CN115851524B - 一株增加农作物产量的菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
一株增加农作物产量的菌株及其应用，本发明涉及一株菌株及其在农业领域的应用。本发明提供了一株增加农作物产量的菌株及其应用，该菌株具有产铁载体、解有机磷的功能。本发明增加农作物产量的菌株是西西布哈加瓦氏菌为Bhargavaea cecembensis HL‑17，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC：24993。本发明的西西布哈加瓦氏菌为Bhargavaea cecembensis HL‑17是从鲤的整条肠道中的内含物分离得到的，该菌株具有很强的产铁载体能力，同时该菌株还具有解有机磷能力，改善农作物生长环境，促进植物的萌发和增加农作物产量，特别适合水稻种植的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一株菌株及其在农业领域的应用。
背景技术
水稻是我国最主要的粮食经济作物，同时稻米作为我国第一大主食，也是人体获取主要营养物质的主要途径之一。目前，全世界有三分之一的人口遭受铁等微量元素营养不良，这些人主要分布在以稻米为主食的亚洲发展中国家，而我国所占的比列相对较大。在我国有三分之一的耕地面积面临铁、磷养分的缺乏的问题，铁、磷营养的缺乏已经成为限制水稻生长、降低水稻产量已成为普遍原因之一。
发明内容
本发明提供一株增加农作物产量的菌株及其应用，该菌株具有产铁载体，解有机磷功能。
本发明一株增加农作物产量的菌株为西西布哈加瓦氏菌Bhargavaeacecembensis HL-17，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC：24993。
本发明上述增加农作物产量的菌株西西布哈加瓦氏菌Bhargavaea cecembensisHL-17在农作物种植中的应用。
本发明上述增加农作物产量的菌株西西布哈加瓦氏菌Bhargavaea cecembensisHL-17在水稻种植中的应用。
本发明上述西西布哈加瓦氏菌Bhargavaea cecembensis HL-17经革兰氏染色为革兰氏阳性菌，需氧，杆状，TSA(胰酪大豆胨琼脂)上菌落呈米白色，圆形，表面具有黏性，在TSA、NA培养基营养琼脂、R2A琼脂培养基上生长情况良好，在LA(李斯特氏菌显色培养基)上生长能力较弱。
所述西西布哈加瓦氏菌HL-17接种在CAS培养基上，培养一段时间后菌落周围形成明显的变色圈，西西布哈加瓦氏菌HL-17的变色圈直径D为6.18mm，菌落直径d为1.62mm，D/d为3.82，说明西西布哈加瓦氏菌HL-17具有极强的产铁载体能力。
所述西西布哈加瓦氏菌HL-17接种在蒙金娜有机磷培养基上，培养一段时间后菌落周围形成明显的溶有机磷圈，西西布哈加瓦氏菌HL-17的溶无机磷圈直径D为5.03mm，菌落直径d为2.97mm，D/d为1.69，说明西西布哈加瓦氏菌HL-17具有较强的解有机磷功能。
本发明的西西布哈加瓦氏菌为Bhargavaea cecembensis HL-17是从鲤的整条肠道中的内含物分离得到的，该菌株产铁载体可螯合环境中的铁离子形成铁元素，参与叶绿体蛋白和叶绿素的合成，维持叶绿体的稳定，有利于农作物的生长发育。同时该菌株还具有解有机磷能力，可将土壤中植物难以吸收的磷分解为易吸收的磷，改善农作物生长环境，促进植物的生长和增加农作物产量，特别适合水稻种植的应用。
本发明西西布哈加瓦氏菌为Bhargavaea cecembensis HL-17，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC：24993，保藏日期是2022年5月30日。
附图说明
图1为Bhargavaea cecembensis HL-17铁载体筛选结果；
图2为Bhargavaea cecembensis HL-17有机磷固体培养基上的解磷圈；
图3为Bhargavaea cecembensis HL-17构建的系统发育树；
图4为Bhargavaea cecembensis HL-17水培盒试验结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
具体实施方式一：本实施方式增加农作物产量的菌株为西西布哈加瓦氏菌Bhargavaea cecembensis HL-17，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC：24993。
一、获得本实施方式西西布哈加瓦氏菌为Bhargavaea cecembensis HL-17的方法：
1、实验材料
2021年9月，选取辽宁省盘锦市大洼区水稻田中养殖的鲤鱼群体，随机选择3尾健康的1龄鲤(150±10g)，采用MS-222麻醉剂(250mg/L)麻醉，使用无水乙醇擦拭鲤的表面，在超净工作台中用灭菌后的剪刀和镊子进行解剖，取出鲤的整条肠道，轻轻挤出内含物置于含玻璃珠和50mL无菌水的锥形瓶中，以180r/min的转速室温振荡30min，再进行梯度稀释，将10-3、10-4、10-5梯度取100μL涂布于LB固体培养基平板上，每个梯度重复3次，置于28℃培养24-48h。培养48h后，选取不同形状的菌株进行分离。
2、细菌产铁载体的鉴定
将已经分离纯化的菌株重新活化所获得的菌株转接到LB平板上培养24h，再用灭菌的牙签挑取单菌落接到铬天青S(Chromeazurol S，CAS)固体检测培养基，37℃倒置培养2-3d，观察菌落周围变色圈大小。
培养一段时间后菌落周围形成明显的变色圈的菌株具有产铁载体的能力。图1为菌株HL-17的产铁载体的鉴定结果，其变色圈直径D为6.18mm，菌落直径d为1.62mm，D/d为3.82，说明菌株HL-17具有极强的产铁载体能力。
对出现明显变色圈的菌株HL-17进一步试验：
(1)将活化的菌株HL-17菌苔接种于限铁SA液体培养基中，37℃摇床培养48h得到HL-17菌液；
(2)将生长48h的待测菌株HL-17菌液转移到已灭菌的10mL离心管中，13000rpm离心15min，去沉淀留上清；
(3)将上清液转移到经浓盐酸处理过的试管中，加入一定量现配的CAS检测液使上清液与检测液的体积比为1:1，充分混匀后室温静置1h；
(4)测定630nm波长处的吸光度值(A)，取双蒸水作为对照调零，以同法测定的未接种的SA限铁培养基与检测液混合后630nm波长处的吸光度值作为参比值(Ar)，并以下式表示铁载体活性单位：
Su≈(Ar-As)/Ar×100；
式中：Su为铁载体含量；Ar为所测未接种的SA限铁培养基与检测液上清液的OD值；As为所测培养基上清液的OD值。
铁载体活性单位小于10，一般认为是阴性的，并且铁载体与检测液的混合物无颜色变化。
菌株HL-17在37℃时产铁载体的Su值为53％，说明该菌株具有很强的产铁载体能力。
3、菌株HL-17解有机磷能力的鉴定
将菌株HL-17用灭菌牙签分别接种于蒙金娜有机磷细菌培养基的平板上。每个梯度重复3次，置于28℃培养24-48h。菌株HL-17接种在蒙金娜有机磷培养基上，培养一段时间后菌落周围形成明显的溶有机磷圈，如图2所示；采用十字交叉法测量菌落直径d和溶有机磷圈直径D，并计算D/d。菌株HL-17的溶无机磷圈直径D为5.03mm，菌落直径d为2.97mm，D/d为1.69，说明菌株HL-17具有较强的解有机磷功能。
4、菌株HL-17的鉴定
4.1菌株HL-17生理生化鉴定：将保藏后的菌株在固体LB培养基平板上三区划线，分离出单菌落并对其形态进行描述，根据《常用细菌系统鉴定手册》对菌株进行革兰氏染色以及生理生化鉴定。
鉴定结果：菌株HL-17经革兰氏染色为革兰氏阳性菌，需氧，杆状，TSA(胰酪大豆胨琼脂)上菌落呈米白色，圆形，表面具有黏性，在TSA、NA培养基营养琼脂、R2A琼脂培养基上生长情况良好，在LA(李斯特氏菌显色培养基)上生长能力较弱。HL-17的部分生理生化指标见下表。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》对芽孢杆菌属生理特征的描述，菌株HL-17生理生化结果如表1所示，菌株HL-17与Bhargavaea cecembensis模式种的生理生化具有相同特征，由各项生理生化推断菌株HL-17可能为Bhargavaea cecembensis。
表1菌株HL-17生理生化结果
4.2 16S rRNA鉴定：选用北京索莱宝生物科技公司的细菌基因组DNA提取试剂盒，提取分离纯化后的菌株DNA。采用细菌通用引物27F/1492R进行PCR扩增，PCR扩增体系为25μL体系：10×缓冲液2.5μL，Taq酶0.5μL，引物27F 0.5μL，引物1492R 0.5μL，DNA模板1μL，ddH2O 20μL。反应程序设定为95℃预变性5min；94℃变性50s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环次数30次，72℃再延伸10min，4℃保存。将PCR扩增产物送往RuiBiotech公司测序。通过NCBI数据库比对菌株16S rRNA的测序结果，并构建系统进化树。
鉴定结果：对16S rRNA序列进行测序后，在NCBI中进行BLAST比对发现菌株HL-17的16S rRNA基因序列与Bhargavaea cecembensis相似度为99％。如图3所示，菌株HL-17的系统发育树可以看出菌株HL-17与Bhargavaea cecembensis(KC844776.1)同处最小的一个分支，进化距离较近，综合生理生化指标将菌株HL-17鉴定为Bhargavaea cecembensis。
5、西西布哈加瓦氏菌Bhargavaea cecembensisHL-17抗逆性检测
5.1耐酸性能检测：将西西布哈加瓦氏菌Bhargavaea cecembensis HL-17接种到pH为2.0、3.0、4.0的LB液体培养基中，始孢子数为2×108cfu/mL，在3h吸取菌液涂板，37℃培养24h后，测定其孢子数，并计算菌株的存活率。
西西布哈加瓦氏菌Bhargavaea cecembensisHL-17耐酸性如表2所示，说明西西布哈加瓦氏菌Bhargavaea cecembensisHL-17具有优异的耐酸性。
5.2耐胆盐检测：将西西布哈加瓦氏菌(Bhargavaea cecembensis)HL-17吸取1mL菌液(始孢子数为2×108cfu/mL)放于灭菌过的平皿内，然后用含0.5％、1.0％和1.5％牛胆酸钠的LB固体培养基倾注平板，同时用不含牛胆酸钠的MRS固体培养基作为对照组，37℃培养48h，进行菌落计数，并计算菌株的存活率。
西西布哈加瓦氏菌Bhargavaea cecembensisHL-17耐胆盐性如表2所示，说明西西布哈加瓦氏菌Bhargavaea cecembensisHL-17具有优异的耐胆盐性。
表2西西布哈加瓦氏菌HL-17耐酸性和耐胆盐能力检测
具体实施方式二：本实施方式配制西西布哈加瓦氏菌(Bhargavaea cecembensis)HL-17菌液。
黄豆芽100g加水1000mL，煮沸1h，过滤后补足水分至1L，121℃湿热灭菌后存放备用，此即质量分数为10％的豆芽汁。
西西布哈加瓦氏菌(Bhargavaea cecembensis)HL-17液体培养基由1000mL质量分数为10％豆芽汁、11.57g甘露糖、2.33g酵母膏、1.69g草酸铵和0.96g氯化锰组成。
以0.2％的接种量将西西布哈加瓦氏菌(Bhargavaea cecembensis)HL-17种子液接种于西西布哈加瓦氏菌(Bhargavaea cecembensis)HL-17菌液培养基，30℃、180r/min、培养24h，西西布哈加瓦氏菌(Bhargavaea cecembensis)HL-17的活菌数达到1.45×109cfu/mL(而西西布哈加瓦氏菌(Bhargavaea cecembensis)HL-17种子液活菌数为6.38×108cfu/mL，西西布哈加瓦氏菌(Bhargavaea cecembensis)HL-17种子液是接种在LB液体培养基中制成)。
实施例1水稻萌发实验
按照具体实施方式二的方法制备西西布哈加瓦氏菌(Bhargavaea cecembensis)HL-17的菌液，用无菌水分别稀释至菌体浓度为1.0×104cfu/mL和1.0×105cfu/mL，作为菌液。
选用水稻LJ31作为供试水稻。各处理组分别选取形态饱满、大小一致的水稻种子，用70％乙醇浸没种子消毒15min，再用无菌水冲洗三次去除乙醇残留。消毒后的水稻种子置于100mL锥形瓶中，加入相应的浸种溶液50mL，置于28±0.5℃培养箱中浸种2天，再催芽2天后，将发芽一致的种子置于水培盒中，放入植物光照培养箱进行28℃常温培养14天。
设置3组处理：
对照组：浸种溶液为无菌水；
104组：浸种溶液是菌体浓度为1.0×104cfu/mL的西西布哈加瓦氏菌HL-17菌液；
105组：浸种溶液是菌体浓度1.0×105cfu/mL的西西布哈加瓦氏菌HL-17菌液；
其中，昼/夜光照时长12h/12h，光强12000lx，植物光照培养箱内湿度设置为60％。
实验结果：
在水培盒培养条件下，各处理的生长情况如图4所示，104组和105组的水稻生长状况明显优于对照组，西西布哈加瓦氏菌HL-17对水稻具有较为明显的促生长作用，并且促生长效果与菌株HL-17的浓度呈正相关关系。从表3中可以看出，105组根长较104组和对照组分别提升10.57％和34.60％；105组地上部较104组和对照组分别提升21.13％和32.00％；105组鲜重较104组和对照组分别提升15.58％和26.18％；105组干重较104组和对照组分别提升19.12％和30.90％，进而说明菌株HL-17能大幅度提升水稻幼苗的地上部、根长、鲜重和干重，有利于水稻植株的萌发。
表3西西布哈加瓦氏菌HL-17对水稻幼苗生长的影响，n＝20
本实施例中西西布哈加瓦氏菌HL-17具有能够促进植物的生长和增加农作物产量，特别适合水稻种植的应用。由于西西布哈加瓦氏菌HL-17具有很强的产铁载体可螯合环境中的铁离子形成铁元素，参与叶绿体蛋白和叶绿素的合成，维持叶绿体的稳定，有利于农作物的生长发育。同时该菌株还具有解有机磷能力，可将土壤中植物难以吸收的磷分解为易吸收的磷，改善农作物生长环境，能够进一步促进植物的生长。
Claims (2)
1.一株增加农作物产量的菌株，其特征在于增加农作物产量的菌株为西西布哈加瓦氏菌（Bhargavaea cecembensis）HL-17，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC：24993。
2.如权利要求1所述的菌株在农作物种植中增加农作物产量的应用。
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