KR20240040089A - 보상 조절 장애의 방지 및/또는 치료 - Google Patents

보상 조절 장애의 방지 및/또는 치료 Download PDF

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Abstract

본 발명은 보상 조절 장애를 방지 및/또는 치료하는데 사용하기 위한, 하나 이상의 파라박테로이데스 속으로부터의 세균 및/또는 이의 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

보상 조절 장애의 방지 및/또는 치료
본 발명은 보상 조절 장애(reward dysregulation)와 관련된 장애의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 보상 조절 장애를 방지 및/또는 치료하는데 사용하기 위한 파라박테로이데스 속(genus Parabacteroides) 속으로부터의 하나 이상의 세균 및/또는 이의 추출물 및/또는 대사산물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
발명의 배경
보상 시스템은 흔히 변연계(limbic system), 기저 핵, 전두엽 피질, 복부 피개 영역, 및 흑색질 내에서, 식욕 자극을 처리하는 신경 회로의 집합(aggregate)과 관련된 것으로 정의된다.
보상 시스템이 적절하게 기능하는 경우, 보상의 기대 또는 획득은 예컨대, 도파민, GABA, 글루타메이트, 세로토닌, 및 노르에피네프린과 같은 신경전달물질을 포함하는 사건의 케스케이드(cascade)를 촉매할 것이다.
보상 시스템의 기능장애는 천연적으로(예컨대, 사회적 고립시 도파민 수치가 감소하는 경우, 또는 노화로 인해 세로토닌 수치가 감소하는 경우), 또는 인공적으로(예컨대, 도파민 길항제의 섭취 시) 발생할 수 있다. 보상 기능 장애는 질병이나 유전 장애로 인해 발생할 수 있다. 이러한 메커니즘의 기능장애는 보상 학습 및 예컨대, 즐거움 또는 만족감의 결여, 동기부여 감소, 및 정서적 무감각과 같은 동기부여 결손, 및 정서적 이상에 의해 특징화된다.
예를 들면, 과식과 칼로리가 높은 식품(calorie-dense food)의 소비가 긍정적인 에너지 균형(에너지 입력이 에너지 출력보다 큼) 및 지방의 저장에 기여하는 주요 양태인, 비만의 경우, 쾌락과 관련된 식습관을 유도하는 보상 시스템은 식품 섭위에 대한 주요 구동인자(driver)가 된다. 지방 및 당이 풍부한, 맛있는 식품은 도파민성 뉴우런을 자극하고 주로 뇌의 피질-변연부 영역(예를 들면, 선조체, 중격 의지핵 및 전전두엽 피질)에서 도파민 방출을 유도할 수 있다. 그러나, 흔히 장기간의 과식의 결과인, 비만은 맛있는 식품 섭취에 대한 반응시 도파민 농도의 감소 및 도파민 마커의 하향조절과 관련되어 있다. 도파민 수용체 1(D1R) 및 2(D2R)의 발현 뿐만 아니라, 속도-제한 합성 효소(타이로신 하이드록실라제, TH)는 감소하지만 도파민 수송체(dopamine transporter; DAT)는 증가한다. 도파민 경로의 이러한 변경된 기능은 비만이 발달하기 전과 동일한 보상 효과를 느끼기 위한 시도에서 지방이 많고 단 음식의 식사량의 증가를 초래하므로 체중 증가의 악순환을 촉진하는 것으로 제시되었다.
보상 조절 장애 메커니즘은 또한 많은 질환, 예를 들면, 중독-관련 장애(addiction-related disorder), 정동 장애(affective disorder), 강박 장애(obsessive compulsive disorder), 정신분열증(schizophrenia), 주의력 결핍 과잉 행동 장애(attention deficit hyperactivity disorder; ADHD), 자폐 스펙트럼 장애( autism spectrum disorder), 주요 우울 장애(major depressive disorder; MDD), 불안 장애(anxiety disorder) 및 파킨슨 질환(Parkinson's disease)에서도 발생할 수 있다.
지금까지, 보상 조절 장애에 대한 치료요법으로 신경약리학적 화합물 및/또는정신치료요법(psychotherapy)이 차지하였다.
따라서, 보상 조절 장애를 치료하기 위한 대체 치료요법을 당해 분야의 상태에 제공할 필요가 있다. 특히, 보상 조절 장애에 대해 효율적인 치료요법을 제공할 필요가 있다.
요약
본 발명은 보상 조절 장애를 방지 및/또는 치료하는데 사용하기 위한, 파라박테로이데스 속으로부터의 하나 이상의 세균 및/또는 이의 추출물 및/또는 이의 대사산물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 파라박테로이데스 속으로부터의 세균은 피. 디스타소니스(P. distasonis), 피. 골드스테이니이(P. goldsteinii), 피. 메르다에(P. merdae), 피. 악시디파시엔스(P. acidifaciens), 피. 보우체스두르호넨시스(P. bouchesdurhonensis), 피. 차르타에(P. chartae), 피, 친칠라(P. chinchilla), 피. 촌기이(P. chongii), 피, 파에시스(P. faecis), 피, 고르도니이(P. gordonii), 피, 존소니이(P. johnsonii), 피. 마씰리엔시스(P. massiliensis), 피, 파카엔시스(P. pacaensis), 피. 프로벤센시스(P. provencensis), 피. 티모넨시스(P. timonensis), 파라박테로이데스 종(Parabacteroides spp.) 및 이의 조합을 포함하거나 또는 이로 이루어진 그룹에서 선택된다.
일 구현예에서, 보상 조절 장애는 정신 장애, 신경 장애, 및 이의 조합을 포함하거나 또는 이로 이루어진 그룹에서 선택된다. 일 구현예에서, 정신 장애는 중독-관련 장애(addiction-related disorder), 섭식-관련 장애(eating-related disorder), 정동 장애, 강박 장애, 정신분열증, 주의력 결핍 과잉 행동 장애(ADHD), 자폐 스펙트럼 장애, 주요 우울 장애(MDD), 및 불안 장애 등을 포함하거나 또는 이로 이루어진 그룹에서 선택된다. 일 구현예에서, 섭식-관련 장애는 거식증(anorexia), 과식증(bulimia), 과체중-관련 장애(overweight-related disorder), 및 비만-관련 장애(obesity-related disorder) 등을 포함하거나 또는 이로 이루어진 그룹에서 선택된다. 일 구현예에서, 중독 관련 장애는 알코올-관련 중독(alcohol-related addiction), 약물-관련 중독(drug-related addiction), 및 게임-관련 중독(game-related addiction) 등을 포함하거나 또는 이로 이루어진 그룹에서 선택된다. 일 구현예에서, 신경 장애는 파킨슨 질환(Parkinson's disease), 및 투렛 증후군(Tourette Syndrome) 등을 포함하거나 또는 이로 이루어진 그룹에서 선택된다.
일 구현예에서, 조성물은 동물 개체, 바람직하게는 포유동물 개체, 보다 바람직하게는 사람 개체(human individual)에게 투여될 예정이다.
일 구현예에서, 조성물은 경구적으로 또는 직장으로 투여될 예정이다.
일 구현예에서, 세균은 약 1Х102 CFU/g 내지 약 1Х1012 CFU/g의 조성물로 구성된 용량(dose)에서 투여될 예정이다.
일 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 유익한 미생물(들)을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 하나 이상의 유익한 미생물(들)은 클로스트리디아세아에(Clostridiaceae) 계열(family)로부터, 펩토스트렙토코카세아에(Peptostreptococcaceae) 계열로부터, 프레보텔라세아에(Prevotellaceae) 계열로부터, 메틸로박테리아세아에(Methylobacteriaceae) 계열로부터, 투리시박터(Turicibacter) 속으로부터, 코프로코쿠스(Coprococcus) 속으로부터, 노엘리아(Knoellia) 속으로부터, 프레보텔라(Prevotella) 속으로부터, 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 속으로부터, 악케르만시아세아에(Akkermansiaceae) 속으로부터의 세균 등을 포함하거나 또는 이로 이루어진 그룹에서 선택된다.
일 구현예에서, 조성물을 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 약제학적 조성물의 형태이다. 다른 구현예에서, 조성물은 영양학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 영양 조성물의 형태이다.
일 구현예에서, 조성물은 상기 조성물을 투여하기 위한 수단을 추가로 포함하는, 키트(kit) 내에 포함된다.
정의
본 발명에서, 다음의 용어는 다음의 의미를 갖는다:
""은, 값 앞에 올 때, 상기 수치 값의 플러스 또는 마이너스 10% 이하를 포함한다. 용어 ""이 지칭하는 값은 자체적으로 또한 구체적으로, 및 바람직하게는 개시되는 것으로 이해되어야 한다.
"포함하다(comprise)"는 "함유하다(contain)", 및 "포함하다(encompassinclude)"를 의미하는 것으로 의도된다. 일부 구현예에서, 용어 "포함하다"는 또한 용어 "로 이루어진(consist of)"을 포함한다.
"파라박테로이데스 속으로부터의 세균"은 20%(w/v)의 담즙을 함유하는 배양 배지에서 성장할 수 있는 그램 음성(Gram-negative)의, 절대 혐기성, 비-포자 형성, 비-운동성 세균을 지칭한다. 파라박테로이데스 속에 속하는 세균은 통상의 과정, 예를 들면, 16S rRNA 유전자 서열 분석을 기반으로 하는, 생리학적 및 생화학적 접근, 이의 세포 지방산 프로필의 평가, 메나퀴논 프로필 및 이의 계통 발생 위치에 의해 용이하게 확인될 수 있다.
"단리된 세균"은 이의 천연적 및/또는 생리학적 비오톱(biotope) 또는 서식지(habitat)에 더 이상 존재하지 않는 세균을 지칭한다. 예를 들면, 미생물군으로부터 관심 있는 세균을 수집하여 다른 세균으로부터 분리하고 조성물 내에 추가로 제형화할 수 있다. 세균 분리는 예컨대, 그랙 착색, 항생제 내성, 특정 기질/배양 배지에서 성장하는 능력 및 이로부터 채택된 프로토콜과 같은 미생물학 분야의 표준 프로토콜에 따라 수행될 수 있다.
"농축된 조성물(enriched composition)"은 파라박테로이데스 속으로부터의 세균의 집단 밀도가 조성물의 전체 미생물 집단 내에서 향상된 조성물을 지칭한다.
"추출물"은 관심 세균으로부터, 또는 관심 세균이 배양된 배양 배지로부터 수득한 임의의 분획을 지칭한다. 실제로, 추출물은 세포 및 세포외 추출물을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 추출물은 세균으로부터의 대사산물을 포함한다.
"보상 시스템"은 예컨대, 식품, 약물 또는 알코올과 같은 보상 자극에 의해 유도되는 신경생물학적 메커니즘(neurobiological mechanism)을 지칭한다. 보상 시스템은 뇌 속의 수개의 구조, 예를 들면, 변연계, 기저핵, 전두엽 피질, 복부 피개 영역, 선조체, 중격 의지핵 및 흑질을 포함한다. 보상의 기대 또는 획득에 의한 보상 시스템의 활성화는 개체에서 긍정적이거나 유쾌한 감각을 유도하는데, 이는 신경 전달 물질인 도파민, 또는 다른 신경전달물질, 예를 들면, GABA, 글루타메이트, 세로토닌, 및 노르에피네프린의 방출로부터, 그러나 또한 오피오이드(opioid) 및/또는 체내칸나비노이드(endocannabinoid)의 방출로부터 발생한다. 특정 약물은 보상 자극 없이 보상 시스템을 직접 활성화할 수 있다. 중요하게는, 보상 시스템은 3개의 구성성분: "좋아함(liking)" 구성성분, "원함(wanting)" 구성성분, 및 "학습" 구성성분을 포함한다. 좋아함 구성성분은 쾌락적 충격(hedonic impact)에 상응하며, 보상 자극에 의해 제공된 유쾌한 감각과 관련된다. 원함 구성성분은 인센티브 현저성(incentive salience)에 상응하며, 개인이 보상을 얻기 위해 얻는 동기나 인센티브와 관련된다. 학습 구성성분은 보상과 상황(context)(예컨대, 장소, 하루의 시간, 행동 또는 일련의 행동 등) 사이에 예측 연관성을 수행하고, 미래의 보상 획득을 위해 이러한 연관성을 지속적으로 기억하는 개체의 능력에 상응한다.
"보상 조절 장애"는 개체가 즐거운 자극, 및 기대하는 쾌락을 추구하거나 획득하려고 노력하고/하거나, 긍정적이거나 보상이 풍부한 신호(reward-laden cue) 또는 긍정적인 감정 반응성에 대해 고조된 반응을 경험하거나(참고: Gruber et al., J Abnorm Child Psychol. 2013; 41(7):1053-1065), 또는 개체가 동일한 쾌락을 획득하기 위해 보상에 대한 더 높은 수준의 노출을 필요로 하는 장애를 지칭한다. 일부 구현예에서, 보상 시스템의 3개의 구성성분(즉, 좋아함, 원함, 학습 구성성분) 중 어느 하나도 조절 장애가 될 수 있다. 일부 구현예에서, 3개의 구성성분 중 1, 2개 또는 모두가 조절 장애될 수 있다. "조절 장애"는, 구성성분이 비정상적으로 "과-자극(과-자극된)"(즉, 활성화, 과활성화, 증가, 상향조절)되거나 "과소-자극(under-stimulated)"(즉, 억제, 감소, 하향조절)될 수 있음을 의미한다. 일 구현예에서, 하나 이상의 구성성분이 과-자극되거나 또는 과소-자극된다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 구성성분이 과-자극되고 하나 이상의 개별 구성성분이 과소-자극된다. 실제로, 보조 조정장애는 아래에 정의된, 정신 장애 및 신경 장애를 포함한다. 보상 조절 장애를 지닌 개체의 진단은 승인된 개인, 예를 들면, 의사에 의해, 당해 분야의 표준 프로토콜에 따라, 특히 임상 징후를 모니터링하고, 흔히 설문지의 도움을 받아 수행할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "정신 장애(mental disorder)"는 보상 조절 장애의 특정 서브세트(subset)를 나타내며, 세계보건기구(World Health Organization; WHO)에서 정의한 바와 같은, 비정상적인 생각, 인식, 감정, 행동 및 타인과의 관계의 조합을 특징으로 하는 장애를 지칭한다. 실제로 정신 장애는 중독-관련 장애, 섭식-관련 장애(eating-related disorder), 정동 장애, 강박 장애, 정신분열증, 주의력 결핍 과잉 행동 장애(ADHD), 자폐 스펙트럼 장애, 주요 우울 장애(MDD), 및 불안 장애 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 정신 장애는 섭식-관련 장애 및 중독-관련 장애를 포함한다.
"섭식-관련 장애"는 정신 장애의 특수한 서브세트를 지칭하며, 거식증, 과식증, 과체중-관련 장애, 및 비만-관련 장애 등을 포함한다. 일부 구현예에서, "과체중-관련 장애" 및 "비만-관련 장애"는 상호교환적으로 사용되고, WHO가 정의한, 25 이상(과체중의 경우)의 체질량지수(body mass index; BMI) 또는 30 이상(비만의 경우)의 BMI와 관련된 장애를 지칭한다. 본 발명의 영역 내에서, "과체중-관련 장애" 및 "비만-관련 장애"는 비정상적인 식품 섭취, 25 또는 30 이상의 BMI를 유도하고/하거나 유지하는 것과 관련된다.
"중독 관련 장애"는 정신 장애의 특정 서브세트를 지칭하며, 알코올-관련 중독, 약물-관련 중독, 담배 또는 니코틴 중독, 및 게임-관련 중독 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "신경 장애"는 보상 조절 장애의 특수한 서브세트를 나타내며, 뇌, 신경 및 척수에 영향을 미치는 장애를 지칭한다. 실제로, 신경 장애를 지닌 개인은 예컨대, 마비(paralysis), 근육 약화(muscle weakness), 협응력 저하(poor coordination), 감각 상실(loss of sensation), 발작(seizure), 혼란(confusion), 통증(pain) 의식 수준 변화(altered levels of consciousness)와 같은 증상을 경험할 수 있다. 신경학적 장애의 비제한적 예는 신경근 장애(neuromuscular disorder), 자폐 스펙트럼 장애(autism spectrum disorder), 신경퇴행성 장애(neurodegenerative disorder)(예컨대, 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease), 파킨슨 질환), 투렛 증후군(Tourette Syndrome), 간질(epilepsy), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis)을 포함한다.
"유익한 미생물(beneficial microbe)"은 숙주에게 건강 이점을 제공할 수 있는, 예를 들면, 숙주 장내 미생물 균형의 개선, 장내 장벽 항상성 유지, 병원체 콜로니화(colonization) 방지, 세균 및 바이러스 감염 방지를 제공할 수 있는 미생물을 지칭한다.
"방지"는 보상 조절 장애의 증상의 발생을 방지하거나 피하는 것을 지칭한다. 본 발명에서, 용어 "방지"는 2차 방비, 즉, 증상의 재-발생 또는 보상 조절 장애의 재발의 방지를 지칭할 수 있다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "완화"는 치료학적 치료 및 예방학적 또는 방지적 조치 둘 다를 지칭하며, 여기서 목적은 표적화된 보상 조절 장애를 방지하거나 늦추기 위한(줄이기 위한(lessen)) 것이다. 치료가 필요한 것은 이미 보상 조절 장애가 있는 것 뿐만 아니라 보상 조절 장애를 가질경향이 있는 것 또는 보상 조절 장애를 방지해야하는 것을 포함한다. 개인 또는 포유동물은, 본 발명에 따른, 조성물, 약제학적 조성물의 치료량을, 단독으로 또는 다른 치료와 함께 투여받은 후, 환자가 보상 조절 장애와 관련된 증상 중 하나 이상에서 관찰 가능하고/하거나 측정가능한 감소, 또는 이의 부재; 및/또는 보상 조절 장애 또는 상태와 관련된 증상 중 하나 이상의 어느 정도까지의 경감; 감소된 질병률 및 사망률, 및 삶의 질 문제에서의 개선을 나타내는 경우, 보상 조절 장애 또는 상태에 대해 성공적으로 "치료"된다.
"치료학적 유효량"은 유리하거나 목적한 결과, 예를 들면, 임상 결과를 가져오기에 충분한 양을 지칭한다. 치료학적 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 치료학적 유효량은 치료될 개체에 의존할 수 있다.
"약제학적으로 허용되는 담체"는 동물 개체, 바람직하게는 사람 개체에게 투여하는 경우 어떠한 부작용, 알레르기 또는 다른 원치않는 반응을 생산하지 않는 담체를 지칭한다. 이는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항세균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 사람 투여를 위해, 제제는 예컨대, 미국의 식품의약청(Food and Drug Administration; FDA) 또는 유럽 연합의 유럽 의약청(European Medicines Agency; EMA)과 같은 규제 기관에서 요구하는 멸균성, 발열성, 일반적인 안전성, 품질 및 순도 표준을 충족하여야 한다.
"개체(individual)"는 동물 개체, 바람직하게는 포유동물 개체, 보다 바람직하게는 사람 개체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 개체는 포유동물 개체일 수 있다. 포유동물은 모든 영장류(사람 및 비-사람), 소(cattle)(예를 들면, 젖소(cow)), 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이, 및 의학적 보호를 받기 위해 대기하거나, 또는 의학적 보호를 받거나, 또는 의학 절차의 대상이었던/대상인/대상일, 또는 보상 조절 장애의 발달에 대해 모니터링되는 임의의 다른 포유동물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 개체는 의학적 보호를 받기 위해 대기하거나, 의학적 보호를 받거나, 또는 의료 절차의 대상이었거나/대상이거나/대상일, 또는 보상 조절 장애의 발달에 대해 모니터링되는 "환자", 즉, 온혈 동물, 보다 바람직하게는 사람일 수 있다. 일부 구현예에서, 개체는 성인(예컨대, 18세 이상의 개체)이다. 일부 구현예에서, 개체는 어린이(예컨대, 18세 미만의 개체)이다. 일부 구현예에서, 개체는 남성이다. 일부 구현예에서, 개체는 여성이다.
다른 정의는 본 개시내용 전체에 문맥에서 드러날 수 있다.
상세한 설명
본 발명은 보상 조절 장애의 방지 및/또는 치료에 사용하기 위한, 파라박테로이데스 속으로부터의 하나 이상의 세균 및/또는 이의 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 발명은 또한 보상 조절 장애를 방지 및/또는 치료하기 위한, 파라박테로이데스 속으로부터의 하나 이상의 세균 및/또는 이의 추출물을 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 보상 조절 장애를 방지 및/또는 치료하기 위한 의약의 제조 또는 제작을 위한, 파라박테로이데스 속으로부터의 하나 이상의 세균 및/또는 이의 추출물을 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 파라박테로이데스 속으로부터의 하나 이상의 세균 및/또는 이의 추출물을 포함하는 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하여, 이를 필요로 하는 개체에서 보상 조절 장애를 방지 및/또는 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에 따라서, 파라박테로이데스 속으로부터의 세균은 피, 디스타소니스(P. distasonis), 피. 골드스테이니이(P. goldsteinii), 피, 메르다에(P. merdae), 피, 악시디파시엔스(P. acidifaciens), 피. 보우체스두르호넨시스(P. bouchesdurhonensis), 피. 차르타에(P. chartae), 피. 친칠라(P. chinchilla), 피, 촌기이(P. chongii), 피, 파에시스(P. faecis), 피, 고르도니이(P. gordonii), 피, 존소니이(P. johnsonii), 피, 마실리엔시스(P. massiliensis), 피, 파카엔시스(P. pacaensis), 피, 프로벤센시스(P. provencensis), 피, 티모넨시스(P. timonensis), 파라박테로이데스 종(Parabacteroides spp. ) 및 이의 조합을 포함하거나 이로 이루어진 그룹에서 선택된다.
일부 구현예에서, 파라박테로이데스 속으로부터의 세균은 피. 디스타소니스, 피, 골드스테이니이 및 피. 메르다에를 포함하거나 또는 이로 이루어진 그룹에서 선택된다. 일부 구현예에서, 파라박테로이데스 속으로부터의 세균은 피. 디스타소니스 또는 피, 골드스테이니이를 포함하거나 또는 이로 이루어진 그룹에서 선택된다. 일부 구현예에서, 파라박테로이데스 속으로부터의 세균은 피, 골드스테이니이이다. 일부 구현예에서, 파라박테로이데스 속으로부터의 세균은 피. 디스타소니스이다. 일부 구현예에서, 파라박테로이데스 속으로부터의 세균은 피. 메르다에이다.
실제로, 파라박테로이데스 속에 속하는 세균은 어떠한 적합한 과정, 또는 이로부터 채택된 과정에 의해서도 확인될 수 있다. 특히, 적합한 과정은 생리학적 및 생화학적 방법, 예를 들면, 선택된 영양소, 예컨대, 만노스, 라피노스에서 발효할 수 있는 능력의 평가; 일부 항생제에 대한 내성의 평가; 예컨대, 알파-갈락토시다제, 베타-갈락토시다제, 알파-글루쿠로니다제, 알칼린 포스파타제, L-아르기닌 아릴아미다제, 루이신 글리신 아릴아미다제, 루이신 글리신 아릴아미다제, 페닐알라닌 아릴아미다제와 같은 특정 효소 활성의 평가; 이의 세포 지방산 프로필인, 메나퀴논 프로필의 평가; 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석기(matrix-assisted laser-desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry; MALDI-TOF MS)에 의한 이의 프로필의 평가; 16S rRNA 유전자 서열 분석을 기반으로 한, 이의 계통 발생 위치의 평가를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 파라박테로이데스 속으로부터의 세균이 단리된다. 일부 구현예에서, 파라박테로이데스 속으로부터의 세균이 예컨대, 장내 미생물총(gut microbiota)와 같은 천연 서식지로부터 단리된다. 실제로, 파라박테로이데스 속으로부터의 세균은 해당 분야의 표준 및 윤리적 절차에 따라, 신선하거나 냉동되거나 특정 배지(동결 방지제 및/또는 항산화제 포함)에 희석되거나 희석되지 않은, 분변 또는 맹장 내용물(ceacal content)로부터 단리할 수 있다.
실제로, 파라박테로이데스 속으로부터의 세균은 예컨대, 효모 카시톤 지방산(Yeast Casitone Fatty Acid; YCFA)(Fisher Scientific®에서 시판), 컬럼비아 혈액 배지(Columbia blood medium)(Sigma Aldrich®, DSMZ®에서 시판)와 같은 임의의 적합한 배양 배지, 세심한 혐기성 브로쓰(fastidious anaerobe broth)(DSMZ®, Neogen®에서 시판), 탄수화물이 들어있는 다진 고기 배지(chopped meat medium with carbohydrate)(DSMZ®에서 시판), 또는 미오-이노시톨이 글루코스로 대체된 변형된 YCFA 배지와 같은 어떠한 적합한 배양 배지 속에서도 배양될 수 있다.
실제로, 파라박테로이데스 속으로부터의 세균의 배양은 약 30℃ 내지 약 42℃, 바람직하게는 약 35℃ 내지 약 40℃, 보다 바람직하게는 약 37℃에서 수행될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "약 30℃ 내지 약 42℃"는 약 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃, 40℃, 41℃ 및 42℃를 포함한다.
실제로, 파라박테로이데스 속으로부터의 세균의 배양은 혐기성 조건, 즉, O2의 부재하에서 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물을 개체로부터 수득된 파라박테로이데스 속으로부터의 세균을 지닌 미생물총을 포함하거나 또는 이로 실질적으로 이루어진다. 일 구현예에서, 미생물총은 개체의 분변으로부터 수득된 장내 미생물총이다. 일 구현예에서, 미생물총은 치료될 개체의 미생물총과 비교하여 파라박테로이데스 속으로부터의 세균으로 농축되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 파라박테로이데스 속으로부터의 세균으로 농축되어 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 파라박테로이데스 속으로부터의 세균으로 농축된 미생물총을 포함하거나 또는 이로 실질적으로 이루어진다.
실제로, 파라박테로이데스 속으로부터의 세균은 파라박테로이데스 속으로부터의 세균의 성장을 우선적으로 자극함으로써 농축시킬 수 있다. 예를 들면, 농축은 배양물의 생리학적 조건을 변형시킴으로써 수행될 수 있다. 예는 배양 배지의 조성, 예를 들면, 영양소 조성의 변형; 배양 조건, 예를 들면, 환경적 pH 값, 온도 및 산소 조건의 변형 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 파라박테로이데스 속으로부터의 세균은 단리되어 농축된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 단리되어, 농축된 파라박테로이데스 속으로부터의 세균을 포함한다.
일 구현예에서, 파라박테로이데스 속으로부터의 세균은 생존가능하다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "생존가능한"은 적합한 배양 조건, 예를 들면, pH, 온도, 염도, 영양소 함량, O2 함량 하에서, 적합한 배양 배지 속에서 활성적인 물질대사를 유지하고/하거나 증식할 수 있는 세균을 지칭한다. 일부 구현예에서, 파라박테로이데스 속으로부터의 세균은 장기-지속되는 지수 성장 상(long-lasting exponential growth phase) 및/또는 정체 성장 상(stationary growth phase)으로 존재한다.
일 구현예에서, 파라박테로이데스 속으로부터의 세균은 생존불가능(non-viable)하다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "생존-불가능한(non-viable)"은 적합한 배양 조건, 예를 들면, 적합한 pH, 온도, 염도, 영양소 함량, O2 함량 하에서, 적합한 배양 배지 속에서 활성적인 물질대사를 유지하고/하거나 증식할 수 없는 세균을 지칭한다. 생존 불가능한 세균의 예는 휴면 세균(dormant bacteria), 죽은 세균 및 비활성 세균이다.
실제로, 세포 생존능(활성적인 물질대사)은 시간 경과에 따라 배양 배지 속의 하나의 영양소의 소비를 측정하여 평가할 수 있다. 세포 생존능(증식)은 본 발명의 적어도 하나의 세균을 함유하는 용액을 페트리 디쉬(petri dish)에 가조질러 스프레딩(spreading)하고 적절한 배양 조건에서 정해진 배양 시간 후에 콜로니의 수를 계수함으로써 평가할 수 있고; 대안적으로, 세균은 액체 배지에서 성장시킬 수 있고, 증식은 적합한 배양 조건에서 결정된 배양 시간 후에 세균 배양물의 광학 밀도를 측정함으로써 측정할 수 있다.
일 구현예에서, 파라박테로이데스 속으로부터의 세균은 저온살균(pasteurization)된다. 일 구현예에서, 저온살균된 파라박테로이데스 및/또는 이의 추출물은 약 50℃ 내지 약 100℃, 바람직하게는 약 60℃ 내지 약 95℃, 보다 바람직하게는 약 70℃ 내지 약 90℃의 범위의 온도에서 가열된다.
일부 구현예에서, 파라박테로이데스 속으로부터의 세균은 저온살균된 파라박테로이데스 디스타소니스, 저온살균된 파라박테로이데스 골드스테이니이 또는 저온살균된 파라박테로이데스 메르다에이다. 일부 구현예에서, 파라박테로이데스 속으로부터의 세균은 저온살균된 파라박테로이데스 골드스테이니이이다. 일부 구현예에서, 파라박테로이데스 속으로부터의 세균은 저온살균된 파라박테로이데스 디스타소니스이다. 일부 구현예에서, 파라박테로이데스 속으로부터의 세균은 저온살균된 파라박테로이데스 메르다에이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "추출물"은 세포 및 세포외 추출물 둘 다를 포함한다.
실제로, 세포 추출물은 세포질 추출물, 막 추출물, 및 이들의 조합, 특히 분획 방법으로부터 수득한 추출물을 포함한다. 세포 추출물은 임의의 표준 화학적(SDS, 프로테이나제 K, 라이소자임, 이의 조합 등으로 시행) 및/또는 기계적(초음파처리, 압력) 분별 접근법 또는 이로부터 채택된 접근법에 의해 수득될 수 있다.
실제로, 세포외 추출물은 분비된 분획, 특히 가용성 화합물 또는 엑소좀(exosome)을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "엑소좀"은 단백질, 핵산 및 지질을 포함하는 세포내이입-유래된 나노소포(endocytic-derived nanovesicle)를 지칭하는 것으로 의도된다. 실제로, 분비된 분획은 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방법 또는 이로부터 채택된 방법에 따라, 배양 배지로부터 단리 및/또는 정제될 수 있다. 예시적으로, 세포외 추출물은 배양 배지로부터 차등 원심분리에 의해; 중합체 침전에 의해; 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography; HPLC)에 의해, 이의 조합 등에 의해 단리될 수 있다.
배양 배지로부터의 차등 원심분리 방법의 비-제한적인 예는 다음 단계를 포함할 수 있다:
- 세포를 제거하기 위해 약 300Хg 내지 약 500Хg의 속도에서 10 내지 20분 동안 원심분리;
- 죽은 세포를 제거하기 위해, 약 1,500Хg 내지 약 3,000Хg의 속도에서 10 내지 20분 동안 원심분리;
-세포 부스러기를 제거하기 위해, 약 7,500Хg 내지 약 15,000Хg의 속도에서 20 내지 45분 동안 원심분리;
- 엑소좀을 펠렛화하기 위해, 약 100,000Хg 내지 약 200,000Хg의 속도에서 30 내지 120분 동안 1회 이상 초원심분리(ultracentrifugation).
엑소좀을 단리하기 위한 대체 방법은 예컨대, exoEasy Maxi Kit(Qiagen®) 또는 총 엑소좀 단리 키트(Total Exosome Isolation Kit)(Thermo Fisher Scientific®)와 같은 상업용 키트의 장점을 취할 수 있다.
실제로, 세포 및/또는 세포외 추출물은 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질 및 지질단백질, 당지질 및 당단백질과 같은 이의 조합, 세균 대사산물, 유기산, 무기산, 염기, 펩타이드, 효소 및 조효소(co-enzyme), 아미노산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지단백질, 당지질, 비타민, 생리활성 화합물, 무기 성분을 함유하는 대사산물과 같은 대사산물 등을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 및/또는 세포외 추출물은 장기-지속되는 지수 성장 상 및/또는 정체 성장 상 동안 생산된다.
일부 구현예에서, 세포 추출물은 석시네이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 대사산물은 석시네이트이다. 따라서, 본 발명의 목적은 보상 조절 장애를 방지하고/하거나 치료하는데 사용하기 위한 석시네이트를 포함하는 조성물이다.
본 발명에 따른 보상 조절 장애는 전용 설문지의 보조하에 또는 보조없이, 임상 징후의 평가를 통해 진단 및/또는 모니터링될 수 있음이 이해되어야 한다. 실제로, 보상 조정장애의 진단 및/또는 모니터링은 승인된 개인에 의해 수행될 수 있다.
보상 시스템은 적어도 3개의 구성성분: "좋아함" 구성성분, "원함" 구성성분, 및 "학습" 구성성분을 포함한다. 보상 시스템의 3가지 구성성분 중 어느 하나가 조절 장애될 수 있음이 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, 3개의 구성성분 중 1개, 2개 또는 모두는 조절 장애된다.
본원에 사용된 바와 같은, "조절 장애된"은 구성성분이 비정상적으로 "과-자극"(즉, 활성화, 과활성화, 증가, 상향조절)되거나 비정상적으로 "과소-자극"(즉, 억제, 덜 활성화, 감소, 하향조절)됨을 의미한다.
일 구현예에서, 하나 이상의 구성성분은 과-자극되거나 또는 과소-자극된다. 특정의 구현예에서, 하나의 구성성분은 과-자극되거나 또는 과소-자극된다. 특정의 구현예에서, 2개의 구성성분은 과-자극되거나 또는 과소-자극된다. 특정의 구현예에서, 3개의 구성성분이 과-자극되거나 또는 과소-자극된다.
특정의 구현예에서, 원함 구성성분은 과-자극된다. 특정의 구현예에서, 좋아함 구성성분은 과-자극된다. 특정의 구현예에서, 좋아함 구성성분은 과소-자극된다. 특정의 구현예에서, 원함 구성성분은 과소-자극된다. 특정의 구현예에서, 학습 구성성분은 과-자극된다. 특정의 구현예에서, 학습 구성성분은 과소-자극된다. 특정의 구현예에서, 좋아함 및 원함 구성성분은 과-자극된다. 특정의 구현예에서, 좋아함 및 원함 구성성분은 과소-자극된다. 특정의 구현예에서, 좋아함 및 학습 구성성분은 과-자극된다. 특정의 구현예에서, 좋아함 및 학습 구성성분은 과소-자극된다. 특정의 구현예에서, 원함 및 학습 구성성분은 과-자극된다. 특정의 구현예에서, 원함 및 학습 구성성분은 과소-자극된다. 특정의 구현예에서, 모든 3개의 구성성분은 과-자극된다. 특정의 구현예에서, 모든 3개의 구성성분은 과소-자극된다.
다른 구현예에서, 하나 이상의 구성성분은 과-자극되고 하나 이상의 명백한 구성성분은 과소-자극된다. 특정의 구현예에서, 하나의 구성성분은 과-자극되고 2개의 구성성분은 과소-자극된다. 특정의 구현예에서, 하나의 구성성분은 과소-자극되고 2개의 구성성분은 과-자극된다. 특정의 구현예에서, 하나의 구성성분은 과-자극되고 하나의 구성성분은 과소-자극된다.
특정의 구현예에서, 좋아함 구성성분은 과소-자극되고 원함 구성성분은 과-자극된다. 특정의 구현예에서, 좋아함 구성성분은 과-자극되고 원함 구성성분은 과소-자극된다. 특정의 구현예에서, 좋아함 구성성분은 과소-자극되고 학습 구성성분은 과-자극된다. 특정의 구현예에서, 좋아함 구성성분은 과-자극되고 학습 구성성분은 과소-자극된다. 특정의 구현예에서, 원함 구성성분은 과소-자극되고 학습 구성성분은 과-자극된다. 특정의 구현예에서, 원함 구성성분은 과-자극되고 학습 구성성분은 과소-자극된다.
특정의 구현예에서, 좋아함 및 학습 구성성분은 과소-자극되고 원함 구성성분은 과-자극된다. 특정의 구현예에서, 좋아함 및 학습 구성성분은 과-자극되고 원함 구성성분은 과소-자극된다. 특정의 구현예에서, 좋아함 및 원함 구성성분은 과소-자극되고 학습 구성성분은 과-자극된다. 특정의 구현예에서, 좋아함 및 원함 구성성분은 과-자극되고 학습 구성성분은 과소-자극된다. 특정의 구현예에서, 원함 및 학습 구성성분은 과소-자극되고 좋아함 구성성분은 과-자극된다. 특정의 구현예에서, 원함 및 학습 구성성분은 과-자극되고 좋아함 구성성분은 과소-자극된다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 과-자극되거나 또는 과소-자극된 구성성분을 정상 수준으로 회복시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 적어도 하나의 과-자극된 구성성분을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 적어도 하나의 과소-자극된 구성성분을 증가시킨다.
특정의 구현예에 따라서, 보상 조절 장애는 정신 장애, 신경학적 장애, 및 이의 조합을 포함하거나 또는 이로 이루어진 그룹에서 선택된다.
일부 구현예에서, 보상 조절 장애는 정신 장애이다. 정신 장애, 또는 정신 건강 장애라고 또한 불리는 정신병은 광범위한 정신 건강 상태, 즉 기분, 사고 및 거동에 영향을 미치는 장애를 지칭한다. 정신병의 예는 우울증, 불안 장애, 정신분열증, 섭식-관련 장애, 강박 행동 및 중독 거동을 포함한다.
일부 구현예에 따라서, 정신 장애는 중독-관련 장애, 섭식-관련 장애, 정동 장애, 강박 장애, 정신분열증, 주의력 결핍 과잉 행동 장애(ADHD), 자폐 스펙트럼 장애, 주요 우울 장애(MDD), 및 불안 장애 등을 포함하거나 또는 이로 이루어진 그룹에서 선택된다. 일 구현예에 따라서, 정신 장애는 중독-관련 장애, 섭식-관련 장애 및 강박 장애를 포함하거나 또는 이로 이루어진 그룹에서 선택된다. 일 구현예에 따라서, 정신 장애는 중독-관련 장애 및 섭식-관련 장애를 포함하거나 또는 이로 이루어진 그룹에서 선택된다.
일부 구현예에서, 정신 장애는 섭식-관련 장애이다.
특정의 구현예에 따라서, 섭식-관련 장애는 거식증, 과식증, 폭식, 과체중 관련 장애, 비만 관련 장애 등을 포함하거나 이로 이루어진 그룹에서 선택된다.
본원에 사용된 바와 같은, 과체중-관련 장애를 지닌 개체는 약 25.0 내지 약 29.9를 포함하는 체 질량 지수(body mass index; BMI)를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같은, 비만-관련 장애를 지닌 개체는 약 30.0 초과의 체 질량 지수(BMI)를 갖는다.
일 구현예에서, 섭식-관련 장애는 거식증이다. 일 특징예에서, 섭식-관련 장애는 과식증이다. 일 구현예에서, 섭식-관련 장애는 폭식(binge eating)이다. 본원에 사용된 바와 같은, "폭식 장애"라고 또한 지칭된, "폭식"은 강박적인 음식 섭취, 과식 및/또는 음식 중독을 포함하는 비정상적인 거동을 지칭하고; 폭식은 과식증과 관련될 수 있다. 일 구현예에서, 섭식-관련 장애는 과체중-관련 장애 또는 비만-관련 장애이다. 일 구현예에서, 섭식-관련 장애는 과체중-관련 장애이다. 일 구현예에서, 섭식-관련 장애는 비만-관련 장애이다.
섭식-관련 장애를 앓고 있는 대상체는 보상 시스템의 좋아함 구성성분의 과소-부족, 및 보상 시스템의 원함 구성성분의 조절 장애로 인해 식품을 먹는데 있거 감소된 쾌락을 가질 수 있음이 이해되어야 한다. 원함 구성성분의 조절 장애는 과-자극 또는 과소-자극일 수 있고, 이는 식품 섭취가 과도하거나 불충분할 수 있다. 원함 구성성분의 조절 장애는 부분적으로 폭식 및 거식증과 같은 질환에 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 섭식-관련 장애는 보상 시스템의 원함 구성성분의 조절 장애와 관련된다. 일부 구현예에서, 섭식-관련 장애는 보상 시스템의 원함 구성성분의 과-자극과관련되고, 바람직하게는 섭식-관련 장애는 보상 시스템의 원함 구성성분의 과-자극 및 좋아함 구성성분의 과소-자극과 관련된다. 일부 구현예에서, 섭식-관련 장애는 보상 시스템의 원함 구성성분의 과-자극에 의해 유도되고, 바람직하게는 섭식-관련 장애는 보상 시스템의 원함 구성성분의 과-자극 및 좋아함 구성성분의 과소-자극에 의해 유도된다.
일 구현예에서, 폭식은 보상 시스템의 원함 구성성분의 과-자극과 관련된다.
일부 구현예에서, 정신 장애는 중독-관련 장애이다.
일부 구현예에 따라서, 중독-관련 장애는 알코올-관련 중독, 약물-관련 중독, 담배 또는 니코틴 중독, 게임-관련 중독 등을 포함하거나 또는 이로 이루어진 그룹에서 선택된다.
일부 구현예에 따라서, 강박 장애(OCD)는 점검 OCD(checking OCD), 오염 OCD(contamination OCD), 계수 OCD(counting OCD), 유해 OCD(harm OCD), 축적 OCD(hoarding OCD), 주산기 OCD(perinatal OCD), 및 출산후 OCD(postpartum OCD) 등을 포함하거나 또는 이로 이루어진 그룹에서 선택된다.
일부 구현예에서, OCD 및 섭식-관련 장애는 동시에 발생한다. 일부 구현예에서, OCD는 특정 유형의 식품 또는 영양물(aliment)에 대한 개체의 식욕을 비정상적으로 증가시키거나 감소시키고, 여기서 "식욕"은 개체의 보상 시스템의 원함 및/또는 좋아함 구성성분을 반영한다.
일부 구현예에서, 보상 조절 장애는 신경학적 장애이다.
특정의 구현예에 따라서, 신경학적 장애는 파킨슨 질환, 및 투렛 증후군 등을 포함하거나 또는 이로 이루어진 그룹에서 선택된다.
일부 구현예에서, 신경 장애는 신경전달물질인 도파민의 조절 장애를 포함하고, 여기서 "조절 장애"는 변경된 신호전달, 도파민 마커의 변경된 발현, 변경된 수준, 변경된 재활용 또는 이의 조합을 의미한다.
일부 구현예에 따라서, 조성물은 동물 개체, 바람직하게는 포유동물 개체, 보다 바람직하게는 사람 개체에게 투여될 예정이다.
일 구현예에서, 개체는 포유동물 개체이다. 일 구현예에서, 개체는 사람 개체이다. 일 구현예에서, 개체는 남성이다. 일 구현예에서, 개체는 여성이다.
특정의 구현예에 따라서, 조성물은 경구적으로 또는 직장으로 투여될 예정이다.
일 구현예에서, 조성물은 소화관내로 투여된다. 소화관은 본 발명에 따른 세균의 최종 위치임이 이해되어야 한다. 다시 말해서, 본 발명에 따른 세균은 개체의 미생물총 내로 혼입되는 것으로 의도된다.
일 구현예에서, 조성물은 고체 조성물이다 실제로, 경구 투여용으로 채택된 고체형은 환제(pill), 정제, 캡슐제, 연질 젤라틴 캡슐제, 경질 젤라틴 캡슐제, 당의정제(dragee), 과립제, 검, 저작검(chewing gum), 카플렛제(caplet), 압착 정제, 카쉐제(cachet), 웨이퍼제(wafer), 당-코팅된 환제(sugar-coated pill), 당-코팅된 정제, 또는 분산 및/또는 붕해 정제, 산제, 경구 투여 전에 액테 속에 용해되거나, 현탁되기에 적합한 고체형 및 발포성 정제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 조성물은 액체 조성물이다. 실제로, 경구 투여용으로 채택된 액체형은 액제, 현탁제, 음료 액제(drinkable solution), 엘릭서르제(elixir), 밀봉 약병(sealed phial), 물약(potion), 드렌치제(drench), 시럽제, 주류(liquor) 및 스프레이제(spray)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에 따라서, 세균은 약 1Х102 CFU/g 내지 약 1Х1012 CFU/g의 조성물, 바람직하게는 약 1Х103 CFU/g 내지 약 1Х1011 CFU/g의 조성물, 보다 바람직하게는 약 1Х104 CFU/g 내지 약 1Х1010 CFU/g의 조성물로 구성된 용량에서 투여될 예정이다. 일 구현예에서, 세균은 약 1Х104 CFU/g 내지 약 1Х1011 CFU/g의 조성물, 약 1Х105 CFU/g 내지 약 1Х1011 CFU/g의 조성물, 약 1Х106 CFU/g 내지 약 1Х1011 CFU/g의 조성물, 약 1Х107 CFU/g 내지 약 1Х1011 CFU/g의 조성물 또는 약 1Х108 CFU/g 내지 약 1Х1011 CFU/g의 조성물을 포함한 용량에서 투여될 예정이다.
본원에 사용된 바와 같은, "CFU"는 "콜로니 형성 단위(Colony Forming Unit)"를 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "약 1Х102 CFU/g 내지 약 1Х1012 CFU/g"는 1Х102, 5Х102, 1Х103, 5Х103, 1Х104, 5Х104, 1Х105, 5Х105, 1Х106, 5Х106, 1Х107, 5Х107, 1Х108, 5Х108, 1Х109, 5Х109, 1Х1010, 5Х1010, 1Х1011, 5Х1011 및 1Х1012 CFU/g를 포함한다.
일부 구현예에 따라서, 세균은 약 1Х102개의 세포/g 내지 약 1Х1012개의 세포/g의 조성물로 구성된 용량에서 투여될 예정이다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "약 1Х102개의 세포/g 내지 약 1Х1012개의 세포/g"는 1Х102, 5Х102, 1Х103, 5Х103, 1Х104, 5Х104, 1Х105, 5Х105, 1Х106, 5Х106, 1Х107, 5Х107, 1Х108, 5Х108, 1Х109, 5Х109, 1Х1010, 5Х1010, 1Х1011, 5Х1011 및 1Х1012개의 세포/g를 포함한다.
일부 구현예에 따라서, 조성물이 고체 조성물인 경우, 세균은 약 1Х102 CFU/g 내지 약 1Х1012 CFU/g의 조성물로 구성된 용량에서 투여될 예정이다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "약 1Х102 CFU/g 내지 약 1Х1012 CFU/g"는 1Х102, 5Х102, 1Х103, 5Х103, 1Х104, 5Х104, 1Х105, 5Х105, 1Х106, 5Х106, 1Х107, 5Х107, 1Х108, 5Х108, 1Х109, 5Х109, 1Х1010, 5Х1010, 1Х1011, 5Х1011 및 1Х1012 CFU/g를 포함한다.
일부 구현예에 따라서, 조성물이 고체 조성물인 경우, 세균은 약 1Х102개의 세포/g 내지 약 1Х1012개의 세포/g의 조성물로 구성된 용량에서 투여될 예정이다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "약 1Х102개의 세포/g 내지 약 1Х1012개의 세포/g"는 1Х102, 5Х102, 1Х103, 5Х103, 1Х104, 5Х104, 1Х105, 5Х105, 1Х106, 5Х106, 1Х107, 5Х107, 1Х108, 5Х108, 1Х109, 5Х109, 1Х1010, 5Х1010, 1Х1011, 5Х1011 및 1Х1012개의 세포/g를 포함한다.
일부 구현예에 따라서, 조성물이 액체 조성물인 경우, 세균은 약 1Х102 CFU/ml 내지 약 1Х1012 CFU/ml의 조성물로 구성된 용량에서 투여될 예정이다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "약 1Х102 CFU/ml 내지 약 1Х1012 CFU/ml"는 1Х102, 5Х102, 1Х103, 5Х103, 1Х104, 5Х104, 1Х105, 5Х105, 1Х106, 5Х106, 1Х107, 5Х107, 1Х108, 5Х108, 1Х109, 5Х109, 1Х1010, 5Х1010, 1Х1011, 5Х1011 및 1Х1012 CFU/ml를 포함한다.
일부 구현예에 따라서, 조성물이 액체 조성물인 경우, 세균은 약 1Х102개의 세포/ml 내지 약 1Х1012개의 세포/ml의 조성물로 구성된 용량에서 투여될 예정이다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "약 1Х102개의 세포/ml 내지 약 1Х1012개의 세포/ml"는 1Х102, 5Х102, 1Х103, 5Х103, 1Х104, 5Х104, 1Х105, 5Х105, 1Х106, 5Х106, 1Х107, 5Х107, 1Х108, 5Х108, 1Х109, 5Х109, 1Х1010, 5Х1010, 1Х1011, 5Х1011 및 1Х1012개의 세포/ml를 포함한다.
본 발명은 추가로 보상 조절 장애를 방지 및/또는 치료하는데 사용하기 위한, 석시네이트를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 보상 조절 장애는 본원의 상기에 기술되었다.
일부 구현예에서, 석시네이트는 파라박테로이데스 속으로부터의 세균에 의해 생산된다. 일부 구현예에서, 석시네이트는 파라박테로이데스 디스타소니스, 파라박테로이데스 골드스테이니이 또는 파라박테로이데스 메르다에에 의해 생산된다.
일부 구현예에서, 석시네이트는 대상체에게 치료학적 유효량으로 투여된다.
"치료학적 유효량"은, 개체에게 유의적인 부정적인 또는 불리한 부작용을 유발하지 않고, 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 보상 조절 장애의 하나 이상의 증상의 진행, 악화 또는 저하(deterioration)를 방지하거나, 늦추거나 또는 정지시키거나; 또는 적어도 하나의 보상 조절 장애의 증상을 완화하거나; 또는 적어도 하나의 보상 조절 장애를 치유하는 데 필요하고 충분한 수준 또는 양을 의미한다. 특정의 구현예에서, 석시네이트의 유효량은 투여량 단위 당 약 0.001 mg 내지 약 3,000 mg의 범위일 수 있다.
본 발명의 영역 내에서, 약 0.001 mg 내지 약 3,000 mg은 투여량 단위 당 약 0.001 mg, 0.002 mg, 0.003 mg, 0.004 mg, 0.005 mg, 0.006 mg, 0.007 mg, 0.008 mg, 0.009 mg, 0.01 mg, 0.02 mg, 0.03 mg, 0.04 mg, 0.05 mg, 0.06 mg, 0.07 mg, 0.08 mg, 0.09 mg, 0.1 mg, 0.2 mg, 0.3 mg, 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.7 mg, 0.8 mg, 0.9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg, 850 mg, 900 mg, 950 mg, 1,000 mg, 1,100 mg, 1,150 mg, 1,200 mg, 1,250 mg, 1,300 mg, 1,350 mg, 1,400 mg, 1,450 mg, 1,500 mg, 1,550 mg, 1,600 mg, 1,650 mg, 1,700 mg, 1,750 mg, 1,800 mg, 1,850 mg, 1,900 mg, 1,950 mg, 2,000 mg, 2,100 mg, 2,150 mg, 2,200 mg, 2,250 mg, 2,300 mg, 2,350 mg, 2,400 mg, 2,450 mg, 2,500 mg, 2,550 mg, 2,600 mg, 2,650 mg, 2,700 mg, 2,750 mg, 2,800 mg, 2,850 mg, 2,900 mg, 2,950 mg 및 3,000 mg을 포함한다.
특정의 구현예에서, 석시네이트는 1일 당 약 0.001 mg/kg 내지 약 100 mg/kg의 대상체의 체중을 전달하는데 충분한 투여량 수준에서 투여될 예정이다.
본 발명은 추가로 이를 필요로 하는 대상체에게 석시네이트를 포함하는 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 보상 조절 장애를 방지 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 특정의 구현예에서, 석시네이트의 유효량은 투여량 단위당 약 0.001 mg 내지 약 3,000 mg 범위일 수 있다.
본 발명은 추가로 보상 조절 장애의 치료 및/또는 방지용 의약의 제작시 사용하기 위한 석시네이트를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
특정의 구현예에 따라서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 추가의 활성제(들)를 추가로 포함한다.
특정의 구현예에 따라서, 하나 이상의 추가의 활성제(들)은 하나 이상의 유익한 미생물(들)을 포함한다. 다시 말해서, 일 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 유익한 미생물(들)을 추가로 포함한다.
일부 구현예에 따라서, 하나 이상의 유익한 미생물(들)은 클로스트리디아세아에 계열로부터, 펩토스트렙토코카세아에 계열로부터, 프레보텔라세아에 계열로부터, 메틸로박테리아세아에 계열로부터, 투리시박터 속으로부터, 코프로코쿠스 속으로부터, 노엘리아 속으로부터, 프레보텔라 속으로부터, 스타필로코쿠스 속으로부터, 악케르만시아세아에 속으로부터의 세균 등을 포함하거나 또는 이로 이루어진 그룹에서 선택된다.
일부 구현예에 따라서, 하나 이상의 유익한 미생물(들)은 클로스트리디아세아에 계열로부터, 펩토스트렙토코카세아에 계열로부터, 프레보텔라세아에 계열로부터, 메틸로박테리아세아에 계열로부터, 투리시박터 속으로부터, 코프로코쿠스 속으로부터, 노엘리아 속으로부터, 프레보텔라 속으로부터, 스타필로코쿠스 속으로부터의 세균 등을 포함하거나 또는 이로 이루어진 그룹에서 선택된다.
특정의 구현예에 따라서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 약제학적 조성물의 형태이다.
특정의 구현예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체는 이온 교환제; 알루미나; 스테아르산알루미늄; 레시틴; 혈청 단백질, 예를 들면, 사람 혈청 알부민; 완충 물질, 예를 들면, 포스페이트; 글리신; 소르브산; 소르빈산 칼륨; 식물성 오일 포화 지방산의 부분 글리세리드 혼합물; 물; 염 또는 전해질, 예를 들면, 황산프로타민, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염; 콜로이드성 실리카; 삼규산마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈; 셀룰로오스-계 물질(예컨대, 나트륨 카복시메틸 셀룰로오스), 폴리에틸렌 글리콜; 폴리아크릴레이트; 왁스; 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체; 폴리에틸렌 글리콜; 양모 지방; 등; 및 이의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
특정의 구현예에 따라서, 조성물은 영양학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 영양 조성물의 형태이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "영양학적 조성물"은 임의의 식품 생성물, 첨가 식품, 보충 식품, 강화 식품, 예를 들면, 액체 식품 생성물 및 고체 식품 생성물을 지칭하는 것으로 의도된다. 실제로 액체 식품 생성물은 수프, 청량 음료, 스포츠 음료, 에너지 음료, 과일 주스, 레모네이드, 차, 우유-기반 음료 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 실제로 고형 식품 제품은 캔디바, 시리얼바, 에너지바 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 영양학적 조성물은 비-치료학적 용도, 또는 비-치료학적 방법에서 사용하기 위한 것이다.
일부 양태에서, 본 발명은 보상 조절 장애를 방지 및/또는 치료하기 위한, 하나 이상의 단리된 파라박테로이데스 속으로부터의 세균의 치료학적 유효량을 포함하는 의약에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물, 약제학적 조성물, 영양학적 조성물, 의학장치 또는 의약은 멸균성이다. 실제로, 멸균성 약제학적 조성물을 수득하기 위한 방법은 GMP 합성을 포함하나, 이에 한정되지 않는다(GMP는 "우수 의약품제조관리기준(Good manufacturing practice)"을 나타낸다).
본 발명은 또한 보상 조절 장애를 방지 및/또는 치료하는 데 사용하기 위한, 하나 이상의 단리된 파라박테로이데스 속으로부터의 세균 및/또는 이의 추출물을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 필수적으로 이로 이루어진 의학 장치에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 의학 장치는 하나 이상의 단리된 파라박테로이데스 속으로부터의 세균 및/또는 이의 추출물의 치료학적 유효량을 포함한다.
특정의 구현예에 따라서, 조성물은 상기 조성물을 투여하기 위한 수단을 추가로 포함하는, 키트(kit) 내에 포함된다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 개체의 미생물총에서 파라박테로이데스 속으로부터의 세균의 수준을 증가시키는 하나 이상의 활성 성분 또는 물질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같은, "미생물총에서 파라박테로이데스 속으로부터의 세균의 수준을 증가시키는 것"은 본 발명의 조성물을 투여하기 전 개체의 미생물총 내 파라박테로이데스 속으로부터의 세균의 상대적인 풍부성과 비교하여, 본 발명의 조성물의 투여 후 개체의 미생물총내 파라박테로이데스 속으로부터의 세균의 상대적인 풍부성을 증가시키는 것을 의미한다.
본 발명은 추가로 이를 필요로 하는 대상체에서 보상 기능을 회복시키는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 방법은 미생물총 내 파라박테로이데스 속으로부터의 세균의 수준을 증가시키는 하나 이상의 활성 성분 또는 물질을 포함하는 조성물의 투여를 포함한다. 특수한 구현예에서, 방법은 하나 이상의 파라박테로이데스 속으로부터의 세균 및/또는 이의 추출물을 포함하는 조성물의 투여를 포함한다. 다른 구현예에서, 방법은 석시네이트를 포함하는 조성물의 투여를 포함한다. 일 구현예에서,이러한 방법은 비-치료학적이다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 개체의 미생물총을 회복시키는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 방법은 미생물총 내 파라박테로이데스 속으로부터의 세균의 수준을 증가시키는 하나 이상의 활성 성분 또는 물질을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 특수한 구현예에서, 방법은 하나 이상의 파라박테로이데스 속으로부터의 세균 및/또는 이의 추출물을 포함하는 조성물의 투여를 포함한다. 일 구현예에서, 이러한 방법은 비-치료학적이다.
본 발명은 추가로 이를 필요로 하는 대상체의 미생물 총 내 파라박테로이데스의 수준을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 방법은 미생물 총 내 파라박테로이데스 속으로부터의 세균의 수준을 증가시키는 하나 이상의 활성 성분 또는 물질을 포함하는 조성물의 투여를 포함한다. 특수한 구현예에서, 방법은 하나 이상의 파라박테로이데스 속으로부터의 세균 및/또는 이의 추출물을 포함하는 조성물의 투여를 포함한다. 일 구현예에서, 이러한 방법은 비-치료학적이다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 개체에서 보상 섭식을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 방법은 미생물총 내 파라박테로이데스 속으로부터의 세균의 수준을 증가시키는 하나 이상의 활성 성분 또는 물질을 포함하는 조성물의 투여를 포함한다. 특수한 구현예에서 방법은 하나 이상의 파라박테로이데스 속으로부터의 세균 및/또는 이의 추출물을 포함하는 조성물의 투여를 포함한다. 다른 구현예에서, 방법은 석시네이트를 포함하는 조성물의 투여를 포함한다. 일 구현예에서, 이러한 방법은 비-치료학적이다. 일부 구현예에서, 방법은 맛있는 식품의 섭취를 감소시킨다. 일부 구현예에서, 방법은 맛있는 음식의 섭취를 감소시키지 않는다.
본 발명은 추가로 필요로 하는 개체에서 맛있는 식이의 섭취를 감소시키기 위한 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 미생물총 내 파라박테로이데스의 수준을 증가시키는 하나 이상의 활성 성분 또는 물질을 포함하는 조성물의 투여를 포함한다. 특수한 구현예에서, 방법은 하나 이상의 파라박테로이데스 속으로부터의 세균 및/또는 이의 추출물을 포함하는 조성물의 투여를 포함한다. 다른 구현예에서, 방법은 석시네이트를 포함하는 조성물의 투여를 포함한다. 일 구현예에서, 이러한 방법은 비-치료학적이다.
본 발명은 또한 개체에게 하나 이상의 파라박테로이데스 속으로부터의 세균 및/또는 이의 추출물을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 보상 기능을 조절하는 방법에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, "보상 기능을 조절하는"은 보상 시스템의 3개의 구성성분(즉, 좋아함, 원함 및 학습) 중 적어도 하나의 활성을 증가시키거나 또는 감소시킴으로써, 적어도 하나의 구성성분이 정상 수준으로 회복되도록 하는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 하나의 구성성분이 조절된다. 일부 구현예에서, 2개의 구성성분이 조절된다. 일부 구현예에서, 3개의 구성성분이 조절된다.
일부 구현예에서, 방법은 원함 구성성분을 조절하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 방법은 원함 구성성분을 증가 또는 감소시키기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서, 방법은 원함 구성성분을 감소시키기 위한 것이다. 다른 구현예에서, 방법은 원함 구성성분을 증가시키기 위한 것이다.
일부 구현예에서, 방법은 좋아함 구성성분을 조절하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 방법은 좋아함 구성성분을 증가 또는 감소시키기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서, 방법은 좋아함 구성성분을 증가시키기 위한 것이다. 다른 구현예에서, 방법은 좋아함 구성성분을 감소시키기 위한 것이다.
일부 구현예에서, 방법은 학습 구성성분을 조절하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 방법은 학습 구성성분을 증가 또는 감소시키기 위한 것이다. 일 구현예에서, 방법은 학습 구성성분을 감소시키기 위한 것이다. 다른 구현예에서, 방법은 학습 구성성분을 증가시키기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 석시네이트를 포함하는 조성물을 개체에게 투여함을 포함하는 상술한 바와 같은 방법이다.
도 1A 내지 C는 비만 마우스가 마른 마우스와 비교하여 고 지방, 고 슈크로스(high fat, high sucrose; HFHS)에 대한 감소된 식품 선호도를 나타냄을 입증하는 그래프의 세트이다. (도 1A) 5주 기간 후 마른 (Lean_do; 사각형) 및 DIO 공여체 마우스(DIO_do; 삼각형) 및 (도 1B) 최종 체중(그램)의 체중 발달(evolution)(그램). (도 1C) 마른(Lean_do; 사각형) 및 DIO 공여체 마우스(DIO_do; 삼각형) 및 (도 1D) 최종 지방 질량 획득(그램)의 지방 질량 획득 발달(그램). (도 1E) 마른(Lean_do) 및 DIO 공여체 마우스(DIO_do)의 180분 동안 HFHS 및 CT 섭취를 나타내는 식품 선호도 시험. (도 1F) 도 1E로부터의 총 HFHS 및 CT 섭취를 나타내는 식품 선호도 시험. 제이타는 평균 ± SEM(n=5/그룹)을 나타낸다. P-값은 2-원 AVOVA에 이어, 본페로니 사후 시험(Bonferroni post-hoc test)(도 1A, C, E, F), 비쌍식 스튜던츠 t-시험(unpaired Student's t-test(도 1B, D) 후 수득하였다. *: p-값 ≤ 0,05; **: p-값 ≤ 0,01; ***: p-값 ≤ 0,001; ****: p-값 ≤ 0,0001. $$$$: CT 대 HFHS 섭취 사이의 p-값 ≤ 0.0001. 상이한 위첨자 문자는 각각의 시점에서 그룹과 식이 유형(CT 또는 HFHS) 상이의 유의적인 p-값을 나타낸다(도 1F).
도 2A 내지 G는 수용체 마우스가 대변 이식 후 공여체 마우스와 유사한 쾌락적인(hedonic) 식품 거동을 나타내는 그래프의 세트이다. (도 2A) FMT 프로토콜의 실험 계획. (도 2B) 마른(Lean_rec; 사각형) 및 DIO 수용체 마우스(DIO_rec; 삼각형)의 체중 발달(그램) 및 (도 2C) 최종 체중(그램). (도 2D) 마른(Lean_rec; 사각형) 및 DIO 수용체 마우스(DIO_rec; 삼각형)의 지방 질량 획득 발달(그램) 및 (도 2E) 최종 지방 질량 획득(그램). (도 2F) 마른(Lean_rec) 및 DIO 수용체 마우스(DIO_rec)에 의한 시험 180분 후 총 HFHS 및 CT 섭취를 나타내는 식품 선호도 시험. 데이타는 평균 ± SEM(n=7 내지 8마리/그룹)을 나타낸다. (도 2G) 마른(Lean_rec; 곡선 1 및 3) 및 DIO 수용체 마우스(DIO_rec; 곡선 2 및 4)에 의한 180분 동안의 HFHS(곡선 3 및 4) 및 CT(곡선 1 및 2) 섭취를 나타내는 식품 선호도 시험. P-값은 2-원 ANOVA에 이은, 본페로니 사후 시험(도 2B, D, F, G) 또는 비쌍식 스튜던츠 t-시험(도 2C, E) 후 수득되었다. *: p-값 ≤ 0.05; **: p-값 ≤ 0,01. $$: p-값 < 0.01; $$$$: p-값 ≤ CT 대 HFHS 섭취 사이의 0.0001(도 2F).
도 3A 내지 D는 비만 장내 미생물총을 지닌 수용체 마우스에서 도파민성 신호전달의 변경을 나타내는 그래프의 세트이다. 마른(Lean_rec) 및 DIO 수용체 마우스(DIO_rec)에서 실시간 qPCR(real-time qPCR)에 의해 측정된 도파민 수용체 1(D1R)(도 3A), 도파민 수용체 2(D2R)(도 3B), 티로신 하이드록실라제(TH)(도 3C) 및 도파민 수송인자(dopamine receptor)(DAT)(도 3D)의 선조체 mRNA 발현 측정. 데이타는 평균 ± SEM(n=7 내지 8마리/그룹)을 나타낸다. p-값은 비쌍식 스튜던츠 t-시험(도 3C) 또는 비-모수 만-휘트니 시험(non-parametric Mann-Whitney test)(도 3A, B, D) 후 수득하였다.
도 4A 내지 F는 수용체 마우스의 장내 미생물총이 공여체 마우스로부터의 장내 미생물총과 유사함을 나타내는 그래프의 세트이다. (도 4A-D) 공여체(Lean_do 및 DIO_do)와 수용체(Lean_rec 및 DIO_rec) 마우스 사이의 OTU 유사성을 기반으로 한 벤 다이어그램(Venn diagram). (도 4E-F) 운영 분류 단위(operational taxonomic unit; OTU)에서 비가중 UniFrac 분석(unweighted UniFrac analysis)을 기반으로 한 주 좌표 분석(principal coordinates analysis; PCoA) (도 4E) PCoA PC1 대 PC2; (도 4F) PCoA PC3 대 PC2; ▶: Lean_do; ■: Lean_rec; ●: DIO_do; ▲: DIO_rec.
도 5는 장내 미생물과 도파민성 마커 사이의 상관관계를 나타낸 그래프이다. FDR 수정 후 스피어만의 상관 관계(spearman's correlation). p-값은 스피어만 상관 시험 후 수득되었다. *: p ≤ 0,05.
도 6A 및 6B는 비만 공여체로부터의 장내 미생물총 수용체 마우스의 도파민성 및 오피오이드 시스템이 과소-자극됨을 나타내는 히스토그램의 세트이다. 마른(Lean_rec) 및 식이-유도된 비만 공여체 마우스(DIO_rec)로부터의 장내 미생물총 수용체 마우스에서 qPCR로 측정된 (도 6A) 도파민 수용체 2(Drd2), 도파민 수용체 1(Drd1), 타이로신 하이드록실라제(Th), 도파민 수송인자(Dat), (도 6B) μ-오피오이드 수용체(Oprm), κ-오피오이드 수용체(Oprk), δ-오피오이드 수용체(Oprd) 및 프레-프로디노르핀(pre-prodynorphin; Pdyn)의 중격 의지핵 mRNA 발현. 데이타는 평균 ± SEM(n=6마리/그룹)을 나타낸다. p-값은 비쌍식 스튜던츠 t-시험 또는 비-모수 만-휘트니 시험 후 수득하였다. *: p-값 ≤ 0,05.
도 7A 및 7B는 비만 마우스가 장내 미생물총에 의해 부분적으로 전달된, 식품 보상의 학습 구성성분의 변경을 나타냄을 입증하는 히스토그램의 세트이다. 도 7A는 마른(Lean_do) 또는 식이-유도된 비만 마우스(DIO_do)에 의한 예비-시험 및 시험 동안 케이지의 맛있는 식품-관련 측면에서 소비된 시간(들) 대 중립-관련 측면(neutral-associated side)에서 소비된 시간의 차이를 기준으로 한 조건화된 장소 선호도의 선호도 점수를 나타낸다. 도 7B는 마른(Lean_rec) 또는 식이-유도된 비만 마우스(DIO_rec)로부터 장내 미생물총 수용체 마우스에 의한 예비-시험 및 시험 동안 케이지의 맛있는 식품-관련 측면에서 소비된 시간(들) 대 중립-관련 측면에서 소비된 시간의 차이를 기준으로 한 조건화된 장소 선호도의 선호도 점수를 나타낸다. 데이타는 평균 ± SEM (n=6마리/그룹)으로 나타낸다. p-값은 쌍식 스튜던츠 t-시험(paired Student's t-test) 후 수득하였다. *: 시험 및 예비-시험 동안 선호도 점수 사이의 p-값 ≤ 0,05.
도 8A 내지 8D는 비만 공여체로부터의 장내 미생물총이 식품 보상에 대한 과도한 동기를 이끔을 나타내는 그래프의 세트이다. 마른(Lean_do) 및 식이-유도된 비만 공여체 마우스(DIO_do)에 의한 (도 8A) 활성 레버 프레스(active lever press)의 수 및 (도 8B) 점진적 비율 세션(progressive ratio sessions; PR) 동안 획득한 펠렛의 수를 나타내는 조작된 조건화 시험. 마른(Lean_rec) 및 식이-유도된 비만 공여체(DIO_rec)에 의한 (도 8C) 활성 레버 프레스 및 (도 8D) 점진적 비율 세션(PR) 동안 획득한 펠렛의 수를 나타내는 조작된 조건화 시험. 데이타는 평균 ± SEM(n=6마리/그룹)을 나타낸다. p-값은 비쌍식 스튜던츠 t-시험 후 수득하였다. *: p-값 ≤ 0,05; **: p-값 ≤ 0,01; ***: p-값 ≤ 0,001; ****: p-값 ≤ 0,0001.
도 9A 내지 9E는 식품 섭취의 항상성 조절인자가 수용체 마우스 사이에서 유사함을 나타내는 히스토그램의 세트이다. 마른(Lean_rec) 및 비만 공여체(DIO_rec)로부터의 장내 미생물총 수용체 마우스에서 (도 9A) 그렐린(ghrelin), (도 9B) 인슐린, (도 9C) 렙틴, (도 9D) 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1) 및 (도 9E) 펩타이드 YY(PYY)의 혈장 농도. 데이타는 평균 ± SEM(n=7 내지 8마리/그룹)을 나타낸다. p-값은 마른 및 비만(DIO) 공여체와 수용체 마우스 상에서 별도로 비쌍식 스튜던츠 t-시험 또는 비-모수 만-휘트니 시험 후 수득하였다. **: p-값 < 0,01; ***: p-값 ≤ 0,001.
도 10은 파라박테로이데스 디스타소니스가 HFD 하에 지방 질량 획득을 감소시킴을 나타내는 히스토그램이다. 8주 기간 후 ND PBS, ND PD, HFD PBS, HFD PD의 지방 질량. 데이터는 평균 ± SEM(n = 9 내지 10마리/그룹)으로 나타낸다. p-값은 일-원 ANOVA에 이은, 터키 사후 시험 후 수득하였다. **: P < 0.01; ****: P<0.0001.
도 11은 식품 선호도 시험 동안 식품 보상의 좋아함 구성성분에 미치는 파라박테로이데스 디스타소니스의 효과를 나타내는 히스토그램이다. ND PBS, ND PD, HFD PBS, HFD PD 마우스에 의한 시험 3시간 후 총 HFHS 및 CT 섭취를 나타내는 심품 선호도 시험. 데이타는 평균 ± SEM(n = 5 내지 6마리/그룹)으로 나타낸다. p-값은 만 휘트니 시험 후 수득하였다. **P<0.01 CT 대 ND PBS에서 HFHS 및 * P<0.05 CT 대 HFHS ND PD 그룹.
도 12는 파라박테로이데스 디스타소니스가 정상-식이를 공급한 마우스에서 식품 보상을 수득하기 위한 동기를 감소시킴을 나타내는 그래프이다. ND PBS, ND PD, HFD PBS, HFD PD에서 슈크로스 펠렛을 수득하기 위해 활성 레버를 누르는 횟수를 나타내는 작동 벽 시험(operant wall test). 데이타는 평균 ± SEM (n=6마리/그룹)으로 나타낸다. p-값은 2-원 ANOVA 반복 측정에 이은, 본페로니 사후 시험으로 수득하였다. **** P<0.001 ND PBS 대 HFD PBS; +P<0.05; ++++ P<0.001 ND PBS 대 ND PD.
도 13A 및 13B는 HFD 하에 체중 획득 및 지방 질량에서 파라벡테로이데스 골드스테이니이의 효과를 나타내는 히스토그램의 세트이다. 5주 후 ND PBS, ND PG, HFD PBS, HFD PG의 체중 증가(도 13A) 및 지방 질량(도 13B). 데이터는 평균 ± SEM으로 나타낸다(n=20마리/그룹, 이러한 데이터는 2개의 독립된 실험의 결과에 상응한다). p-값은 일-원 ANOVA에 이은, 터키 사후 시험으로 수득하였다, *: P <0.05; **: P<0.01; *** P<0.001; **** P<0.0001.
도 14는 식품 선호도 시험 동안 식품 보상의 좋아함 구성성분에서 파라박테로이데스 골드스테이니이의 효과를 나타내는 히스토그램이다. ND PBS, ND PG, HFD PBS 및 HFD PG 마우스에 의한 3시간 세션 후 총 HFHS 및 CT 섭취를 나타내는 식품 선호도 시험. 데이터는 평균 ± SEM(n = 10 내지 12마리/그룹, 이 데이터는 2개의 독립적인 실험의 결과에 상응한다)로서 나타낸다. p-값은 2-원 ANOVA에 이은, 본페로니 사후 시험 후 수득하였다. *: P <0.05; **: P < 0.01; ***: P< 0.001.
도 15는 파라박테로이데스 골드스테이니이가 정상-식이를 공급한 마우스에서 식품 보상을 수득하기 위한 동기를 감소시킴을 나타내는 그래프이다. ND PBS, ND PD, HFD PBS, HFD PD 마우스에서 슈크로스 펠렛을 수득하기 위해 활성 레버를 누르는 횟수를 나타내는 작동 벽 시험. 데이타는 평균 ± SEM (n=11 내지 12마리/그룹, 이러한 데이타는 2개의 독립된 실험의 결과에 상응한다)으로 나타낸다. p-값은 2-원 ANOVA 반복 측정에 이은, 본페로니 사후 시험으로 수득하였다. **P<0.01; *** P<0.001 ND PBS 대 HFD PBS; +P<0.05; +++ P<0.001 ND PBS 대 ND PG; £ P<0.05; ££ P<0.01; £££ P<0.001 ND PBS 대 HFD PG.
도 16은 파라박테로이데스 골드스테이니이가 식품 보상의 학습 구성성분에서 강력한 긍정적인 강화를 유도함을 나타내는 히스토그램이다. ND PBS, ND PG, HFD PBS, HFD PG 마우스에서 CPP 점수를 나타내는 조건화된 장소 선호도 시험. 데이터는 평균 ± SEM(n = 11 내지 12마리/그룹, 이러한 데이터는 2개의 독립적인 실험 결과에 상응한다)로서 나타낸다. p-값은 2-테일 쌍식 T 시험(Two-tailed paired T test) 후 수득하였다: *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; ****P<0.0001 예비시험 대 시험; p-값은 일-원 ANOVA에 이은, 터키 사후 시험에 의해 수득하였따: $ P<0.05 HFD PG 시험 대 HFD PBS 시험.
도 17A 및 17B는 석시네이트가 비만 표현형에 유익한 효과를 가짐을 나타내는 그래프의 세트이다. 5주 기간 후 ND PBS, ND PD, HFD PBS, HFD PD의 체중(도 17A) 및 지방 질량(도 17B). 데이터는 평균 ± SEM(n=10마리/그룹)으로 나타낸다. p-값은 이-원 ANOVA 반복 측정에 이은, 본페로니 사후 시험 후 수득하였다. £ P<0.05; £££ P<0.001 ND 대 HFD; *P < 0.05; **: P<0.01; **** P<0.0001 HFD 대 HFD SUC; $ P<0.05 ND 대 ND SUC.
도 18은 석시네이트가 HFD-유도된 비만 동안 변경된 음식 보상의 좋아함 구성성분을 향상시킴을 나타내는 히스토그램이다. ND, HFD, ND SUCC 및 HFD SUCC 마우스에서 3시간 세션 후 총 HFHS 및 CT 섭취를 나타내는 식품 선호도 시험. 데이타는 평균 ± SEM(n = 5 내지 6마리/그룹)로 나타낸다. p-값은 이-원 ANOVA에 이은, 본페로니 사후 시험 후 수득하였다. *P<0.05; **: P < 0.01; ***: P< 0.001; ***P<0.0001 CT 대 HFHS, +P<0.05 HFD SUC HFHS 대 ND SUC HFHS; ++ P<0.01 HFD SUC HFHS 대 ND HFHS; ++++ P<0.0001, HFD SUC HFHS 대 HFD HFHS.
도 19는 석시네이트가 비만에서 보상 시스템 구성성분 <<원함>>을 역전시키고 정상적인 식이를 제공한 마우스에서 식품 보상을 획득하려는 동기를 감소시킴을 나타내는 그래프이다. ND, HFD, ND SUC, HFD SUC 마우스에서 슈크로스 펠렛을 수득하기 위하여 활성 레버를 누르는 횟수를 나타내는 작동 벽 시험. 데이터는 평균 ± SEM(n=6마리/그룹)으로 나타낸다. p-값은 이-원 ANOVA 반복 측정에 이어, 본페로니 사후 시험(£ P<0.05; ££ P<0.01; £££ P<0.001 ND 대 HFD) 및 PR 분리된 분석을 위한 비쌍식 T 시험(*P<0.05 HFD SUC 대 HFD; $P<0.05 ND SUC 대 ND) 후 수득하였다.
실시예
본 발명을 하기 실시예에 의해 추가로 나타낸다.
실시예 1:
물질 및 방법
1. 마우스 및 실험 설계
모든 마우스 실험은 특정 번호 2017/UCL/MD/005 하에 UCLouvain, Universit catholique de Louvain의 보건 부문의 동물 보호 윤리 위원회에 의해 승인되었고 지역 윤리 위원회(local ethics committee)의 지침 및 실험 동물의 보호에 관한 2013년 5월 29일자의 벨기에 법(Belfian Law)(계약 번호 LA1230314)에 따라 수행되었다.
2. 공여체 마우스
8주령의 특정-기회감염 및 병원체가 없는(specific-opportunistic and pathogen-free; SOPF) 수컷 C57BL/6J 마우스(10마리, 그룹 당 n=5마리)(Janvier Laboratories®, 프랑스)의 코호트(cohort)를 케이지당 2마리의 마우스 그룹으로, 멸균 식품(조사됨) 및 멸균수에 자유로이 접근하도록 하면서, 제어된 환경(22 ± 2℃의 실온, 12시간의 일광 주기)에 가두었다. 출산 후 생쥐를 1주의 적응 기간을 거치고, 그 동안 이에게 대조군 식이(CT, AIN93Mi, Research Diet, 미국 뉴저지주 뉴 브룬스윅)을 제공하였다. 이후에, 마우스를 2개 그룹으로 무작위로 나누고, 5주 동안 대조군 저-지방 식이(CT, AIN93Mi) 또는 고-지방 식이(HFD, 60% 지방 및 20% 탄수화물(kcal/100g)) D12492i, 연구 식이, 미국 뉴저지주 뉴 브룬스윅)를 5주 동안 제공하였다. 체중, 식품 및 물 섭취를 1주에 1회 기록하였다. 신체 조성은 7.5MHz 시간 영역-핵자기공명(time domain-nuclear magnetic resonance; TD-NMR, LF50 Minispec, Bruker®, 독일 라인수테텐)을 사용하여 평가하였다. 4주간의 추적 관찰 후, 마우스를 대사 챔버(metabolic chamber)내로 도입하여 음식 선호도 시험을 수행하였다.
3. 수용체 마우스
3주령의 특정-기회감염 및 병원체가 없는(SOPF) 수컷 C57BL/6J 마우스(15마리, 그룹 당 n=7 내지 8마리)(Janvier Laboratories®, 프랑스)의 코호트를 케이지당 2마리의 마우스 그룹으로, 멸균 식품(조사됨) 및 멸균수에 자유로이 접근하도록 하면서, 제어된 환경(22 ± 2℃의 실온, 12시간의 일광 주기)에 가두었다. 마우스에게 전체 이식 프로토콜 동안 뿐만 아니라 장내 미생물총 이식 후에 저-지방 대조군 식이(CT, AIN93Mi)을 제공하였다. 체중, 식품 및 물 섭취를 1주에 1회 기록하였다. 신체 조성은 7.5MHz 시간 영역-핵자기공명(TD-NMR, LF50 Minispec, Bruker®, 독일 라인수테텐)을 사용하여 평가하였다. 12주간의 추적 관찰 후, 마우스를 대사 챔버에 도입시켜 이의 식품 섭취와 물질대사를 정밀하게 평가한 다음 식품 선호도 시험을 수행하였다.
4. 분변 미생물총 이식
공여체 실험 말기에, 맹장 내용물을 멸균 용기에 수집하고 즉시 멸균 링거 완충제(4.5g NaCl, 200mg KCl, 125mg CaCl2) 속에 희석시켰다(1:50 w/vol). 이후에 이러한 현탁액을 20%(w/v) 탈지유(무지방 분유, Biorad®, 2005668 A) 속에 희석(1:1 v/v)한 후 -80℃에서 저장하였다. 공여체 코호트로부터의 2마리의 CT를 제공한 마우스 및 2마리의 HFD를 제공한 마우스를 3 또는 4마리의 수용체 마우스에 대해 1마리의 공여체를 지닌 그룹 당 각각 7 또는 8마리의 수용체 마우스에 대해 분변 미생물총 공여체로서 선택하였다. 장내 미생물총 접종 전에, 3주령의 SOPF 수용체 마우스를 5일 동안 항진균제(암포테리신 B 1 mg/kg)이 가해된 광범위하고 잘 흡수되지 않는 항생제 혼합물(100mg/kg의 암피실린, 네오마이신 및 메트로니다졸 및 50 mg/kg의 멸균수 속에 희석된 반코마이신)의 매일 위관영양에 의해 장내 미생물총을 고갈시켰다. 이후에, 항생제 치료를 2시간 절식 후 30분 간격으로 2회 경구 위관영양에 의해 PEG 용액(PEG/마크로골(Macrogol) 4000, Colofort®, 프랑스 입셍) 600μl의 투여로 장 세척을 실시하였다. 이후에, 콜로니화를 1주일 동안 1주 당 3회 300μl의 접종물을 사용한 위장내 위관영양으로 달성하였다. 항생제 치료 및 접종 동안, 마우스를 1주에 4회 깨끗한 케이지로 옮겼다. 모든 수용체 마우스는 CT 식이(CT, AIN93Mi) 하에 유지시켰다.
5. 대사 챔버
11주간의 추적 관찰 후, 수용체 마우스를 분리하고 대사 챔버에 도입시키기 1주 전에 개별적으로 수용하였다(Labmaster, TSE Systems GmbH, 독일 바드 홈부르그). 이후에, 마우스에 대해 식품 선호도 시험 전 4일 동안 대사 평가를 하였다. 마우스를 간접 열량측정법(calorimetry)(Labmaster, TSE Systems GmbH)을 사용하여 산소 소비, 및 이산화탄소 생산에 대해 분석하였다. 이러한 매개변수는 전체 체중의 함수로 나타내었다. 운동 활동(locomotor activity)을 적외선 빔-기반 운동 모니터링 시스템(infrared light beam-based locomotion monitoring system)(시간당 빔 중단 수(beam breaks count per hour)로 나타냄)을 사용하여 기록하였다. 센서는 15분마다 각 식단의 정밀한 식품 섭취량을 기록하였다. 챔버 내부에서, 측정이 15분마다 이루어졌다. 최종 데이터 표시(전체, 낮 또는 밤)은 측정되고 합산된 모든 값(밝은 상 또는 어두운 상)에 상응한다. 최종적으로 평균(n=7)을 그룹 사이에서 비교하였다.
6. 식품 선호도 시험
낮에 3시간 동안, 마우스를 2개 종류의 식단: 저-지방, 대조군 일반 식이(CT, AIN93Mi, Research Diet, 미국 뉴저지주 뉴 브룬스윅) 또는 고-지방 고-슈크로스 식이(HFHS, 45% 지방 및 27.8% 슈크로스(kcal/100g) D17110301i, Research Diet, 미국 뉴저지주 뉴 브룬스윅)에 대사 챔버(Labmaster/Phenomaster, TSE Systems, 독일) 내에서 노출시켰다. 센서를 15분마다 각 식단의 정밀한 식품 섭취량을 기록하였다.
7. 조직 샘플링
각각의 실험의 말기에, 마우스에게 이소플루란(Forene®, Abbott, 영국)을 사용하여 마취하기 전에 HFHS에 먹이를 주고 1시간 동안 노출시켰다. 이는 식품 선호도 시험의 조건을 모사하고 도파민성 식품 보상 시스템을 자극하는 것을 목표로 한다. 이후에, 마우스를 채혈 및 경추 탈구로 안락사시켰다. 선조체, 중격의지핵, 전 전두엽 피질 및 꼬리피각을 정밀하게 해부하고, 맹장 내용물을 수거하여 즉시 액체 질소에 침지한 다음, 추가 분석을 위해 -80℃에 보관하였다.
8. RNA 제조 및 실시간 qPCR 분석
총 RNA를 TriPure 시약(Roche®)을 사용하여 선조체로부터 제조하였다. 총 RNA의 정량화 및 완전성 분석을 Agilent® 2100 생체분석기)(Bioanalyzer(Agilent® RNA 6000 N)에서 각각의 샘플 2μl를 작동시켜 수행하였다. RNA 무결성 수(integrity number; RIN)가 6 미만인 경우, 샘플을 추가 분석으로부터 제외시켰다. cDNA를 GoScript® 역전사효소(Reverse Transcriptase) 키트(Promega®, 미국 위스콘신주 매디슨)를 사용하여 총 RNA 1μg의 역 전사에 의해 제조하였다. 실시간 PCR을 QuantStudio 3 실시간 PCR 시스템(Thermo Fisher Scientific®, 미국 매사추세츠주 왈탐)을 사용하여 수행하였다. Rpl19 RNA를 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)로서 선택하였다. 모든 샘플은 중복으로 수행하였고, 데이터는 2-△△CT 방법에 따라 분석하였다. 증폭된 생성물의 확인 및 순도를 증폭의 말기에 용융 곡선 분석(melting curve analysis)에 의해 평가하였다. 실시간 qPCR에 사용된 프라이머의 서열은 표 1에서 이용가능하다.
[표 1]
9. 마우스 맹장 샘플로부터 DNA 단리 및 서열분석
맹장 내용물을 수집하여 사용 전까지 -80℃에서 냉동시켜 유시하였다. 메타게놈성(Metagenomic) DNA를 변형된 제조업체의 지침에 따라 QIAamp® DNA 분변 미니 키트(Stool Mini Kit)(Qiagen®, 독일 힐덴)를 사용하여 맹장 내용물로부터 추출하였다(참고: Everard et al., ISME J 2014; 8:2116-30). 16S rRNA 유전자의 V1-V3 영역을 다음의 범용 진정 세균 프라이머(eubacterial primer)를 사용하여 마우스의 맹장 미생물총으로부터 증폭시켰다: 27Fmod(5'-agrgtttgatcmtggctcag-3'; 서열 번호: 11) 및 519Rmodbio(5'-gtnttacngcggckgctg- 3'; 서열 번호 12). 정제된 앰플리콘(amplicon)을 제조업자의 지침에 따라 MiSeq®을 사용하여 서열분석하였다. 서열분석은 MR DNA(www.mrdnalab.com, 미국 텍사스주 샬로워터)에서 수행하였다. 서열을 QIIME 파이프라인(디폴트 옵션(default option)을 사용하는 v1.9: Q25, 최소의 서열 길이 = 200bp, 최대의 서열 길이 = 1,000bp, 모호한 염기의 최대 수 = 6, 단독중합체의 최대 수 = 6, 프라이머 불일치의 최대 수 = 0)을 사용하여 역다중화(demultiplex)시키고 처리하였다. 분석된 22개의 샘플에 대해, 102개의 OTU가 식별되었다(97% 유사성). 샘플당 서열의 최소의 수는 48,170개이었고 샘플당 서열의 최대 수는 86,360개이었다. 샘플당 서열의 중앙 수(median number)는 61,143이고 샘플당 서열의 평균 수는 63,7392 ± 10,798(표준 편차)이었다. 서열분석 공정으로부터 유래된 Q25 서열 데이터를 QIIME 1.9 파이프라인을 사용하여 분석하였다. 요약하면, 서열에서 바코드 및 프라이머를 고갈시켰다. 이후에, 서열 1,000bp를 제거하고; 모호한 기본 호출(base call) 및 6bp를 초과하는 동종중합체 작동이 있는 서열을 또한 제거하였다. 서열을 탈노이즈(denoise)시키고 운영 분류 단위(operational taxonomic unit; OTU)를 생성시켰다. 키메라를 또한 제거하였다. OTU는 3% 발산(97% 유사성)으로 클러스터링(clustering)함으로써 정의하였다. 최종 OTU를 전문적인 그린진 데이타베이스(curated Greengenes database)에 대해 BLASTn을 사용하여 분류학적으로 분류하였다. PCoA를 샘플 사이의 비가중 UniFrac 거리 매트릭스(unweighted UniFrac distance matrix)를 사용하고 앞서 기술된 34, 35, 36, 37과 같이 QIIME으로 생성시켰다. 데이터는 요청 시 이용가능하다.
10. 통계적 분석
상술한 바와 같은 미생물총 분석을 제외하고 통계적 분석을 Windows용 GraphPad Prism® 버전 8.1.2(GraphPad® Software, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)를 사용하여 수행하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타낸다. 2개 그룹 사이의 차이는 비쌍식 스튜던츠 t-시험을 사용하여 평가하였다. 피셔 시험(Fisher test)에 따라 그룹 사이에 유의적으로 상이한 변량(variance)의 경우, 비-모수(만-휘트니) 시험을 수행하였다. 반복 측정의 경우, 일-원 ANOVA 또는 이-원 ANOVA에 이어, 터키 또는 본페로니 각각의 사후 시험을 사용하여 2개 그룹 사이의 차이를 평가하였다. 그룹 사이에 상이한 변량의 경우에, 비-모수 크루스칼-왈리스 시험(non-parametric Kruskal-Wallis test)에 이어 던넷 사후 시험(Dunnett post-hoc test)을 수행하였다.
11. 조건화된 장소 선호도 시험(Conditioned Place Preference test)
식품 보상의 학습 구성성분을 앞서 기술된 바와 같이 편향된 장치(biased apparatus; Phenottyper 챔버, 네덜란드 놀두스)에서 광 상(light phase)의 말기에 수행된 조건화된 장소 선호도(CPP) 시험에 의해 공여체 및 수용체 마우스에서 평가하였다. 거동 케이지를 매끄럽거나 거친 바닥과 검은색 또는 줄무늬 벽으로 특성화된 2개의 구획으로 분리하였다. 모든 구획을 각각의 세션 전후에 모든 구획을 완전히 세정하였다. 각각의 세션(예비-시험, 훈련, 시험)을 정확히 30분 동안 지속한다. 운동 활동을 적외선 카메라 모니터링 시스템으로 기록하고 제공된 소프트웨어(EthoVision XT 14)로 분석하였다. 1일째에, 예비-시험을 사용하여 기준선에서 덜 선호되는 구획(마우스가 자발적으로 더 적은 시간을 보낸 구획)을 결정하고 보상-관련 구획(편향된 CPP 방법)으로 정의한다. 2일부터 9일째까지, 공여체 및 수용체 마우스를 보상 자극(Reese's®)이 있거나 없는 상태에서, 각각 덜 선호하는 구획과 가장 선호하는 구획(각 구획에서 4회 세션)에서 8회의 훈련을 시켰다. 시험 중에, 마우스는 케이지의 각 구획에서 자유롭게 달릴 수 있으며(보상 자극이 없는 경우), 각 구획에서 소비한 시간을 기록한다(제공된 소프트웨어(EthoVision XT 14)로 분석함). 선호도 점수는 예비-시험 및 시험 동안 케이지의 맛있는 식품-관련 측면에서 보낸 시간과 중립-관련 측면에서 보낸 시간의 차이를 기반으로 한다.
12. 작동 벽 시험(operant wall test)
원함 구성성분을 보상을 수득하기 위한 동기와 연결시키고 앞서 기술된 바와 같이 공여체 및 수용체 마우스에서 작동 벽 시험으로 평가한다. 시험의 각각의 세션을 작동 조건화 챔버(Phenotyper 챔버, 네덜란드 놀두스)에서 광 상의 말기 동안 수행하고 제공된 소프트웨어(Ethovision XT 14)로 분석하였다. 요약하면, 마우스를 이의 집 케이지내 작동 벽에 간헐적으로 접근시켰다. 작동 벽 시스템은 2개의 레버 및 2개의 광 및 펠렛 디스펜서로 구성된다. 1개의 레버는 임의로 활성으로 지정되는데, 이는 이러한 레버를 누르면 슈크로스 펠렛(5-TUT 땅콩버터 풍미의 슈크로스 펠렛, TestDiet, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)의 전달을 개시하고 불이 켜지는 것과 관련된다. 다른 측면에, 불 끄기와 관련된 다른 레버를 임의로 비활성으로 지정하고 보상을 결코 제공하지 않을 것이다. 마우스를 FR 스케쥴(1회의 레버 누르기는 하나의 보상에 상응한다)에서 밤새 2회 시스템에 대해 훈련시킨 다음, 1시간 30분 동안 2개의 세션을 거쳤다. 이후에, 마우스를 PR 세션(2시간)으로 이동시켰고, 보상을 수득하기 위한 레버 누름 수를 모든 펠렛에 대해 점진적으로 증가시킨다(n+3). 상이한 세션 동안 활성 레버를 누르지 않은 마우스는 제거하였다.
13. 다른 자극
식품, 예컨대, 알코올 또는 약물로부터 명백한 보상 자극을 사용할 수 있다.
결과
1. DIO 공여체 마우스는 쾌락적 식사에서의 변경을 나타낸다.
첫째로, 10마리의 공여체 마우스를 저-지방(대조군, CT) 또는 고-지방 식이(HFD)에 5주 동안 노출시켜 각각 마른 또는 비만 표현형(식이-유발된 비만, DIO)을 유도하였다. 예상대로, HFD를 제공한 마우스는 CT를 제공한 마우스와 비교하여 체중이 12%(도 1A-B) 증가하였고 체 질량 획득이 230%(도 1C-D) 증가한 것으로 나타났다. 이후에, 식품 섭취의 쾌락적 구성성분을 연구하기 위해, 이러한 마우스에서 맛있는 음식 소비와 관련된 쾌락을 분석하였다.
자발적인 쾌락 식품 섭취를 평가하기 위하여, 공여체 마우스를 처음으로 맛있는 식이(고-지방 고-슈크로스, HFHS)에 노출시키는 식품 선호도 시험을 실시하였다. 이러한 식품 선호도 시험 동안, 공여체 마우스를 광 상 동안 3시간 동안 HFHS와 저-지방 대조군 식이(CT)에 노출시키고 각각의 식이의 소비를 기록하였다(도 1E도 1F). 마른 마우스 및 비만 마우스 둘 다는 식품 선호도 시험 동안 CT보다 더 많은 HFHS를 먹었으므로 CT보다 HFHS 식단을 선호하였다. 그러나 마른 마우스는 시험의 시작부터 CT보다 유의적으로 더 많은 HFHS를 먹었으므로 HFHS에 대한 더 빠른 향성을 나타낸 반면, DIO 마우스는 90분 후에만 대조군 식이보다 유의적으로 맛있는 식이을 선호하였다(도 1E). 전반적으로, DIO 마우스는 전체 식품 선호도 시험에 걸쳐 마른 마우스보다 HFHS를 58% 적게 먹어서(p < 0.0001), 맛있는 식이에 유의적으로 덜 이끌렸다(도 1F).
2. 비만 장내 미생물총 이식은 비만과 관련된 쾌락적 섭식의 변경을 전달한다.
비만-관련 쾌락적 섭식 장애에서 장내 미생물총의 인과적 역할을 연구하기 위하여, 2마리의 마른 마우스 및 2마리의 비만 공여체 마우스로부터의 장내 미생물총을 각각 7마리및 8마리의 수용체 쥐에 이식하였다. 모든 수용체 쥐에게 전체 실험 동안 동일한 저-지방의, 대조군 식이를 제공하였다(도 2A).
마른 및 비만 장내 미생물총 수용체 마우스(각각 Lean_rec 및 DIO_rec)는 체중(도 2B-C) 또는 지방 질량 획득(도 2D-E)의 측면에서 어떤 차이도 나타내지 않았다. 그러나, DIO 장내 미생물총 수용체 마우스는 시간이 지남에 따라 더 많은 지방 질량을 획득하는 경향이 있었고, 64일째에 통계적으로 유의적이었다(도 2D). 마른 및 비만 장내 미생물총 수용체 마우스의 에너지 대사를 조사하기 위하여, 대사 챔버 내에서 O2 소비 및 CO2 생산의 정밀한 측정을 수행하였다. 비만 또는 마른 장내 미생물총을 제공받은 마우스 사이에는 어떠한 차이도 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 공여체 마우스가 분변 이식 후 지방 질량과 체중의 측면에서 이의 비만 표현형을 수용체 마우스에게 전달하지 않았음을 시사한다.
흥미롭게도, 전체 추적 기간 동안, 마른 및 비만 장내 미생물총 수용체 마우스는 대조군 식이을 유사하게 섭취하였다. 그러나, 맛있는 음식에 처음 노출되는 동안(즉, 식품 선호도 시험), HFHS 섭취량의 차이가 나타났다(도 2F 및 도 2G). 마른 장내 미생물총 수용체 마우스는 DIO 장내 미생물총 수용체 마우스보다 HFHS에 대해 더 빠른 선호도를 나타내었다. 실제로, 마른 장내 미생물총 수용체 마우스는 시험 90분 후에 CT 식이보다 유의적으로 더 많은 HFHS를 섭취한 반면, DIO 장내 미생물총 수용체 마우스에서 HFHS와 CT 섭취량의 차이는 150분 및 180분 후에만 유의미하였다(도 2G). 공여체 마우스와 마찬가지로, 2개의 수용체 그룹은 CT 식이보다 맛있는 식이를 선호하는 것으로 나타났다. 놀랍게도, 총 HFHS 섭취량은 마른 장내 미생물총 수용체 마우스에 비해 DIO 장내 미생물총 수용체 마우스에서 40% 덜 중요하였다(p < 0.01, 도 2F). 이러한 결과는 마른 및 DIO 장내 미생물총 수용체 마우스가 이의 각각의 미생물총 공여체와 같은 쾌락적 섭식 거동의 측면에서 유사한 패턴을 나타내고 이러한 교과는 비만 발달 또는 비-쾌락적 급식 거동과는 독립적이었음을 입증한다. 물론, 시험 동안 보행 활동은 수용체 마우스 사이에서 비교가능하였고, 이는 설탕과 지방이 높은 이러한 새로운 음식에 대한 유사한 탐색 거동을 시사한다. 종합하면, 비만과 관련된 쾌락적 식품 고동 변경에서 장내 미생물총의 인과적 역할이 발견되었다.
3. 선조체내 도파민성 마커는 DIO 수용체 마우스에서의 기능저하 식품 보상 시스템을 시사한다
맛있는 식품 섭취와 관련된 쾌락은 중피질변연계의 도파민 경로에 의해 구동된다. 실제로, 지방과 설탕이 풍부한 식이의 섭취는 식품 섭취로부터 유래된 쾌락의 자체-보고된 수준에 비례하여 등쪽 선조체의 도파민의 방출과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. 도파민 수용체 1 및 2(D1R 및 D2R)는 보상 시스템에서 가장 많이 발현되는 도파민 수용체이며 과학 문헌은 사람 및 설치류에서의 비만과 관련하여 이러한 수용체의 하향조절을 기술하고 있고, 이는 궁극적으로 맛있는 음식 섭취와 관련된 쾌락의 감소와 관련된다. 비만 장내 미생물총의 이식은 비만과 관련된 식품 선호도 변경을 복제하였으므로(도 2F), 이것이 도파민 마커에서의 변형과 관련되었는지가 궁금하였다. 따라서, 수용체 마우스의 선조체 내 도파민 마커의 발현을 qPCR로 시험하였다.
결과는 미생물총 이식 후 DIO 수용체 마우스가 마른 수용체 마우스에 비해 선조체내에서 Drd1 및 Drd2를 최소 60% 적게 발현함을 나타내지만, 이는 Lean_rec 그룹의 높은 가변성으로 인해 통계적 임계값을 통과하지 못하였다(p>0.05, 도 3A-B). 도파민을 합성하는 속도-제한 효소인 타이로신 하이드록실라제(TH)의 발현은 마른 미생물총을 제공받은 마우스에 비해 비만 미생물총을 게공받은 마우스에서 또한 감소하였다(50%)(p > 0.05, 도 3C). 이러한 결과와 일치하여, 방출된 도파민의 약 80%를 회수하는 역할을 하는 도파민 수송체(dopamine transporter; DAT)는 Lean_rec에 비해 DIO_rec에서 2배 더 많이 발현되었고(p > 0.05, 도 3D), 이는 비만 장내 미생물총 이식된 마우스의 도파민 시스템의 낮은 기능을 시사한다. 물론, 도파민 마커의 발현의 변형은 보행 활동에서의 변화와 관련이 없으며, 이는 선조체에서 관찰된 qPCR 결과가 운동 기능보다는 보상 시스템에 대해 특이적임을 시사한다.
선조체 내 도파민 시스템 외에도, 꼬리 피각, 중격의지핵, 전전두엽 피질과 같은 다른 뇌 영역이 식품 보상에 관여한다. 따라서, 이러한 영역내 도파민 마커의 mRNA 수준을 추가로 조사하고 분석하였다(표 2).
[표 2]
전전두엽 피질 및 꼬리 피각내 마른 및 비만 장내 미생물총 수용체 마우스 사이에 어떠한 차이도 관찰되지 않았다. 그러나, 결과는 중격의지핵의 도파민 마커 발현의 약간의 조절을 나타내는 경향이 있다.
이러한 결과를 확인하기 위해, 실험의 다른 라인을 수행하였지만, 이번에는 시험 동안 마우스를 칼로리 제한 조건으로 유지하였다. 마른 및 비만 공여체로부터의 장내 미생물총 수용체 마우스의 중격의지핵(Nucleus accumben; NAc)내 도파민 및 오피오이드 마커의 발현을 조사하였다(도 6A 및 B). 도파민 수용체 2(Drd2)와 도파민을 합성하는 효소인, 타이로신 하이드록실라제(Th)의 발현에서 유의적인 감소가 마른 공여체로부터의 장내 미생물총의 수용체 마우스와 비교하여 비만 공여체로부터의 장내 미생물총의 NAc에서 발견되었다. 도파민 수용체 1(Drd1) 및 도파민 수송체(Dat)는 마른 마우스로부터의 장내 미생물총을 이식한 마우스와 비교하여 비만 마우스로부터의 장내 미생물총을 이식한 마우스에서 감소하는 경향이 있었다(도 6A).
오피오이드 시스템은 식품 보상에 또한 포함되고, 비만 상태에서는 둔화되는 것으로 나타났으므로, 일부 주요 마커의 발현이 측정되었으며 DIO_rec가 μ-오피오이드 수용체(Oprm)의 NAc 발현에서 유의적인 감소, κ-오피오이드 수용체(Oprk, p=0.05) 및 다이노르핀(dynorphin)의 전구체(Pdyn, 전-프로다이노르핀(pre-prodynorphin), p=0.06, 도 6B)에서의 감소에 대한 유사한 경향성을 가졌음이 밝혀졌다. δ-오피오이드 수용체(Oprd)의 발현은 Lean_rec와 DIO_rec 사이에 차이가 상이하지 않았다(도 6B).
4. 비만 공체체로부터 마른 수용체 내로의 분변 물질 이식은 효율적이다
장내 미생물총 이식의 효능을 입증하기 위하여, 공여체 및 수용체 마우스로부터의 맹장 내용물의 세균 구성을 16S rRNA 서열분석을 사용하여 분석하였다. 공여체와 수용체 사이의 공통 OTU(운영 분류 단위)를 식품 선호도 시험 직후, 각각의 실험의 말기에 비교하였다(도 4A 내지 D). 각각의 공여체 그룹(CT-제공 또는 HFD-제공)으로부터의 2마리의 마우스는 3마리 또는 4마리의 수용체 마우스에 대해 1마리의 공여체 마우스로서 각각 7마리의 Lean_rec 및 8마리의 DIO_rec 수용체 마우스에 대한 공여체이었다. 벤 다이어그램은 공여체와 수용체 사이에 OTU의 높은 유사성(50% 이상)을 나타내었고, 이는 공여체로부터 장내 미생물총을 지닌 항생체-처리된 수용체의 콜로니화를 입증한다(도 4A 내지 D).
추가로, PCoA에서 제시된 바와 같이, 비만 공여체 및 비만 장내 수용체 마우스는 기본 구성성분 PC2에 따라 마른 공여체 및 마른 장내 미생물총 수용체 마우스와는 상이한 장내 미생물총 프로필을 갖는다(도 4E 및 F).
5. 파라박테로이데스는 쾌락적 식품 섭취를 제어하는 장-대-뇌 축 내 잠재적인 연결을 나타낸다
비만의 맥락에서 장내 미생물총과 식품 보상 시스템 사이의 잠재적 연관성을 강조하기 위한 예비 접근법으로서, 스피어만 상관관계를 사용하여 식품 보상 시스템의 여러 매개변수와 장내 미생물총 사이의 연관성을 확립하였다. 공여체 마우스와 수용체 마우스로부터의 데이터를 합하여 상관 매트릭스를 생성시켰다. 표는 18개의 OTU가 식품 선호도 시험 동안 측정된 총 HFHS 섭취와 관련되었음을 나타내었다(표 3). 또한, 펩토코카세아에 계열의 미확인 속과 D1R, D2R 및 TH의 mRNA 발현 사이에 양의 상관관계가 발견되었다(표 3).
[표 3]
그러나, FDR(거짓 발견율(false discovery rate)) 방법을 사용하여 다중 비교를 수정한 후, 파라박테로이데스 만이 HFHS 섭취와 매우 긍적적으로 관련되어 남았다(도 5). 이는 마우스가 파라박테로이데스를 많이 가질수록, 식품 선호도 시험 동안 더 많은 HFHS를 먹었고 이러한 거동은 기능적 보상 시스템을 내포함을 시사하였다.
6. 비만 공여체로부터의 분변 물질 이식은 학습 구성성분을 변경시킨다
학습에서 장내 미생물총의 역할을 조사하기 위하여, 공여체 및 수용체 마우스에서 CPP 시험을에 의해 식품 보상의 학습 구성성분을 평가하였다(도 7A-B). 이러한 시험의 목적은, 자극이 제거된 후에도, 식품 자극이 있는 구획을 선호하도록 마우스를 조건화할 수 있는 정도를 평가하기 위한 것이다. 여기서 목표는 보상 시스템을 자극하는 맛있는 식품 펠렛(Reese's®)을 사용한 훈련 세션 동안 마우스가 케이지 한쪽 측면에 구속된 후 케이지의 한쪽에서 소비한 시간을 증가시키는 것이었다. 예비-테스트를 사용하여 마우스가 기준선에서 임의의 구획에 대해 기존 선호도를 가졌는지의 여부를 측정한다.
마른 공여체와 비만 공여체 둘 다는 예비-시험 동안 보다 시험 동안 맛있는 음식과 관련된 구획에서 더 많은 시간을 보냈고, 이는 이들이 훈련 세션 후 케이지의 한쪽에 대한 이의 초기 선호도를 되돌릴 수 있음을 시사한다(도 7A). 그러나, 식품 보상의 학습 구성성분은 비만 마우스에서보다 마른 마우스에서 보다 효율적이다. 더욱이, 중립 구획과 비교하여 맛있는 식품-관련된 구획에서 소비한 시간의 차이는 마른 마우스와 비교하여 비만 마우스에서 더 낮은 경향이 있다(p=0.1, 도 7A).
마른 공여체로부터의 장내 미생물총의 수용체는 또한 하나의 구획에 대한 이의 초기 선호도를 역전시켰고 예비-시험과 비교하여 시험 동안 쾌락 측면에서 보낸 시간을 유의적으로 증가시켰다(도 7B). 반대로, 이것이 시험 동안 쾌락 관련 구획에서 보다 많은 시간을 소비하는 경우에도, 비만 공여체로부터의 장내 미생물총 수용체 마우스는 예비-시험과 비교하여 시험 동안 쾌락 측면에 대한 선호도 점수에서 유의적인 차이를 나타내지 않았다(도 7B). DIO_rec 그룹은 케이지의 한쪽 측면에 대한 이의 초기 선호도를 역전시키는데 실패하였고, 이는 케이지의 측면을 맛있는 식품-유도된 쾌락과 효율적으로 연관시키기 위한 이의 불능을 반영한다. 이러한 결과는 비만 공여체로부터의 장내 미생물총의 수용체 마우스가 식품 보상의 조절되지 않은 학습 구성성분을 가짐을 시사한다. 전체적으로, 이들 데이타는 비만과 관련된 학습 구성성분의 변경이 공여체와 수용체 마우스 사이에 FMT를 통해 부분적으로 전달됨을 입증한다.
7. 비만 공여체로부터의 장내 미생물총 수용체 마우스는 식품 보상에 대해 과도한 동기부여를 나타낸다.
원함 구성성분 또는 식품 보상을 수득하기 위한 동기부여를 평가하기 위해, 공여체 및 수용체 마우스에게 이들이 보상 슈크로스 펠렛을 제공받기 위해 레버를 눌르는 작동 벽 시험을 실시하였다(도 8A-D). 시험의 처음 3개의 세션은 고정 비율(FR) 원칙을 기반으로 하고; 하나의 식품 보상은 1회 레버 누르기를 필요로 한다. 이후에, 점진적인 비율 세션(PR)에서, 마우스는 각각의 새로운 슈크로스 펠렛을 수득하기 위하여 레버에서 점진적으로 증가하는 횟수(N+3)로 누르도록 함으로써 식품 보상을 수득하기 위한 이의 동기부여를 평가하였다.
비만 마우스는 마른 마우스와 비교하여 PR 세션 동안 레버에서 유의적으로적게 눌렀다(도 8A). 수득된 보상 펠렛의 수는 PR 세션 동안 마른 공여체에 대해서보다 비만의 경우 또한 유의적으로 더 낮다(도 8B). PR 세션은 보상을 수득하기 위한 동기부여를 보다 잘 반영하며, 본 발명자의 데이터는 비만이 식품 보상의 원함 구성성분의 변경과 관련됨을 나타낸다.
놀랍게도, 비만 공여체로부터의 장내 미생물총 수용체 마우스는 마른 장내 미생물총 수용체 마우스와 비교하여, PR 세션 2, 3 및 4 동안 레버를 보다 더 눌렀다(PR2 동안 p=0.05, PR3 동안 p<0.05, PR4 동안 p=0.07(도 8C). 이러한 경향성은 PR 세션 2, 3 및 4 동안 비만 공여체로부터의 장내 미생물 총을 접종한 마우스에 의해 수득된 보다 높은 수의 보상에 의해 반영되었다(도 8D). 이러한 결과는 비만 공여체로부터의 장내 미생물총 수용체 마우스가 이의 비만 공여체보다 식품 보상을 수득하기 위해 레버에서 대략 100배 회수를 눌렀으므로, 이들이 보상을 수득하기 위한 동기부여를 평가하는 본 시험에서 이의 비만 공여체와 반대 방식으로 거동함을 시사한다. 레버 누르기 수의 절대적 값이 Lean_rec와 Lean_do 그룹 사이에서 유사한 것은 가치가 있다(도 8A, 8C). 비만 공여체로부터의 장내 미생물총 수용체 마우스는 활성 레버 누르기의 특히 더 높은 값을 나타내었고(도 8D), 이는 마른 조건 하에서 관찰된 정상적인 동기부여된 거동보다는, 식품 보상에 대한 과도한 동기부여를 시사한다.
8. 식품 보상에 대한 과도한 동기부여는 식품 섭취의 항상성 조절인자의 조절과 관련되지 않는다.
비만 마우스에서 장내 미생물총이 마른 상태(수용체 마우스)에서 거동 및 신경 보상 시스템에 어떻게 작용할 수 있는지 이해하기 위하여, 항상성 식품 섭취의 조절에 포함된 장-뇌 축(gut-brain axis)의 수개의 매개인자를 분석하였고, 이는 또한 식품 보상 시스템에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 그렐린, 인슐린, 렙틴, GLP-1 및 PYY를 수용체 마우스 뿐만 아니라 공여체 마우스의 혈장에서 측정하였다. 혈장 속에서 분석된 항상성 조절인자 중 어느 것도 마른 및 비만 공여체로부터의 장내 미생물총 수용체 마우스 사이에서 상이하였다(도 9A-E). 대조적으로, 그렐린에서 유의적인 감소(도 9A), 인슐린혈증(insulinemia)(도 9B) 및 렙틴혈증(leptinemia)(도 9C)에서 유의적인 증가와 같이, 비만과 관련된 대표적인 호르몬 변화가 마른 마우스와 비교하여 비만 공여체의 혈장에서 관측되었다. GLP-1 및 PYY의 혈장 수준은 마른 및 비만 공여체 마우스 사이에서 유의적으로 상이하지 않았다(도 9D-E).
실시예 2:
물질 및 방법
1. 마우스 및 실험 설계
모든 마우스 실험은 특정 번호 2021/UCL/MD/061 하에 의 보건 부문 동물 보호 윤리 위원회의 승인을 받았으며 지역 윤리 위원회의 지침에 따라 및 실험 동물의 보호에 관한 2013년 5월 29일자 벨기에 법률(계약 번호 LA1230314)에 따라 수행되었다.
9주령의 특정-기회감염 및 무병원체(pathogen-free; SOPF) 수컷 C57BL/6J 마우스(Janvier 실험실, 프랑스 르 게네스-상-이슬(Le Genest-Saint-Isle))의 코호트를 제어된 환경(실온 22 ± 2℃, 12시간 일광 주기) 내에 케이지당 2마리의 마우스 그룹으로, 멸균 식품(방사선 조사) 및 멸균수를 자유롭게 접근하도록 하면서, 가두었다. 분만 시, 마우스는 일주일 동안 적응하도록 허용되었고, 이 동안 마우스에게 대조군 저-지방 식이(ND, AIN93Mi, Research Diet, 미국 뉴저지주 뉴 브룬스윅)을 제공하였다. 이후에, 마우스를 무작위로 4개 그룹(40 마리의 마우스, ND PBS, ND PD, HFD PBS, HFD PD로 명명된 n=10마리/그룹)으로 나누고, 대조군 저-지방 식이(ND, AIN93Mi) 또는 고-지방 식이(HFD), 60% 지방 및 20% 탄수화물(kcal/100g)(D12492i, Research Diet, 미국 뉴저지주 뉴 브룬스윅)를 8주 동안제공하였다. 1.2% 글리세롤을 함유하는 혐기성 PBS 200μL 속에 마우스당 파라박테로이데스 디스타소니스(PD)의 2x108개의 콜로니 형성 단위(CFU)를 경구 투여함에 의한 일일 치료를 ND PD 및 HFD PD 그룹에서 수행하였다. 1.2% 글리세롤을 함유하는 등가 용적의 멸균 PBS를 경구 투여하는 매일 치료를 ND 및 HFD 대조군 그룹에서 수행하였다. 체중은 1일에 1회 기록하였다. 신체 구성은 7.5MHz 시간 영역-핵 자기 공명(TD-NMR, LF50 Minispec, Bruker, 독립 라인슈테텐)을 사용하여 매주 평가하였다. 4주간의 추적 관찰 후, 마우스를 거동 케이지(Phenotyper, Noldus, 네덜란드 바게닌겐)에 두어 식품 선호도 시험 및 작동 벽 시험을 수행하였다. 마지막 시험 동안, 마우스를 앞서 기술한 바와 같이, 식품을 제한하고 체중을 초기 체중의 85%(거동 시험 전)로 유지하였다. 열량 제한으로 자극에 대한 보상 반응을 강화하도록 하였다.
2. 파라박테로이데스 디스타소니스 배양 및 제조
파라박테로이데스 디스타소니스를 혐기성 액체 YCFA 배지 및 한천 YCFA 배지 속에서 배양하였다. 파라박테로이데스 디스타소니스를 원심분리(20분 동안 4000g로 4℃에서 2회)로 수집하고 25% 글리세롤이 들어있는 멸균 PBS 속에 재현탁시킨 다음 혐기성 바이알 속에 즉시 동결시키고 -80℃에서 저장하였다. 투여 전에, 세포 펠렛을 혐기성 PBS 속에서 재현탁시켰다.
3. 식품 선호도 시험
낮에 3시간 동안, 마우스를 거동 케이지(Phenotyper, Noldus, 네덜란드, 바게닌겐) 내에서 2개의 식이에 노출시켰다: 저-지방, 대조군 식이(CT, AIN93Mi, Research diet, 미국 뉴저지주 뉴 브룬스위) 또는 고-지방 고-슈크로스 식이(HFHS, 45% 지방 및 27.8% 슈크로스(kcal/100 g) D17110301i, Research diet, 미국 뉴저지주 뉴 브룬스윅). 식품 섭취를 만족스러운 상태(시험 전 및 후에 식품에 자유롭게 접근 가능)에서, 광 상의 말기에 3-시간 세션 동안 기록하였다. 시험 동안 식품의 유출을 나타내는 마우스는 제거하였다.
4. 작동 벽 시험
원함 구성성분을 동기부여에 연시켜 이미 기술된 바와 같은 작동 벽 시험을 일부 변경시켜 평가하였다. 시험의 각각의 세션을 광 상의 말기 동안, 작동 조건화 챔버(Phenotyper, Noldus, 네덜란드) 내에서 수행하고 제공된 소프트웨어(Ethovision XT 14)로 분석하였다. 마우스는 이의 집 케이지 내 작동 벽에 간헐적으로 접근하였다. 작동 벽 시스템은 레버 및 2개의 광 및 펠렛 분배기로 구성된다. 1개의 레버를 임의로 활성인 것으로 지정하며, 이는 이러한 레버를 누르면 슈크로스 펠렛(5-TUT 땅풍 버터 풍미된 슈크로스 펠렛, TestDiet, 미국 미주리주 세인트 루이스)의 전달이 개시되고 불이 켜지는 것과 관련된다. 다른 측면에, 불 끄기와 관련된 다른 레버를 임의로 비활성으로 지정하고 보상을 결코 제공하지 않을 것이다. 마우스를 고정된-비율 스케쥴(활성 레버 누르기에서 1회의 레버 누르기는 하나의 보상에 상응한다)에서 밤새 2회 시스템에 대해 훈련시킨 다음, 1시간 30분 동안 4개의 세션을 거쳤다. 이후에, 마우스를 점진적인 비율 세션(PR)으로 이동시켰다(2시간), PR 세션 동안, 보상을 수득하기 위해 활성 레버에서 레버를 누르는 수는 모든 펠렛에 대해 점진적으로 증가한다(n+3). 상이한 세션 동안 활성 레버를 누르지 않았던 마우스를 제거하였다.
5. 통계적 분석
통계적 분석을 윈도우(Windows)용 GraphPad Prism 버전 9.1.2(GraphPad Software, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)를 사용하여 수행하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타낸다. 그룹 사이의 차이는 일-원 ANOVA 및 터키 사후 시험을 사용하여 평가하였다. 그룹과 상이한 시점 사이의 차이는 이-원 ANOVA 반복 측정에 이어 본페로니 사후 서험을 사용하여 평가하였다. 이상치(outlier)는 그루브스(Grubbs) 시험 후에 배제하였다.
6. 다른 자극
식품, 예컨대, 알코올 또는 약물로부터 명백한 보상 자극을 사용할 수 있다.
결과
1. 지방 질량 획득에 대한 파라박테로이데스 디스타소니스의 효과
지방 질량에서 파라박테로이데스 디스타소니스의 효과를 평가하기 위해, 마우스를 ND 및 HFD에 8주 동안 노출시키고 파라박테로이데스 디스타소니스 또는 비히클(PBS)의 매일 투여를 ND PD/HFD PD 및 ND PBS/HFD PBS 그룹 각각에서 수행하였다(도 10). 예측한 바와 같이, HFD를 제공받은 마우스는 ND 마우스와 비교하여 시간에 걸체 지방 질량에서 유의적인 증가를 나타내었다. 추가로, 지방 질량에서 유의적인 감소가 또한 HFD PBS와 비교하여 HFD PD 마우스에서 관측된다(P<0.05).
2. 식품 보상의 좋아함 구성성분에 대한 파라박테로이데스 디스타소니스의 효과
쾌락 식품 섭취의 연구의 부분으로서, 다양한 식이(ND 및 HFD)에 노출된 지 4주째에 식품 선호도 시험을 수행하였다. 이러한 시험 동안, 마우스를 대조군 식이(CT) 뿐만 아니라 맛이 좋은 새로운 음식(HFHS)에도 노출시켜, 식품 보상 시스템의 "좋아함" 구성성분을 평가하도록 하였다. 상이한 식품의 소비를 측정하였다(도 11). 시험 동안 소비된 대조군(CT) 및 쾌락 식품(HFHS)의 양을 비교하는 경우, ND PBS 마우스는 CT보다 유의적으로 더 많은 HFHS를 소비하였지만(만-휘트니 시험에 따른 p<0.01) HFD PBS 그룹에서 유의적인 차이는 관측되지 않았다.
이러한 결과는 HFD-유도된 비만 동안 식품 섭취의 좋아함 구성성분의 손상을 입증한다. 맛있는 및 대조군 식품 소비에서 유의적인 차이는 HFD PBS와 HFD PD 마우스 사이에서 관측되지 않았다.
이러한 결과는 파라박테로이데스 디스타소니스가 마른 또는 비만 맥락에서 보상 시스템의 좋아함 구성성분에 영향을 미치지 않음을 시사한다.
3. 식품 보상을 수득하기 위한 동기부여에 대한 파라박테로이데스 디스타소니스의 효과
식품 보상 시스템의 상이한 구성성분, 특히 음식 보상을 수득하기 위한 마우스의 동기부여(즉, 식품 섭취의 "원함" 구성성분)를 추가로 특성화하기 위하여, 작동 벽 시험을 수행하고 마우스의 동기부여를 점진적인 비율 세션 동안 평가하였다(도 12). 이러한 시험은 PR1, PR2 및 PR3 세션 동안 ND PBS 마우스와 비교하여 HFD PBS 마우스의 슈크로스 펠렛을 수득하기 위해 활성 레버를 누르는 횟수에서 유의적인 감소를 나타내었고, 이는 비만 동안 보상 시스템의 원함 구성성분과 관련된 거동에서의 결여를 반영한다. HFD PBS와 HFD PD 그룹 사이에 활성적인 레버 누르기의 수에서 유의적인 차이가 관측되지 않았다.
놀랍게도, ND 하에 파라박테로이데스 디스타소니스를 제공받은 마우스는 PR3 (P<0.0001) 및 PR4 세션(P<0.05) 동안 ND PBS 마우스와 비교하여 활성 레버에서 유의적으로 보다 적인 회수로 눌렀다. 대조군 조건에서, 정상 식이 하에, 활성 레버 누르기의 감소는 폭식-유형 섭식의 감소와 관련되었으므로, 이러한 결과는 마른 맥락에서, 식품 보상 원함의 대조군에서 파라박테로이데스 디스타소니스의 잠재적인 유익한 효과를 나타낸다.
이러한 결과는 섭식-관련 장애를 치료하기 위한 파라박테로이데스 디스타소니스, 및 보다 일반적으로 원함 구성성분이 전형적으로 보상 자극을 향해 강박 거동을 갖는 환자에서 과-자극되는 조절 장애를 치료하기 위한 보상의 사용을 뒷받침한다.
실시예 3:
물질 및 방법
1. 마우스 및 실험 설계
실시예 2 참고.
2. 파라박테로이데스 골드스테이니이 배양 및 제조
파라박테로이데스 골드스테이니이(19448)를 기탁기관(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)(DSMZ, 독립)에서 구입하였다. 파라박테로이데스 골드스테이니이는 혐기성 액체 YCFA 배지와 한천 YCFA 배지에서 배양하였다. 파라박테로이데스 골드스테이니이를 원심분리(4℃에서 20분 동안 4,000g, 2회)하여 수집하고 25% 글리세롤이 포함된 멸균 PBS에 재현탁시킨 후 즉시 혐기성 바이알에 넣어 -80℃에서 보관하였다. 투여 전, 세포 펠렛을 혐기성 PBS 속에 재현탁시켰다.
3. 식품 선호도 시험 및 작동 벽 시험
실시예 2 참고.
5. 조건화된 장소 선호도 시험
실시예 1 참고.
6. 통계적 분석
통계적 분석을 윈도우용 GraphPad Prism 버전 9.1.2(GraphPad Software, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)를 사용하여 수행하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타낸다. 예비-시험 및 시험 동안 CPP 점수 사이의 차이는 상식 스튜던츠 t-시험을 사용하여 평가하였다. 그룹 사이에 상이한 차이는 일-원 ANOVA에 이어 터키 사후 시험을 사용하여 평가하였다. 그룹과 상이한 시점 사이의 차이는 이-원 ANOVA 반복 측정에 이어, 본페로니 사후 시험을 사용하여 평가하였다. 이상치는 그루브스(Grubbs) 시험 후에 배제하였다.
결과
1. 체중 획득 및 지방 질량에 대한 파라박테로이데스 골드스테이니이의 효과
비만 표현형에서 파라박테로이데스 골드스테이니이의 효과를 평가하기 위하여, 마우스를 4주 동안 ND 및 HFD에 노출시키고 파라박테로이데스 골드스테이니이 또는 비히클(PBS)의 매일 투여를 ND PG/HFD PG 및 ND PBS/HFD PBS 그룹 각각에서 수행하였다(도 13A-13B). 예측한 바와 같이, HFD를 제공받은 마우스는 ND-제공된 마우스와 비교하여 체중 획득(P<0.0001) 및 지방 질량(P<0.01)에서 유의적인 증가를 나타내었다. 그러나, 위약과 비교하여 파라박테로이데스 골드스테이니이를 매일 투여받은 마우스에서 유의적인 차이는 관측되지 않았다. 이러한 결과는 파라박테로이데스 골드스테이니이가 HFD에 의해 유도된 비만 표현형에서 유의적인 효과를 가지지 않음을 시사한다. 체중 획득 및 지방 질량과 관련하여 ND PBS와 ND PG 그룹 사이에 유의적인 차이는 관측되지 않았음이 또한 주목할 수 있으며, 이는 이러한 매개변수에서 ND 제공된 조건에서 파라박테로이데스 골드스테이니이의 효과가 없음을 시사한다.
2. 식품 보상의 좋아함 구성성분에 대한 파라박테로이데스 골드스테이니이의 효과
식품 섭취와 관련된 쾌락을 평가하기 위하여, 식품 선호도 시험을 상이한 식이(ND 및 HFD)에 5주 노출 후 수행하였다. 이러한 시험 동안, 마우스를 대조군 식이(CT) 뿐만 아니라 맛있는 새로운 식이(HFHS)에 노출시켜, 식품 보상 시스템의 "좋아함" 구성성분을 평가하도록 하였다. 상이한 식품의 소비를 측정하였다(도 14). 이러한 시험 동안 먹은 CT와 HFHS 식품의 양을 비교하는 경우, ND PBS 및 ND PG 그룹의 마우스는 대조 식품(CT)보다 유의적으로 더 맛있는(HFHS) 식품을 먹었다(P<0.001; P<0.01). 그러나 ND PBS와 ND PG 마우스 사이에 섭취된 HFHS 측면에서 유의미한 차이는 관찰되지 않았다. 비만 상태에서 HFD PBS 및 HFD PG 마우스는 맛있는 음식(HFHS)과 대조군 식품(CT) 섭취 사이에 어떠한 유의적인 차이도나타내지 않았다. 또한, HFD PBS는 ND PBS보다 훨씬 덜 맛있는 음식을 소비하였다(P<0.05).
이러한 결과는 파라박테로이데스 골드스테이니이가 마른 및 비만 맥락에서 보상 시스템의 좋아함 구성성분에 영향을 미치지 않음을 시사한다.
3. 식품 보상을 수득하기 위한 동기부여에 대한 파라박테로이데스 골드스테이니이의 효과
식품 보상 시스템의 상이한 구성성분, 및 특히 식품 보상을 수득하기 위한 마우스의 동기부여(즉, 식품 섭취의 "원함" 구성성분)를 추가로 특성화하기 위하여, 작동 벽 시험을 수행하고 마우스의 동기부여를 점진적 비율 세션 동안 평가하였다(도 15). 이러한 시험은 PR2(P<0.01), PR3(P<0.001) 및 PR4 세션(P<0.01) 동안 ND PBS 마우스와 비교하여 HFD PBS 마우스의 슈크로스 펠렛을 수득하기 위해 활성 레버를 누르는 수에서 유의적인 감소를 나타내었고, 이는 비만 동안 보상 시스템의 원함 구성성분과 관련된 거동에서의 결여를 반영한다. HFD PBS와 HFD PG 그룹 사이에 활성적인 레버 누르기의 수에서 유의적인 차이는 관측되지 않았다.
놀랍게도, ND 하에 파라박테로이데스 골드스테이니이를 제공받은 마우스는 PR2(P<0.05), PR3(P<0.001) 및 PR4(P<0.001) 세션 동안 ND PBS 마우스와 비교하여 활성 레버를 훨씬 적은 수로 눌렀다. 제어 조건, 정상적인 식이 하에서, 활성 레버 누르기의 감소는 폭식 유형 섭식의 감소와 연관되어 있기 때문에, 이러한 결과는 마른 맥락에서, 식품 보상 시스템에서 원함의 제어시 파라박테로이데스 골드스테이니이의 잠재적으로 유익한 효과를 강조한다.
이러한 결과는 섭식-관련 장애를 치료하기 위한 파라박테로이데스 골드스테이니이, 및 보다 일반적으로 원함 구성성분이 전형적으로 보상 자극을 향해 강박 거동을 갖는 환자에서 과-자극되는 조절 장애를 치료하기 위한 보상의 사용을 뒷받침한다.
4. 식품 보상의 학습 구성성분에서 긍정적인 보강에 대한 파라박테로이데스 골드스테이니이의 효과
식품 보상 시스템의 다른 구성성분을 탐구하기 위하여, "학습", 즉 조건화된 장소 선호도 시험을 사용하였다. 이러한 시험의 목표는 심지어 자극이 제거된 후에도, 마우스가 식품 자극이 있는 구획을 선호하도록 조건화될 수 있는 정도를 평가하기 위한 것이다. 목표는 보상 시스템을 자극하는 맛있는 음식 펠릿(Reese's®)을 사용하는 훈련 세션 동안 마우스가 케이지의 이러한 측면에 구속된 후 케이지 한 측면에서 소비하는 시간을 증가시키기 위한 것이었다. 예비-시험을 사용하여 마우스가 기준선에서 임의의 구획에 대한 기존의 선호도를 가졌는지의 여부를 측정한다.
맛있는 식품(Reese's®)과 관련된 구획에서 소비한 시간에 관해 도 16에 나타낸 바와 같이, 조건화 세션은 ND PBS 마우스에서 예비 시험 동안 소비된 시간과 비교하여 시험 동안 이러한 구획에서 소비된 시간의 유의적인 증가를 유도하였다(P< 0.01). 이러한 효과는 또한 HFD PBS 마우스에서 관측되었지만 유의적인 효과는 더 낮았다(P<0.05). ND PG 마우스의 경우, 긍정적인 보강이 또한 예비시험 동안 구획 내에서 소비한 시간과 비교하여 시험 동안 구획 내에서 소비한 시간의 유의적인 증가에 의해 관측되었다(P<0.001).
흥미롭게도, HFD PG 그룹에서 파라박테로이데스 골드스테이니이의 투여는 예비시험 동안 구획 내에서 소비된 시간과 비교하여 시험 동안 구획 내에서 소비한 시간의 유의적인 증가에 의해 반영된 강력한 긍정적인 보강을 유도하였다(P<0.0001). 추가로, 시험 동안, HFD PG 마우스는 HFD PBS CPP 점수보다 유의적으로 더 높은 CPP 점수를 나타낸다(P<0.05).
이러한 결과는 식품과 관련된 보상 시스템 및 보상 시스템과 관련된 어떠한 다른 자극의 학습 구성성분에 대한 파라박테로이데스 골드스테이니이의 식이-의존적 효과를 뒷받침한다.
실시예 4:
물질 및 방법
1. 마우스 및 실험 설계
모든 마우스 실험은 특정 번호 2017/UCL/MD/005 하에 UCLouvain, Universit catholique de Louvain의 보건 부문의 동물 보호 윤리 위원회에 의해 승인되었고 지역 윤리 위원회의 지침 및 실험 동물의 보호에 관한 2013년 5월 29일자의 벨기에 법(Belfian Law)(계약 번호 LA1230314)에 따라 수행되었다.
9주령의 특정-기회감염 및 병원체가 없는(SOPF) 수컷 C57BL/6J 마우스(Janvier Laboratories, 프랑스 르 게네스-상-이슬)의 코호트를 제어된 환경(실온 22 ± 2℃, 12시간 일광 주기) 내에 케이지당 2마리의 마우스 그룹으로, 멸균 식품(방사선 조사) 및 멸균수를 자유롭게 접근하도록 하면서, 가두었다. 분만 시, 마우스는 일주일 동안 적응하도록 허용되었고, 이 동안 마우스에게 대조군 저-지방 식이(ctrl, AIN93Mi, Research Diet, 미국 뉴저지주 뉴 브룬스윅)을 제공하였다. 이후에, 마우스를 무작위로 4개 그룹(40 마리의 마우스, ND, HFD, ND SUCC, HFD SUCC로 명명된 n=10마리/그룹)으로 나누고, 대조군 저-지방 식이(ND)인, 10kcal% 지방(D1245Oji, Research Diet, 미국 뉴저지주 뉴 브룬스윅), 고-지방 식이(HFD)인, 60kcal% 지방(D12492i, Research Diet, 미국 뉴저지주 뉴 브룬스윅), 석신산나트륨(W327700, Sigma)가 5% w/w에서 보충된 ND 및 석신산나트륨이 5% w/w에서 보충된 HFD를 8주 동안 제공하였다. 나트륨 수준은 모든 식단에서 일치시켰다. 체중은 매주 기록하였다. 신체 조성을 7.5MHz 시간 영역-핵자기공명(TD-NMR, LF50 Minispec, Bruker, 독일 라인슈테텐)을 사용하여 매주 평가하였다. 4주간의 추적 관찰 후, 마우스를 행동 케이지(Phenotyper, Noldus, 네덜란드 바게닌겐)에 넣고 식품 선호도 시험 및 작동 벽 시험을 수행하였다. 이러한 마지막 시험 동안, 마우스를 앞서 기술된 바와 같이 식품을 제한하고 체중을 초기 체중의 85%(거동 시험 전)로 유지시켰다. 열량 제한은 자극에 대한 보상 반응을 강화시키도록 하였다.
2. 식품 선호도 시험
실시예 2 참고.
3. 작동 벽 시험
실시예 2 참고.
4. 통계적 분석
실시예 2 참고.
5. 다른 자극
식품, 예컨대, 알코올 또는 약물로부터의 명백한 보상 자극을 사용할 수 있다.
결과
1. 비만 표현형에 대한 석시네이트의 효과
비만 표현형에 대한 석시네이트의 효과를 평가하기 위하여, 마우스를 석신산나트륨이 5% w/w에서 보충되거나 보충되지 않은 ND 및 HFD에 8주 동안 ND SUCC/HFD SUCC 및 ND/HFD 그룹 각각에서 노출시켰다(도 17A-17B). 예측한 바와 같이, HDF를 제공한 마우스는 ND를 제공한 마우스와 비교하여 체중 및 지방 질량에서 유의적인 증가를 나타내었다. 또한, 석시네이트와 조합된 HFD 식이를 제공받은 마우스는 HDF 마우스와 비교하여 체중 및 지방 질량에서 유의적인 감소를 나타내었다. 석시네이트와 함해진 ND 식이는 ND 마우스와 비교하여 ND SUCC 마우스에서 체중에 유의적인 감소를 유도하였지만, 지방 질량에서 유의적인 변화는 관측되지 않았다.
이러한 결과는 식이-유도된 비만 맥락에서 석시네이트 보충의 잠재적인 유익한 효과를 강조한다.
2. 식품 보상의 좋아함 구성성분에 대한 석시네이트의 효과
쾌락 식품 섭취의 연구의 부분으로서, 식품 선호도 시험을 상이한 식이(ND 및 HFD)에 노출한지 4주째에 수행하였다. 이러한 시험 동안, 마우스를 대조군 식이(CT) 뿐만 아니라 맛있는 새로운 식이(HFHS)에 노출시킴으로써, 식품 보상 시스템의 "좋아함" 구성성분을 평가하였다(도 18). 대조군(CT) 및 HFHS의 섭취한 양과 비교하는 경우, ND 및 ND SUCC 그룹에서 마우스는 CT 식품보다 유의적으로 더 많은 HFHS를 먹는다(P<0.01; P<0.001). 그러나, ND와 ND SUCC 마우스 사이에 HFHS의 양 사이에 유의적인 차이는 관찰되지 않았다. HFD 마우스에 의한 CT 및 HFHS 소비의 경우, HFD SUCC 마우스와 대조적으로 유의적인 차이가 관측되지 않았다. HFD SUCC 마우스는 시험에서 CT보다 더 많은 HFHS를 소비하였지만, ND, ND SUCC 및 HFD 그룹에서의 마우스보다 더 많은 HFHS를 소비하였다(P<0.01 ND HFHS 대 HFD SUCC HFHS; P<0.05 ND SUCC HFHS 대 HFD SUCC HFHS; P<0.0001 HFD HFHS 대 HFD SUCC HFHS).
이러한 결과는 식품과 관련된 보상 시스템에서 좋아함 구성성분의 회복시 석시네이트의 잠재적인 관여를 강조한다.
이러한 결과는 섭식-관련 장애 치료의 맥락에서 특히 흥미롭다. 실제로, 보상 시스템의 좋아함 구성성분의 과소-자극은 쾌락적 자극을 획득하기 위해 증가된 식품 소비를 이끄는 것으로 알려져 있고; 결과적으로, 석시네이트는 섭식-관련 장애(예컨대, 비만 관련 장애, 폭식 등)에서 음식 소비를 줄이는 데 도움이 될 수 있다. 좋아함 구성성분에서 석시네이트의 효과는 또한 좋아함 구성성분이 조절 장애가 있는 다른 보상 조절 장애의 치료의 경우에 흥미로울 수 있다.
3. 식품 보상의 원함 구성성분에 대한 석시네이트의 효과
식품 보상 시스템의 다양한 구성성분 및 특히 식품 보상을 수득하기 위한 마우스의 동기부여(즉, 식품 섭취의 "원함" 구성성분)를 추가로 특성화하기 위하여, 작동 벽 시험을 수행하고 마우스의 동기부여를 점진적 비율 세션 동안 평가하였다(도 19).
이러한 시험은 PR2(P<0.05), PR3(P<0.01) 및 PR4 세션(P<0.001) 동안 ND 마우스와 비교하여 HFD 마우스의 석시네이트 펠렛을 수득하기 위해 활성 레버를 누르는 수에서의 유의적인 감소를 나타내었고, 이는, 비만의 맥락에서 보상 시스템 구성성분 "원함"과 관련된 거동에서의 결여를 반영한다. 상이한 점진적 비율 세션 중에 별도의 분석은 또한 PR2 동안 ND 마우스와 비교하여 PR1 및 PR2 동안 HFD SUC 및 HFD 마우스 사이의 활성 레버 누르기의 수에서 유의적인 증가 및 ND SUC 마우스의 활성 레버 누르기의 수에서의 유의적인 감소를 나타낸다.
이러한 시험은 비만 및 마른 상태에서 보상 시스템의 원함 구성성분에서 석시네이트의 효과를 나타낸다.
이러한 결과는 섭식-관련 장애를 치료하기 위한 석시네이트, 및 보다 일반적으로 원함 구성성분이 전형적으로 보상 자극을 향한 강박 거동을 갖는 환자에서 과-자극되는 조절 장애를 치료하기 위한 보상의 사용을 뒷받침한다.

Claims (15)

  1. 보상 조절 장애(reward dysregulation disorder)를 방지 및/또는 치료하는데 사용하기 위한, 파라박테로이데스(Parabacteroides) 속으로부터의 하나 이상의 세균 및/또는 이의 추출물 및/또는 이의 대사산물을 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 파라박테로이데스 속으로부터의 세균이 피. 디스타소니스(P. distasonis), 피. 골드스테이니이(P. goldsteinii), 피. 메르다에(P. merdae), 피. 악시디파시엔스(P. acidifaciens), 피. 보우체스두르호넨시스(P. bouchesdurhonensis), 피. 차르타에(P. chartae), 피, 친칠라(P. chinchilla), 피. 촌기이(P. chongii), 피, 파에시스(P. faecis), 피, 고르도니이(P. gordonii), 피, 존소니이(P. johnsonii), 피. 마씰리엔시스(P. massiliensis), 피, 파카엔시스(P. pacaensis), 피. 프로벤센시스(P. provencensis), 피. 티모넨시스(P. timonensis), 파라박테로이데스 종(Parabacteroides spp.) 및 이의 조합을 포함하거나 또는 이로 이루어진 그룹에서 선택되는, 사용하기 위한 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보상 조절 장애가 정신 장애(mental disorder), 신경 장애(neurological disorder), 및 이의 조합을 포함하거나 또는 이로 이루어진 그룹에서 선택되는, 사용하기 위한 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 정신 장애가 중독-관련 장애(addiction-related disorder), 섭식-관련 장애(eating-related disorder), 정동 장애(affective disorder), 강박 장애(obsessive compulsive disorder), 정신분열증(schizophrenia), 주의력 결핍 과잉 행동 장애(attention deficit hyperactivity disorder; ADHD), 자폐 스펙트럼 장애(autism spectrum disorder), 주요 우울 장애(major depressive disorder; MDD), 및 불안 장애(anxiety disorder) 등을 포함하거나 또는 이로 이루어진 그룹에서 선택되는, 사용하기 위한 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 섭식-관련 장애가 거식증(anorexia), 과식증(bulimia), 과체중-관련 장애(overweight-related disorder), 및 비만-관련 장애(obesity-related disorder) 등을 포함하거나 또는 이로 이루어진 그룹에서 선택되는, 사용하기 위한 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 중독-관련 장애가 알코올-관련 중독(alcohol-related addiction), 약물-관련 중독(drug-related addiction), 및 게임-관련 중독(game-related addiction) 등을 포함하거나 또는 이로 이루어진 그룹에서 선택되는, 사용하기 위한 조성물.
  7. 제3항에 있어서, 신경 장애가 파킨슨 질환(Parkinson's disease), 및 투렛 증후군(Tourette Syndrome) 등을 포함하거나 또는 이로 이루어진 그룹에서 선택되는, 사용하기 위한 조성물.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 동물 개체(animal individual), 바람직하게는 포유동물 개체, 보다 바람직하게는 사람 개체(human individual)에게 투여될 예정인, 사용하기 위한 조성물.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 경구적으로 또는 직장으로 투여될 예정인, 사용하기 위한 조성물.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 세균이 약 1Х102 CFU/g 내지 약 1Х1012 CFU/g의 조성물로 구성된 용량(dose)에서 투여될 예정인, 사용하기 위한 조성물.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 하나 이상의 유익한 미생물(들)을 추가로 포함하는, 사용하기 위한 조성물.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 유익한 미생물(들)이 클로스트리디아세아에(Clostridiaceae) 계열(family)로부터, 펩토스트렙토코카세아에(Peptostreptococcaceae) 계열로부터, 프레보텔라세아에(Prevotellaceae) 계열로부터, 메틸로박테리아세아에(Methylobacteriaceae) 계열로부터, 투리시박터(Turicibacter) 속으로부터, 코프로코쿠스(Coprococcus) 속으로부터, 노엘리아(Knoellia) 속으로부터, 프레보텔라(Prevotella) 속으로부터, 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 속으로부터, 악케르만시아세아에(Akkermansiaceae) 속으로부터의 세균 등을 포함하거나 또는 이로 이루어진 그룹에서 선택되는, 사용하기 위한 조성물.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 약제학적 조성물의 형태인, 사용하기 위한 조성물.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 영양학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 영양 조성물의 형태인, 사용하기 위한 조성물.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 상기 조성물을 투여하기 위한 수단을 추가로 포함하는, 키트(kit) 내에 포함되는, 사용하기 위한 조성물.
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