CN116262900B - 一种微生物驱油菌及其菌剂与其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种微生物驱油菌及其菌剂与其制备方法和应用，该微生物驱油菌的微生物保藏号是：CGMCC No.21180。所述微生物驱油菌剂，含有如下任一种或多种：1)所述微生物驱油菌；2)所述微生物驱油菌的发酵液；3)所述微生物驱油菌的代谢产物。本发明所开发的是一种耐温、耐高压、耐矿化度，并且耐受杀菌剂和缓蚀剂的菌种，不仅提高了驱油菌种油藏环境适应性，而且在不改变油田现场生产制度的情况下，降低因停加杀菌剂等带来的腐蚀和硫化氢风险，同时改变现场注入方式，使驱油菌种经过地面扩培后持续注入地层，延长有效注入时间，降低实施成本，对微生物采油技术在低渗透油田的推广应用具有重要意义。

Description

一种微生物驱油菌及其菌剂与其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物采油技术领域，具体涉及一种微生物驱油菌及其菌剂与其制备方法和应用。
背景技术
微生物采油技术(Microbial Enhanced Oil Recovery,MEOR)是指将地面分离培养的微生物菌液和营养液注入油层，或单纯注入营养液激活油层内微生物，使其在油层内生长繁殖，产生有利于提高采收率的代谢产物或直接作用于原油改善原油物性，以提高油田采收率的采油方法。该技术相较物理、化学等三次采油技术，具有适用范围广、工艺简单、环境友好等优点，美国、俄罗斯、我国大庆油田、胜利油田等已经成功开展了现场应用，微生物采油技术的现场应用逐渐进入区块化、规模化的快速发展和工业化阶段。
菌种是微生物技术在油田应用的重要前提。一般认为分离、筛选自油田采出水或油泥中的采油功能菌对油藏地质环境的适应性更强，能够更好地发挥驱油作用。目前筛选到的采油菌种评价指标各异，并且大多没有经过高温、高压、高盐、杀菌剂和缓蚀剂等模拟油田地质和开发条件的驯化筛选，现场应用效果和适用范围受到很大影响。同时，微生物驱油技术在现场实施普遍采用微生物发酵生产后，将发酵液通过泵注方式挤入地层，受发酵成本和施工费用限制，单井组注入量0.001～0.003PV或者更少，且注入时间较短，微生物驱油效果难以体现。
发明内容
为了克服采油功能菌种油藏环境适应性不足、注入方式单一、综合成本高的问题，本发明的目的一是提供一种耐温、耐高压、耐矿化度，并且耐受油田常用杀菌剂和缓蚀剂的微生物驱油菌；
本发明的目的二是提供一种获得上述微生物驱油菌菌株的方法；
本发明的目的三是提供一种微生物驱油菌菌剂；
本发明的目的四是将所述的微生物驱油菌株或其发酵液或微生物驱油菌菌剂在微生物采油或者制备微生物采油的产品中的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一株微生物驱油菌CQS，其微生物保藏号为CGMCC No.21180。
本发明所述微生物驱油菌CQS的细胞形态特征如下：在LB平板上培养3天形成1～2mm白色菌落，菌落边缘整齐，无皱褶，菌体为长杆状，无鞭毛，菌体大小(0.2～0.6)×(1～2)μm；经16SrDNA序列同源性分析鉴定该微生物驱油菌为一新菌，属于线团拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis synnemataformans)；该微生物驱油菌的生理生化特征如下：革兰氏阳性，不抗酸，接触酶阳性，明胶液化阴性，酪氨酸水解阴性，酪蛋白水解阴性，无特征性糖，全细胞水解液不含马杜拉糖，无诺卡枝菌酸。
本发明还提供了一种获得微生物驱油菌菌株的方法，包括如下步骤：
a.菌种分离：将采集的油、水样各按体积百分比10％加入原油发酵培养基中，在55℃，100rpm条件下，恒温振荡富集培养7～10天后，挑选能够使原油分散成油滴或成褐色悬浮液的摇瓶培养物，吸取1mL做梯度稀释，然后涂布在血平板培养基上，在37℃恒温下培养48h，培养结束后挑取产生溶血圈的单菌落，转接到斜面培养基上保存备用；
b.驯化，包括b01：用含0、10、15、25g/L NaHCO3的水分别配制LB液体培养基，调pH分别为5、7、9，将步骤a筛选到的菌种分别接种于上述LB液体培养基中，在15℃、35℃、55℃、75℃，以及0MPa、10MPa、20MPa、30MPa环压下培养菌种，进行菌种驯化筛选，培养72h后取培养液涂布LB平板，挑取单菌落转接至斜面培养基上保存备用，得到微生物驱油菌菌株，其可耐受20～55℃的培养温度，NaHCO3耐受性为0～25g/L，pH耐受性为5～9，压力耐受性为0～30MPa；
b02：将油田用杀菌剂、缓蚀剂分别加入LB液体培养基中至终浓度分别为100ppm、200ppm，并将杀菌剂和缓蚀剂同时添加至LB培养基中至终浓度分别为100、200ppm，然后将上述三种LB液体培养基中分别接种步骤a斜面培养基上保存的菌种，在35℃恒温下，100rpm振荡培养3～5天红藕取培养液涂布LB平板，挑取单菌落转接于斜面培养基上保存备用，得到微生物驱油菌菌株，其杀菌剂和缓蚀剂的耐受性为0～200ppm。
进一步地，上述步骤a中，原油发酵培养基，用于富集和分离以原油为唯一碳源的细菌，其配方按质量百分比计，包括：NaCl3％，KH2PO40.5％，NaNO30.07％，酵母膏0.01％，NH4NO30.07％，微量元素液0.5mL％，MgSO4·7H2O 0.05％，原油10％，其中微量元素液按质量百分比计，包括：硫酸锌0.029％，氯化钙0.024％，硫酸铜0.025％，pH：7.0～7.2，110℃灭菌30分钟。
进一步地，所述血平板培养基，用于分离生物表面活性剂产生菌，按质量百分比计，其配方为：牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，酵母膏0.01％，氯化钠0.5％，琼脂1.8％，pH：7.0，121℃灭菌15分钟，在培养基冷却至42～48℃时，将无菌绵羊红细胞按质量百分数为5％的比例加入并混合均匀，制成血平板培养基，4℃冷藏保存备用。
进一步地，所述斜面培养基，用于菌种的保藏，按质量百分比计，其配方为：蛋白胨1％，葡萄糖2％，酵母膏0.01％，琼脂1.8％，pH：7.0，110℃灭菌15分钟。
本发明还提供了上述微生物驱油菌的发酵液。
进一步地，该微生物驱油菌的发酵液是由以下培养基发酵获得：可溶性淀粉20g/L，KNO31g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH＝7.4～7.6。
更进一步地，所述发酵液的发酵条件为35℃恒温，100rpm振荡培养3～5天。
本发明还提供了一种微生物驱油菌剂，其含有如下任一种或多种：
1)所述微生物驱油菌；
2)所述微生物驱油菌的发酵液；
3)所述微生物驱油菌的代谢产物。
本发明还提供了一种微生物驱油菌剂的制备方法，包括如下步骤：
S1.菌种的活化：将-80℃或液氮条件下的微生物驱油菌，解冻后，以划线法接种于活化用固体培养基上，在35℃恒温下培养48h；
S2.种子液的制备：从步骤S1的固体培养基上挑取单克隆菌落，接种于种子培养基中，在35℃、100rpm的条件下振荡培养48h，得种子液；
S3.发酵培养：将S2得到的种子液按质量百分数5％的接菌量接入发酵培养基中，在35℃恒温下，100rpm振荡培养3～5天，得到发酵液；
S4.质检：采用稀释梯度法检测发酵液中活菌数目，使活菌数≥108CFU/ml，得到微生物驱油菌剂。
进一步地，步骤S1中，所述活化用固体培养基的配方为：酵母浸粉1.0g/L，多价蛋白胨2.0g/L，牛肉浸粉1.0g/L，葡萄糖10.0g/L，琼脂20.0g/L，pH值7.0±0.1。
进一步地，步骤S2中，所述种子培养基的配方包括：可溶性淀粉10.0g/L，K2HPO41.0g/L，MgSO4.7H2O 1.0g/L，NaCl 1.0g/L，(NH4)2SO42.0g/L，CaCO32.0g/L，FeSO4.7H2O 0.001g/L，MnCl2.7H2O 0.001g/L，pH值7.0±0.1。
进一步地，步骤S3中，所述发酵培养的配方为：可溶性淀粉20g/L，KNO31g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH＝7.4～7.6。
本发明还提供了上述微生物驱油菌或其发酵液或微生物驱油菌菌剂在微生物采油或者制备微生物采油的产品中的应用。
本发明还提供了一种微生物采油的方法，包括如下步骤：在采油过程中，加入上述微生物驱油菌或微生物驱油菌的发酵液或上述微生物驱油菌剂。
进一步地，上述微生物采油的方法，具体为：培养期，关闭采出水处理系统中的二级生化处理池、三级生化处理池底部的排放阀，打开一级生化处理池底部的排放阀，采出水依次经除油池、缓冲池、冷却塔、一级生化处理池处理后直接进入下级流程，注入地层；将质量百分比为8～12％的微生物驱油菌菌株发酵液投入二级生化处理池和三级生化处理池进行扩培增菌，3～7天后三级生化处理池出口端注入液中总菌数达到106CFU/ml以上时，关闭一级生化处理池底部的排放阀，同时打开三级生化处理池底部的排放阀，此时采出水依次经除油池、缓冲池、冷却塔、一级生化处理池、二级生化处理池、三级生化处理池处理后，再经由下级流程注入地层；此后每3～7天通过自吸泵投加质量百分比为0.8～1.2％菌株发酵液注入二级生化处理池和三级生化处理池中。
采用上述技术方案，本发明的优点如下：
1.本发明提供的菌株分离、筛选自油田采出水，能够以原油为唯一碳源，并且经过高温、高压、高盐、杀菌剂和缓蚀剂等模拟油田地质和开发条件的驯化筛选，生长温度20～55℃，pH5～9，NaHCO3耐受性0～25g/L，压力耐受性0～30MPa，油田常用杀菌剂和缓蚀剂耐受性0～200ppm，对油田环境的适应性更强(相比现有微生物采油技术的菌种筛选，其大多无菌种驯化过程，菌株压力耐受性差，一般耐压小于10MPa，无杀菌剂和缓蚀剂耐受性，所以现场使用一般需要停加杀菌剂和缓蚀剂，影响油田正常注水工作制度，由此带来管道腐蚀及高H2S风险)，从而能够更好地发挥驱油作用，具有广阔应用前景。
2.本发明提供的菌株经由采出水处理系统扩培后持续注入地层，延长有效注入时间，降低实施成本，以此形成了低成本微生物采油技术(相比现有微生物采油技术的现场实施工艺，菌株发酵液一般通过泵注方式挤入地层，现场需要配备柱塞泵、储液罐、配液罐等注入配套设备，受发酵成本和施工费用限制，单井组注入量0.001～0.003PV或者更少，且注入时间较短，微生物驱油效果难以体现)，一次投菌(10％投菌量)后区块递减降低1～3个百分点，对应油井井口H2S平均下降33.76％，对微生物采油技术在低渗透油田的推广应用具有重要意义。
3.本发明所述微生物驱油菌菌株应用时实施扩培后，其提高驱油效率评价结果为提高了模拟岩心驱替效率10.66％。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚的了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的设计方案和附图。
图1为实施例1中摇瓶培养物涂布血平板培养过程中的观察图。
图2为实施例1中血平板上产生溶血圈的单菌落图。
图3为实施例1中菌株的16S rDNA序列分子进化树。
图4为实施例3中菌株接入采出水处理系统后总菌数检测结果图。
图5为实施例3中菌株接入采出水处理系统后原油含量检测结果图。
图6为实施例3中菌株接入采出水处理系统后表面张力检测结果图。
图7为实施例3中菌株接入采出水处理系统后生物表面活性剂检测结果图。
图8为实施例3中菌株接入采出水处理系统后pH值检测结果图。
图9为实施例4中菌株接入采出水处理系统后生长曲线图。
图10为实施例4中10％菌株接入采出水处理系统后续投加周期优化结果图。
图11为实施例4中现场实施工艺流程示意图。
附图标记说明：
1、采出水；2、除油池；3、缓冲池；4、冷却塔；5、一级生化处理池；6、二级生化处理池；7、三级生化处理池；8、自吸泵；9、原液桶。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
具体实施方式
结合以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可进一步地理解本发明的内容。
需要说明的是，实施例中采用的实施条件可以根据具体实验环境做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。本发明中所提及的方法如无特殊说明则均为常规方法；下述实施例中提及的所有原料如无特别说明均从公开的商业途径获得。
本发明提供了一种微生物驱油菌CQS，该菌是从油田采出液中分离，以原油为唯一碳源的富集培养基以及血平板筛选得到，并通过高温、高压、高盐，以及油田用杀菌剂和缓蚀剂驯化筛选获得；该菌株已经已于2020年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，分类命名为：线团拟诺卡氏菌Nocardiopsis synnemataformans，保藏编号为CGMCC No.21180。
本发明所分离的微生物驱油菌CQS的细胞形态特征如下：在LB平板上培养3天形成1～2mm白色菌落，菌落边缘整齐，无皱褶，菌体为长杆状，无鞭毛，菌体大小(0.2～0.6)×(1～2)μm；经16SrDNA序列同源性分析鉴定该微生物驱油菌为一新菌，属于线团拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis synnemataformans)。
该微生物驱油菌菌株兼性好氧，能够以原油为生长繁殖的唯一碳源，生长温度20～55℃，pH5～9，NaHCO3耐受性0～25g/L，压力耐受性0～30MPa，其对油田环境的适应性更强，经由采出水处理系统扩培后持续注入地层，延长有效注入时间，降低实施成本，以此形成了成本更低的微生物采油技术。
该微生物驱油菌CQS的生理生化特征如下：革兰氏阳性，不抗酸，接触酶阳性，明胶液化阴性，酪氨酸水解阴性，酪蛋白水解阴性，无特征性糖，全细胞水解液不含马杜拉糖，无诺卡枝菌酸。
在一具体实施例中，本发明提供了一种获得微生物驱油菌菌株的方法，包括如下步骤：
a.菌种分离：将采集的油、水样各按体积百分比10％加入原油发酵培养基中，在55℃，100rpm条件下，恒温振荡富集培养7～10天后，挑选能够使原油分散成油滴或成褐色悬浮液的摇瓶培养物，吸取1mL做梯度稀释，然后涂布在血平板培养基上，在37℃恒温下培养48h，培养结束后挑取产生溶血圈的单菌落，转接到斜面培养基上保存备用；
b.驯化，包括b01：用含0、10、15、25g/L NaHCO3的水分别配制LB液体培养基，调pH分别为5、7、9，将步骤a筛选到的菌种分别接种于上述LB液体培养基中，在15℃、35℃、55℃、75℃，以及0MPa、10MPa、20MPa、30MPa环压下培养菌种，进行菌种驯化筛选，培养72h后取培养液涂布LB平板，挑取单菌落转接至斜面培养基上保存备用，得到微生物驱油菌菌株，其可耐受20～55℃的培养温度，NaHCO3耐受性为0～25g/L，pH耐受性为5～9，压力耐受性为0～30MPa；
b02：将油田用杀菌剂、缓蚀剂分别加入LB液体培养基中至终浓度分别为100ppm、200ppm，并将杀菌剂和缓蚀剂同时添加至LB培养基中至终浓度分别为100、200ppm，然后将上述三种LB液体培养基中分别接种步骤a斜面培养基上保存的菌种，在35℃恒温下，100rpm振荡培养3～5天红藕取培养液涂布LB平板，挑取单菌落转接于斜面培养基上保存备用，得到微生物驱油菌菌株，其杀菌剂和缓蚀剂的耐受性为0～200ppm。
进一步地，上述步骤a中，原油发酵培养基，用于富集和分离以原油为唯一碳源的细菌，其配方按质量百分比计，包括：NaCl 3％，KH2PO40.5％，NaNO30.07％，酵母膏0.01％，NH4NO30.07％，微量元素液0.5mL％，MgSO4·7H2O 0.05％，原油10％，其中微量元素液按质量百分比计，包括：硫酸锌0.029％，氯化钙0.024％，硫酸铜0.025％，pH：7.0～7.2，110℃灭菌30分钟。
进一步地，所述血平板培养基，用于分离生物表面活性剂产生菌，按质量百分比计，其配方为：牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，酵母膏0.01％，氯化钠0.5％，琼脂1.8％，pH：7.0，121℃灭菌15分钟，在培养基冷却至42～48℃时，将无菌绵羊红细胞按质量百分数为5％的比例加入并混合均匀，制成血平板培养基，4℃冷藏保存备用。
进一步地，所述斜面培养基，用于菌种的保藏，按质量百分比计，其配方为：蛋白胨1％，葡萄糖2％，酵母膏0.01％，琼脂1.8％，pH：7.0，110℃灭菌15分钟。
在一具体实施例中，本发明提供了一种微生物驱油菌的发酵液。
进一步地，该微生物驱油菌的发酵液是由以下培养基发酵获得：可溶性淀粉20g/L，KNO31g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH＝7.4～7.6。
所述发酵液的发酵条件为35℃恒温，100rpm振荡培养3～5天。
在一具体实施例中，本发明提供了一种微生物驱油菌剂，其含有如下任一种或多种：
1)所述微生物驱油菌；
2)所述微生物驱油菌的发酵液；
3)所述微生物驱油菌的代谢产物。
在一具体实施例中，本发明提供了一种微生物驱油菌剂的制备方法，包括如下步骤：
S1.菌种的活化：将-80℃或液氮条件下的微生物驱油菌，解冻后，以划线法接种于活化用固体培养基上，在35℃恒温下培养48h；
S2.种子液的制备：从步骤S1的固体培养基上挑取单克隆菌落，接种于种子培养基中，在35℃、100rpm的条件下振荡培养48h，得种子液；
S3.发酵培养：将S2得到的种子液按质量百分数5％的接菌量接入发酵培养基中，在35℃恒温下，100rpm振荡培养3～5天，得到发酵液；
S4.质检：采用稀释梯度法检测发酵液中活菌数目，使活菌数≥108CFU/ml，得到微生物驱油菌剂。
本发明还提供了上述微生物驱油菌或其发酵液或微生物驱油菌菌剂在微生物采油或者制备微生物采油的产品中的应用。
在一具体实施例中，本发明提供了一种微生物采油的方法，包括如下步骤：在采油过程中，加入上述微生物驱油菌或微生物驱油菌的发酵液或上述微生物驱油菌剂。
进一步地，上述微生物采油的方法，具体为：培养期，关闭采出水处理系统中的二级生化处理池、三级生化处理池底部的排放阀，打开一级生化处理池底部的排放阀，采出水依次经除油池、缓冲池、冷却塔、一级生化处理池处理后直接进入下级流程，注入地层；将质量百分比为8～12％的微生物驱油菌菌株发酵液投入二级生化处理池和三级生化处理池进行扩培增菌，3～7天后三级生化处理池出口端注入液中总菌数达到106CFU/ml以上时，关闭一级生化处理池底部的排放阀，同时打开三级生化处理池底部的排放阀，此时采出水依次经除油池、缓冲池、冷却塔、一级生化处理池、二级生化处理池、三级生化处理池处理后，再经由下级流程注入地层；此后每3～7天通过自吸泵投加质量百分比为0.8～1.2％菌株发酵液注入二级生化处理池和三级生化处理池中。
值得一提的是，除非另有说明，采出水处理系统为本领域已知的任意的油田采出水回注处理站点使用的基于微生物挂膜(亦称微生物固定化)技术的含油污水处理系统，其使用的组合填料(即微生物贴附生长的材料)由双圈塑料环与均匀地压在所述塑料环的圈上的醛化纤维束或涤纶细丝组成；含有上述组合填料的本领域已知的含油污水处理系统包括一级生化处理池、二级生化处理池、三级生化处理池中的一个或多个。
下面将结合实施例详细阐述本发明。
以下实施例中发酵液为工业化大规模发酵生产的发酵液，有效活菌数≥108CFU/ml。
实施例1：
本实施例提供了一种微生物驱油菌菌株的分离、驯化、鉴定与保藏：
一、菌种分离
将采集的油、水样各按10％(体积百分比)加入原油发酵培养基中，在55℃，100rpm条件下，恒温振荡富集培养7～10天后，以原油为唯一碳源的耐较高温度和较高盐度的兼性厌氧菌被富集；挑选能够使原油分散成油滴或成褐色悬浮液的摇瓶培养物，吸取1mL做梯度稀释，然后涂布血平板培养基上，在37℃恒温培养箱中培养48h，培养期间观察如图1所示，培养结束后挑取产生溶血圈的单菌落(如图2所示)，转接到斜面培养基上保存。
上述原油发酵培养基，用于富集和分离以原油为唯一碳源的细菌，其配方为(质量百分比)：NaCl3％，KH2PO40.5％，NaNO30.07％，酵母膏0.01％，NH4NO30.07％，微量元素液0.5mL％(体积百分比)，MgSO4·7H2O 0.05％，原油10％，其中微量元素液为(质量百分比)：硫酸锌0.029％，氯化钙0.024％，硫酸铜0.025％，pH：7.0～7.2，110℃灭菌30分钟。
血平板培养基：分离生物表面活性剂产生菌，其配方为(质量百分比)：牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，酵母膏0.01％，氯化钠0.5％，琼脂1.8％，pH：7.0，121℃灭菌15分钟。在培养基冷却至45℃左右时，将无菌绵羊红细胞按5％(质量百分比)的比例加入并混合均匀，制成血平板，4℃冷藏保存备用。
斜面培养基：用于菌种的保藏，其配方为(质量百分比)：蛋白胨1％，葡萄糖2％，酵母膏0.01％，琼脂1.8％，pH：7.0，110℃灭菌15分钟。
二、驯化
用含0、10、15、25g/L NaHCO3的水分别配制LB液体培养基，调pH分别为5、7、9，将筛选到的菌种分别接种于上述LB液体培养基中，在15、35、55、75℃，以及0、10、20、30MPa环压下培养菌种，进行菌种驯化筛选，培养72h后取培养液涂布LB平板，挑取单菌落转接至斜面培养基上保存。
将油田现场常用杀菌剂、缓蚀剂(本实施例使用的杀菌剂型号为SJ66和AD52-168，缓蚀剂型号为AD43-3)分别加入LB培养基中至终浓度分别为100ppm(现场使用浓度)、200ppm，并将杀菌剂和缓蚀剂同时添加至LB培养基中至终浓度分别为100、200ppm，上述三种LB培养基中分别接种斜面培养基保存的菌种，在35℃恒温下，100rpm振荡培养3～5天，取培养液涂布LB平板，挑取单菌落转接与斜面培养基上保存。
得到驯化后的菌种，其可耐受20～55℃培养温度，最佳生长温度20～55℃，pH5～9，NaHCO3耐受性0～25g/L，压力耐受性0～30MPa，油田常用杀菌剂和缓蚀剂耐受性0～200ppm。
三、菌株的鉴定
1、形态学鉴定
在LB平板培养3天形成1～2mm白色菌落，菌落边缘整齐，无皱褶；无菌条件下挑取单菌落，涂抹于载玻片上，在载玻片上滴加1滴无菌水，覆盖盖玻片，普通光学显微镜下观察得到，菌体为长杆状，无鞭毛，菌体大小(0.2～0.6)×(1～2)μm。
2、生理生化特征分析
参考《常见细菌系统鉴定手册》和《微生物学实验》测定菌株的生理生化特征，结果表明，该菌株的生理生化特征如下：革兰氏阳性，不抗酸，接触酶阳性，明胶液化阴性，酪氨酸水解阴性，酪蛋白水解阴性，无特征性糖，全细胞水解液不含马杜拉糖，无诺卡枝菌酸。
3、16S rDNA序列同源性分析
将菌株发酵液抽提基因组DNA，通过PCR扩增16S rDNA基因片段，PCR产物纯化回收后进行测序，测序结果显示其16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，得到的序列在NCBI数据库(https://www.nlm.nih.gov/)进行Blast在线比对，下载比对结果，经由Mega(Molecular Evolutionary Genetic Analusis)X软件，采用Neighbor-Joinning方法绘制分子进化树(如图3所示)，菌种鉴定结果为线团拟诺卡氏菌属(Nocardiopsissynnemataformans)。
四、菌株的保藏
菌株已于2020年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，分类命名为：线团拟诺卡氏菌Nocardiopsis synnemataformans，保藏编号为CGMCC No.21180。
实施例2：
本实施例提供了一种微生物驱油菌剂，其含有如下任一种或多种：1)实施例1所述微生物驱油菌；2)实施例1所述微生物驱油菌的发酵液；3)实施例1所述微生物驱油菌的代谢产物。
本实施例还提供了一种具体地制备微生物驱油菌剂的方法，包括如下步骤：
S1.菌种的活化：将-80℃或液氮条件下的微生物驱油菌，解冻后，以划线法接种于活化用固体培养基上，在35℃恒温下培养48h；具体地，所述活化用固体培养基的配方为：酵母浸粉1.0g/L，多价蛋白胨2.0g/L，牛肉浸粉1.0g/L，葡萄糖10.0g/L，琼脂20.0g/L，pH值7.0±0.1；
S2.种子液的制备：从步骤S1的固体培养基上挑取单克隆菌落，接种于种子培养基中，在35℃、100rpm的条件下振荡培养48h，得种子液；具体地，所述种子培养基的配方包括：可溶性淀粉10.0g/L，K2HPO41.0g/L，MgSO4.7H2O 1.0g/L，NaCl 1.0g/L，(NH4)2SO42.0g/L，CaCO32.0g/L，FeSO4.7H2O 0.001g/L，MnCl2.7H2O 0.001g/L，pH值7.0±0.1；
S3.发酵培养：将S2得到的种子液按质量百分数5％的接菌量接入发酵培养基中，在35℃恒温下，100rpm振荡培养3～5天，得到发酵液；具体地，所述发酵培养的配方为：可溶性淀粉20g/L，KNO31g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH＝7.4～7.6
S4.质检：采用稀释梯度法检测发酵液活菌数≥108CFU/ml。
实施例3：
本实施例提供菌株与采出水处理系统配伍性评价。
(1)菌株对采出水处理系统中除油微生物的影响
将现场采集到的1串采出水处理系统生化处理池中的除油微生物菌膜悬挂于采出水中，维持35℃恒温、曝气，模拟现场水处理状态，添加1％NaNO3(氮源)继续培养菌膜，分别加入5％和10％菌株发酵液(通过菌种发酵获得，按5％接菌量接入发酵培养基中，35℃恒温，100rpm振荡培养3～5天。其中发酵培养配方：可溶性淀粉20g/L，KNO3 1g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH＝7.4～7.6)，观察菌膜和采出水状态，并检测总菌数和水中原油含量。菌株加入后，除油微生物菌膜目视观察没有出现脱落现象，采出水处理后澄清透明，菌株可以在除油微生物存在的情况下迅速繁殖，12小时总菌数增长至1.4×108CFU/ml(如图4所示)，采出水中原油含量采用基于紫外风光光度法的OilTech121便携式测油仪检测，其原油含量由208.2mg/L降至7.8mg/L(如图5所示)，达到SY/T 5329-2012《碎屑岩油藏注水水质指标及分析方法》标准要求。
(2)菌株在采出水处理系统中贴膜生长及代谢性能的评价
将现场采集到的1串采出水处理系统生化处理池中的除油微生物菌膜悬挂于采出水中，维持35℃恒温、曝气，模拟现场水处理状态，加入10％菌株发酵液，连续培养10天，菌膜干重采用差重法进行检测，结果显示在菌株挂膜前后增加了1.751-2.898g；表面张力按照GB/T 5549-2010《表面活性剂表面张力的测定》中规定的铂金圆环拉起液膜法，采用JYW-200A型表界面张力检测仪进行检测，结果显示表面张力逐渐由73.2133mN/m降为41.1259mN/m(如图6所示)；生物表面活性剂含量采用硫酸-蒽酮法进行检测，结果显示生物表面活性剂逐渐升高为82.3mg/L(如图7所示)；pH值采用玻璃电极法进行检测，结果显示pH值由7.5下降至6.3(如图8所示)。以上结果表明驱油微生物生长繁殖和代谢性能良好。
(3)菌株与采出水处理系统中杀菌剂、缓蚀剂的配伍性评价
用采出液配制LB培养基，设置杀菌剂处理组如下：
阳性对照(CK+)：不加杀菌剂，即10％菌株发酵液；
阴性对照(CK-)：只加杀菌剂，即SJ66杀菌剂100ppm；
试验组1：SJ66杀菌剂100ppm+10％菌株发酵液；
试验组2：SJ66杀菌剂200ppm+10％菌株发酵液；
试验组3：AD52-168杀菌剂100ppm+10％菌株发酵液；
试验组4：AD52-168杀菌剂200ppm+10％菌株发酵液；
试验组5：SJ66杀菌剂100ppm+AD52-168杀菌剂100ppm+10％菌株发酵液。
用采出液配制LB培养基，设置缓蚀剂处理组如下：
阳性对照(CK+)：不加缓蚀剂，即10％菌株发酵液；
阴性对照(CK-)：只加缓蚀剂，即AD43-3缓蚀剂100ppm；
试验组1：AD43-3缓蚀剂100ppm+10％菌株发酵液；
试验组2：AD43-3缓蚀剂200ppm+10％菌株发酵液；
试验组3：SJ66杀菌剂100ppm+AD43-3缓蚀剂100ppm+10％菌株发酵液；
试验组4：AD52-168杀菌剂100ppm+AD43-3缓蚀剂100ppm+10％菌株发酵液。
所有处理组不灭菌，在35℃恒温条件下，100rpm振荡培养24小时，检测总菌数。结果显示各试验组总菌数与阳性对照(CK+)组总菌数相当(如表1、2所示)，均为108CFU/ml，驱油微生物对杀菌剂和缓蚀剂耐受性为0～200ppm。
表1不同浓度杀菌剂条件下总菌数检测结果
处理组 微生物总菌数(CFU/ml)
CK+ 6.9×108
CK- 2.5×102
1 5.8×108
2 5.5×108
3 6.3×108
4 5.7×108
5 5.2×108
表2不同浓度缓蚀剂条件下总菌数检测结果
处理组 微生物总菌数(CFU/ml)
CK+ 6.9×108
CK- 5.2×102
1 4.8×108
2 3.9×108
3 5.8×108
4 5.5×108
实施例4
本实施例提供微生物驱油菌株在长庆油田N区块中的应用。
现场应用在长庆油田N区块采出水生化处理站。如图11所示，培养期旁通采出水处理系统中的二、三级生化处理池，即关闭采出水处理系统中的二级生化处理池6、三级生化处理池7底部的排放阀，打开一级生化处理池5底部的排放阀，采出水1依次经除油池2、缓冲池3、冷却塔4、一级生化处理池5处理后直接进入下级流程，注入地层；将质量百分比为8～12％的微生物驱油菌菌株发酵液投入二级生化处理池6和三级生化处理池7进行扩培增菌(菌株接入采出水处理系统后生长曲线图如图9所示)，7天后三级生化处理池7出口端注入液中总菌数达到106CFU/ml以上时，关闭一级生化处理池5底部的排放阀，同时打开三级生化处理池7底部的排放阀，此时采出水1依次经除油池2、缓冲池3、冷却塔4、一级生化处理池5、二级生化处理池6、三级生化处理池7处理后，再经由下级流程注入地层；后续不旁通生化处理池，保存正常注水流程注入，每3天通过自吸泵从原液桶9中吸取1％的菌株发酵液注入到二级生化处理池6和三级生化处理池7可保证总菌数处于较高水平(10％菌株接入采出水处理系统后续投加周期优化结果如图10所示)，经由下级流程持续注入地层。注入站点在微生物注入约15天后，H2S开始出现下降趋势，对应油井井口H2S在微生物注入后普遍下降，平均下降幅度33.76％，区块阶段递减由措施前1.13％下降至-1.35％。
上述微生物驱油菌菌株应用时实施扩培后，三级生化池出口端(注入液)的物理模拟提高驱油效率评价，其中所述评价方法包括：准备岩心，测岩心气相渗透率；岩心抽真空，饱和地层水，测定岩心孔隙体积，计算岩心孔隙度；岩心饱和原油，老化7天，计算束缚水饱和度；一次水驱至出口端含水98％，计算水驱效率；注入1PV三级生化池出口端(注入液)，计算驱油效率；后续水驱至含水100％，计算该微生物驱油菌菌株现场实施扩培后，三级生化池出口端(注入液)的驱油效率提高值，评价结果为提高了模拟岩心驱替效率10.66％。
本发明克服了采油功能菌种油藏环境适应性不足、注入方式单一、综合成本高的问题，开发的微生物驱油菌，耐温、耐高压、耐矿化度，并且耐受杀菌剂和缓蚀剂，提高驱油菌种油藏环境适应性，不改变油田现场生产制度，降低因停加杀菌剂等带来的腐蚀和硫化氢风险，同时改变现场注入方式，使驱油菌种经过地面扩培后持续注入地层，延长有效注入时间，降低实施成本，对微生物采油技术在低渗透油田的推广应用具有重要意义。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中国石油天然气股份有限公司（长庆油田分公司）
<120> 一种微生物驱油菌及其菌剂与其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1459
<212> DNA
<213> 线团拟诺卡氏菌属()
<400> 1
caggacgaac gctggcggcg tgcttaacac atgcaagtcg agcggtaagg cccttcgggg 60
tacacgagcg gcgaacgggt gagtaacacg tgagcaacct gcccctgact ctgggataag 120
cggtggaaac gccgtctaat accggatacg acccgccacc tcatggtgga gggtggaaag 180
tttttcggtc agggatgggc tcgcggccta tcagcttgtt ggtggggtaa cggcctacca 240
aggcgattac gggtagccgg cctgagaggg cgaccggcca cactgggact gagacacggc 300
ccagactcct gcgggaggca gcagtgggga atattgcgca atgggcgaaa gcctgacgca 360
gcgacgccgc gtgggggatg acggccttcg ggttgtaaac ctcttttacc accaacgcag 420
gctcgaagtt ctcttcgggt tgacggtagg tggggaataa ggaccggcta actacgtgcc 480
agcagccgcg gtaatacgta gggtccgagc gttgtccgga attattgggc gtaaagagct 540
cgtaggcggc gtgtcacgtc tgctgtgaaa gaccggggct taactccggt tctgcagtgg 600
atacgggcat gctagaggta ggtaggggag actggaattc ctggtgtagc ggtgaaatgc 660
gcagatatca ggaggaacac cggtggcgaa ggcgggtctc tgggccttac ctgacgctga 720
ggagcgaaag catggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccatg ccgtaaacgt 780
tgggcgctag gtgtggggac tttccacggt ttccgcgccg tagctaacgc attaagcgcc 840
ccgcctgggg agtacggccg caaggctaaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa 900
gcggcggagc atgttgctta attcgacgca acgcgaagaa ccttaccaag gtttgacatc 960
acccgtggac tcgcagagat gtgaggtcat ttagttggcg ggtgacaggt ggtgcatggc 1020
tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgtt 1080
ccatgttgcc agcacgtaat ggtggggact catgggagac tgccggggtc aactcggagg 1140
aaggtgggga tgacgtcaag tcatcatgcc ccttatgtct tgggctgcaa acatgctaca 1200
atggccggta caatgggcgt gcgataccgt aaggtggagc gaatccctaa aagccggtct 1260
cagttcggat tggggtctgc aactcgaccc catgaaggtg gagtcgctag taatcgcgga 1320
tcagcaacgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacgtcatga 1380
aagtcggcaa cacccgaaac ttgcggccta accccttgtg ggagggagtg agtgaaggtg 1440
gggctggcga ttgggacga 1459

Claims (10)

1.一种微生物驱油菌，其特征在于，其微生物分类命名为：线团拟诺卡氏菌Nocardiopsis synnemataformans，微生物保藏号是：CGMCC No.21180。
2.一种权利要求1所述微生物驱油菌的发酵液。
3.如权利要求2所述的微生物驱油菌的发酵液，其特征在于，所述发酵液是由以下培养基发酵获得：可溶性淀粉20g/L，KNO3 1g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH＝7.4～7.6。
4.如权利要求2所述的微生物驱油菌的发酵液，其特征在于，所述发酵液的发酵条件为35℃恒温，100rpm振荡培养3～5天。
5.一种微生物驱油菌剂，其特征在于，所述微生物驱油菌剂含有如下任一种或多种：
1）权利要求1所述微生物驱油菌；
2）权利要求1所述微生物驱油菌的发酵液。
6.一种权利要求5所述的微生物驱油菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.菌种的活化：将-80℃或液氮条件下的微生物驱油菌，解冻后，以划线法接种于活化用固体培养基上，在35℃恒温下培养48h；
S2.种子液的制备：从步骤S1的固体培养基上挑取单克隆菌落，接种于种子培养基中，在35℃、100rpm的条件下振荡培养48h，得种子液；
S3.发酵培养：将S2得到的种子液按质量百分数5％的接菌量接入发酵培养基中，在35℃恒温下，100rpm振荡培养3～5天，得到发酵液；
S4.质检：采用稀释梯度法检测发酵液中活菌数目，使活菌数≥108CFU/ml，得到微生物驱油菌剂。
7.如权利要求6所述的微生物驱油菌剂的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述活化用固体培养基的配方为：酵母浸粉1.0g/L，多价蛋白胨2.0g/L，牛肉浸粉1.0g/L，葡萄糖10.0g/L，琼脂20.0g/L，pH值7.0±0.1；
步骤S2中，所述种子培养基的配方包括：可溶性淀粉10.0g/L，K2HPO4 1.0g/L，MgSO4.7H2O 1.0g/L，NaCl 1.0g/L，（NH4）2SO4 2.0g/L，CaCO3 2.0g/L，FeSO4.7H2O 0.001g/L，MnCl2.7H2O 0.001g/L，pH值7.0±0.1；
步骤S3中，所述发酵培养的配方为：可溶性淀粉20g/L，KNO3 1g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH＝7.4～7.6。
8.权利要求1所述微生物驱油菌或其发酵液或权利要求5所述微生物驱油菌剂在微生物采油或者制备微生物采油的产品中的应用。
9.一种微生物采油的方法，其特征在于，包括如下步骤：在采油过程中，加入权利要求1所述微生物驱油菌或权利要求5所述的微生物驱油菌剂。
10.如权利要求9所述的微生物采油的方法，其特征在于，包括如下步骤：培养期，关闭采出水处理系统中的二级生化处理池（6）、三级生化处理池（7）底部的排放阀，打开一级生化处理池（5）底部的排放阀，采出水（1）依次经除油池（2）、缓冲池（3）、冷却塔（4）、一级生化处理池（5）处理后直接进入下级流程，注入地层；将质量百分比为8～12％的微生物驱油菌菌株发酵液投入二级生化处理池（6）和三级生化处理池（7）进行扩培增菌，3～7天后三级生化处理池（7）出口端注入液中总菌数达到106CFU/ml以上时，关闭一级生化处理池（5）底部的排放阀，同时打开三级生化处理池（7）底部的排放阀，此时采出水（1）依次经除油池（2）、缓冲池（3）、冷却塔（4）、一级生化处理池（5）、二级生化处理池（6）、三级生化处理池（7）处理后，再经由下级流程注入地层；此后每3～7天通过自吸泵（8）投加质量百分比为0.8～1.2％菌株发酵液注入二级生化处理池（6）和三级生化处理池（7）中。
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