于鉴定能够在人大肠的生理相关pH（例如约5.5至约7.5pH，或约pH5.7至约7.4）下产生GABA的微生物。

为了实现该目的，利用E. gabavorous的严格的GABA需求以筛选能够在强烈缓冲的培养基上分泌GABA的细菌。细菌生长的代谢副产物可能降低不存在缓冲剂的培养基的pH。将粪便样品与熔化的琼脂混合并且在无菌室中导入培养皿，将琼脂凝固后立即将E.gabavorous分散在琼脂顶部。通过寻找E. gabavorous的生长诱导，并且测量琼脂的pH，鉴定在约6.0至约7.0的pH下产生GABA的细菌，以及在约4.5至约5.0下产生GABA的细菌，如在图4B中所示。使用27F和1492R通用引物扩增和测序全长16S rRNA基因，并且使用EZTaxon标注解释了多个属的多个代表细菌，所述属包括拟杆菌属、双歧杆菌属、Blautia、粪球菌属、Gordonibacter、Dorea、梭菌属（图4C）。在这些细菌中，仅青春双岐杆菌在先前被报道产生GABA。

实施例8：使用经工程改造的大肠杠菌菌株产生GABA并诱导E. gabavorous的生长

可以通过肠上皮细胞和通过一些细菌例如大肠杆菌和单增李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes），通过谷氨酸的脱羧作用产生GABA。在大肠杆菌中，谷氨酸的脱羧作用可以作为降低胞内pH的机制起作用并且GABA产生通常发生在低pH。为了研究大肠杆菌是否可以经工程改造以产生GABA，经由使用E. gabavorous的共培养测定，测试了具有在pCA24NIPTG诱导型高拷贝数载体中的天然谷氨酸脱羧酶（gadA、gadB）或GABA反向转运蛋白的大肠杆菌克隆的GABA生产。在大肠杆菌中谷氨酸脱羧酶（gadA、gadB）的过表达导致诱导了达到使用脆弱拟杆菌观察到的KLE1738生长水平，而GABA反向转运蛋白的表达则没有（图6）。改变KLE1738的生长培养基的pH不会改变GABA依赖性表型。不希望受到理论的束缚，这提示经工程改造的细菌组成型地或诱导型地过表达谷氨酸脱羧酶或其他产生GABA的酶，是产生GABA以及诱导E. gabavorous生长的有效方式。

等效性

尽管本发明连同上文所示的具体实施方案进行描述，但是很多可选方案、修改和其他变化将对于本领域技术人员显而易见。此类可选方案、修改和变化全部意图落入本发明的精神和范围之中。

Claims (85)

1.一种治疗性组合物，其包含至少一种纯化的细菌群体，所述细菌群体由能够在有需要的受试者中产生GABA的细菌组成。

2.权利要求1的治疗性组合物，其中所述至少一种细菌群体由包含与选自表1中所示的Seq. ID. No. 1-31之一的16S rDNA序列具有至少约95%同一性的16S rDNA序列的细菌组成。

3.权利要求1的治疗性组合物，其中所述至少一种纯化的细菌群体由选自以下的细菌组成：粪便拟杆菌 KLE1911; Bacteroides clarus KLE1930; Bacteroides doreiKLE1912; Bacteroides finegoldii KLE1931; 脆弱拟杆菌KLE1958; Bacteroidesmassiliensis KLE1932; 椭圆形拟杆菌 KLE1770; 粪便拟杆菌 KLE1933; 多形拟杆菌KLE1934; 单形拟杆菌 KLE1913; 普通拟杆菌 KLE1910; 解木聚糖拟杆菌 KLE1935; 青春双岐杆菌 KLE 1879; Blautia obeum KLE1914; Blautia wexlerae KLE1916;Butyricimonas virosa KLE1938; 产气荚膜梭菌 KLE1937; 索氏梭菌 KLE1939; 梭菌属KLE1862; 梭菌属 KLE1918; 粪芽孢菌属 KLE1779; 粪球菌属KLE1880; Dorealongicatena KLE1917; 迟缓埃格特菌 KLE1926; 直肠真杆菌 KLE1922; Gordonibacterpamelaeae KLE1915; Oscillibacter sp. KLE1928; 吉氏拟杆菌 KLE2020;Parabacteroides merdae KLE1863; 活泼瘤胃球菌 KLE1940; Turicibacter sanguinisKLE1941或其组合。

4.权利要求1的治疗性组合物，其中所述至少一种纯化的细菌群体由包含与选自表2中所示的Seq. ID. No.32-274之一的16S rDNA序列具有至少约95%同一性的16S rDNA序列的细菌组成。

5.权利要求1的治疗性组合物，其中所述至少一种细菌群体由包含与选自表10中所示的Seq. ID. No. 305-2217之一的16S rDNA序列具有至少约95%同一性的16S rDNA序列的细菌组成。

6.权利要求1的治疗性组合物，其中所述至少一种纯化的细菌群体由包含编码选自以下的酶的DNA序列的细菌组成：谷氨酸脱羧酶；腐胺氨基转移酶；γ-氨基丁醛脱氢酶；精氨酸脱羧酶；精胺酶；鸟氨酸脱羧酶或其组合。

7.权利要求6的治疗性组合物，其中所述谷氨酸脱羧酶；腐胺氨基转移酶；γ-氨基丁醛脱氢酶；精氨酸脱羧酶；精胺酶；鸟氨酸脱羧酶或其组合由与表3中所示的Seq. ID. No.275-304中任一的DNA序列具有至少70%相似的DNA序列编码。

8.权利要求6的治疗性组合物，其中所述谷氨酸脱羧酶由在DNA序列上与表4中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因具有至少95%相似的DNA序列编码。

9.权利要求6的治疗性组合物，其中所述腐胺氨基转移酶由在DNA序列上与表5中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因具有至少95%相似的DNA序列编码。

10.权利要求6的治疗性组合物，其中所述γ-氨基丁醛脱氢酶由在DNA序列上与表6中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因具有至少95%相似的DNA序列编码。

11.权利要求6的治疗性组合物，其中所述精氨酸脱羧酶由在DNA序列上与表7中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因具有至少95%相似的DNA序列编码。

12.权利要求6的治疗性组合物，其中所述胍丁胺酶由在DNA序列上与表8中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因具有至少95%相似的DNA序列编码。

13.权利要求6的治疗性组合物，其中所述鸟氨酸脱羧酶由在DNA序列上与表9中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因具有至少95%相似的DNA序列编码。

14.权利要求1的治疗性组合物，其中所述至少一种纯化的细菌群体由包含与选自以下的参考细菌具有至少约95%相似性的16S rDNA序列的细菌组成：

大肠杆菌 MG1655;

大肠杆菌 MG1655; 大肠杆菌 Nissle 1917或其组合。

15.权利要求1的治疗性组合物，其中所述细菌群体由能够在生理相关pH下产生GABA的细菌组成。

16.权利要求1的治疗性组合物，其中所述细菌群体由能够在约4.5至约7.5的pH范围下产生GABA的细菌组成。

17.权利要求1的治疗性组合物，其中所述细菌群体由能够在人消化道中产生GABA的细菌组成。

18.权利要求1的治疗性组合物，其中所述组合物为益生菌、益生元、胶囊、片剂、囊片、丸剂、糖锭、锭剂、粉剂、颗粒、医疗食物或其组合的形式。

19.权利要求1的治疗性组合物，其中所述组合物以粪便移植物施用。

20.权利要求1的治疗性组合物，其中所述细菌可以经由谷氨酸脱羧酶、腐胺氨基转移酶、γ-氨基丁醛脱氢酶、精氨酸脱羧酶、精胺酶和/或鸟氨酸脱羧酶的任意组合的表达产生GABA。

21.权利要求1的治疗性组合物，其进一步包含对消耗GABA的细菌是细胞毒性或细胞抑制性的纯化的细菌菌株。

22.权利要求21的治疗性组合物，其中所述消耗GABA的细菌是Evtepia gabavorous或厚壁菌门细菌MGS:114。

23.权利要求1的治疗性组合物，其进一步包含能够刺激产生GABA的细菌的生长或GABA产生水平的益生菌。

24.一种治疗有需要的受试者中的疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗性组合物，所述治疗性组合物包含至少一种由能够在有需要的受试者中产生GABA的细菌组成的纯化的细菌群体。

25.权利要求24的方法，其中所述疾病或病症是精神病或病症。

26.权利要求24的方法，其中所述精神病或病症选自：抑郁、躁郁症、精神分裂症、焦虑、焦虑症、成瘾、社交恐惧症、难治性重度抑郁症（TR-MDD）、重度抑郁症及其亚型（抑郁型忧郁、典型抑郁症、紧张性忧郁症、产后抑郁症和季节性情绪病症）、神经病变性淀粉样病症（帕金森氏病、阿尔茨海默病和亨廷顿氏病）、站立性颤抖、拉福拉病、不宁腿综合征、神经性疼痛、疼痛病症、痴呆、癫痫、僵人综合症、经前焦虑症、自闭症谱系障碍、睡眠障碍、多动症（ADHD）及其组合。

27.权利要求24的方法，其中治疗疾病或病症包括减轻所述疾病或病症的至少一种症状，诸如疲劳、失眠、运动障碍、压力、持续性焦虑、持续性沮丧、社交退缩、物质戒断、易怒、自杀倾向、自残倾向、不安、性欲低下、注意力地下、癫痫、失忆、发怒、情绪反应发作、混乱、疼痛和肌肉痉挛、食欲丧失、改变肠运动性或其组合。

28.权利要求24的治疗性组合物，其中所述至少一种细菌群体由包含与选自表1中所示的Seq. ID. No. 1-31之一的16S rDNA序列具有至少约95%同一性的16S rDNA序列的细菌组成。

29.权利要求24的治疗性组合物，其中所述至少一种纯化的细菌群体由选自以下的细菌组成：粪便拟杆菌 KLE1911; Bacteroides clarus KLE1930; Bacteroides doreiKLE1912; Bacteroides finegoldii KLE1931; 脆弱拟杆菌KLE1958; Bacteroidesmassiliensis KLE1932; 椭圆形拟杆菌 KLE1770; 粪便拟杆菌 KLE1933; 多形拟杆菌KLE1934; 单形拟杆菌 KLE1913; 普通拟杆菌 KLE1910; 解木聚糖拟杆菌 KLE1935; 青春双岐杆菌 KLE 1879; Blautia obeum KLE1914; Blautia wexlerae KLE1916;Butyricimonas virosa KLE1938; 产气荚膜梭菌 KLE1937; 索氏梭菌 KLE1939; 梭菌属KLE1862; 梭菌属 KLE1918; 粪芽孢菌属 KLE1779; 粪球菌属KLE1880; Dorealongicatena KLE1917; 迟缓埃格特菌 KLE1926; 直肠真杆菌 KLE1922; Gordonibacterpamelaeae KLE1915; Oscillibacter sp. KLE1928; 吉氏拟杆菌 KLE2020;Parabacteroides merdae KLE1863; 活泼瘤胃球菌 KLE1940; Turicibacter sanguinisKLE1941或其组合。

30.权利要求24的治疗性组合物，其中所述至少一种纯化的细菌群体由包含与选自表2中所示的Seq. ID. No.32-274 之一的16S rDNA序列具有至少约95%同一性的16S rDNA序列的细菌组成。

31.权利要求24的治疗性组合物，其中所述至少一种细菌群体由包含与选自表10中所示的Seq. ID. No. 305-2217中任一的16S rDNA序列具有至少约95%同一性的16S rDNA序列的细菌组成。

32.权利要求24的方法，其中所述至少一种纯化的细菌群体由包含编码选自以下的酶的DNA序列的细菌组成：谷氨酸脱羧酶；腐胺氨基转移酶；γ-氨基丁醛脱氢酶；精氨酸脱羧酶；精胺酶；鸟氨酸脱羧酶或其组合。

33.权利要求32的方法，其中所述谷氨酸脱羧酶；腐胺氨基转移酶；γ-氨基丁醛脱氢酶；精氨酸脱羧酶；精胺酶；鸟氨酸脱羧酶或其组合由与选自表3中所示的Seq. ID. No.275-304之一的DNA序列具有至少70%相似的DNA序列编码。

34.权利要求32的方法，其中所述谷氨酸脱羧酶由在DNA序列上与表4中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因具有至少95%相似的DNA序列编码。

35.权利要求32的方法，其中所述腐胺氨基转移酶由在DNA序列上与表5中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因具有至少95%相似的DNA序列编码。

36.权利要求32的方法，其中所述γ-氨基丁醛脱氢酶由在DNA序列上与表6中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因具有至少95%相似的DNA序列编码。

37.权利要求32的方法，其中所述精氨酸脱羧酶由在DNA序列上与表7中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因具有至少95%相似的DNA序列编码。

38.权利要求32的方法，其中所述胍丁胺酶由在DNA序列上与表8中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因具有至少95%相似的DNA序列编码。

39.权利要求32的方法，其中所述鸟氨酸脱羧酶由在DNA序列上与表9中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因具有至少95%相似的DNA序列编码。

40.权利要求24的方法，其中所述细菌经基因工程改造以产生GABA。

41.权利要求40的方法，其中所述细菌经工程改造以经由谷氨酸脱羧酶；腐胺氨基转移酶；γ-氨基丁醛脱氢酶；精氨酸脱羧酶；精胺酶；鸟氨酸脱羧酶或其组合的表达产生GABA。

42.权利要求41的方法，其中所述谷氨酸脱羧酶；腐胺氨基转移酶；γ-氨基丁醛脱氢酶；精氨酸脱羧酶；精胺酶；鸟氨酸脱羧酶或其组合由与选自表3中所示的Seq. ID. No.275-304之一的DNA序列具有至少70%相似的DNA序列编码。

43.权利要求41的方法，其中所述谷氨酸脱羧酶由在DNA序列上与表4中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因具有至少95%相似的DNA序列编码。

44.权利要求41的方法，其中所述腐胺氨基转移酶由在DNA序列上与表5中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因具有至少95%相似的DNA序列编码。

45.权利要求41的方法，其中所述γ-氨基丁醛脱氢酶由在DNA序列上与表6中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因具有至少95%相似的DNA序列编码。

46.权利要求41的方法，其中所述精氨酸脱羧酶由在DNA序列上与表7中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因具有至少95%相似的DNA序列编码。

47.权利要求41的方法，其中所述胍丁胺酶由在DNA序列上与表8中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因具有至少95%相似的DNA序列编码。

48.权利要求41的方法，其中所述鸟氨酸脱羧酶由在DNA序列上与表9中发现的具有EMBL/GENBANK/DDBJ ID的基因具有至少95%相似的DNA序列编码。

49.权利要求24的方法，其中所述至少一种纯化的细菌群体由包含与选自以下的参考细菌具有至少约95%相似性的16S rDNA序列的细菌组成：

大肠杆菌 MG1655;

大肠杆菌 MG1655; 大肠杆菌 Nissle 1917或其组合。

50.权利要求24的方法，其中所述细菌群体由能够在生理相关pH下产生GABA的细菌组成。

51.权利要求24的方法，其中所述细菌群体由能够在约4.5至约7.5的pH范围下产生GABA的细菌组成。

52.权利要求24的方法，其中所述细菌群体由能够在人消化道中产生GABA的细菌组成。

53.权利要求24的方法，其中所述组合物以粪便移植物施用。

54.权利要求24的方法，其中所述组合物以益生菌施用。

55.权利要求24的方法，其中所述细菌可以经由谷氨酸脱羧酶、腐胺氨基转移酶、γ-氨基丁醛脱氢酶、精氨酸脱羧酶、精胺酶、鸟氨酸脱羧酶及其组合的任意组合的表达产生GABA。

56.权利要求24的方法，其中所述至少一种细菌菌株对消耗GABA的细菌是细胞毒性或细胞抑制性的。

57.权利要求56的方法，其中所述消耗GABA的细菌是Evtepia gabavorous或厚壁菌门细菌MGS:114。

58.权利要求24的方法，其中进一步包括通过由测量受试者粪便中GABA的起始量确定受试者是否会从增加内源性GABA获益来鉴定需要治疗的受试者。

59.权利要求58的方法，其中所述受试者粪便中GABA的起始量低于约8 μg/湿或干粪便。

60.权利要求58的方法，其中所述受试者粪便中GABA的量在施用所述治疗性组合物后相对于起始量增加。

61.权利要求24的方法，其进一步包括通过由测量受试者粪便中产生GABA的细菌的起始量确定受试者是否会从增加内源性GABA获益来鉴定需要治疗的受试者。

62.权利要求61的方法，其中如通过16S序列作图测量的，在受试者粪便中的产生GABA的细菌的起始量小于总细菌的约10%。

63.权利要求61的方法，其中在施用所述治疗性组合物后，相对于受试者粪便中产生GABA的细菌的起始量，受试者粪便中的至少一种产生GABA的细菌增加。

64.权利要求24的方法，其进一步包括通过由测量受试者血液或血清中GABA的起始量确定受试者是否会从增加内源性GABA获益来鉴定需要治疗的受试者。

65.权利要求64的方法，其中所述受试者血液或血清中GABA的起始量低于约10 μg/升血液。

66.权利要求64的方法，其中所述受试者血液或血清中GABA的量在施用所述治疗性组合物后相对于起始量增加。

67.权利要求24的方法，其进一步包括通过由测量受试者脑中GABA的量确定受试者是否会从增加内源性GABA获益来鉴定需要治疗的受试者。

68.权利要求67的方法，其中所述受试者脑中GABA的起始量低于约1.0 mM/kg。

69.权利要求67的方法，其中所述受试者脑中GABA的量在施用所述治疗性组合物后相对于起始量增加。

70.权利要求24的方法，其进一步包括通过由测量受试者粪便中产生GABA的酶的起始量确定受试者是否会从增加内源性GABA获益来鉴定需要治疗的受试者。

71.权利要求70的方法，其中所述产生GABA的酶选自谷氨酸脱羧酶、腐胺氨基转移酶、γ-氨基丁醛脱氢酶、精氨酸脱羧酶、精胺酶、鸟氨酸脱羧酶或其组合。

72.权利要求70的方法，其中所述酶表达的起始量通过qPCR测量。

73.权利要求70的方法，其中在施用所述治疗性组合物后酶的表达相对于酶表达的起始量增加。

74.权利要求24的方法，其进一步包括通过由测量受试者脑中GABAergic应答的起始量确定受试者是否会从增加内源性GABA获益来鉴定需要治疗的受试者。

75.权利要求74的方法，其中所述受试者脑中GABAergic应答的量在施用所述治疗性组合物后相对于起始量增加。

76.权利要求24的方法，其中所述治疗性组合物包含能够刺激产生GABA的细菌的生长或GABA产生的益生元。

77.一种培养GABA依赖性细菌的方法，其包括将至少一种活的GABA依赖性细菌细胞放置在合适的基质上，并提供GABA来源。

78.权利要求77的方法，其中所述合适的基质是琼脂。

79.权利要求77的方法，其中提供GABA来源包括与另一种细菌菌株共培养，所述菌株能够产生GABA。

80.权利要求77的方法，其中将GABA添加至所述基质。

81.权利要求77的方法，其中所述GABA依赖性的细菌是E. gabavorous。

82.一种鉴定在人肠道的生理相关pH下能够产生GABA的一种或多种细菌菌株的方法，其包括：

（a）将据信含有产生GABA的细菌的样品分散在基质中，所述基质对GABA至少部分可渗透，

（b）将加载了潜在产生GABA细菌的基质与GABA依赖性细菌接触；和

（c）通过观察在基质中潜在产生GABA的细菌的周围形成的GABA依赖性细菌的菌落来鉴定产生GABA的细菌。

83.权利要求82的方法，其中所述基质经缓冲以维持在人胃肠道中发现的生理范围的pH下。

84.权利要求82的方法，其中所述GABA依赖性的细菌是E. gabavorous。

85.权利要求82的方法，其中所述pH是约4.5至约7.5。