TW201907930A - 包含細菌菌株之組合物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供包含細菌菌株之組合物，其用於治療及預防中樞神經系統病症及病狀。

Description

包含細菌菌株之組合物
本發明係在包含自哺乳動物消化道分離之細菌菌株的組合物及此類組合物在疾病治療中之用途的領域內。
人類腸道在子宮內被認為是無菌的，但其在出生之後即刻暴露於各種各樣的母體及環境微生物。此後，發生微生物定植及演替之動態期受諸如遞送模式、環境、膳食及宿主基因型之因素的影響，所有此等因素均影響腸道微生物叢之組成，尤其在早期生活期間。隨後，微生物叢穩定且變得像成年一樣[1]。人類腸道微生物叢含有超過500-1000種不同種系型，基本上屬於兩種主要細菌類群：擬桿菌門及厚壁菌門[2]。由人類腸道之細菌定植產生的成功共生關係已產生多種代謝功能、結構功能、保護功能及其他有益功能。定植之腸道的增強的代謝活性確保以其他方式難消化之膳食組分得以降解，並且副產物之釋放為宿主提供重要營養來源。類似地，腸道微生物叢之免疫重要性為完全認可的且例示於具有受損之免疫系統的無菌動物中，該受損之免疫系統在引入共生細菌之後在功能上得以重建[3-5]。
人類微生物群系之大小及複雜性之發現已引起對許多健康及疾病概念之持續評估。當然，已在諸如炎性腸道疾病(IBD)之胃腸道病症中記錄了微生物叢組成之顯著變化[6-9]。最近，對關於在人類腦部疾病中可發揮病理生理學作用之腸道微生物群系之改變的技術的興趣有所增加[10]。臨床前及臨床證據強烈表明腦部發育與微生物叢之間的聯繫[11]。
愈來愈多之臨床前文獻證實腦部與腸道微生物群系之間涉及多個神 經分泌及內分泌信號傳導系統的雙向信號傳導。實際上，已將微生物群系中增加之梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium )種類含量與腦部病症相聯繫[12]，且在腦部發育病症中亦涉及擬桿菌門與厚壁菌門不平衡[13]。在免疫介導之中樞神經系統(CNS)病症中涉及改變含量之腸道共生物，包括雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、薩特氏菌屬(Sutterella)、普雷沃菌屬(Prevotella)及瘤胃球菌屬(Ruminococcus)之腸道共生物以及產鹼菌科(Alcaligenaceae)之腸道共生物之暗示因表明在患者與健康個體之間缺乏微生物叢改變之研究而受到懷疑[14]。此表明，目前，微生物群系與人類腦部疾病之間的聯繫的實際作用未得到充分表徵。因此，需要更多直接分析研究來鑑定改變微生物群系對CNS病症之治療性影響。
承認某些細菌菌株可能對動物腸道具有潛在積極影響，已建議將多種菌株用於治療各種疾病(參見例如[14-17])。另外，已建議將包括大部分乳桿菌屬及雙歧桿菌屬菌株之某些菌株用於治療不與腸道直接相關之各種炎性及自體免疫性疾病(關於綜述，參見[18]及[19])。此外，已在動物模型中研究了一系列益生菌，以確定腸道微生物群系在調節情緒行為中之作用，且雙歧桿菌屬及乳桿菌屬為顯示有益作用、減輕焦慮及重複行為且增加社交互動之主要屬[20-22]。然而，不同疾病與不同細菌菌株之間的關係以及特定細菌菌株對腸道及在全身性含量下以及對任何特定類型之疾病的精確作用未得到充分表徵，尤其對於中樞神經系統疾病來說。
存在愈來愈多之證據表明在自閉症譜系病症(ASD)及其他神經發育及神經精神病症中微生物叢-腸-腦軸受到影響。動物模型已提供對微生物叢如何可參與ASD之深入瞭解。此外，臨床前研究已證實在包括母體免疫活化(MIA)小鼠模型及黑褐色短尾(BTBR)小鼠之動物模型中通過投與有益活生物治療劑來靶向腸道微生物叢在改善孤獨症相關行為中展示功效。BTBR小鼠為基因修飾之 近交小鼠品系，展示許多與ASD相關之行為，諸如受損之社交性、重複行為及增加之焦慮。此外，此等小鼠亦展現胃腸功能失調以及腸道微生物叢組成之改變。因此，其代表用於研究微生物叢-腸-腦軸在ASD中之作用的適當動物模型。
因此，在此項技術中對治療中樞神經系統病症之新方法存在需要。亦需要表徵腸道細菌之潛在效應以使得可開發使用腸道細菌之新療法。
本發明人已開發用於治療及預防中樞神經系統病症之新療法。特定而言，本發明人已開發用於治療及預防由微生物叢-腸-腦軸介導之中樞神經系統病症及病狀的新療法。特定而言，本發明人已確定布勞特氏菌屬(Blautia )之細菌菌株可有效治療及預防由微生物叢-腸-腦軸介導之疾病及病狀。如實例中所描述，在自閉症譜系病症之小鼠模型中經口投與包含布勞特氏菌屬菌株之組合物可減輕與微生物叢-腸-腦軸之功能失調相關的症狀。此外，如實例中所描述，經口投與包含布勞特氏菌屬菌株之組合物可調節與微生物叢-腸-腦軸之功能相關之信號傳導分子的含量及神經發育及神經精神病症。
因此，在第一實施例中，本發明提供一種用於治療或預防中樞神經系統病症或病狀之方法中的包含布勞特氏菌屬之細菌菌株的組合物。在較佳實施例中，本發明提供一種用於治療或預防中樞神經系統病症或病狀之方法中的包含糞便布勞特氏菌(Blautia stercoris )種類之細菌菌株的組合物。使用糞便布勞特氏菌之組合物可對治療中樞神經系統病症或病狀尤其有效。在某些實施例中，本發明提供一種用於治療或預防中樞神經系統病症或病狀之方法中的包含韋克斯勒布勞特氏菌(Blautia wexlerae )種類之細菌菌株的組合物。在特定實施例中，中樞神經系統病症或病狀為由微生物叢-腸-腦軸介導的。在其他實施例中，本發明提供一種用於治療或預防神經發育障礙或神經精神病狀之方法中的包含布勞特氏菌屬之細菌菌株的組合物。在較佳實施例中，本發明提供一種用於治 療或預防神經發育障礙或神經精神病狀之方法中的包含糞便布勞特氏菌種類之細菌菌株的的組合物。使用糞便布勞特氏菌之組合物可對治療神經發育障礙或神經精神病狀尤其有效。在某些實施例中，本發明提供一種用於治療或預防神經發育障礙或神經精神病狀之方法中的包含韋克斯勒布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物。本發明人已確定用來自此屬之細菌菌株治療可在中樞神經系統病症，特定而言彼等由微生物叢-腸-腦軸介導之中樞神經系統病症的小鼠模型中提供臨床益處。本發明人已確定用來自此屬之細菌菌株治療可調節樞神經系統、自主神經系統及腸道神經系統中之信號傳導；可調節下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸路徑之活性；可調節神經內分泌及/或神經免疫路徑；及/或可調節共生代謝產物、炎性標記物之含量及/或個體之胃腸道滲透性。使用糞便布勞特氏菌之組合物可對調節樞神經系統、自主神經系統及腸道神經系統中之信號傳導；調節下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸路徑之活性；調節神經內分泌及/或神經免疫路徑；及/或調節共生代謝產物、炎性標記物之含量及/或個體之胃腸道滲透性尤其有效。在某些實施例中，使用韋克斯勒布勞特氏菌之組合物亦可為有效的。
在特定實施例中，本發明提供一種包含布勞特氏菌屬之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防選自由以下各項組成之群的疾病或病狀之方法中：自閉症譜系病症(ASD)；兒童發育障礙；強迫症(OCD)；重度抑鬱障礙；抑鬱；季節性情感障礙；焦慮障礙；慢性疲勞症候群(肌痛性腦脊髓炎)；壓力障礙；創傷後壓力障礙；精神分裂症譜系病症；精神分裂症；雙極性障礙；精神病；情緒障礙；癡呆；阿爾茨海默氏病(Alzheimer's)；帕金森氏病(Parkinson's disease)；及/或慢性疼痛。在其他實施例中，本發明之組合物可適用於治療或預防多發性硬化；運動神經元病；亨廷頓氏病(Huntington's disease)；格林-巴利症候群(Guillain-Barre syndrome)及/或腦膜炎。來自布勞特氏菌屬之細菌菌株對微生物叢-腸-腦軸及對由微生物叢-腸-腦軸介導之疾病的影響可為由微生物叢-腸-腦軸 介導之其他疾病及病狀，諸如上文所列之彼等疾病及病狀提供治療益處。在其他實施例中，本發明提供一種包含布勞特氏菌屬之細菌菌株的組合物，其用於治療與由微生物叢-腸-腦軸介導之疾病及病狀，諸如上文所列之彼等疾病及病狀相關之共病的方法中。在尤其較佳實施例中，本發明提供一種包含布勞特氏菌屬之細菌菌株的組合物，其用於治療與由微生物叢-腸-腦軸介導之疾病及病狀，諸如上文所列之彼等疾病及病狀相關之胃腸道共病的方法中。本申請案中所用之用於評估自閉症譜系病症之症狀的小鼠模型實驗在此項技術中已知可適用於評估其他中樞神經系統病症，包括上文所列之彼等中樞神經系統病症的症狀[23-25]。
在尤其較佳實施例中，本發明提供一種包含布勞特氏菌屬之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防諸如自閉症之自閉症譜系病症之方法中。本發明人已確定在自閉症譜系病症之小鼠模型中用布勞特氏菌屬菌株治療可減輕症狀嚴重程度且可預防或減輕刻板、重複、強迫及焦慮行為。在較佳實施例中，本發明提供一種包含布勞特氏菌屬之細菌菌株的組合物，其用於治療自閉症譜系病症。使用布勞特氏菌屬之組合物可對治療自閉症譜系病症尤其有效。在較佳實施例中，本發明提供一種用於減輕刻板、重複、強迫或焦慮行為，特定而言用於治療自閉症譜系病症之組合物。在較佳實施例中，本發明提供一種包含布勞特氏菌屬之細菌菌株的組合物，其用於治療自閉症譜系病症之行為症狀。在較佳實施例中，本發明提供一種包含布勞特氏菌屬之細菌菌株的組合物，其用於治療自閉症譜系病症之胃腸道症狀。在較佳實施例中，本發明提供一種包含布勞特氏菌屬之細菌菌株的組合物，其用於治療自閉症譜系病症之行為及胃腸道症狀。用布勞特氏菌屬菌株治療可調節中樞神經系統、自主神經系統及腸道神經系統中之信號傳導；可調節HPA軸路徑之活性；可調節神經內分泌及/或神經免疫路徑；及/或可調節共生代謝產物、炎性標記物之含量及/或個體之胃 腸道滲透性，自閉症譜系病症之神經病理學中涉及所有該等因素。在某些實施例中，用布勞特氏菌屬菌株治療可調節催產素及/或升壓素激素之含量。在較佳實施例中，本發明提供一種包含糞便布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於一種治療或預防自閉症譜系病症之方法中。使用糞便布勞特氏菌之組合物可對治療自閉症譜系病症尤其有效。在某些實施例中，本發明提供一種包含韋克斯勒布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防自閉症譜系病症之方法中。
在其他較佳實施例中，本發明提供一種包含布勞特氏菌屬之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防強迫症(OCD)之方法中。在較佳實施例中，本發明提供一種用於在OCD之治療中減輕刻板、重複、強迫或焦慮行為的組合物。用布勞特氏菌屬菌株治療可調節中樞神經系統、自主神經系統及腸道神經系統中之信號傳導；可調節HPA軸路徑之活性；可調節神經內分泌及/或神經免疫路徑；及/或可調節共生代謝產物之含量及/或個體之胃腸道滲透性，OCD之神經病理學中涉及所有該等因素。在較佳實施例中，本發明提供一種包含糞便布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防OCD之方法中。使用糞便布勞特氏菌之組合物可對治療OCD尤其有效。在某些實施例中，本發明提供一種包含韋克斯勒布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防OCD之方法中。
在其他較佳實施例中，本發明提供一種包含布勞特氏菌屬之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防重度抑鬱障礙(MDD)之方法中。用布勞特氏菌屬菌株治療可在抑鬱小鼠模型中提供臨床益處。在較佳實施例中，本發明提供一種包含布勞特氏菌屬之細菌菌株的組合物，其用於治療抑鬱。使用布勞特氏菌屬菌株之組合物可對治療抑鬱尤其有效。在較佳實施例中，本發明提供一種用於在抑鬱之治療中減輕刻板、重複、強迫或焦慮行為的組合物。用布勞特氏 菌屬菌株治療可調節中樞神經系統、自主神經系統及腸道神經系統中之信號傳導；可調節HPA軸路徑之活性；可調節神經內分泌及/或神經免疫路徑；且可調節共生代謝產物、炎性標記物之含量及/或個體之胃腸道滲透性，MDD之神經病理學中涉及所有該等因素。在某些實施例中，用布勞特氏菌屬菌株治療可調節催產素及/或升壓素激素之含量。在較佳實施例中，本發明提供一種包含糞便布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防MDD之方法中。使用糞便布勞特氏菌之組合物可對治療MDD尤其有效。在某些實施例中，本發明提供一種包含韋克斯勒布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防MDD之方法中。
在其他較佳實施例中，本發明提供一種包含布勞特氏菌屬之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防焦慮障礙之方法中。在本申請案之實例中在焦慮症之小鼠模型中用布勞特氏菌屬菌株治療降低發病率及疾病嚴重程度。在較佳實施例中，本發明提供一種包含布勞特氏菌屬之細菌菌株的組合物，其用於治療焦慮障礙。使用布勞特氏菌屬菌株之組合物可對治療焦慮障礙尤其有效。在較佳實施例中，本發明提供一種用於在焦慮症之治療中減輕刻板、重複、強迫或焦慮行為的組合物。在較佳實施例中，本發明提供一種包含糞便布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防焦慮障礙之方法中。使用糞便布勞特氏菌之組合物可對治療焦慮障礙尤其有效。在某些實施例中，本發明提供一種包含韋克斯勒布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防焦慮障礙之方法中。
在其他較佳實施例中，本發明提供一種包含布勞特氏菌屬之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防諸如創傷後壓力障礙之壓力障礙的方法中。在壓力障礙之小鼠模型中包含布勞特氏菌屬之細菌菌株的組合物可減小壓力。用布勞特氏菌屬菌株治療可調節中樞神經系統、自主神經系統及腸道神經系統中 之信號傳導；可調節HPA軸路徑之活性；可調節神經內分泌及/或神經免疫路徑；且可調節共生代謝產物、炎性標記物之含量及/或個體之胃腸道滲透性，壓力障礙之神經病理學中涉及所有該等因素。在某些實施例中，用布勞特氏菌屬菌株治療可調節催產素及/或升壓素激素之含量。在較佳實施例中，本發明提供一種包含糞便布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防壓力障礙之方法中。使用糞便布勞特氏菌之組合物可對治療壓力障礙尤其有效。在某些實施例中，本發明提供一種包含韋克斯勒布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防壓力障礙之方法中。
在其他較佳實施例中，本發明提供一種包含布勞特氏菌屬之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防諸如精神分裂症之精神分裂症譜系及精神病性障礙的方法中。包含布勞特氏菌屬之細菌菌株的組合物可改善精神分裂症譜系及精神病性障礙之小鼠模型中的陽性及陰性症狀。用布勞特氏菌屬菌株治療可調節中樞神經系統、自主神經系統及腸道神經系統中之信號傳導；可調節HPA軸路徑之活性；可調節神經內分泌及/或神經免疫路徑；且可調節共生代謝產物之含量及/或個體之胃腸道滲透性，精神分裂症譜系及精神病性障礙之神經病理學中涉及所有該等因素。在較佳實施例中，本發明提供一種包含糞便布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防精神分裂症譜系及精神病性障礙之方法中。使用糞便布勞特氏菌之組合物可對治療精神分裂症譜系及精神病性障礙尤其有效。在某些實施例中，本發明提供一種包含韋克斯勒布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防精神分裂症譜系及精神病性障礙之方法中。
在其他較佳實施例中，本發明提供一種包含布勞特氏菌屬之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防雙極性障礙之方法中。包含布勞特氏菌屬之細菌菌株的組合物在雙極性障礙之小鼠模型中可減少躁狂症及/或抑鬱症的發生。 用布勞特氏菌屬菌株治療可調節中樞神經系統、自主神經系統及腸道神經系統中之信號傳導；可調節HPA軸路徑之活性；可調節神經內分泌及/或神經免疫路徑；且可調節共生代謝產物、炎性標記物之含量及/或個體之胃腸道滲透性，雙極性障礙之神經病理學中涉及所有該等因素。在某些實施例中，用布勞特氏菌屬菌株治療可調節催產素及/或升壓素激素之含量。在較佳實施例中，本發明提供一種包含糞便布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防雙極性障礙之方法中。使用糞便布勞特氏菌之組合物可對治療雙極性障礙尤其有效。在某些實施例中，本發明提供一種包含韋克斯勒布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防雙極性障礙之方法中。
在其他較佳實施例中，本發明提供一種包含布勞特氏菌屬之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防諸如阿爾茨海默氏病之神經認知障礙的方法中。包含布勞特氏菌屬種類之細菌菌株的組合物在神經認知障礙之小鼠模型中可改善認知及行為功能。用布勞特氏菌屬菌株治療可調節中樞神經系統、自主神經系統及腸道神經系統中之信號傳導；可調節HPA軸路徑之活性；可調節神經內分泌及/或神經免疫路徑；且可調節共生代謝產物之含量及/或個體之胃腸道滲透性，神經認知障礙之神經病理學中涉及所有該等因素。在較佳實施例中，本發明提供一種包含糞便布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防神經認知障礙之方法中。使用糞便布勞特氏菌之組合物可對治療神經認知障礙尤其有效。在某些實施例中，本發明提供一種包含韋克斯勒布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防神經認知障礙之方法中。
在其他較佳實施例中，本發明提供一種包含布勞特氏菌屬之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防帕金森氏病之方法中。包含布勞特氏菌屬之細菌菌株的組合物在帕金森氏病之小鼠模型中可改善運動及認知功能。用布勞特氏菌屬菌株治療可調節中樞神經系統、自主神經系統及腸道神經系統中之信號 傳導；可調節HPA軸路徑之活性；可調節神經內分泌及/或神經免疫路徑；且可調節共生代謝產物、炎性標記物之含量及/或個體之胃腸道滲透性，帕金森氏病之神經病理學中涉及所有該等因素。在某些實施例中，用布勞特氏菌屬菌株治療可調節催產素及/或升壓素激素之含量。在較佳實施例中，本發明提供一種包含糞便布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防帕金森氏病之方法中。使用糞便布勞特氏菌之組合物可對治療帕金森氏病尤其有效。在某些實施例中，本發明提供一種包含韋克斯勒布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防帕金森氏病之方法中。
在某些實施例中，本發明提供一種包含嗜氫布勞特氏菌(Blautia hydrogenotrophica )種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防中樞神經系統病症或病狀之方法中。使用嗜氫布勞特氏菌之組合物可對治療中樞神經系統病症或病狀尤其有效。
在某些實施例中，本發明提供一種包含嗜氫布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防神經發育障礙或神經精神病狀之方法中。使用嗜氫布勞特氏菌之組合物可對治療神經發育障礙或神經精神病狀尤其有效。
使用嗜氫布勞特氏菌之組合物可對調節中樞神經系統、自主神經系統及腸道神經系統中之信號傳導；調節下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸路徑之活性；調節神經內分泌及/或神經免疫路徑；及/或調節共生代謝產物、炎性標記物之含量及/或個體之胃腸道滲透性尤其有效。在一尤其較佳實施例中，嗜氫布勞特氏菌調節丁酸鹽之含量。在某些實施例中，丁酸鹽含量之調節可治療或預防中樞神經系統病症或病狀。
在某些實施例中，本發明提供一種包含嗜氫布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防自閉症譜系病症之方法中。使用嗜氫布勞特氏菌之組合物可對治療自閉症譜系病症尤其有效。
在某些實施例中，本發明提供一種包含嗜氫布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防OCD之方法中。使用嗜氫布勞特氏菌之組合物可對治療OCD尤其有效。
在某些實施例中，本發明提供一種包含嗜氫布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防MDD之方法中。使用嗜氫布勞特氏菌之組合物可對治療MDD尤其有效。
在某些實施例中，本發明提供一種包含嗜氫布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防焦慮障礙之方法中。使用嗜氫布勞特氏菌之組合物可對治療焦慮障礙尤其有效。
在某些實施例中，本發明提供一種包含嗜氫布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防壓力障礙之方法中。使用嗜氫布勞特氏菌之組合物可對治療壓力障礙尤其有效。
在某些實施例中，本發明提供一種包含嗜氫布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防精神分裂症譜系及精神病性障礙之方法中。使用嗜氫布勞特氏菌之組合物可對治療精神分裂症譜系及精神病性障礙尤其有效。
在某些實施例中，本發明提供一種包含嗜氫布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防雙極性障礙之方法中。使用嗜氫布勞特氏菌之組合物可對治療雙極性障礙尤其有效。
在某些實施例中，本發明提供一種包含嗜氫布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防神經認知障礙之方法中。使用嗜氫布勞特氏菌之組合物可對治療神經認知障礙尤其有效。
在某些實施例中，本發明提供一種包含嗜氫布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防帕金森氏病之方法中。使用嗜氫布勞特氏菌 之組合物可對治療帕金森氏病尤其有效。
在某些實施例中，本發明之組合物係用於在由微生物叢-腸-腦軸介導之疾病或病狀之治療或預防中調節微生物叢-腸-腦軸之方法中。特定而言，本發明之組合物可用於在自閉症譜系病症；強迫症；重度抑鬱障礙；焦慮障礙；壓力障礙；精神分裂症譜系病症；雙極性障礙；神經認知障礙及帕金森氏病之治療或預防中調節微生物叢-腸-腦軸。
在本發明之較佳實施例中，組合物中之細菌菌株屬於糞便布勞特氏菌。亦可使用密切相關之菌株，諸如具有與糞便布勞特氏菌之細菌菌株的16s rRNA序列至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列的細菌菌株。較佳地，細菌菌株具有與SEQ ID NO：1或2至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列。較佳地，序列一致性係對於SEQ ID NO：2。較佳地，用於本發明中之細菌菌株具有由SEQ ID NO：2表示之16s rRNA序列。
在本發明之較佳實施例中，組合物中之細菌菌株屬於韋克斯勒布勞特氏菌。亦可使用密切相關之菌株，諸如具有與韋克斯勒布勞特氏菌之細菌菌株的16s rRNA序列至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列的細菌菌株。較佳地，細菌菌株具有與SEQ ID NO：3或4至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列。較佳地，序列一致性係對於SEQ ID NO：4。較佳地，用於本發明中之細菌菌株具有由SEQ ID NO：4表示之16s rRNA序列。
在本發明之較佳實施例中，組合物中之細菌菌株屬於嗜氫布勞特氏菌。亦可使用密切相關之菌株，諸如具有與嗜氫布勞特氏菌之細菌菌株的16s rRNA序列至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列的細菌菌株。較佳地，細菌菌株具有與SEQ ID NO：7至少95%、96%、97%、 98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列。最佳地，組合物中之細菌菌株為以登錄號DSM 10507/14294保藏之嗜氫布勞特氏菌菌株。
在某些實施例中，本發明之組合物係用於經口投與。經口投與本發明菌株可有效治療中樞神經系統病症及病狀，特定而言由微生物叢-腸-腦軸介導之彼等中樞神經系統病症及病狀。另外，經口投與對於患者及從業者來說為方便的且允許遞送至腸道及/或部分或全部定植於腸道。
在某些實施例中，本發明之組合物包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。
在某些實施例中，本發明之組合物包含已凍乾之細菌菌株。凍乾為用於製備允許遞送細菌之穩定組合物的有效且方便之技術。
在某些實施例中，本發明提供一種包含如上文所描述之組合物的食物產品。
在某些實施例中，本發明提供一種包含如上文所描述之組合物的疫苗組合物。
另外，本發明提供一種治療或預防由微生物叢-腸-腦軸功能失調介導之疾病或病狀的方法，該方法包括投與包含布勞特氏菌屬之細菌菌株的組合物。
在研發以上發明時，本發明人已鑑定及表徵尤其適合用於治療之細菌菌株。本發明之糞便布勞特氏菌菌株顯示有效治療本文所描述之疾病，諸如自閉症譜系病症。因此，在另一態樣中，本發明提供一種以登錄號NCIMB 42381保藏之糞便布勞特氏菌菌株或其衍生物的細胞。本發明亦提供包含此類細胞之組合物，或此類細胞之生物純培養物。本發明亦提供一種以登錄號NCIMB 42381保藏之糞便布勞特氏菌菌株或其衍生物的細胞，其用於特定而言針對本文所描述之疾病的療法中。
在尤其較佳實施例中，本發明提供一種包含以登錄號NCIMB 42381 保藏之菌株的組合物，其用於治療或預防中樞神經系統病症或病狀之方法中。在尤其較佳實施例中，本發明提供一種包含以登錄號NCIMB 42381保藏之菌株的組合物，其用於治療或預防神經發育障礙或神經精神病狀之方法中。在尤其較佳實施例中，本發明提供一種包含以登錄號NCIMB 42381保藏之菌株的組合物，其用於治療或預防自閉症譜系病症或較佳為自閉症之方法中。在尤其較佳實施例中，本發明提供一種包含以登錄號NCIMB 42381保藏之菌株的組合物，其用於尤其在自閉症之治療中減輕刻板、重複、強迫或焦慮行為的方法中。
在研發以上發明時，本發明人已鑑定及表徵對於療法尤其適用之另一細菌菌株。本發明之韋克斯勒布勞特氏菌菌株顯示有效治療本文所描述之疾病，諸如自閉症譜系病症。因此，在另一態樣中，本發明提供一種以登錄號NCIMB 42486保藏之韋克斯勒布勞特氏菌菌株或其衍生物的細胞。本發明亦提供包含此類細胞之組合物，或此類細胞之生物純培養物。本發明亦提供一種以登錄號NCIMB 42486保藏之韋克斯勒布勞特氏菌菌株或其衍生物的細胞，其用於特定而言針對本文所描述之疾病的療法中。
在尤其較佳實施例中，本發明提供一種包含以登錄號NCIMB 42486保藏之菌株的組合物，其用於治療或預防中樞神經系統病症或病狀之方法中。在尤其較佳實施例中，本發明提供一種包含以登錄號NCIMB 42486保藏之菌株的組合物，其用於治療或預防神經發育障礙或神經精神病狀之方法中。在尤其較佳實施例中，本發明提供一種包含以登錄號NCIMB 42486保藏之菌株的組合物，其用於治療或預防自閉症譜系病症或較佳為自閉症之方法中。在尤其較佳實施例中，本發明提供一種包含以登錄號NCIMB 42486保藏之菌株的組合物，其用於尤其在自閉症之治療中減輕刻板、重複、強迫或焦慮行為的方法中。
在研發以上發明時，本發明人已鑑定及表徵尤其適合用於治療之細菌菌株。本發明之嗜氫布勞特氏菌菌株顯示有效治療本文所描述之疾病，諸如 自閉症譜系病症。因此，在另一態樣中，本發明提供一種以登錄號DSM 10507/14294保藏之嗜氫布勞特氏菌菌株或其衍生物的細胞。本發明亦提供包含此類細胞之組合物，或此類細胞之生物純培養物。本發明亦提供一種以登錄號DSM 10507/14294保藏之嗜氫布勞特氏菌菌株或其衍生物的細胞，其用於特定而言針對本文所描述之疾病的療法中。
在尤其較佳實施例中，本發明提供一種包含以登錄號DSM 10507/14294保藏之菌株的組合物，其用於治療或預防中樞神經系統病症或病狀之方法中。在尤其較佳實施例中，本發明提供包含以登錄號DSM 10507/14294保藏之菌株的組合物，其用於治療或預防神經發育障礙或神經精神病狀之方法中。在尤其較佳實施例中，本發明提供一種包含以登錄號DSM 10507/14294保藏之菌株的組合物，其用於治療或預防自閉症譜系病症或較佳為自閉症之方法中。在尤其較佳實施例中，本發明提供一種包含以登錄號DSM 10507/14294保藏之菌株的組合物，其用於尤其在自閉症之治療中減輕刻板、重複、強迫或焦慮行為的方法中。
圖1 ：在3-室測試中用MRX006處理對C57Bl/6小鼠之影響。*p<0.05，新穎相較於熟悉(A)，且**p<0.01，物體相較於動物(B)。
圖2 ：在強迫游泳測試中用MRX006處理對C57Bl/6小鼠之影響。Mrx006顯著不同於媒劑組，**p<0.01；媒劑組顯著不同於原初組，##p<0.01。
圖3 ：在懸尾測試中用MRX006處理對C57Bl/6小鼠之影響。
圖4 ：在恐懼條件化測試中用MRX006處理對C57Bl/6小鼠之影響。*MRX006顯著不同於媒劑組；#媒劑顯著不同於原初組；*p<0.05，#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001。
圖5 ：在新穎物體識別測試中用MRX006處理對C57Bl/6小鼠之影 響。#，相較於組內之熟悉物體顯著不同；#p<0.05。
圖6 ：在埋珠測試中用MRX006處理對C57Bl/6小鼠之影響。
圖7 ：在高架十字迷宮測試中用MRX006處理對C57Bl/6小鼠之影響。
圖8 ：用MRX006處理對C57Bl/6小鼠中壓力誘導之體溫過高的影響。#媒劑組顯著不同於原初組，#p<0.05。
圖9 ：用MRX006處理對C57Bl/6小鼠中之循環催產素含量的影響。*Mrx006顯著不同於媒劑組；*p<0.05。
圖10 ：用MRX006處理對C57Bl/6小鼠中之皮質固酮血漿含量的影響。#顯著不同於原初(A)或媒劑(B)組；*p<0.05。
圖11 ：用MRXO06處理對C57Bl/6小鼠之腸道滲透性的影響。
圖12 ：用MRX006處理對C57Bl/6小鼠之器官重量及結腸長度的影響。
圖13 ：在三室社交互動測試中用MRX006處理對BTBR小鼠之影響。##p<0.01，相對於組內之各別小鼠。###p<0.001，相對於組內之各別小鼠。*p<0.05，相對於媒劑組。
圖14 ：在強迫入侵者測試中用MRX006處理對BTBR小鼠之影響。
圖15 ：在埋珠測試中用MRX006處理對BTBR小鼠之影響。*p<0.05，如藉由事前比較相對於媒劑組所測定。
圖16 ：在梳理測試中用MRX006處理對BTBR小鼠之影響。*p<0.05，相對於媒劑組。**p<0.01，如藉由事前比較相對於媒劑組所揭示。
圖17 ：在高架十字迷宮測試中用MRX006處理對BTBR小鼠之影響。
圖18 ：在曠場場地中用MRX006處理對BTBR小鼠之影響。*p<0.05，相對於媒劑組。
圖19 ：在強迫游泳測試中用MRX006處理對BTBR小鼠之影響。
圖20 ：在雌性尿液嗅聞測試中用MRX006處理對BTBR小鼠之影響。#p<0.05，相對於水媒劑組。**p<0.01，相對於媒劑組。
圖21 ：在新穎物體識別測試中用MRX006處理對BTBR小鼠之影響。
圖22 ：用MRX006處理對BTBR小鼠之離體胃腸道滲透性的影響。
圖23 ：用MRX006處理對BTBR小鼠之活體內胃腸道滲透性的影響。
圖24 ：用MRX006處理對BTBR小鼠之活體內胃腸道活力的影響。*p<0.05，如藉由事前比較相對於媒劑組所揭示。
圖25 ：用MRX006處理對BTBR小鼠中之壓力誘導之皮質固酮血漿含量的影響。
圖26 ：用MRX006處理對BTBR小鼠之器官重量及結腸長度的影響。
圖27 用MRX006處理對BTBR小鼠隨時間推移之重量的影響。
圖28 ：在MIA小鼠模型中用Mrx006長期處理使埋藏彈珠之數目減少。#p<0.05，相對於對照組；**p<0.01，相對於媒劑MIA組。
圖29 ：在食物偏好社交傳遞測試中用MRX006長期處理對MIA小鼠之社交性的影響。
圖30 ：用MRX006長期處理使MIA小鼠中由暴露於曠場場地引起之壓力誘導之自主活動減弱。##p<0.01，相對於對照組，*p<0.05，相對於媒劑MIA組。
圖31 ：在雌性尿液嗅聞測試中用MRX006長期處理對MIA小鼠之抑鬱樣行為的影響。&p<0.05相對於各別水組。
圖32 ：用MRX006處理對MIA小鼠之活體內胃腸道活力的影響。
圖33 ：用MRX006處理對MIA小鼠之器官重量及結腸長度的影響。
圖34 ：用MRX006處理對BTBR小鼠中之循環細胞因子濃度的影響。
圖35 ：在埋珠測試中用MRX008處理對MIA小鼠之影響。##p<0.01，相對於對照組。
圖36 ：在食物偏好社交傳遞測試中用MRX008長期處理對MIA小鼠之影響。
圖37 ：在強迫游泳測試中用MRX008長期處理對MIA小鼠之影響。
圖38 ：用MRX008長期處理對腸道滲透性之影響。
圖39 ：用MRX008長期處理對腸道活力之影響。##p<0.01，相對於對照組。
圖40 ：在食物偏好社交傳遞測試中用MRX008長期處理對BTBR小鼠之影響。
圖41 ：在強迫入侵者測試中用MRX008長期處理對BTBR小鼠之影響。
圖42 ：在埋珠測試中用MRX008長期處理對BTBR小鼠之影響。
圖43 ：在高架十字迷宮中用MRX008長期處理對BTBR小鼠之影響。
圖44 ：在曠場場地中用MRX008長期處理對BTBR小鼠之影響。*p<0.05，如藉由事前成對比較相對於媒劑組所揭示。
圖45 ：在強迫游泳測試中用MRX008長期處理對BTBR小鼠之影響。
圖46 ：在雌性尿液嗅聞測試中用MRX008長期處理對BTBR小鼠之抑鬱樣行為的影響。##p<0.01，相對於水媒劑組。
圖47 ：用MRX008長期處理對BTBR小鼠之活體內腸道活力的影響。
圖48 ：用MRX008長期處理對BTBR小鼠中之選擇性解剖學標記物的影響。
圖49 ：用MRX006長期處理對BTBR小鼠之下丘腦中的催產素、升壓素及其各別受體之表現的影響。*p<0.05，相對於媒劑組。
圖50 ：用MRX006長期處理對BTBR小鼠之杏仁核中的催產素、升壓素及其各別受體之表現的影響。*p<0.05，相對於媒劑組。
圖51 ：在曠場場地中用嗜氫布勞特氏菌及丁酸鹽長期處理對BTBR小鼠之影響。圖51B、51D、51F及51H中之資料分別與圖51A、51C、51E及51G中之資料相同，除了已將PBS 及LYO 對照數值彙集在一起。p<0.05：*，相較於C57BL/6(相同處理，在適用之情況下)；#，相較於PBS相同基因型；§ BTBR：But相較於PBS或Bact相較於Lyo。PBS為丁酸鹽投與之陰性對照；LYO為細菌(嗜氫布勞特氏菌)投與之陰性對照；BUT為丁酸鹽之實驗投與；BACT為嗜氫布勞特氏菌之實驗投與。
圖52 ：在埋珠測試中用嗜氫布勞特氏菌及丁酸鹽長期處理對BTBR小鼠之影響。圖52B中之資料與圖52A中之資料相同，除了已將PBS 及LYO 對照數值彙集在一起。p<0.05：*，相較於C57BL/6(相同處理，在適用之情況下)；#，相較於PBS相同基因型；§ BTBR：But相較於PBS或Bact相較於Lyo。PBS為丁酸鹽投與之陰性對照；LYO為細菌(嗜氫布勞特氏菌)投與之陰性對照；BUT為丁酸鹽之實驗投與；BACT為嗜氫布勞特氏菌之實驗投與。
圖53 ：在挖掘測試中用嗜氫布勞特氏菌及丁酸鹽長期處理對BTBR小鼠之影響。圖53A顯示挖掘所用時間，而圖53B顯示挖掘次數。p<0.05：*，相較於C57BL/6(相同處理，在適用之情況下)；#，相較於PBS相同基因型；§ BTBR：But相較於PBS或Bact相較於Lyo。PBS為丁酸鹽投與之陰性對照；LYO為細菌(嗜氫布勞特氏菌)投與之陰性對照；BUT為丁酸鹽之實驗投與；BACT為嗜氫布勞特氏菌之實驗投與。
圖54 ：在自我梳理測試中用嗜氫布勞特氏菌及丁酸鹽長期處理對BTBR小鼠之影響。圖54A顯示梳理所用時間；圖54C顯示梳理次數，且圖54E顯示每一次之梳理所用時間。圖54B、54D及54F中之資料分別與圖54A、54C 及54E相同，除了已將PBS 及LYO 對照數值彙集在一起。p<0.05：*，相較於C57BL/6(相同處理，在適用之情況下)；#，相較於PBS相同基因型；§ BTBR：But相較於PBS或Bact相較於Lyo。PBS為丁酸鹽投與之陰性對照；LYO為細菌(嗜氫布勞特氏菌)投與之陰性對照；BUT為丁酸鹽之實驗投與；BACT為嗜氫布勞特氏菌之實驗投與。
圖55 ：嗜氫布勞特氏菌(每天1010 個持續14天)對健康HIM大鼠之盲腸內容物中的短鏈脂肪酸產量(RMN1 H)之影響。
圖56 ：用包含嗜氫布勞特氏菌(BlautiX)之組合物處理28天或未用其處理之IBS-HMA大鼠的糞便樣品中之嗜氫布勞特氏菌群體的qPCR評估。
圖57 ：用嗜氫布勞特氏菌(Blautix)處理28天或未用其處理之IBS-HMA大鼠的盲腸樣品中之短鏈脂肪酸(SCFA)濃度。圖57A 顯示總SCFA之濃度。圖57B 顯示乙酸、丙酸及丁酸之濃度。
圖58 ：在三室測試中用嗜氫布勞特氏菌及丁酸鹽長期處理對BTBR小鼠之影響。圖58A顯示投與對社交性(嗅聞物體或另一小鼠之偏好)之影響，而圖58B顯示社交新穎性之偏好(亦即相較於熟悉小鼠嗅聞新的小鼠)。p<0.05：S，相較於50%；*，相較於C57BL/6(相同處理，在適用之情況下)；#，相較於PBS相同基因型；§ BTBR：But相較於PBS或Bact相較於Lyo。PBS為丁酸鹽投與之陰性對照；LYO為細菌(嗜氫布勞特氏菌)投與之陰性對照；BUT為丁酸鹽之實驗投與；BACT為嗜氫布勞特氏菌之實驗投與。
圖59 ：用MRX006長期處理對下丘腦細胞株中催產素及催產素受體之表現的影響。
圖60 ：在BALBc小鼠模型中用MRX006長期處理對結腸中之離體胃腸道滲透性及緊密連接表現的影響。
圖61 ：在BALBc小鼠模型中用MRX006長期處理對迴腸中之離體胃腸道滲透性及緊密連接表現的影響。
圖62 ：在BALBc小鼠模型中用MRX006長期處理對盲腸短鏈脂肪酸產量之影響。
圖63 ：在BALBc小鼠模型中用MRX006長期處理對脾細胞之細胞因子表現的影響。
圖64 ：在BALBc小鼠模型中用MRX006長期處理對胺基酸之血漿含量的影響。
圖65 ：在BALBc小鼠模型中用MRX006長期處理對腦幹中之神經遞質含量的影響。
圖66 ：在BALBc小鼠模型中用MRX006長期處理對海馬神經遞質受體之基因表現的影響。
圖67 ：在BALBc小鼠模型中用MRX006長期處理對杏仁核神經遞質受體之基因表現的影響。
圖68 ：在BALBc小鼠模型中用MRX006長期處理對前額葉皮質神經遞質受體之基因表現的影響。
圖69 ：在BALBc小鼠模型中用MRX006長期處理對海馬中炎性標記物之基因表現的影響。
圖70 ：在BALBc小鼠模型中用MRX006長期處理對杏仁核中炎性標記物之基因表現的影響。
圖71 ：在BALBc小鼠模型中用MRX006長期處理對前額葉皮質中炎性標記物之基因表現的影響。
圖72 ：在BALBc小鼠模型中用MRX006長期處理對海馬內分泌標記物之基因表現的影響。
圖73 ：在BALBc小鼠模型中用MRX006長期處理對杏仁核內分泌標記物之基因表現的影響。
圖74 ：在BALBc小鼠模型中用MRX006長期處理對前額葉皮質內分泌標記物之基因表現的影響。
圖75 ：在MIA小鼠模型中用MRX006長期處理對結腸及迴腸之活體內胃腸道滲透性之影響。
圖76 ：在MIA小鼠中在三室社交互動測試中用MRX006處理對社交新穎性之影響。
圖77 ：在MIA小鼠中在三室社交互動測試中用MRX006處理對社交偏好之影響。
圖78 ：在梳理測試中用MRX006處理對MIA小鼠之影響。
圖79 ：在高架十字迷宮測試中用MRX006處理對MIA小鼠之影響。
圖80 ：在強迫游泳測試中用MRX006處理對MIA小鼠之影響。
圖81 ：用MRX006處理對MIA小鼠中之壓力誘導之皮質固酮血漿含量的影響。
 細菌菌株
本發明之組合物包含布勞特氏菌屬之細菌菌株。實例證實此種類之細菌適用於治療或預防由微生物叢-腸-腦軸介導之自閉症譜系病症及中樞神經系統病症。本申請案中用於評估自閉症譜系病症之症狀的小鼠模型實驗在此項技術中已知可適用於評估包括上文所列之彼等的其他中樞神經系統病症之症狀。
本發明提供一種包含布勞特氏菌屬之細菌菌株的組合物，其用於療法中，例如用於治療或預防中樞神經系統病症或病狀，特定而言為由微生物叢-腸-腦軸介導之中樞神經系統病症或病狀。在某些實施例中，本發明之組合物包含布勞特氏菌屬之菌株且不含任何其他細菌屬。在某些實施例中，本發明之組 合物包含布勞特氏菌屬之單一菌株且不含任何其他細菌菌株、屬或種類。
用於本發明中之布勞特氏菌屬菌株之實例包括糞便布勞特氏菌、糞布勞特氏菌(B.faecis )、球形布勞特氏菌(B.coccoides )、哥魯色布勞特氏菌(B.glucerasea )、漢遜布勞特氏菌(B.hansenii )、嗜氫布勞特氏菌、魯提布勞特氏菌(B.luti )、延長布勞特氏菌(B.producta )、施氏布勞特氏菌(B.schinkii )及韋克斯勒布勞特氏菌。較佳種類為糞便布勞特氏菌、韋克斯勒布勞特氏菌及嗜氫布勞特氏菌。布勞特氏菌屬種類為革蘭氏反應陽性、非能動細菌，其可為球形或橢圓形的且全部為產生乙酸作為葡萄糖醱酵之主要終產物的專性厭氧微生物[26]。布勞特氏菌屬可自人類腸道分離，不過延長布勞特氏菌係自敗血病樣品分離。糞便布勞特氏菌菌株GAM6-1T 之16S rRNA基因序列的GenBank登錄號為HM626177(本文中以SEQ ID NO：1形式揭示)。示例性糞便布勞特氏菌菌株描述於[27]中。韋克斯勒布勞特氏菌之典型菌株為WAL 14507=ATCC BAA-1564=DSM 19850[28]。韋克斯勒布勞特氏菌菌株WAL 14507 T之16S rRNA基因序列的GenBank登錄號為EF036467(在本文中以SEQ ID NO：3形式揭示)。此示例性韋克斯勒布勞特氏菌菌株描述於[28]中。
實例中測試了以登錄號NCIMB 42381保藏之糞便布勞特氏菌細菌且本文中亦稱為MRX006(菌株830)。術語「MRX006」、「MRx0006」、「Mrx006」、「Mrx0006」及菌株830在本文中可互換使用。所測試之MRX006(830菌株)之16S rRNA序列提供於SEQ ID NO：2中。MRX006(菌株830)係由GT Biologics Ltd.(Life Sciences Innovation Building,Aberdeen,AB25 2ZS,Scotland)於2015年3月12日以「糞便布勞特氏菌830」形式保藏於國際保藏機構NCIMB,Ltd.(Ferguson Building,Aberdeen,AB21 9YA,Scotland)且分配登錄號NCIMB 42381。GT Biologics Ltd.後來更名為4D Pharma Research Limited。
MRX006(菌株830)之基因組包含染色體及質粒。MRX006(菌株830) 之染色體序列提供於SEQ ID NO：5中。MRX006(菌株830)之質粒序列提供於SEQ ID NO：6中。此等序列係使用PacBio RS II平台產生。
實例中測試了以登錄號NCIMB 42486保藏之韋克斯勒布勞特氏菌細菌且在本文中亦稱為菌株MRX008。術語「MRX008」、「MRx0008」、「Mrx008」及「Mrx0008」在本文中可互換使用。所測試之MRX008菌株之16S rRNA序列提供於SEQ ID NO：4中。菌株MRX008由4D Pharma Research Ltd.(Life Sciences Innovation Building,Aberdeen,AB25 2ZS,Scotland)於2015年11月16日以「布勞特氏菌屬/瘤胃球菌屬」形式保藏於國際保藏機構NCIMB,Ltd.(Ferguson Building,Aberdeen,AB21 9YA,Scotland)且分配登錄號NCIMB 42486。
本發明之另一較佳菌株為以登錄號DSM 10507且亦以登錄號DSM 14294保藏之嗜氫布勞特氏菌細菌。此菌株以登錄號DSM 10507以「嗜氫瘤胃球菌」形式於1996年1月26日且亦以登錄號DSM 14294以「S5a33」形式於2001年5月10日保藏於Deutsche Sammlung von Mikroorganismen[德國微生物保藏中心](Mascheroder Weg 1b,38124 Braunschweig,Germany)。保藏人為INRA Laboratoire de Microbiologie CR de Clermont-Ferrand/Theix 63122 Saint Genes Champanelle,France。已通過分配將保藏物之所有權轉給4D Pharma Plc。4D Pharma Plc已通過協議批准4D Pharma Research Limited在申請案中提及所保藏之生物材料且已無保留且不可撤回地同意使得保藏材料為公眾可獲得的。登錄號DSM 14294下之保藏物係於2000年5月11日公佈於US7749494B2中且DSMZ 10507可購自DSMZ保藏中心。此兩種保藏物為公眾可獲得的。
實例中測試了以登錄號DSM 10507且亦以登錄號DSM 14294保藏之嗜氫布勞特氏菌細菌且為本發明之較佳菌株。
與實例中所測試之菌株密切相關的細菌菌株亦預期有效治療或預防自閉症譜系病症及中樞神經系統病症及病狀，特定而言為由微生物叢-腸-腦軸介 導之中樞神經系統病症及病狀。在某些實施例中，用於本發明中之細菌菌株具有與糞便布勞特氏菌之細菌菌株的16s rRNA至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列。較佳地，用於本發明中之細菌菌株具有與SEQ ID NO：1或2至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列。較佳地，序列一致性係對於SEQ ID NO：2。較佳地，用於本發明中之細菌菌株具有由SEQ ID NO：2表示之16s rRNA序列。在某些實施例中，用於本發明中之細菌菌株具有與韋克斯勒布勞特氏菌之細菌菌株的16s rRNA序列至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列。
較佳地，用於本發明中之細菌菌株具有與SEQ ID NO：3或4至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列。較佳地，序列一致性係對於SEQ ID NO：4。較佳地，用於本發明中之細菌菌株具有由SEQ ID NO：4表示之16s rRNA序列。
在某些實施例中，用於本發明中之細菌菌株具有與SEQ ID NO：5具有序列一致性之染色體。在較佳實施例中，用於本發明中之細菌菌株具有在SEQ ID NO：5之至少60%(例如至少65%、70%、75%、80%、85%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)的範圍內與SEQ ID NO：5具有至少90%序列一致性(例如至少92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性)的染色體。舉例而言，用於本發明中之細菌菌株所具有的染色體可在SEQ ID NO：5之70%中與SEQ ID NO：5具有至少90%序列一致性，或在SEQ ID NO：5之80%中與SEQ ID NO：5具有至少90%序列一致性，或在SEQ ID NO：5之90%中與SEQ ID NO：5具有至少90%序列一致性，或在SEQ ID NO：5之100%中與SEQ ID NO：5具有至少90%序列一致性，或在SEQ ID NO：5之70%中與SEQ ID NO：5具有至少95%序列一致性，或在SEQ ID NO：5之80%中與SEQ ID NO：5具有至少95%序列一致性，或在SEQ ID NO：5之90%中與SEQ ID NO：5具有至少95%序列一致性， 或在SEQ ID NO：5之100%中與SEQ ID NO：5具有至少95%序列一致性，或在SEQ ID NO：5之70%中與SEQ ID NO：5具有至少98%序列一致性，或在SEQ ID NO：5之80%中與SEQ ID NO：5具有至少98%序列一致性，或在SEQ ID NO：5之90%中與SEQ ID NO：5具有至少98%序列一致性，或在SEQ ID NO：5之100%中與SEQ ID NO：5具有至少98%序列一致性。
在某些實施例中，用於本發明中之細菌菌株具有與SEQ ID NO：6具有序列一致性之質粒。在較佳實施例中，用於本發明中之細菌菌株具有在SEQ ID NO：6之至少60%(例如至少65%、70%、75%、80%、85%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)的範圍內與SEQ ID NO：6具有至少90%序列一致性(例如至少92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性)的質粒。舉例而言，用於本發明中之細菌菌株所具有的質粒可在SEQ ID NO：6之70%中與SEQ ID NO：6具有至少90%序列一致性，或在SEQ ID NO：6之80%中與SEQ ID NO：6具有至少90%序列一致性，或在SEQ ID NO：6之90%中與SEQ ID NO：6具有至少90%序列一致性，或在SEQ ID NO：6之100%中與SEQ ID NO：6具有至少90%序列一致性，或在SEQ ID NO：6之70%中與SEQ ID NO：6具有至少95%序列一致性，或在SEQ ID NO：6之80%中與SEQ ID NO：6具有至少95%序列一致性，或在SEQ ID NO：6之90%中與SEQ ID NO：6具有至少95%序列一致性，或在SEQ ID NO：6之100%中與SEQ ID NO：6具有至少95%序列一致性，或在SEQ ID NO：6之70%中與SEQ ID NO：6具有至少98%序列一致性，或在SEQ ID NO：6之80%中與SEQ ID NO：6具有至少98%序列一致性，或在SEQ ID NO：6之90%中與SEQ ID NO：6具有至少98%序列一致性，或在SEQ ID NO：6之100%中與SEQ ID NO：6具有至少98%序列一致性。
在某些實施例中，用於本發明中之細菌菌株具有與SEQ ID NO：5具有序列一致性的染色體及與SEQ ID NO：6具有序列一致性的質粒。
作為以登錄號42381保藏之細菌之生物型的細菌菌株亦預期有效治療或預防自閉症譜系病症及中樞神經系統病症及病狀，特定而言為由微生物叢-腸-腦軸介導之中樞神經系統病症及病狀。作為以登錄號42486保藏之細菌之生物型的細菌菌株亦預期有效治療或預防自閉症譜系病症及中樞神經系統病症及病狀，特定而言為由微生物叢-腸-腦軸介導之中樞神經系統病症及病狀。生物型為具有相同或非常類似之生理及生物化學特徵之密切相關之菌株。
作為以登錄號NCIMB 42381或42486保藏之細菌之生物型且適合用於本發明中的菌株可藉由對以登錄號NCIMB 42381或42486保藏之細菌的其他核苷酸序列進行測序來鑑定。舉例而言，實質上可對整個基因組進行測序，且用於本發明中之生物型菌株可在其整個基因組之至少80%中(例如在至少85%、90%、95%或99%中，或在其整個基因組中)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%序列一致性。舉例而言，在一些實施例中，生物型菌株在其基因組之至少98%中具有至少98%序列一致性或在其基因組之99%中具有至少99%序列一致性。其他適合用於鑑定生物型菌株之序列可包括hsp60或重複序列，諸如BOX、ERIC、(GTG)5 或REP或[29]。生物型菌株可具有與以登錄號NCIMB 42381或42486保藏之細菌之對應序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%序列一致性的序列。
在一些實施例中，生物型菌株具有與以NCIMB 42381保藏之菌株MRX006之對應序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%序列一致性的序列且包含與SEQ ID NO：2至少99%一致(例如至少99.5%或至少99.9%一致)的16S rRNA序列。在一些實施例中，生物型菌株具有與以NCIMB 42381保藏之菌株MRX006之對應序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%序列一致性的序列且具有SEQ ID NO：2之16S rRNA序列。
在一些實施例中，生物型菌株具有與以NCIMB 42486保藏之菌株 MRX008之對應序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%序列一致性的序列且包含與SEQ ID NO：4至少99%一致(例如至少99.5%或至少99.9%一致)的16S rRNA序列。在一些實施例中，生物型菌株具有與以NCIMB 42486保藏之菌株MRX008之對應序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%序列一致性的序列且具有SEQ ID NO：4之16S rRNA序列。
或者，作為以登錄號NCIMB 42381或42486保藏之細菌之生物型且適合用於本發明中之菌株可藉由使用登錄號NCIMB 42381保藏物或登錄號NCIMB 42486保藏物及限制片段分析及/或PCR分析來鑑定，例如藉由使用螢光擴增片段長度多態性(FAFLP)及重複DNA元件(rep)-PCR指紋分析或蛋白質表現譜分析或部分16S或23s rDNA測序來進行。在較佳實施例中，此類技術可用於鑑定其他糞便布勞特氏菌或韋克斯勒布勞特氏菌菌株。
在某些實施例中，作為以登錄號NCIMB 42381或42486保藏之細菌之生物型且適合用於本發明中的菌株為如下菌株，該等菌株當藉由擴增核糖體DNA限制分析(ARDRA)進行分析時，例如當使用Sau3AI限制酶時提供與以登錄號NCIMB 42381或42486保藏之細菌相同的模式(關於示例性方法及指導參見例如[30])。或者，生物型菌株經鑑定為如下菌株，該等菌株具有與以登錄號NCIMB 42381或42486保藏之細菌相同的碳水化合物醱酵模式。
適合用於本發明之組合物及方法中的其他糞便布勞特氏菌菌株，諸如以登錄號NCIMB 42381或42486保藏之細菌之生物型可使用包括實例中所描述之分析的任何適當之方法或策略來鑑定。舉例而言，用於本發明中之菌株可藉由在厭氧YCFA中培養及/或將細菌投與自閉症譜系病症小鼠模型且然後評估細胞因子含量來鑑定。特定而言，與以登錄號NCIMB 42381或42486保藏之細菌具有類似生長模式、代謝類型及/或表面抗原的細菌菌株可適合用於本發明中。適用菌株將具有與NCIMB 42381或42486菌株類似之免疫調節活性。特定 而言，生物型菌株將對自閉症譜系病症模型引發與實例中所示之效應類似的效應，此可藉由使用實例中所描述之培養及投與方案來鑑定。
本發明之尤其較佳菌株為以登錄號NCIMB 42381保藏之糞便布勞特氏菌菌株。此為實例中所測試之示例性MRX006菌株且顯示有效治療疾病。因此，本發明提供一種以登錄號NCIMB 42381保藏之糞便布勞特氏菌菌株或其衍生物的細胞，諸如分離之細胞。本發明亦提供一種包含以登錄號NCIMB 42381保藏之糞便布勞特氏菌菌株或其衍生物之細胞的組合物。本發明亦提供一種以登錄號NCIMB 42381保藏之糞便布勞特氏菌菌株的生物純培養物。本發明亦提供一種以登錄號NCIMB 42381保藏之糞便布勞特氏菌菌株或其衍生物的細胞，其用於特定而言針對本文所描述之疾病的療法中。
本發明之尤其較佳菌株為以登錄號NCIMB 42486保藏之韋克斯勒布勞特氏菌菌株。此為實例中所測試之示例性MRX008菌株且顯示有效治療疾病。因此，本發明提供一種以登錄號NCIMB 42486保藏之韋克斯勒布勞特氏菌菌株或其衍生物的細胞，諸如分離之細胞。本發明亦提供一種包含以登錄號NCIMB 42486保藏之韋克斯勒布勞特氏菌菌株或其衍生物之細胞的組合物。本發明亦提供一種以登錄號NCIMB 42486保藏之韋克斯勒布勞特氏菌菌株的生物純培養物。本發明亦提供一種以登錄號NCIMB 42486保藏之韋克斯勒布勞特氏菌菌株或其衍生物的細胞，其用於特定而言針對本文所描述之疾病的療法中。
以登錄號NCIMB 42381或42486保藏之菌株的衍生物可為子代菌株(子代)或自原始菌株培養(亞選殖)之菌株。以登錄號NCIMB 42381或42486保藏之菌株的衍生物可為子代菌株(子代)或自原始菌株培養(亞選殖)之菌株。本發明之菌株的衍生物可例如在基因層面上經修飾，而不會消除生物活性。特定而言，本發明之衍生菌株具治療活性。衍生菌株將具有與原始NCIMB 42381或42486菌株類似之免疫調節活性。特定而言，衍生菌株將對中樞神經系統病症或病狀 模型引發與實例中所示之效應類似的效應且對細胞因子含量引發類似效應，此可藉由使用實例中所描述之培養及投與方案來鑑定。NCIMB 42381菌株之衍生物通常將為NCIMB 42381菌株之生物型。NCIMB 42486菌株之衍生物通常將為NCIMB 42486菌株之生物型。
提及以登錄號NCIMB 42381保藏之糞便布勞特氏菌菌株之細胞涵蓋與以登錄號NCIMB 42381保藏之菌株具有相同安全性及治療功效特徵的任何細胞，且此類細胞由本發明涵蓋。因此，在一些實施例中，提及以登錄號NCIMB 42381保藏之糞便布勞特氏菌菌株之細胞僅指以NCIMB 42381保藏之MRX006菌株，而不指不以NCIMB 42381保藏之細菌菌株。在一些實施例中，提及以登錄號NCIMB 42381保藏之糞便布勞特氏菌菌株之細胞指與以登錄號NCIMB 42381保藏之菌株具有相同安全性及治療功效特徵但不為以NCIMB 42381保藏之菌株的細胞。
提及以登錄號NCIMB 42486保藏之韋克斯勒布勞特氏菌菌株的細胞涵蓋與以登錄號NCIMB 42486保藏之菌株具有相同安全性及治療功效特徵的任何細胞，且此類細胞由本發明涵蓋。因此，在一些實施例中，提及以登錄號NCIMB 42486保藏之韋克斯勒布勞特氏菌菌株的細胞僅指以NCIMB 42486保藏之菌株，而不指不以NCIMB 42486保藏之細菌菌株。在一些實施例中，提及以登錄號NCIMB 42486保藏之韋克斯勒布勞特氏菌菌株的細胞係指與以登錄號NCIMB 42486保藏之菌株具有相同安全性及治療功效特徵但不為以NCIMB 42486保藏之菌株的細胞。
在某些實施例中，用於本發明中之細菌菌株具有例如如上文所描述與SEQ ID NO：5具有序列一致性之染色體；及例如如上文所描述與SEQ ID NO：1、2、3或4具有序列一致性之16S rRNA序列，較佳具有與SEQ ID NO：2或4至少99%一致之16s rRNA序列，更佳其包含SEQ ID NO：2或4之16S rRNA 序列。
在某些實施例中，用於本發明中之細菌菌株具有例如如上文所描述與SEQ ID NO：5具有序列一致性之染色體，且有效治療或預防中樞神經系統病症及病狀，特定而言為由微生物叢-腸-腦軸介導之中樞神經系統病症及病狀。
在某些實施例中，用於本發明中之細菌菌株具有例如如上文所描述與SEQ ID NO：5具有序列一致性之染色體；及例如如上文所描述與SEQ ID NO：1、2、3或4具有序列一致性之16S rRNA序列，且有效治療或預防中樞神經系統病症及病狀，特定而言為由微生物叢-腸-腦軸介導之中樞神經系統病症及病狀。
在某些實施例中，用於本發明中之細菌菌株具有與由SEQ ID NO：2或4表示之16s rRNA序列至少99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列(例如其包含SEQ ID NO：2或4之16S rRNA序列)；及在SEQ ID NO：5之至少90%中與SEQ ID NO：5具有至少95%序列一致性之染色體，且其有效治療或預防中樞神經系統病症及病狀，特定而言為由微生物叢-腸-腦軸介導之中樞神經系統病症及病狀。
在某些實施例中，用於本發明中之細菌菌株為糞便布勞特氏菌且具有與由SEQ ID NO：2或4表示之16s rRNA序列至少99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列(例如其包含SEQ ID NO：2或4之16S rRNA序列)；及在SEQ ID NO：5之至少98%中(例如在至少99%或至少99.5%中)與SEQ ID NO：5具有至少98%序列一致性(例如至少99%或至少99.5%序列一致性)之染色體，且有效治療或預防中樞神經系統病症及病狀，特定而言為由微生物叢-腸-腦軸介導之中樞神經系統病症及病狀。
在某些實施例中，用於本發明中之細菌菌株具有例如如上文所描述與SEQ ID NO：6具有序列一致性之質粒；及例如如上文所描述與SEQ ID NO：1、 2、3或4具有序列一致性之16S rRNA序列，較佳具有與SEQ ID NO：2或4至少99%一致之16s rRNA序列，更佳其包含SEQ ID NO：2或4之16S rRNA序列。
在某些實施例中，用於本發明中之細菌菌株具有例如如上文所描述與SEQ ID NO：6具有序列一致性之質粒，且有效治療或預防中樞神經系統病症及病狀，特定而言為由微生物叢-腸-腦軸介導之中樞神經系統病症及病狀。
在某些實施例中，用於本發明中之細菌菌株具有例如如上文所描述與SEQ ID NO：6具有序列一致性之質粒；及例如如上文所描述與SEQ ID NO：1、2、3或4具有序列一致性之16S rRNA序列，且有效治療或預防中樞神經系統病症及病狀，特定而言為由微生物叢-腸-腦軸介導之中樞神經系統病症及病狀。
在某些實施例中，用於本發明中之細菌菌株具有與由SEQ ID NO：2或4表示之16s rRNA序列至少99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列(例如其包含SEQ ID NO：2或4之16S rRNA序列)；及在SEQ ID NO：6之至少90%中與SEQ ID NO：6具有至少95%序列一致性之質粒，且有效治療或預防中樞神經系統病症及病狀，特定而言為由微生物叢-腸-腦軸介導之中樞神經系統病症及病狀。
在某些實施例中，用於本發明中之細菌菌株為糞便布勞特氏菌且具有與由SEQ ID NO：2或4表示之16s rRNA序列至少99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列(例如其包含SEQ ID NO：2或4之16S rRNA序列)；及在SEQ ID NO：6之至少98%中(例如在至少99%或至少99.5%中)與SEQ ID NO：6具有至少98%序列一致性之質粒(例如至少99%或至少99.5%序列一致性)，且有效治療或預防中樞神經系統病症及病狀，特定而言為由微生物叢-腸-腦軸介導之中樞神經系統病症及病狀。
在某些實施例中，用於本發明中之細菌菌株具有例如如上文所描述與SEQ ID NO：5具有序列一致性之染色體；例如如上文所描述與SEQ ID NO：6 具有序列一致性之質粒；及例如如上文所描述與SEQ ID NO：1、2、3或4具有序列一致性之16S rRNA序列，較佳具有與SEQ ID NO：2或4至少99%一致之16s rRNA序列，更佳其包含SEQ ID NO：2或4之16S rRNA序列。
在某些實施例中，用於本發明中之細菌菌株具有例如如上文所描述與SEQ ID NO：5具有序列一致性之染色體；及例如如上文所描述與SEQ ID NO：6具有序列一致性之質粒，且有效治療或預防中樞神經系統病症及病狀，特定而言為由微生物叢-腸-腦軸介導之中樞神經系統病症及病狀。
在某些實施例中，用於本發明中之細菌菌株具有例如如上文所描述與SEQ ID NO：5具有序列一致性之染色體；例如如上文所描述與SEQ ID NO：6具有序列一致性之質粒；及例如如上文所描述與SEQ ID NO：1、2、3或4具有序列一致性之16S rRNA序列，且有效治療或預防中樞神經系統病症及病狀，特定而言為由微生物叢-腸-腦軸介導之中樞神經系統病症及病狀。
在某些實施例中，用於本發明中之細菌菌株具有與由SEQ ID NO：2或4表示之16s rRNA序列至少99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列(例如其包含SEQ ID NO：2或4之16S rRNA序列)；在SEQ ID NO：5之至少90%中與SEQ ID NO：5具有至少95%序列一致性之染色體；及在SEQ ID NO：6之至少90%中與SEQ ID NO：6具有至少95%序列一致性之質粒，且有效治療或預防中樞神經系統病症及病狀，特定而言為由微生物叢-腸-腦軸介導之中樞神經系統病症及病狀。
在某些實施例中，用於本發明中之細菌菌株為糞便布勞特氏菌且具有與由SEQ ID NO：2或4表示之16s rRNA序列至少99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列(例如其包含SEQ ID NO：2或4之16S rRNA序列)；在SEQ ID NO：5之至少98%中(例如在至少99%或至少99.5%中)與SEQ ID NO：5具有至少98%序列一致性(例如至少99%或至少99.5%序列一致性)之染色體；及在SEQ ID NO：6之至少98%中(例如在至少99%或至少99.5%中)與SEQ ID NO：6具有至少98%序列一致性(例如至少99%或至少99.5%序列一致性)之質粒，且有效治療或預防中樞神經系統病症及病狀，特定而言為由微生物叢-腸-腦軸介導之中樞神經系統病症及病狀。
在較佳實施例中，本發明之組合物中之細菌菌株為有活力的且能夠部分或完全定植於腸道。
已自哺乳動物之腸道分離之嗜氫布勞特氏菌(先前稱為嗜氫瘤胃球菌(Ruminococcus hydrogenotrophicus ))為嚴格厭氧的，且將H2 /CO2 代謝為乙酸鹽，乙酸鹽對於人體營養及健康而言可為重要的。嗜氫布勞特氏菌之典型菌株為S5a33=DSM 10507=JCM 14656。嗜氫布勞特氏菌菌株S5a36之16S rRNA基因序列之GenBank登錄號為X95624.1(在本文中以SEQ ID NO：7形式揭示)。此示例性嗜氫布勞特氏菌菌株描述於[28]及[31]中。S5a33菌株及S5a36菌株對應於自健康個體之糞便樣品分離之菌株的兩個亞純系。其顯示相同形態、生理學及代謝且具有相同16S rRNA序列。因此，在一些實施例中，用於本發明中之嗜氫布勞特氏菌具有SEQ ID NO：7之16S rRNA序列。
在某些實施例中，用於本發明中之細菌菌株具有與嗜氫布勞特氏菌之細菌菌株的16s rRNA序列至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列。較佳，用於本發明中之細菌菌株具有與SEQ ID NO：7至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列。較佳，用於本發明中之細菌菌株具有由SEQ ID NO：7表示之16s rRNA序列。
作為以登錄號DSM 10507/14294保藏之細菌之生物型的細菌菌株亦預期有效治療或預防自閉症譜系病症及中樞神經系統病症及病狀，特定而言為由微生物叢-腸-腦軸介導之中樞神經系統病症及病狀。
作為以登錄號DSM 10507/14294保藏之細菌之生物型且適合用於本 發明中的菌株可藉由對以登錄號DSM 10507/14294保藏之細菌的其他核苷酸序列進行測序來鑑定。舉例而言，實質上可對整個基因組進行測序，且用於本發明中之生物型菌株可在其整個基因組之至少80%中(例如在至少85%、90%、95%或99%中，或在其整個基因組中)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%序列一致性。舉例而言，在一些實施例中，生物型菌株在其基因組之至少98%中具有至少98%序列一致性或在其基因組之99%中具有至少99%序列一致性。其他適合用於鑑定生物型菌株之序列可包括hsp60或重複序列，諸如BOX、ERIC、(GTG)5 或REP或[29]。生物型菌株可具有與以登錄號DSM 10507/14294保藏之細菌之對應序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%序列一致性的序列。
在一些實施例中，生物型菌株具有與以登錄號DSM 10507/14294保藏之菌株之對應序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%序列一致性的序列且包含與SEQ ID NO：7至少99%一致(例如至少99.5%或至少99.9%一致)的16S rRNA序列。在一些實施例中，生物型菌株具有與以登錄號DSM 10507/14294保藏之菌株之對應序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%序列一致性的序列且具有SEQ ID NO：7之16S rRNA序列。
或者，作為以登錄號DSM 10507/14294保藏之細菌之生物型且適合用於本發明中的菌株可藉由使用登錄號DSM 10507/14294保藏物及限制片段分析及/或PCR分析來鑑定，例如藉由使用螢光擴增片段長度多態性(FAFLP)及重複DNA元件(rep)-PCR指紋分析或蛋白質表現譜分析或部分16S或23s rDNA測序來進行。在較佳實施例中，此類技術可用於鑑定其他嗜氫布勞特氏菌菌株。
在某些實施例中，作為以登錄號NCIMB 42381或42486保藏之細菌之生物型且適合用於本發明中的菌株為如下菌株，該等菌株當藉由擴增核糖體DNA限制分析(ARDRA)進行分析時，例如當使用Sau3AI限制酶時提供與以登 錄號DSM 10507/14294保藏之細菌相同的模式(關於示例性方法及指導參見例如[30])。或者，生物型菌株經鑑定為如下菌株，該等菌株與以登錄號DSM 10507/14294保藏之細菌具有相同之碳水化合物醱酵模式。
適合用於本發明之組合物及方法中之其他嗜氫布勞特氏菌菌株，諸如以登錄號DSM 10507/14294保藏之細菌之生物型可使用包括實例中所描述之分析的任何適當之方法或策略來鑑定。舉例而言，用於本發明中之菌株可藉由在厭氧YCFA中培養及/或將細菌投與自閉症譜系病症小鼠模型且然後評估細胞因子含量來鑑定。特定而言，與以登錄號DSM 10507/14294保藏之細菌具有類似生長模式、代謝類型及/或表面抗原之細菌菌株可適合用於本發明中。適用菌株將具有與登錄號DSM 10507/14294菌株類似之免疫調節活性。特定而言，生物型菌株將對自閉症譜系病症模型引發與實例中所示之效應類似的效應，此可藉由使用實例中所描述之培養及投與方案來鑑定。
本發明之尤其較佳菌株為以登錄號DSM 10507/14294保藏之嗜氫布勞特氏菌菌株。此為實例中所測試之示例性菌株且顯示有效治療疾病。因此，本發明提供一種以登錄號DSM 10507/14294保藏之嗜氫布勞特氏菌菌株或其衍生物的細胞，諸如分離之細胞。本發明亦提供一種包含以登錄號DSM 10507/14294保藏之嗜氫布勞特氏菌菌株或其衍生物之細胞的組合物。本發明亦提供一種以登錄號DSM 10507/14294保藏之嗜氫布勞特氏菌菌株的生物純培養物。本發明亦提供一種以登錄號DSM 10507/14294保藏之嗜氫布勞特氏菌菌株或其衍生物的細胞，其用於特定而言針對本文所描述之疾病的療法中。
以登錄號DSM 10507/14294保藏之菌株的衍生物可為子代菌株(子代)或自原始菌株培養(亞選殖)之菌株。以登錄號DSM 10507/14294保藏之菌株的衍生物可為子代菌株(子代)或自原始菌株培養(亞選殖)之菌株。本發明之菌株的衍生物可例如在基因層面上經修飾，而不會消除生物活性。特定而言，本發明之 衍生菌株具治療活性。衍生菌株將具有與以登錄號DSM 10507/14294保藏之原始菌株類似之免疫調節活性。特定而言，衍生菌株將對中樞神經系統病症或病狀模型引發與實例中所示之效應類似的效應且對細胞因子含量引發類似效應，此可藉由使用實例中所描述之培養及投與方案來鑑定。DSM 10507/14294菌株之衍生物通常將為DSM 10507/14294菌株之生物型。
提及以登錄號DSM 10507/14294保藏之嗜氫布勞特氏菌菌株的細胞涵蓋與以登錄號DSM 10507/14294保藏之菌株具有相同安全性及治療功效特徵的任何細胞，且此類細胞由本發明涵蓋。因此，在一些實施例中，提及以登錄號DSM 10507/14294保藏之嗜氫布勞特氏菌菌株的細胞僅指以DSM 10507/14294保藏之菌株，而不指不以DSM 10507/14294保藏之細菌菌株。在一些實施例中，提及以登錄號DSM 10507/14294保藏之嗜氫布勞特氏菌菌株的細胞指與以登錄號DSM 10507/14294保藏之菌株具有相同安全性及治療功效特徵但不為以DSM 10507/14294保藏之菌株的細胞。
在較佳實施例中，本發明之組合物中之細菌菌株為有活力的且能夠部分或完全定植於腸道。
治療用途 微生物叢-腸-腦軸之調節
腸與腦之間的通信(微生物叢-腸-腦軸)係經由雙向神經介質通信系統來進行。當前證據表明存在於腸道中之微生物叢可經由微生物叢-腸-腦軸調節腦部發育且產生行為表型。實際上，許多綜述提出微生物叢-腸-腦軸在維持中樞神經系統功能中起作用且中樞神經系統病症及病狀發展中涉及微生物叢-腸-腦軸功能失調[10]、[13]、[14]、[32]。
腦與腸道之間的雙向通信(亦即腸-腦軸)包括中樞神經系統、神經內分泌及神經免疫系統，包括下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸、自主神經系統(ANS) 之交感神經及副交感神經臂，包括腸道神經系統(ENS)及迷走神經，以及腸道微生物叢。
如實例中所證實，本發明之組合物可調節微生物叢-腸-腦軸且減輕與CNS病症相關之行為症狀。因此，本發明之組合物可適用於治療或預防中樞神經系統(CNS)之病症，特定而言為與微生物叢-腸-腦軸功能失調相關之彼等病症及病狀。
本發明之組合物亦可適用於治療或預防神經發育障礙及/或神經精神病狀。神經發育疾病及神經精神病狀常常與微生物叢-腸-腦軸相關。本發明之組合物可適用於治療或預防由微生物叢-腸-腦軸功能失調介導之神經發育疾病及/或神經精神病狀。在其他較佳實施例中，本發明之組合物係用於治療或預防神經發育障礙或神經精神病狀。
在特定實施例中，本發明之組合物可適用於治療或預防選自由以下各項組成之群的疾病或病狀：自閉症譜系病症(ASD)；兒童發育障礙；強迫症(OCD)；重度抑鬱障礙；抑鬱；季節性情感障礙；焦慮障礙；精神分裂症譜系病症；精神分裂症；雙極性障礙；精神病；情緒障礙；慢性疲勞症候群(肌痛性腦脊髓炎)；壓力障礙；創傷後壓力障礙；癡呆；阿爾茨海默氏病；帕金森氏病；及/或慢性疼痛。在其他實施例中，本發明之組合物可適用於治療或預防運動神經元病；亨廷頓氏病；格林-巴利症候群及/或腦膜炎。
本發明之組合物可特別適合用於治療或預防慢性病，治療或預防對其他療法(諸如用抗精神病劑及/或抗抑鬱劑處理)尚未起反應之患者的疾病，且/或治療或預防組織損傷及與微生物叢-腸-腦軸功能失調相關之症狀。
在某些實施例中，本發明之組合物調節CNS。在一些實施例中，本發明之組合物調節自主神經系統(ANS)。在一些實施例中，本發明之組合物調節腸道神經系統(ENS)。在一些實施例中，本發明之組合物調節下丘腦、垂體、腎 上腺(HPA)軸。在一些實施例中，本發明之組合物調節神經內分泌路徑。在一些實施例中，本發明之組合物調節神經免疫路徑。在一些實施例中，本發明之組合物調節CNS、ANS、ENS、HPA軸及/或神經內分泌及神經免疫路徑。在某些實施例中，本發明之組合物調節共生代謝產物之含量及/或個體之胃腸道滲透性。
微生物叢-腸-腦軸之信號傳導由神經系統調節。因此，在一些實施例中，本發明之組合物調節神經系統中之信號傳導。在某些實施例中，本發明之組合物調節中樞神經系統之信號傳導。在一些實施例中，本發明之組合物調節感覺神經元中之信號傳導。在其他實施例中，本發明之組合物調節運動神經元中之信號傳導。在一些實施例中，本發明之組合物調節ANS中之信號傳導。在一些實施例中，ANS為副交感神經系統。在較佳實施例中，本發明之組合物調節迷走神經之信號傳導。在其他實施例中，ANS為交感神經系統。在其他實施例中，本發明之組合物調節腸道神經系統中之信號傳導。在某些實施例中，ANS及ENS神經元之信號傳導係直接響應於胃腸道之管腔內容物。在其他實施例中，ANS及ENS神經元之信號傳導係間接響應於由管腔細菌產生之神經化學品。在其他實施例中，ANS及ENS神經元之信號傳導係響應於由管腔細菌或腸內分泌細胞產生之神經化學品。在某些較佳實施例中，ENS之神經元活化迷走傳入，從而影響CNS之功能。在一些實施例中，本發明之組合物調控腸嗜鉻細胞之活性。
在某些實施例中，本發明之組合物調節動物模型中之恐懼條件化。在某些實施例中，本發明之組合物可用於調節恐懼及/或焦慮之發展及/或調節個體中恐懼及/或焦慮消除之程度。在某些實施例中，本發明之組合物可用於調節動物模型中壓力誘導之體溫過高的程度。在某些實施例中，本發明之組合物調節個體中壓力及/或焦慮之水準。
自閉症譜系病症(ASD)
自閉症譜系病症為異質性神經發育病狀之集合，其特徵為早發性社交互動困難、溝通困難及異常限制之重複行為及興趣。症狀可在很小之年齡就被識別到，但ASD常常係在開始主流教育之更有能力之兒童中診斷出來。自閉症代表主要類型之ASD。
有史以來，自閉症係基於三個核心範圍來診斷：社交互動減少、溝通異常以及限制及重複之行為及興趣。在國際疾病分類(ICD-10R，WHO 1993)及診斷及統計手冊(DSM-IV，American Psychiatric Association，2000)中，將自閉症歸入廣泛性發育障礙(PDD)之涵蓋性術語，有四種可能之診斷亞型：亞斯伯格症候群(Asperger Syndrome)、兒童自閉症/孤獨症、非典型自閉症及PDD未另外規定者。在DMS-5中，將此等診斷亞型組合成單一類別之自閉症譜系病症(ASD)且先前使用之三個受損核心範圍已減少至兩個主要範圍，亦即社交溝通及互動以及重複行為，其包括感覺統合失調。
ASD為『譜系病症』，因為其以多種不同方式影響每個人且可在非常輕度至重度範圍內。視語言能力、智力水準、共病、症狀之組成及服務之可獲得性而定，受影響之個體的功能實質上發生變化。認知功能、學習、注意力及感覺處理通常受損。
DSM-IV說明自閉症之診斷需要存在至少六種症狀，包括社交互動定性損傷之最少兩種度量、一種溝通定性損傷症狀及一種限制及重複行為症狀。DMS-5重新定義了在兩種症狀範圍中對ASD之診斷：(i)社交互動及社交溝通缺陷；及(ii)限制、重複模式之行為、興趣或活動。
在ASD中共病醫學病狀為高度普遍的。共病包括焦慮及抑鬱、癲癇發作、注意力缺陷、攻擊行為、睡眠問題、胃腸道病症、癲癇症、智力遲鈍、智障及進食困難。
實例證實本發明之組合物在自閉症譜系病症之動物模型中達成發病 率減少及疾病嚴重程度降低，且因此其可適用於治療或預防自閉症譜系病症。
ASD為部分由環境因素觸發之中樞神經系統病症。因此，微生物叢-腸-腦軸功能失調可引起ASD之發展及持續。因此，在較佳實施例中，本發明之組合物係用於治療或預防自閉症譜系病症。在一些實施例中，本發明之組合物係用於治療或預防自閉症。在一些實施例中，自閉症為廣泛性發育障礙(PDD)。在另一實施例中，PDD為亞斯伯格症候群、兒童自閉症/孤獨症、非典型自閉症及/或PDD未另外規定者。因此，在一些實施例中，本發明之組合物係用於治療或預防自閉症譜系病症、自閉症、廣泛性發育障礙；亞斯伯格症候群；兒童自閉症/孤獨症、非典型性自閉症及/或PDD未另外規定者。
本發明之組合物可適用於調節個體之微生物叢-腸-腦軸。因此，在較佳實施例中，本發明之組合物係用於預防已鑑定為處於ASD風險中或在出生前或早期發育階段；在兒童期及/或成年期已診斷為患有ASD之患者的ASD。本發明之組合物可適用於預防ASD之發展。
本發明之組合物可適用於管理或緩解ASD。ASD之治療或預防可指例如緩解症狀之嚴重程度或減少惡化頻率或減小對於患者來說為問題之觸發因素的範圍。
在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解ASD之至少一種核心症狀。
在一些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解DMS-5中分類之ASD的兩種症狀範圍中之至少一者。在一些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解社交互動及/或社交溝通缺陷。在一些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解限制、重複模式之行為、興趣或活動。在一些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解社交互動、社交溝通缺陷及/或預防、減輕或緩解限制、重複模式之行為、興趣或活動。
在一些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解重複行為、刻板行為、強迫行為、慣例行為、相同行為及限制行為。在一些實施例中，本發明之組合物改善患有ASD之個體的社交認識、社交資訊處理、社交溝通能力、社交焦慮/回避及孤獨症性貫注及特質。
在一些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解與ASD之核心症狀相關之其他症狀。在一些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解患有ASD之個體的易怒(包括攻擊性、故意自我傷害及發脾氣)、激動、哭喊、昏睡、社交退縮、刻板行為、活動過度、不遵從、言語不當、焦慮、抑鬱及/或過度控制或受控之行為。在一些實施例中，本發明之組合物改善患有ASD之個體的認知功能、學習、注意力及/或感覺處理。
在其他實施例中，本發明之組合物改善患有ASD之個體中的二級結果量測。在一些實施例中，二級結果量測包括其他症狀及/或功能評定量表、行為量表及相關雜項量測。
在一些實施例中，本發明之組合物在用於評估患有ASD之個體的核心症狀之診斷及/或症狀量表中引起陽性變化。在一些實施例中，診斷及/或症狀量表為自閉症診斷訪視修正版(ASI-R)。在一些實施例中，診斷或症狀量表為通用型自閉症診斷觀察時間表(ADOS-G)，現為ADOS-2。在其他實施例中，診斷或症狀量表為自閉症診斷訪視修正版(ADI-R)。在其他實施例中，診斷或症狀量表為社交及溝通障礙診斷訪視(DISCO)。在其他實施例中，診斷或症狀量表為兒童自閉症評定量表(CARS及CARS2)。
在一些實施例中，本發明之組合物在ASD之功效終點的通用量測中引起陽性變化。在某些實施例中，通用量測包括但不限於異常行為清單(ABC)、兒童行為清單(CBCL)、文蘭-II適應行為量表(Vineland-II Adaptive Behaviour Scales，VABS)、社交反應量表(SRS)及/或重複行為量表修正版(RBS-R)。
在一些實施例中，本發明之組合物改善用於評估精神及神經病症之臨床總體印象-總體改善(CGI-I)量表。在一些實施例中，本發明之組合物對患有ASD之個體的總體功能展示積極影響。
其他量表將為熟習此項技術者已知的。在一些實施例中，本發明之組合物將改善熟習此項技術者已知之診斷及/或症狀量表之結果。
在某些實施例中，本發明之組合物預防、減少或緩和ASD之共病之發病。在一些實施例中，本發明之組合物預防、減少或緩和焦慮及抑鬱、癲癇發作、注意力缺陷、攻擊行為、睡眠問題、胃腸道病症(包括腸易激症候群(IBS))、癲癇症、智力遲鈍、智障及/或進食困難之發生。在某些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解胃腸道共病，諸如腹痛、腹瀉及脹氣。
在一些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解可在臨床上與自閉症相似地存在之某些精神及行為病症之症狀。因此，在一些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解注意缺陷病症(ADHD)；情感/焦慮障礙；依戀障礙；對立違抗性障礙(ODD)；強迫症(OCD)及/或精神病，包括精神分裂症(認知損傷)。
在一些實施例中，本發明之組合物當與用於治療ASD之另一療法組合使用時對預防、減輕或緩解ASD特別有效。此類療法包括抗精神劑、抗焦慮及抗抑鬱劑藥物。此類藥物包括利培酮(risperidone)(Risperdal®)；奧氮平(olanzapine)(Zyprexa®)；氟西汀(fluoxetine)(Prozac®)；舍曲林(sertraline)(Zoloft®)；氟伏沙明(fluvoxamine)(Luvox®)；氯米帕明(clomipramine)(Anafranil®)；鹵吡醇(haloperidol)(Haldol®)；硫利達嗪(thioridazine)；氟非那嗪(fluphenazine)；氯丙嗪；齊拉西酮(ziprasidone)(Geogon®)；卡馬西平(carbamazepine)(Tegretol®)；拉莫三嗪(lamotrigine)(Lamictal®)；托吡酯(topiramate)(Topomax®)；丙戊酸(Depakote®)；哌醋甲酯(methylphenidate) (Ritalin®)；地西泮(diazepam)(Valium®)及勞拉西泮(lorazepam)(Ativan®)。
關於用於治療自閉症譜系病症之醫學產品之臨床開發的EMA準則說明，歸因於疾病之異質性，使用單一化合物可能不會對全部核心症狀達成顯著影響，且因此必定展現對至少一種核心症狀之短期功效。實例中所用之活生物治療菌株已顯示有效治療自閉症譜系病症之至少一種核心症狀，因此此等菌株及相關布勞特氏菌屬菌株預期針對人類疾病為有效的。
強迫症(OCD)
OCD為屬於焦慮障礙之異質性、慢性且致殘之病症。根據DSM-IV定義，OCD之基本特徵為嚴重且耗時(一天超過一小時)之復發性強迫及/或強制(準則A)或引起明顯痛苦或顯著妨礙個體之正常慣例、職業功能、平常社交活動或關係(準則C)。因為在病症過程期間之一些點，該人已認識到強迫或強制為過度的或不合理的(準則B)。
強迫定義為所經歷之侵入性及不適當的復發性及持久性想法、衝動或想像且引起明顯焦慮或痛苦。該等想法、衝動或想像並非簡單地為過度擔心現實問題，其作為患者自己想法之產物而被患者識別(例如擔心污染、對稱強迫)。該人試圖忽略、抑制或以另外一些想法或動作來中和該等強迫。
強制定義為重複行為(例如洗手、順序、貯藏、檢驗)或精神動作(例如默默祈禱、計數、重複措辭)，其為人感到響應於強迫或根據必須嚴格應用之規則而被迫進行的。
OCD常常與包括以下各項之其他精神疾病之共病發病率相關：重度抑鬱障礙、其他焦慮障礙(廣泛性焦慮障礙、社交焦慮障礙、恐慌障礙)、物質濫用及飲食障礙(厭食症及暴食症)。
OCD為可歸因於微生物叢-腸-腦軸功能失調而發展或持續之精神病症。因此，在較佳實施例中，本發明之組合物係用於治療或預防個體之OCD。
在某些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解OCD之基本症狀特徵。在某些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體之復發性強迫及/或強制。在某些實施例中，強迫為所經歷之侵入性及不適當的復發性及持久性想法、衝動或想像且引起明顯焦慮或痛苦。在某些實施例中，強制為個體感到響應於強迫或根據必須嚴格應用之規則而被迫進行的重複行為。
在某些實施例中，根據Y-BOCS及/或NIMH-OC診斷及/或症狀量表，本發明之組合物改善個體之OCD症狀。在一些實施例中，Y-BOCS量表用於監測主要終點之改善。在一些實施例中，NIMH-OC量表用於監測二級參數之改善。
在一些實施例中，本發明之組合物改善用於評估精神及神經病症之臨床總體印象-總體改善(CGI-I)量表。在一些實施例中，本發明之組合物對患有ASD之個體的總體社交功能(關係、工作等)展示積極影響。在一些實施例中，總體量表為席漢殘疾量表(Sheehan disability scale)。
在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解OCD之至少一種共病。OCD之共病包括重度抑鬱障礙、其他焦慮障礙(廣泛性焦慮障礙、社交焦慮障礙、恐慌障礙)、物質濫用及飲食障礙(厭食症及暴食症)基列得拉吐瑞氏症候群(Gilles de la Tourette syndrome)、ADHD(注意力缺陷/活動過度障礙)及發育障礙。
在一些實施例中，本發明之組合物當與用於治療OCD之另一療法組合使用時對預防、減輕或緩解OCD特別有效。此類療法包括血清素及多巴胺再攝取抑制劑；氯米帕明及抗精神病劑。
重度抑鬱障礙(MDD)
MDD與實質性社交心理功能失調及高個體精神緊張有關並且具有過高發病率及死亡率(自殺風險相當大)。術語重度抑鬱障礙涵蓋臨床抑鬱症、重 度抑鬱症、單極性抑鬱症、單極性病症、復發性抑鬱症及簡單地抑鬱症。術語重度抑鬱障礙覆蓋情緒障礙；精神抑鬱；慢性抑鬱；季節性情感障礙及邊緣型人格障礙。
根據DMS-5準則，MDD症狀包括情緒抑鬱或日常活動之興趣或快樂喪失超過兩週；及社交、職業及教育功能受損。幾乎每天存在特定症狀(以下九種中之至少五種)：一天中大多數時間情緒抑鬱或易怒；每天大多數時間對大多數活動之興趣或快樂減少；顯著體重變化或食慾變化；睡眠變化(失眠症或嗜睡症)；積極性變化(精神運動性激動或遲緩)；疲勞或能量損失；負罪感或無用感(感到無價值或過度或不適當之內疚)；專注力下降(思考或專注能力削弱，或更猶豫不決；及自殺傾向(死亡或自殺想法，或個體具有自殺計劃)。此外，MDD與包括以下各項之焦慮症狀有關：不合理之擔憂；全神貫注於令人不愉快之擔憂；難以放鬆及/或感到緊張。MDD事件可為輕度、中度或重度的。
MDD事件常常與同如帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、腦血管病症、癌症及慢性疼痛症候群之其他精神病症或軀體病症的共病相關。MDD經常與作為共病之廣譜之其他精神障礙相關，包括廣泛性焦慮障礙；焦慮障礙；物質使用障礙；創傷後壓力障礙(PTSD)；人格障礙；疼痛；壓力；腸易激症候群；失眠症；頭痛及人際問題。
重度抑鬱障礙為可歸因於微生物叢-腸-腦軸功能失調而發展或持續之精神病症。因此，在較佳實施例中，本發明之組合物係用於治療或預防個體之MDD。
在某些實施例中，本發明之組合物係用於治療或預防急性重度抑鬱事件及/或預防新事件(復發預防)。在某些實施例中，本發明之組合物預防、減少或緩和輕度、中度或重度MDD事件之發生。
在某些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解如根據本文所 列之DMS-5準則所歸類之MDD症狀中之一或多者。在一較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體之情緒抑鬱。在一較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體在大多數活動中之興趣或快樂減少。在一些實施例中，本發明之組合物在2-週時間內減少MDD症狀之發生。
在一些實施例中，根據症狀或診斷量表本發明之組合物改善MDD症狀。用於評估症狀改善之此類量表包括漢密爾頓抑鬱評定量表(Hamilton Rating Scale of Depression，HAMD)及蒙哥馬利阿斯伯格抑鬱評定量表(Montgomery Asberg Depression Rating Scale)。此外，祖恩抑鬱自我評定量表(SDS)及祖恩焦慮症自我評定量表(SAS)亦為適合之症狀改善量表。
在一些實施例中，本發明之組合物改善用於評估精神及神經病症之臨床總體印象-總體改善(CGI-I)量表。在一些實施例中，本發明之組合物對患有MDD之個體的總體社交及職業功能展示積極影響。
在某些實施例中，本發明之組合物係用於治療或預防抗治療性MDD。
在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解MDD之至少一種共病。MDD之共病包括廣泛性焦慮障礙；焦慮障礙；物質使用障礙；創傷後壓力障礙(PTSD)；人格障礙；疼痛；壓力；IBS；失眠症；頭痛及人際問題。
在一些實施例中，本發明之組合物當與用於治療MDD之另一療法組合使用時對預防、減輕或緩解MDD特別有效。此類療法包括抗抑鬱劑、加強策略(例如組合療法、鋰及其他情緒穩定劑、甲狀腺激素及非典型性抗精神病劑)或甚至第二代抗精神病劑。
焦慮障礙
焦慮障礙為以感到焦慮及恐懼為特徵之精神障礙的群組。存在許多焦慮障礙，包括廣泛性焦慮障礙(GAD)；特定恐懼症；社交焦慮障礙；分離焦慮 障礙；廣場恐懼症；恐慌障礙及選擇性緘默症。
GAD係根據DMS-5以六個準則來診斷。第一準則為過於焦慮或擔憂歷時超過六個月，其中該焦慮或擔憂為關於許多活動在大多數時間存在的。第二準則為個體不能管理第一準則之症狀。第三準則為發生以下各項中之至少三者(在兒童中為一者)：不安；容易疲勞；專注問題；易怒；肌肉緊張及睡眠問題。最後三個準則為症狀產生顯著社交、職業及功能損傷；症狀並非歸因於藥劑、藥物或其他身體健康問題；及症狀不更好地符合另一精神問題，諸如恐慌障礙。全部其他焦慮障礙均可視為GAD之鑑別診斷。
GAD經常與作為共病之廣譜之其他精神障礙相關，包括抑鬱；物質使用障礙；壓力；IBS；失眠症；頭痛；疼痛；心臟事件；人際問題及ADHD。
焦慮障礙為可歸因於微生物叢-腸-腦軸功能失調而發展或持續之精神病症。因此，在較佳實施例中，本發明之組合物係用於治療或預防個體之焦慮障礙。在某些實施例中，焦慮障礙為廣泛性焦慮障礙(GAD)；特定恐懼症；社交焦慮障礙；分離焦慮障礙；廣場恐懼症；恐慌障礙及選擇性緘默症。
在某些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體之如根據本文所列之DMS-5準則所歸類之GAD症狀中之一或多者。根據DMS-5，相同症狀與其他焦慮障礙有關。因此，在某些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體之焦慮障礙症狀中之一或多者。在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體之焦慮或擔憂。在某些實施例中，本發明之組合物在六個月時間內減少症狀之發生。在某些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解不安；疲勞；專注力喪失；易怒；肌肉緊張；及/或睡眠問題。在一些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解與焦慮障礙相關之社交、職業及功能損傷。
在一些實施例中，根據症狀或診斷量表本發明之組合物改善焦慮障 礙之症狀。在某些實施例中，用於評估症狀改善之量表包括漢密爾頓焦慮評定量表(HAM-A)。在一些實施例中，HAM-A總量表用於評估主要終點。在其他實施例中，HAM-A精神焦慮因素可適合作為次要終點。
在一些實施例中，本發明之組合物改善用於評估精神及神經病症之臨床總體印象-總體改善(CGI-I)量表。在一些實施例中，本發明之組合物對患有焦慮障礙之個體的總體社交、職業及功能損傷展示積極影響。在一些實施例中，總體量表為席漢殘疾量表。
在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解GAD及焦慮障礙之至少一種共病。GAD之共病包括抑鬱；物質使用障礙；壓力；IBS；失眠症；頭痛；疼痛；心臟事件；人際問題及ADHD。
在一些實施例中，本發明之組合物當與用於治療焦慮障礙之另一療法組合使用時對預防、減輕或緩解焦慮障礙特別有效。此類療法包括選擇性血清素再攝取抑制劑(文拉法辛(venlafaxine)、度洛西汀(duloxetine)、艾司西酞普蘭(escitalopram)及帕羅西汀(paroxetine))；苯并二氮呯(阿普唑侖(alprazolam)、勞拉西泮(lorazepam)及氯硝西泮(clonazepam))；普瑞巴林(pregabalin)(Lyrica®)及加巴噴丁(gabapentin)(Neurontin®)；血清素受體部分促效劑(丁螺環酮及坦度螺酮(tandospirone))；非典型性血清素能抗抑鬱劑(諸如伊米帕明(imipramine)及氯米帕明)、單胺氧化酶抑制劑(MAOI)(諸如嗎氯貝胺(moclobemide)及苯乙肼)；羥嗪；普萘洛爾(propranolol)；可尼丁(clonidine)；胍法辛(guanfacine)及哌唑嗪。
創傷後壓力障礙(PTSD)
PTSD為嚴重且致殘之病症，其基本特徵為包括創傷事件作為此病症之誘發因素。
根據DMS-V準則將PTSD之症狀分組至四個主要群集中：(i)侵擾：實例包括惡夢、不希望有之創傷事件想法、閃回及以情緒痛苦或生理反應性對 創傷提示起反應；(ii)回避：實例包括避免引起創傷記憶，包括地點、場合或其他提示；(iii)認知及情緒之陰性改變：實例包括因創傷事件而扭曲責備自己或他人、關於自己或世界之消極看法、持久之消極情緒(例如恐懼、內疚、羞愧)、感到疏遠及情感受限(例如不能經歷積極情緒)；(iv)警覺性及反應性之改變：實例包括生氣、魯莽或自毀行為、睡眠問題、專注力問題、吃驚反應增加及過度警覺。
創傷事件4週內消除之症狀符合急性壓力障礙之準則。DSM將急性(症狀持續不到三個月)與慢性PTSD(症狀持續長於3個月)區別開。若症狀在壓力源之後超過6個月時開始，則將病症定義為延遲發作之PTSD。
PTSD帶有與重度抑鬱障礙及物質使用障礙之高共病率。
PTSD為可歸因於微生物叢-腸-腦軸功能失調而發展或持續之精神病症。因此，在較佳實施例中，本發明之組合物係用於治療或預防個體之PTSD。根據類似發病機理，在某些實施例中，本發明之組合物係用於治療或預防壓力障礙。在某些實施例中，本發明之組合物治療急性壓力障礙。在一些實施例中，本發明之組合物治療急性及/或慢性PTSD。在一些實施例中，本發明之組合物治療延遲發作之PTSD。
在某些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體之如根據本文所列之DMS-5準則所歸類之PTSD(或壓力障礙)症狀中之一或多者。在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解患有PTSD之個體的侵入性想法。在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解患有PTSD之個體的回避行為。在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解患有PTSD之個體的認知及情緒的陰性改變。在較佳實施例中，本發明之組合物預防患有PTSD之個體的警覺性及反應性的改變。
在一些實施例中，根據症狀或診斷量表本發明之組合物改善PTSD 及壓力障礙之症狀。在某些實施例中，用於評估症狀改善之量表為PTSD臨床管理(CAPS)量表。
在一些實施例中，本發明之組合物改善用於評估精神及神經病症之臨床總體印象-總體改善(CGI-I)量表。在一些實施例中，本發明之組合物對患有PTSD及壓力障礙之個體的總體社交、職業及功能損傷展示積極影響。在一些實施例中，總體量表為席漢殘疾量表。
在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解PTSD及壓力障礙之至少一種共病。PTSD及壓力障礙之共病包括MDD、物質使用障礙；壓力及焦慮。
在一些實施例中，本發明之組合物當與用於治療PTSD及壓力障礙之另一療法組合使用時對預防、減輕或緩解PTSD及壓力障礙特別有效。此類療法包括血清素能劑、三環抗抑鬱劑、情緒穩定劑、腎上腺素能抑制劑、抗精神病劑、苯并二氮呯、舍曲林(Zoloft®)、氟西汀(Prozac®)及/或帕羅西汀(Paxil®)。
精神分裂症譜系及精神病性病症
此等疾病影響個體清楚思考、作出正確判斷、在情緒上作出反應、有效溝通、理解現實及適當表現之能力。精神疾病包括精神分裂症(症狀列舉如下)；情感分裂性障礙(個體具有精神分裂症與情緒障礙之症狀，諸如抑鬱或雙極性障礙)；精神分裂症樣障礙(展示精神分裂症之症狀，但症狀持續較短時間：在1至6個月之間)；短時精神病性病症(個體展示突然、短期精神病行為，常常係響應於非常緊張之事件，諸如家人死亡-恢復通常不到一個月)；妄想障礙(妄想持續至少1個月)；共有型精神病性病症；物質誘導之精神病性病症；歸因於另一醫學病狀之精神病性病症；妄想癡呆(展示類似於精神分裂症之症狀且在晚年當人年老時開始)。最熟知之精神病性病症為精神分裂症且大部分精神病性病症展示與精神分裂症類似之症狀。
精神分裂症為具有異質性過程及症狀型態之重度精神疾病。精神分裂症臨床上與所謂的陽性及陰性症狀一起存在。陽性症狀包括妄想、幻覺、無組織之言語及無組織或緊張性行為。陰性症狀包括情感冷淡、想法及言語之流利性及多產性方面以及開始有目的行為方面的限制。陽性症狀似乎反映正常功能之過量或扭曲，而陰性症狀似乎反映正常功能之減少或喪失。此外，認知缺陷(工作記憶、資訊處理、注意力/警惕性、學習、推理及社交認知之缺陷)為常見的。在當前抗精神病治療之情況下，認知缺陷通常顯示不良改善。精神分裂症患者亦具有情緒症狀。除此等主導症狀之外，精神分裂症亦與同諸如以下其他精神症狀之共病有關：躁狂及抑鬱症狀、焦慮或強迫症狀、物質濫用及依賴及人格障礙。
根據DMS-5，對於精神分裂症之診斷，個體必須具有以下症狀中之至少兩者：妄想；幻覺；無組織之言語；無組織或緊張性行為及陰性症狀。該等症狀中之至少一者必須為存在妄想、幻覺或無組織之言語。連續紊亂跡象必須持續至少6個月，在此期間個體必須經歷至少1個月之活動性症狀，並且在大量時間內發生社交或職業退化問題。
精神分裂症譜系及精神病性病症為可歸因於微生物叢-腸-腦軸功能失調而發展或持續之精神病症。因此，在較佳實施例中，本發明之組合物係用於治療或預防個體之精神分裂症譜系及/或精神病性病症。在某些實施例中，精神分裂症譜系及精神病性病症係選自精神分裂症；情感分裂性病症；精神分裂症樣病症；短時精神病性病症；妄想障礙；共有型精神病性病症；物質誘導之精神病性病症；歸因於另一醫學病狀之精神病性病症及妄想癡呆。在較佳實施例中，本發明之組合物係用於治療或預防精神分裂症。在某些實施例中，精神分裂症係選自偏執狂樣、無組織、緊張性、未分化及其餘精神分裂症。
在某些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體之如根據 本文所列之DMS-5準則所歸類之精神分裂症症狀中之一或多者。此等實施例適用於預防、減輕或緩解其他精神分裂症譜系及精神病性病症之症狀。在某些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解精神分裂症之陰性症狀。在某些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解精神分裂症之陽性症狀。在某些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解精神分裂症之陰性及陽性症狀。在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解患有精神分裂症之個體的妄想、幻覺、無組織之言語及無組織或緊張性行為。在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解患有精神分裂症之個體的情感冷淡、想法及言語之流利性及多產性方面及開始有目的行為方面之限制。在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解患有精神分裂症之個體的認知缺陷及/或情緒障礙。
在某些實施例中，本發明之組合物在6個月時間內減少個體中精神分裂症之陽性及/或陰性症狀之發生。在某些實施例中，本發明之組合物改善患有精神分裂症譜系或精神病性病症之個體的社交及/或職業功能。
在一些實施例中，根據症狀或診斷量表本發明之組合物改善精神分裂症譜系或精神病性病症之症狀。在某些實施例中，用於評估症狀改善之量表為陽性及陰性症狀量表(PANSS)及簡明精神病學評定量表(BPRS)。在某些實施例中，使用用於評估陰性症狀(SANS)之量表。
在一些實施例中，本發明之組合物改善用於評估精神及神經病症之臨床總體印象-總體改善(CGI-I)量表。在一些實施例中，本發明之組合物對患有精神分裂症譜系或精神病性病症之個體的總體社交及職業損傷展示積極影響。
在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解精神分裂症譜系或精神病性病症之至少一種共病。在某些實施例中，共病呈躁狂及抑鬱症狀、焦慮或強迫症狀、物質濫用及依賴及人格障礙形式。
在某些實施例中，本發明之組合物係用於治療或預防抗治療性難治 性精神分裂症。
在一些實施例中，本發明之組合物當與用於治療PTSD及壓力障礙之另一療法組合使用時對預防、減輕或精神精神分裂症譜系或精神病性病症特別有效。在某些實施例中，此類療法包括第一代抗精神病劑，包括氯丙嗪、氟非那嗪、鹵吡醇及/或過非那嗪(perphenazine)。在某些實施例中，此類療法包括第二代療法，包括阿立哌唑(aripiprazole)(Abilify®)；阿塞那平(asenapine)(Saphris®)；依匹哌唑(brexpiprazole)(Rexulti®)；卡利拉嗪(cariprazine)(Vraylar®)；氯氮平(clozapine)(Clozaril®)；伊潘立酮(iloperidone)(Fanapt®)；魯拉西酮(lurasidone)(Latuda®)；奧氮平(Zyprexa®)；帕利哌酮(paliperidone)(Invega)；喹硫平(quetiapine)(Seroquel®)；利培酮(Risperdal®)；齊拉西酮(Geodon®)。
雙極性障礙
雙極性障礙一般為慢性病。躁狂症為雙極性障礙之主要症狀。根據特定躁狂及抑鬱事件之持續時間及模式，存在若干類型之雙極性障礙。在DMS-5中，在I型雙極性病症、II型雙極性病症、循環性精神病症、快速循環雙極性障礙及雙極性障礙NOS之間進行區分。
根據DSM，躁狂症為明顯之異常及持續升高、擴張或易怒情緒時期。事件必須持續一週，且情緒必須具有以下症狀中之至少三者：高自尊；睡眠需要減少；言語速率增加；想法快速跳躍；容易分心；對物體或活動之興趣增加；精神運動性激動；對高危風險活動之追求增加。
I型雙極性病症涉及一或多個躁狂或混合(躁狂症及抑鬱症)事件及至少一個重度抑鬱事件(MDD事件之症狀參見上文)。II型雙極性病症具有一或多個重度抑鬱事件，伴隨至少一個輕度躁狂事件。不存在躁狂或混合事件。輕度躁狂症為躁狂症之較輕形式。該等症狀引起顯著社交、職業及功能損傷。循環 性精神病之特徵為改變之低水準抑鬱症以及輕度躁狂症時期。在可進行診斷之前該等症狀在成人中必須存在至少兩年或在兒童中存在一年。成人及兒童中之無症狀時期分別持續不長於兩個月或一個月。快速循環雙極性障礙為嚴重形式之雙極性障礙。其係在人在一年內具有重度抑鬱症、躁狂症、輕度躁狂症或混合狀態之至少四個事件時發生。未另外說明(NOS)之雙極性障礙歸類不明顯符合其他類型之雙極性症狀。當存在多個雙極性症狀但不足以符合其他亞型中之任一者的標誌時診斷為NOS。
雙極性障礙與以下共病有關：ADHD；焦慮障礙；物質障礙；肥胖症及代謝症候群。
雙極性障礙為可歸因於微生物叢-腸-腦軸功能失調而發展或持續之精神病症。因此，在較佳實施例中，本發明之組合物係用於治療或預防個體之雙極性障礙。在某些實施例中，雙極性障礙為I型雙極性病症。在某些實施例中，雙極性障礙為II型雙極性病症。在某些實施例中，雙極性障礙為循環性精神病病症。在某些實施例中，雙極性障礙為快速循環雙極性障礙。在某些實施例中，雙極性障礙為雙極性障礙NOS。
在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體之雙極性障礙症狀中之一或多者。在某些實施例中，本發明之組合物預防、減少或緩和個體中躁狂事件之發生。在某些實施例中，本發明之組合物預防、減少或緩和異常及持續升高、擴張或易怒情緒之發生。在某些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解以下症狀中之一或多者：高自尊；睡眠需要減少；言語速率增加；想法快速跳躍；容易分心；對物體或活動之興趣增加；精神運動性激動；對高危風險活動之追求增加。在某些實施例中，本發明之組合物預防、減少或緩和個體中一或多個躁狂或混合事件之發生。在某些實施例中，本發明之組合物減少個體中至少一個重度抑鬱事件之發生。在某些實施例中，本發明之組合 物預防、減少或緩和至少一個重度抑鬱事件伴隨至少一個輕度躁狂事件之發生。
在較佳實施例中，本發明之組合物治療急性期之雙極性障礙及/或預防其他事件之發生。在某些實施例中，本發明之組合物治療患有雙極性障礙之個體的急性期躁狂/抑鬱事件且預防其他躁狂/抑鬱事件之發生。
在一些實施例中，根據症狀或診斷量表本發明之組合物改善雙極性障礙之症狀。在某些實施例中，用於評估躁狂事件之症狀改善之量表為躁狂狀態評定量表及楊氏躁狂症評定量表(Young Mania Rating Scale)。在某些實施例中，量表為倍克-拉範森躁狂症量表(Bech-Rafaelsen Mania Scale，BRMAS)。在某些實施例中，用於評估自躁狂事件轉換至抑鬱事件之症狀改善之量表包括漢密爾頓抑鬱評定量表、蒙哥馬利郡-阿斯伯格評定量表及倍克-拉範森抑鬱量表。
在一些實施例中，本發明之組合物改善用於評估精神及神經病症之臨床總體印象-總體改善(CGI-I)量表。在一些實施例中，本發明之組合物對患有雙極性障礙之個體的總體社交、職業及功能損傷展示積極影響。
在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解雙極性障礙之至少一種共病。在某些實施例中，共病係選自ADHD、焦慮障礙、物質障礙、肥胖症及代謝症候群。
在某些實施例中，本發明之組合物係用於治療或預防對鋰及雙丙戊酸鹽無反應之躁狂抑鬱病及雙極性障礙。
在一些實施例中，本發明之組合物當與用於治療雙極性障礙之另一療法組合使用時對預防、減輕或緩解雙極性障礙特別有效。在某些實施例中，此類療法包括碳酸鋰、抗驚厥藥物(包括丙戊酸鹽、雙丙戊酸鹽、卡馬西平及拉莫三嗪)及抗精神病藥物(包括阿立哌唑、奧氮平、喹硫平及利培酮)。
神經認知障礙及阿爾茨海默氏病
在DSM-5中，將術語癡呆用術語重度神經認知障礙及輕度神經認知 障礙替換。神經認知障礙為異質性類別之精神疾病。最常見之神經認知障礙為阿爾茨海默氏病，隨後為血管性癡呆或兩者之混合形式。其他形式之神經退行性病症(例如路易體病(Lewy body disease)、額顳癡呆、帕金森氏癡呆(Parkinson’s dementia)、克羅伊茨費爾特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)、亨廷頓氏病及韋尼克-柯沙可夫症候群(Wernicke-Korsakoff syndrome))伴隨有癡呆。
根據DSM-5之癡呆症狀準則為在一或多種選自以下之認知範圍中認知自先前表現水準顯著衰退之證據：學習及記憶；語言；執行功能；複雜注意力；知覺運動及社交認知。認知缺陷必定妨礙在日常活動中之獨立性。此外，在精神錯亂之情形中不排他地發生認知缺陷且藉由另一精神障礙(例如MDD或精神分裂症)不能更好地解釋。
除主要症狀之外，患有神經認知障礙之個體展示行為及精神症狀，包括激動、攻擊性、抑鬱、焦慮、冷漠、精神病及睡眠覺醒循環紊亂。
神經認知障礙為可歸因於微生物叢-腸-腦軸功能失調而發展或持續之精神病症。因此，在較佳實施例中，本發明之組合物係用於治療或預防個體之神經認知障礙。在較佳實施例中，神經認知障礙為阿爾茨海默氏病。在其他實施例中，神經認知障礙係選自血管性癡呆；阿爾茨海默氏病及血管性癡呆混合形式；路易體病；額顳癡呆；帕金森氏癡呆；克羅伊茨費爾特-雅各布病；亨廷頓氏病；及韋尼克-柯沙可夫症候群。
在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體之神經認知障礙症狀中之一或多者。在某些實施例中，本發明之組合物預防、減少或緩和個體之認知衰退之發生。在某些實施例中，本發明之組合物改善患有神經認知障礙之個體在一或多種選自以下之認知範圍中的表現水準：學習及記憶；語言；執行功能；複雜注意力；知覺運動及社交認知。在一些實施例中，本發明之組合物預防、減少或緩和與神經認知障礙相關之一或多種選自以下之行為及 精神症狀之發生：激動、攻擊性、抑鬱、焦慮、冷漠、精神病及睡眠覺醒循環紊亂。
在某些實施例中，本發明之組合物藉由在臨床前階段干預疑似發病機理來預防、減輕或緩解症狀性疾病。在某些實施例中，本發明之組合物以減慢或抑制症狀進展來改善疾病修飾(disease modification)。在一些實施例中，減慢或抑制症狀進展與延遲潛在神經病理學過程方面之證據有關。在較佳實施例中，本發明之組合物改善神經認知障礙之症狀，包含增強之認知及功能改善。在較佳實施例中，本發明之組合物改善癡呆(BPSD)之行為及精神症狀。在較佳實施例中，本發明之組合物改善患有神經認知障礙之個體進行日常活動的能力。
在較佳實施例中，本發明之組合物改善患有阿爾茨海默氏病之個體的認知與功能兩者。在一些實施例中，本發明之組合物改善患有阿爾茨海默氏病之個體的認知終點。在一些實施例中，本發明之組合物改善患有阿爾茨海默氏病之個體的功能終點。在較佳實施例中，本發明之組合物改善患有阿爾茨海默氏病之個體的認知及功能終點。在其他較佳實施例中，本發明之組合物改善患有阿爾茨海默氏病之個體的總臨床反應(總體終點)。
在一些實施例中，根據症狀或診斷測試本發明之組合物改善神經認知障礙之症狀。在某些實施例中，用於評估阿爾茨海默氏病(及其他神經認知障礙)之症狀改善之測試係選自物體認知、日常生活之活動、變化總體評估、健康相關生活品質測試及評估神經認知障礙之行為及精神症狀的測試。
在某些實施例中，用於評估症狀改善之物體認知測試使用阿爾茨海默氏病評估量表認知子量表(ADAS-cog)及經典ADAS量表。在某些實施例中，使用用於阿爾茨海默氏病之神經生理學測試系列(NTB)來評估認知之症狀改善。
在一些實施例中，變化總體評估測試使用用於評估精神及神經病症之臨床總體印象-總體改善(CGI-I)量表。在一些實施例中，總體量表為基於臨床 醫師訪視之改變印象量表(Clinician's Interview Based Impression of Change plus，CIBIC-plus)。在一些實施例中，總體量表為阿爾茨海默氏病合作研究單位臨床醫師總體變化印象(ADCS-CGIC)。
在某些實施例中，健康相關生活品質量測為阿爾茨海默氏病相關QOL(ADRQL)及QOL-阿爾茨海默氏病(QOL-AD)。
在某些實施例中，評估神經認知障礙之行為及精神症狀之測試係選自阿爾茨海默氏病行為病理學評定量表(BEHAVE-AD)；癡呆行為評定量表(BRSD)；神經精神調查表(NPI)；及柯恩-曼斯菲而德激動行為調查表(Cohen-Mansfield Agitation Inventory，CMAI)。
在一些實施例中，本發明之組合物當與用於治療神經認知障礙之另一療法組合使用時對預防、減輕或緩解神經認知障礙特別有效。在某些實施例中，此類療法包括乙醯膽鹼酯酶抑制劑，包括多奈哌齊(donepezil)(Aricept®)、加蘭他敏(galantamine)(Razadyne®)及利斯的明(rivastigmine)(Exelon®)；及美金剛。
帕金森氏病
帕金森氏病為常見神經退行性疾病，其神經病理學特徵為神經細胞(產生多巴胺之細胞)之異質性群體之退化。帕金森氏病之臨床診斷需要動作遲緩及以下核心症狀中之至少一者：靜止性震顫；肌肉僵硬及姿勢反射損傷。疾病進展期間可存在或發展之其他跡象及症狀為自主性紊亂(流涎、皮脂溢出、便秘、排尿紊亂、性功能問題、立位低血壓、多汗症)、睡眠紊亂及嗅覺感覺或溫度感覺紊亂。抑鬱症狀及認知功能障礙共病在許多帕金森氏病患者以及與路易體有關之神經認知障礙中發展。
帕金森氏病為可歸因於微生物叢-腸-腦軸功能失調而發展或持續之精神病症。因此，在較佳實施例中，本發明之組合物係用於治療或預防個體之 帕金森氏病。
在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體之帕金森氏病症狀中之一或多者。在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體之帕金森氏病之一或多種核心症狀。在某些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體之動作遲緩。在某些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體之靜止性震顫；肌肉僵硬及/或姿勢反射損傷。在某些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解與帕金森氏病進展相關之一或多種選自以下之症狀：自主性紊亂(流涎、皮脂溢出、便秘、排尿紊亂、性功能問題、立位低血壓、多汗症)、睡眠紊亂及嗅覺感覺或溫度感覺紊亂。
在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解作為帕金森氏病之共病的抑鬱症狀。在某些實施例中，本發明之組合物改善詞語記憶及/或執行功能。在某些實施例中，本發明之組合物改善注意力、工作記憶、詞語流利性及/或焦慮。
在其他較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解作為帕金森氏病之共病的認知功能障礙。
在某些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解帕金森氏病之進展。在某些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解後期運動併發症。在某些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解後期運動波動。在某些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解神經元丟失。在某些實施例中，本發明之組合物改善帕金森氏病癡呆(PDD)之症狀。在某些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解執行功能、注意力及/或工作記憶之損傷。在某些實施例中，本發明之組合物改善多巴胺能神經傳遞。在某些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解受損之多巴胺能神經傳遞。
在一些實施例中，根據症狀或診斷量表本發明之組合物改善帕金森 氏病之症狀。在某些實施例中，用於評估帕金森氏病中之運動功能症狀改善之測試為統一帕金森氏病評定量表。特定而言，UPDRS II考慮日常生活之活動而UPDRS III考慮運動檢驗。
在一些實施例中，根據症狀或診斷測試及/或量表本發明之組合物改善與PDD相關之症狀。在某些實施例中，測試或量表係選自霍普金斯詞語學習測驗修正版(Hopkins Verbal Learning Test-Revised，HVLT-R)；戴利斯-卡普蘭執行功能系統(Delis-Kaplan Executive Function System，D-KEFS)顏色-字語干擾測試；漢密爾頓抑鬱評定量表(HAM-D 17；抑鬱)；漢密爾頓焦慮評定量表(HAM-A；焦慮)及統一帕金森氏病評定量表(UPDRS；PD症狀嚴重程度)。
在一些實施例中，本發明之組合物改善用於評估精神及神經病症之臨床總體印象-總體改善(CGI-I)量表。在一些實施例中，本發明之組合物對患有帕金森氏病之個體的總體社交及職業損傷展示積極影響。
在一些實施例中，本發明之組合物當與用於治療神經認知障礙之另一療法組合使用時對預防、減輕或緩解神經認知障礙特別有效。在某些實施例中，此類療法包括多巴胺促效劑(包括L-Dopa+)；單胺氧化酶抑制劑、兒茶酚胺-O-甲基轉移酶抑制劑；抗膽鹼能劑及麩胺酸鹽調節劑。
其他中樞神經系統病症
在較佳實施例中，本發明之組合物係用於治療或預防與微生物叢-腸-腦軸功能失調相關之中樞神經系統病症。除以上實施例之外，本發明之組合物係用於治療或預防精神病；慢性疲勞症候群(肌痛性腦脊髓炎)及/或慢性疼痛。在其他實施例中，本發明之組合物可適用於治療或預防運動神經元病；亨廷頓氏病；格林-巴利症候群及/或腦膜炎。
亨廷頓氏病
亨廷頓氏病為由遺傳性缺陷基因引起之遺傳性腦部病狀，其損害腦 中之某些神經細胞。此腦損傷隨時間推移逐漸變得更糟且可影響運動、認知(感知、意識、思考、判斷)及行為。該疾病之早期特徵可包括個性改變、情緒波動、不安運動、易怒及改變之行為。
在某些實施例中，本發明之組合物係用於治療或預防亨廷頓氏病。在某些實施例中，本發明之組合物管理亨廷頓氏病之症狀，諸如易怒或過分之運動。在某些實施例中，本發明之組合物治療與亨廷頓氏病相關之抑鬱及/或改善症狀，諸如社交退縮、缺乏興趣及睡眠紊亂。在某些實施例中，本發明之組合物改善記憶及專注於任務之能力。在某些實施例中，本發明之組合物治療致殘異常運動。在某些實施例中，本發明之組合物治療行為問題、反社交行為、易怒及與亨廷頓氏病相關之精神病。在某些實施例中，本發明之組合物誘導神經保護且預防神經損傷。在某些實施例中，本發明之組合物增加多巴胺之含量及/或含多巴胺之細胞的含量。
神經化學因子、神經肽及神經遞質及微生物叢-腸-腦軸
如上文所概述，微生物叢-腸-腦軸由許多不同生理系統調節。微生物叢-腸-腦軸由許多信號傳導分子調節。此等信號傳導分子含量改變引起中樞神經系統發育及/或功能方面之缺陷。實際上，微生物叢-腸-腦軸之功能及中樞神經系統病症或病狀之發病機理中涉及本部分中所揭示之許多分子([14]、[32]、[10]、[33])。由本發明人進行之實驗表明可藉由投與布勞特氏菌屬菌株觸發行為變化。此影響可為由對信號傳導分子，特定而言本部分中所列之彼等信號傳導分子的含量之影響所介導的。此等改變可引起與布勞特氏菌屬菌株相關之治療益處。因此，歸因於本文所揭示之中樞神經系統病症及病狀展示類似基礎生物化學及生理發病機理(亦即經由微生物叢-腸-腦軸)之事實，對於此等病症及病狀亦可達成布勞特氏菌屬菌株之類似治療益處。投與糞便布勞特氏菌可對觸發與中樞神經系統病症或病狀相關之行為變化特別有效。在某些實施例中，投與韋克 斯勒布勞特氏菌可對觸發與中樞神經系統病症或病狀相關之行為變化特別有效。
微生物叢-腸-腦軸之信號傳導係由神經化學因子、神經肽及神經遞質之含量調節。因此，在某些實施例中，本發明之組合物調節神經化學因素、神經肽及神經遞質之含量。因此，在某些較佳實施例中，本發明之組合物直接改變CNS生物化學。在較佳實施例中，本發明之組合物調節腦源性神經營養因子(BDNF)之含量。在某些實施例中，本發明之組合物調節單胺之含量。在某些實施例中，單胺為血清素(5-羥基色胺(5-HT))、多巴胺、降腎上腺素及/或腎上腺素。在某些實施例中，單胺為兒茶酚胺。在某些實施例中，兒茶酚胺為多巴胺、降腎上腺素及腎上腺素。在某些實施例中，單胺為色胺。在某些實施例中，色胺為血清素及褪黑素。在某些實施例中，本發明之組合物調節乙醯膽鹼之含量。
在某些較佳實施例中，本發明之組合物調節催產素之含量。催產素與情緒、社交、認知及神經內分泌生理學以及自調節有關。特定而言，催產素釋放參與抗焦慮；積極情緒；母性行為、配對結合；性行為；社交記憶；嗅覺記憶；食慾減退作用；HPA軸對壓力之反應的減弱；在出生及哺乳期間之自激勵以及其他生理及心理過程。在某些實施例中，本發明之組合物增加催產素之含量。在某些實施例中，本發明之組合物降低催產素之含量。在某些實施例中，本發明之組合物增加或減少催產素信號傳導。在某些實施例中，本發明之組合物調節催產素受體之含量。在某些實施例中，本發明之組合物調節進入神經元、肌肉及胃腸道細胞或從中出來之鈣離子的通量。在較佳實施例中，本發明之組合物藉由調節催產素之含量治療和預防與微生物叢-腸-腦軸相關之神經發育及神經精神病症及疾病。
在某些實施例中，本發明之組合物調節腦單胺及其代謝產物之含量。在較佳實施例中，單胺為血清素。在某些實施例中，本發明之組合物調節 色胺酸代謝之血清素能及/或犬尿胺酸途徑。在某些實施例中，本發明之組合物調節諸如5-羥基吲哚乙酸(5-HIAA)之血清素代謝產物之含量。在某些實施例中，本發明之組合物調節諸如高香草酸(HVA)之多巴胺代謝產物之含量。此等神經遞質及神經化學因子之調節適用於治療壓力、抑鬱症及焦慮相關病症。
微生物叢-腸-腦軸之信號傳導由γ-胺基丁酸(GABA)之含量調節。因此，在較佳實施例中，本發明之組合物調節GABA之含量。GABA為降低神經元興奮性之抑制性神經遞質。在某些實施例中，本發明之組合物增加GABA之含量。在某些實施例中，本發明之組合物降低GABA之含量。在某些實施例中，本發明之組合物改變GABA能神經傳遞。在某些實施例中，本發明之組合物調節中樞神經系統不同區中之GABA轉錄之水準。在某些實施例中，共生體衍生之GABA穿過血腦障壁且直接影響神經傳遞。在某些實施例中，本發明之組合物導致海馬、杏仁核及/或藍斑中之GABA減少。在某些實施例中，本發明之組合物使得皮質區中之GABA增加。
諸如血清素、褪黑素、GABA、組胺及乙醯膽鹼之神經活性分子之含量與諸如癡呆、阿爾茨海默氏病及亨廷頓氏病之中樞神經系統疾病的病理生理學有關。
微生物叢-腸-腦軸之信號傳導由組胺之含量調節。因此，在某些實施例中，本發明之組合物調節組胺之含量。在某些實施例中，組胺具有免疫調節作用。在某些實施例中，組胺含量使細菌能夠自管腔轉位至系統循環中。因此，在一些實施例中，本發明之組合物改變胃腸道滲透性及/或障壁功能。在某些其他實施例中，組胺充當與中樞過程有關之神經遞質。
微生物叢-腸-腦軸之信號傳導由HPA軸調節。因此，在某些實施例中，本發明之組合物調節HPA活性。在某些實施例中，本發明之組合物使HPA壓力反應減弱。在某些較佳實施例中，本發明之組合物調節與HPA活性相關之 炎性反應。在某些實施例中，本發明之組合物調節糖皮質素之含量。在某些較佳實施例中，本發明之組合物調節皮質固酮及腎上腺素之含量。在某些實施例中，本發明之組合物調節促腎上腺皮質素釋放因子及/或升壓素之含量。在某些實施例中，本發明之組合物調節升壓素及/或其他神經垂體或抗利尿激素之含量。HPA軸活性改變與焦慮及壓力障礙有關。
微生物叢-腸-腦軸之信號傳導由免疫反應及炎性因子及標記物之改變調節。因此，在某些實施例中，本發明之組合物可調節免疫反應。在某些實施例中，本發明之組合物調節循環神經免疫信號傳導分子之全身含量。在某些較佳實施例中，本發明之組合物調節促炎性細胞因子產生及炎症。在某些實施例中，本發明之組合物調節炎性狀態。在某些實施例中，本發明之組合物調節脾細胞增殖反應。在某些實施例中，本發明之組合物調節C-反應蛋白；IL-1家族細胞因子；IL-1β；IL-2；IL-4；IL-6；IL-8；IL-10；IL-12p40；IL-17；IL-17A；IL-21；IL-23；TNF-α及IFN-γ之全身及/或血漿含量。在一些實施例中，本發明之組合物調節抗炎性細胞因子(例如IL-10)之含量。在較佳實施例中，本發明之組合物增加IL-10之含量。在一些實施例中，本發明之組合物調節TNF-α之含量。在較佳實施例中，本發明之組合物調節IFN-γ之含量。在一些實施例中，本發明之組合物調節IFN-γ：IL-10比率。在某些較佳實施例中，本發明之組合物降低IFN-γ：IL-10比率。在較佳實施例中，本發明之組合物降低促炎性細胞因子TNF-α及IFN-γ之含量。增加之細胞因子循環含量與包括抑鬱、焦慮、精神分裂症及ASD之各種神經精神病症密切相關。在諸如精神分裂症、重度抑鬱障礙及雙極性障礙之病症中突出了炎性狀態改變之證據。
在某些實施例中，本發明之組合物調節介導耐受性之樹突細胞之含量且相互地調控促炎及抗炎性細胞因子反應。在某些實施例中，本發明之組合物降低髓過氧化物酶(炎症及氧化之標記物)之全身含量。免疫系統及炎性反應之 治療調節劑適用於治療自閉症譜系病症及情緒障礙。
在某些實施例中，本發明之組合物調節對感染或接種之免疫反應。在某些實施例中，本發明之組合物調節響應於感染或接種之炎症的水準。在某些較佳實施例中，本發明之組合物調節在妊娠期間響應於感染或接種之母體免疫活化。因此，可在妊娠期間投與本發明之組合物以治療或預防後代之中樞神經系統病症。
微生物叢-腸-腦軸之信號傳導由共生代謝產物之含量調節。因此，在某些實施例中，本發明之組合物調節微生物叢代謝產物之全身含量。在某些較佳實施例中，本發明之組合物調節短鏈脂肪酸(SCFA)之含量。在某些實施例中，SCFA之含量增加或降低。在一些實施例中，SCFA為丁酸(BA)(或丁酸鹽)。在一些實施例中，SCFA為丙酸(PPA)。在一些實施例中，SCFA為乙酸。在某些實施例中，本發明之組合物調節SCFA穿過血腦障壁之能力。在某些實施例中，本發明之組合物調節多醣A(PSA)之含量。在某些實施例中，本發明之組合物調節有效促炎性內毒素脂多醣(LPS)之含量。LPS引起炎性細胞因子之產生，從而改變生理大腦活動且調節神經肽合成。LPS對CNS之調節具有重要影響，增加致力於控制情緒之區域(例如杏仁核)的活性。在某些實施例中，本發明之組合物調節色胺酸及/或其代謝產物之含量。在某些實施例中，本發明之組合物調節4-乙基苯基硫酸鹽(4EPS；與ASD相關行為異常相關之尿毒症毒素)之含量。在較佳實施例中，本發明之組合物降低個體中4-乙基苯基硫酸鹽之含量。藉由刺激由管腔內腸道刺激引起之神經元信號傳導路徑所產生的信號有力調節大腦活動，包括疼痛感知、免疫反應調節、情緒控制及其他穩態功能。因此，能夠調節此等因子之含量的組合物對於治療或預防CNS病症而言將具有廣泛治療應用。
微生物叢-腸-腦軸之信號傳導由胃腸道滲透性之水準調節。因此，在一些實施例中，本發明之組合物改變胃腸道上皮之完整性。在某些實施例中， 本發明之組合物調節胃腸道之滲透性。在某些實施例中，本發明之組合物調節胃腸道之障壁功能及完整性。在某些實施例中，本發明之組合物調節胃腸道活力。在某些實施例中，本發明之組合物調節共生代謝產物及炎性信號傳導分子自胃腸道管腔至血流中之轉位。
微生物叢-腸-腦軸之信號傳導由胃腸道中之微生物群系組成調節。因此，在某些實施例中，本發明之組合物調節胃腸道之微生物群系組成。在某些實施例中，本發明之組合物預防微生物群系生態失調及毒性代謝產物(例如LPS)之相關增加。在某些實施例中，本發明之組合物調節胃腸道中梭狀芽胞桿菌屬之含量。在較佳實施例中，本發明之組合物降低胃腸道中梭狀芽胞桿菌屬之含量。在某些實施例中，本發明之組合物降低空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni )之含量。在某些實施例中，本發明之組合物調節有害厭氧菌之增殖及由此等細菌產生之神經毒素的產量。在某些實施例中，本發明之組合物調節乳桿菌屬及/或雙歧桿菌屬之微生物群系含量。在某些實施例中，本發明之組合物調節微生物群系含量之薩特氏菌屬、普雷沃菌屬、瘤胃球菌屬及/或產鹼菌科。在某些實施例中，本發明之組合物增加植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum )及/或布拉酵母(Saccharomyces boulardii )之含量。
在某些實施例中，本發明之組合物藉由大量使用抗生素預防微生物群系組成之失調。在某些較佳實施例中，本發明之組合物在妊娠期間投與抗生素後維持功能性母體微生物群系組成。因此，可在妊娠期間投與本發明之組合物以治療或預防後代之中樞神經系統病症。
調節微生物群系已顯示對改善精神病症相關行為，包括焦慮、抑鬱、自閉症譜系病症、強迫症及記憶能力(包括空間及非空間記憶)以及包括帕金森氏病之其他CNS相關病症為有效的。某些研究已表明益生菌可降低心理壓力、軀體化、抑鬱及憤怒-敵意。乳桿菌屬之含量與抑鬱有關且在與胃腸道不適相關之 疼痛信號傳導中有所涉及。
在某些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解與本文所描述之中樞神經系統病症相關之行為症狀中之至少一者。在較佳實施例中，本發明之組合物改善個體之總臨床反應。
在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體之刻板、重複行為。在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減少或緩和異常限制行為及/或興趣之發生。在某些實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體之復發性強迫及/或強制。在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體社交行為之缺陷。在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體之回避行為。在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體溝通行為之缺陷。
在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體之認知及情緒之陰性改變。在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體之焦慮相關行為。在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體之壓力相關行為。在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體之抑鬱相關行為。在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體之攻擊行為。在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減少或緩和異常及持續升高、擴張性或易怒情緒之發生。
在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體之侵入性想法。在較佳實施例中，本發明之組合物預防個體之警覺性及反應性之改變。在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體之妄想、幻覺、無組織之言語及無組織或緊張性行為。在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體之情感冷淡、想法及言語之流利性及多產性方面及開始有目的行為方面之限制。在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解以下症狀 中之一或多者：高自尊；睡眠需要減少；言語速率增加；想法快速跳躍；容易分心；對物體或活動之興趣增加；精神運動性激動；對高危風險活動之追求增加。
在較佳實施例中，本發明之組合物改善個體之空間及/或非空間記憶缺陷。在較佳實施例中，本發明之組合物改善個體之認知及功能兩者。在較佳實施例中，本發明之組合物改善個體之自主活動。在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體之動作遲緩。在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解個體之靜止性震顫；肌肉僵硬及/或姿勢反射損傷。
在較佳實施例中，本發明之組合物預防、減輕或緩解與本文所揭示之CNS病症相關之至少一種共病。
在較佳實施例中，本發明之組合物改善個體關於用於本文所描述之CNS病症的症狀及/或診斷量表中之至少一者的得分。在某些其他實施例中，症狀及/或診斷量表係選自一般健康問卷(GHQ)；抑鬱焦慮及壓力量表(DASS)；萊頓抑鬱敏感性指數修正版(Leiden Index of Depression Sensitivity-Revised，LEIDS-r)；陽性及陰性症狀量表(PANSS)；狀態特質焦慮調查表(STAI)；發育行為檢查表(DBC)；貝克抑鬱調查表(Beck Depression Inventory，BDI)；貝克焦慮調查表(Beck Anxiety Inventory，BAI)；霍普金斯症狀檢查表(Hopkins Symptom Checklist，HSCL-90)；醫院焦慮及抑鬱量表(HADS)；知覺壓力量表(PSS)；應對檢查表(CCL)(亦用於對付日常生活之壓力)；及基於問卷之情緒狀態分析(POMS)。
在某些實施例中，當在熟習此項技術者已知之CNS病症之其他動物模型中評估治療功效時本發明之組合物可改善症狀及/或診斷量表。除實例中所揭示之行為分析之外，本發明之組合物可改善互惠社交互動；嗅覺溝通；超音波發聲；運動刻板(諸如轉圈及垂直跳躍)、重複行為，諸如自我梳理及挖掘；及 在空間任務中之毅力。
此外，本發明之組合物將適合用於治療及/或預防CNS病症之其他動物模型中的CNS病症。其他小鼠模型包括近交小鼠品系(包括BALB/cJ及C58/J)且亦包括經基因修飾之小鼠品系(包括NEUREXIN1、NEUROLIGIN3、NEUROLIGIN4、SHANK2、SHANK3、CNTNAP2、Tsc1/2 及Fmr1 基因突變異體小鼠品系)。
丁酸鹽為短鏈脂肪酸，其充當組蛋白去乙醯酶抑制劑，能夠通過G蛋白偶合受體進行信號傳導且在代謝路徑之調控中有所涉及。
實例證實嗜氫布勞特氏菌當以口服組合物形式投與時增加丁酸鹽之腸道含量。實例亦證實嗜氫布勞特氏菌適用於治療中樞神經系統病症及病狀。嗜氫布勞特氏菌之此作用可由丁酸鹽介導。
已將丁酸鹽與大腦之海馬及額葉皮質中之組蛋白去乙醯化相聯繫[34]且在亨廷頓氏病、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病及自閉症中有所涉及[35]。
在某些實施例中，用於本發明中之嗜氫布勞特氏菌菌株為丁酸鹽產生者。在某些實施例中，用於本發明中之嗜氫布勞特氏菌菌株藉由乙醯輔酶A、戊二酸鹽、4-胺基丁酸鹽及/或離胺酸路徑合成丁酸鹽。在某些實施例中，用於本發明中之嗜氫布勞特氏菌菌株代謝複合多醣(例如澱粉及木聚糖)以產生乙醯輔酶A，其可隨後用於合成丁酸鹽。在某些實施例中，用於本發明中之嗜氫布勞特氏菌菌株藉由結腸中之細菌醱酵產生丁酸鹽。
在某些較佳實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物調節丁酸鹽之含量。在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物增加丁酸鹽之含量。
在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物為組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑。在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組 合物抑制大腦之海馬及額葉皮質中之組蛋白去乙醯化。在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物增加組蛋白乙醯化且促進促存活、促再生及促可塑性基因之表現。在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物拯救組蛋白乙醯化，預防神經元細胞死亡且延長壽命(例如在亨廷頓氏病中)。在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物防止神經元發生細胞死亡(例如在帕金森氏病中)。在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物恢復組蛋白乙醯化且增加學習相關基因之表現(例如用於治療或預防阿爾茨海默氏病)。在某些實施例中，此等表觀遺傳修飾可為潛在精神病治療。
在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物的HDAC抑制劑活性影響參與神經元存活、可塑性及再生之許多基因的轉錄。在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物增加神經營養因子之啟動子周圍之乙醯化。在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物增加BDNF、GDNF及NGF之啟動子周圍之乙醯化。在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物增加BDNF、GDNF及NGF之表現。在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物增加參與可塑性之包括c-Fos及Homer1a之即刻早期基因之表現。在某些實施例中，腦中此等因子之表現發生改變。
在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物之去乙醯酶抑制活性維持非組蛋白蛋白質之乙醯化。在某些實施例中，乙醯化影響許多蛋白質之酶及代謝活性。舉例而言，HDAC抑制劑已顯示在氧化應力期間維持轉錄因子Sp1之乙醯化及活化，從而增強保護性適應反應以促進細胞存活。在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物預防活體內之氧化應力。
在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物恢復血腦障壁(BBB)完整性及/或額葉皮質、海馬及紋狀體中之緊密連接蛋白之表現(例如 水閘蛋白5及/或閉合蛋白)。在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物恢復及/或維持BBB完整性。在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物促進及/或維持緊密連接表現。因此，在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物可建立及/或維持針對與中樞神經系統病症，特定而言為神經發育障礙及/或神經精神病狀相關之炎性介體、神經化學因子、神經肽及神經遞質的障壁。
在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物抑制神經炎症。在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物增加IL-1RA(促炎性IL-1β之抑制劑)之含量。在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物降低促炎性IL-1β及/或TNFα之含量。在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物增加IL-4表現，其增加IL-1RA之含量。
在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物為消炎劑。在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物抑制因子κB(NF-κB)活化。因此，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物可調節包括以下之早期免疫發炎反應基因之表現：IL-1B、TNFα、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、可誘導硝酸合酶、環氧合酶-2、細胞間黏附分子-1、T細胞受體-α及MHC II類分子。
在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物影響粒線體活性。因此，在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物治療及/或預防阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷頓氏病、粒線體腦病變及/或腎上腺腦白質營養不良。
在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物影響通過GPCR進行之信號傳導。因此，在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物治療及/或預防帕金森氏病。
在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物影響組蛋 白乙醯化。因此，在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物治療及/或預防阿爾茨海默氏病、帕金森氏病及/或亨廷頓氏病。
在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物影響微生物群系穩態。因此，在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物治療及/或預防中樞神經系統病症及病狀。
在某些實施例中，本發明之包含嗜氫布勞特氏菌之組合物可觸發與中樞神經系統病症或病狀相關之行為變化之改善。
在某些實施例中，嗜氫布勞特氏菌之作用可能與丁酸鹽無關。舉例而言，實例證實投與嗜氫布勞特氏菌，但不單獨投與丁酸鹽，顯著增加小鼠之水平及垂直活動及在曠場模型中央所用之時間，表明在減輕焦慮方面之作用。特定而言，嗜氫布勞特氏菌在減輕焦慮樣及刻板行為方面展示功效，而丁酸鹽之功效限於減輕刻板行為。
投與模式
較佳地，本發明之組合物係要投與至胃腸道以使本發明之細菌菌株能夠遞送至及/或部分或完全定植於腸道。通常，本發明之組合物係經口投與，但其可經直腸、經鼻內或經由經頰或經舌下途徑投與。
在某些實施例中，本發明之組合物可以泡沫形式、以噴霧或凝膠形式投與。
在某些實施例中，本發明之組合物可以栓劑(諸如直腸栓劑)形式，例如以可可豆油(可可脂)、合成硬脂(例如suppocire、witepsol)、甘油基-明膠、聚乙二醇或肥皂甘油組合物形式投與。
在某些實施例中，本發明之組合物係經由管子，諸如鼻胃管、口胃管、胃管、空腸造口管(J管)、經皮內鏡胃造口述(PEG)；或孔口，諸如提供到達胃、空腸之入口的胸壁孔口及其他適合之入口孔投與至胃腸道。
本發明之組合物可一次投與，或其可作為治療方案之一部分依序投與。在某些實施例中，本發明之組合物係要每天投與。
在本發明之某些實施例中，伴隨根據本發明之治療進行患者腸道微生物叢之評估。若未達成本發明之菌株的遞送及/或部分或完全定植，以致未觀測到功效，則可將治療重複，或者若遞送及/或部分或總定植為成功的且觀測到功效，則可停止治療。
在某些實施例中，本發明之組合物可投與妊娠動物，例如哺乳動物，諸如人類，以防止其孩子在子宮內及/或在其出生之後發展炎性或自體免疫疾病。
可向已經診斷具有中樞神經系統病症或病狀，特定而言為由微生物叢-腸-腦軸介導之中樞神經系統病症或病狀，或已經鑑定為處於中樞神經系統病症或病狀，特定而言為由微生物叢-腸-腦軸介導之中樞神經系統病症或病狀之風險中的患者投與本發明之組合物。亦可作為預防措施投與組合物以防止健康患者中發展中樞神經系統病症或病狀，特定而言為由微生物叢-腸-腦軸介導之中樞神經系統病症或病狀。
本發明之組合物可向已經鑑定具有異常腸道微生物叢之患者投與。舉例而言，患者可具有減少或不存在之布勞特氏菌屬，特定而言為糞便布勞特氏菌或韋克斯勒布勞特氏菌的定植。舉例而言，患者可具有減少或不存在之布勞特氏菌屬，特定而言為糞便布勞特氏菌、韋克斯勒布勞特氏菌或嗜氫布勞特氏菌的定植。
本發明之組合物可以諸如營養補充物之食物產品形式投與。
通常，本發明之組合物用於治療人類，不過其可用於治療動物，包括單胃哺乳動物，諸如禽類、豬、貓、狗、馬或兔。本發明之組合物可適用於增強動物之生長及表現。若投與動物，則可使用口服灌胃。
組合物
通常，本發明之組合物包含細菌。在本發明之較佳實施例中，組合物係配製成冷凍乾燥形式。舉例而言，本發明之組合物可包含顆粒或明膠膠囊，例如硬明膠膠囊，其包含本發明之細菌菌株。
較佳地，本發明之組合物包含經凍乾之細菌。細菌之凍乾為充分確立之程序且相關指導可在例如參考文獻[36]、[37]及[38]中獲得。
或者，本發明之組合物可包含活的活性細菌培養物。
在一些實施例中，本發明之組合物中之細菌菌株尚未去活化，例如尚未加熱去活化。在一些實施例中，本發明之組合物中之細菌菌株尚未殺死，例如尚未加熱殺死。在一些實施例中，本發明之組合物中之細菌菌株尚未減毒，例如尚未加熱減毒。舉例而言，在一些實施例中，本發明之組合物中之細菌菌株尚殺死、去活化及/或減毒。舉例而言，在一些實施例中，本發明之組合物中之細菌菌株為活的。舉例而言，在一些實施例中，本發明之組合物中之細菌菌株為有活力的。舉例而言，在一些實施例中，本發明之組合物中之細菌菌株能夠部分或完全定植於腸道。舉例而言，在一些實施例中，本發明之組合物中之細菌菌株為有活力的且能夠部分或完全定植於腸道。
在一些實施例中，組合物包含活細菌菌株及已殺死之細菌菌株的混合物。
在較佳實施例中，本發明之組合物經囊封以使細菌菌株能夠遞送至腸道。囊封防止組合物降解直至通過例如在諸如壓力、酶活性之化學或物理刺激下破裂或可由pH值變化觸發之物理崩解而遞送至目標位置。可使用任何適當之囊封方法。示例性囊封技術包括包埋於多孔基質內、附著或吸附於固體載劑表面、藉由絮凝或在交聯劑存在下自我聚集及機械容納於微孔膜或微膠囊後。關於可適用於製備本發明之組合物的囊封之指導可在例如參考文獻[39]及[40]中獲得。
組合物可經口投與且可呈錠劑、膠囊或粉末形式。囊封產品為較佳的，因為布勞特氏菌屬為厭氧菌。可包括其他成分(諸如維生素C)作為除氧劑及益菌生受質以改善遞送及/或部分或完全定植及活體內存活。或者，本發明之益生菌組合物可以食物或營養產品(諸如基於奶或乳清之醱酵乳製品)形式或以醫藥產品形式經口投與。
組合物可調配成益生菌形式。
本發明之組合物包括治療有效量之本發明之細菌菌株。治療有效量之細菌菌株足以對患者發揮有益作用。治療有效量之細菌菌株可足以使得遞送至及/或部分或總定植於患者腸道。
舉例而言，對於成年人類，細菌之適合之日劑量可為約1×103 至約1×1011 個菌落形成單位(CFU)；例如約1×107 至約1×1010 CFU；在另一實例中，為約1×106 至約1×1010 CFU。
在某些實施例中，組合物含有相對於組合物之重量約1×106 至約1×1011 CFU/g之量的細菌菌株；例如約1×108 至約1×1010 CFU/g。劑量可為例如1g、3g、5g及10g。
典型地，益生菌(諸如本發明之組合物)視情況與至少一種適合之益菌生化合物組合。益菌生化合物通常為不易消化之碳水化合物，諸如寡醣或多醣，或糖醇，其在上部消化道中不降解或吸收。已知益菌生包括諸如菊粉及轉半乳-寡醣之商業產品。
在某些實施例中，本發明之益生菌組合物包括相對於組合物總重量約1至約30重量%之量的益菌生化合物(例如5至20重量%)。碳水化合物可選自由以下各項組成之群：果糖-寡醣(或FOS)、短鏈果糖-寡醣、菊粉、異麥芽糖醇-寡醣、果膠、木糖-寡醣(或XOS)、殼聚糖-寡醣(或COS)、β-葡聚糖、經阿拉伯膠修飾且具耐性之澱粉、聚糊精、D-塔格糖、阿拉伯膠纖維、角豆、燕麥及柑桔纖維。在一個態樣中，益菌生為短鏈果糖-寡醣(為簡單起見在下文中顯示為 FOSs-c.c)；該FOSs-c.c.不為可消化之碳水化合物，通常藉由甜菜糖轉化而獲得且包括與三種葡萄糖分子結合之蔗糖分子。
在某些實施例中，本發明之組合物係與用於治療或預防該中樞神經系統病症之另一治療劑化合物組合使用。在一些實施例中，本發明之組合物係與調節中樞神經遞質及神經肽之營養補充物一起投與。在較佳實施例中，營養補充物包含營養維生素或由其組成。在某些實施例中，維生素為維生素B6、鎂、二甲基甘胺酸(維生素B16)及維生素C。在某些實施例中，本發明之組合物係與另一益生菌組合投與。在某些較佳實施例中，益生菌包含豬鞭蟲(Trichuris suis )卵或由其組成。
本發明之組合物可包含醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。此類適合之賦形劑之實例可見於參考文獻[41]中。用於治療使用之可接受之載劑或稀釋劑為醫藥技術中熟知的且描述於例如參考文獻[42]中。適合之載劑的實例包括乳糖、澱粉、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、甘露糖醇、山梨糖醇及類似物。適合之稀釋劑之實例包括乙醇、甘油及水。醫藥載劑、賦形劑或稀釋劑之選擇可考慮預期投藥途徑及標準醫藥實踐來進行選擇。醫藥組合物可包含作為載劑、賦形劑或稀釋劑或除載劑、賦形劑或稀釋劑之外的任何適合之黏合劑、潤滑劑、懸浮劑、包衣劑、增溶劑。適合之黏合劑之實例包括澱粉、明膠、天然糖(諸如葡萄糖)、無水乳糖、自由流動乳糖、β-乳糖、玉米甜味劑、天然及合成樹膠(諸如阿拉伯膠、黃蓍膠或海藻酸鈉)、羧甲基纖維素及聚乙二醇。適合之潤滑劑之實例包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉及類似物。防腐劑、穩定劑、染料及甚至調味劑可提供於醫藥組合物中。防腐劑之實例包括苯甲酸鈉、山梨酸及對羥基苯甲酸之酯。亦可使用抗氧化劑及懸浮劑。
本發明之組合物可調配成食物產品形式。舉例而言，除本發明之治 療作用之外食物產品亦可提供營養益處，諸如在營養補充物中。類似地，食物產品可經配製以增強本發明之組合物的味道或使得組合物因更類似於常見食物項目，而非醫藥組合物而更具消費吸引力。在某些實施例中，本發明之組合物係調配成基於奶之產品形式。術語「基於奶之產品」意謂具有不同脂肪含量之任何液體或半固體之基於奶或乳清之產品。基於奶之產品可為例如奶牛奶、山羊奶、綿羊奶、脫脂乳、全脂奶、奶粉再製奶及未經任何加工之乳清或經加工產品，諸如酸乳、凝結奶、凝乳、酸奶、酸全脂奶、白脫乳及其他酸奶產品。另一重要群包括奶飲料，諸如乳清飲料、醱酵奶、濃縮奶、嬰兒或寶寶奶；調味奶、冰淇淋；含奶食物，諸如甜品。
在一些實施例中，本發明之組合物包含布勞特氏菌屬之一或多個細菌菌株且不含來自任何其他屬之細菌，或其僅包含微量或生物學不相關量之來自另一屬之細菌。因此，在一些實施例中，本發明提供一種包含布勞特氏菌屬之一或多個細菌菌株之組合物，其不含來自任何其他屬之細菌或其僅包含微量或生物學不相關量之來自另一屬之細菌，其用於療法中。
在一些實施例中，本發明之組合物包含糞便布勞特氏菌或韋克斯勒布勞特氏菌種類之一或多個細菌菌株且不含來自任何其他種類之細菌，或其僅包含微量或生物學不相關量之來自另一種類之細菌。因此，在一些實施例中，本發明提供一種包含糞便布勞特氏菌或韋克斯勒布勞特氏菌種類之一或多個細菌菌株的組合物，其不含來自任何其他種類之細菌或其僅包含微量或生物學不相關量之來自另一種類之細菌，其用於療法中。
在一些實施例中，本發明之組合物包含嗜氫布勞特氏菌種類之一或多個細菌菌株且不含來自任何其他種類之細菌，或其僅包含微量或生物學不相關量之來自另一種類之細菌。因此，在一些實施例中，本發明提供一種包含嗜氫布勞特氏菌種類之一或多個細菌菌株的組合物，其不含來自任何其他種類之 細菌或其僅包含微量或生物學不相關量之來自另一種類之細菌，其用於療法中。
在一些實施例中，本發明之組合物包含糞便布勞特氏菌或韋克斯勒布勞特氏菌種類之一或多個細菌菌株且不含來自任何其他布勞特氏菌屬種類之細菌，或其僅包含微量或生物學不相關量之來自另一布勞特氏菌屬種類之細菌。因此，在一些實施例中，本發明提供一種包含糞便布勞特氏菌或韋克斯勒布勞特氏菌種類之一或多個細菌菌株的組合物，其不含來自任何其他布勞特氏菌屬種類之細菌或其僅包含微量或生物學不相關量之來自另一布勞特氏菌屬種類之細菌，其用於療法中。
在一些實施例中，本發明之組合物包含嗜氫布勞特氏菌種類之一或多個細菌菌株且不含來自任何其他布勞特氏菌屬種類之細菌，或其僅包含微量或生物學不相關量之來自另一布勞特氏菌屬種類之細菌。因此，在一些實施例中，本發明提供一種包含嗜氫布勞特氏菌種類之一或多個細菌菌株的組合物，其不含來自任何其他布勞特氏菌屬種類之細菌或其僅包含微量或生物學不相關量之來自另一布勞特氏菌屬種類之細菌，其用於療法中。
在某些實施例中，本發明之組合物含有單一細菌菌株或種類且不含任何其他細菌菌株或種類。此類組合物可僅包含微量或生物學不相關量之其他細菌菌株或種類。此類組合物可為實質上不含其他種類之有機體的培養物。
在一些實施例中，本發明提供一種包含布勞特氏菌屬之單一細菌菌株的組合物，其不含來自任何其他菌株之細菌或其僅包含微量或生物學不相關量之細菌來自另一菌株，其用於療法中。
在一些實施例中，本發明提供一種包含糞便布勞特氏菌或韋克斯勒布勞特氏菌種類之單一細菌菌株的組合物，其不含來自任何其他菌株之細菌或其僅包含微量或生物學不相關量之來自另一菌株之細菌，其用於療法中。
在一些實施例中，本發明提供一種包含嗜氫布勞特氏菌種類之單一 細菌菌株的組合物，其不含來自任何其他菌株之細菌或其僅包含微量或生物學不相關量之來自另一菌株之細菌，其用於療法中。
在一些實施例中，本發明之組合物包含超過一個細菌菌株。舉例而言，在一些實施例中，本發明之組合物包含來自相同種類之超過一個菌株(例如超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或45個菌株)，且視情況，不含來自任何其他種類之細菌。在一些實施例中，本發明之組合物包含來自相同種類之不到50個菌株(例如不到45、40、35、30、25、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4或3個菌株)，且視情況，不含來自任何其他種類之細菌。在一些實施例中，本發明之組合物包含來自相同種類之1-40、1-30、1-20、1-19、1-18、1-15、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-50、2-40、2-30、2-20、2-15、2-10、2-5、6-30、6-15、16-25或31-50個菌株，且視情況，不含來自任何其他種類之細菌。本發明包含前述各項之任何組合。
在一些實施例中，組合物包含微生物菌劑。舉例而言，在一些實施例中，組合物包含布勞特氏菌屬細菌菌株作為微生物菌劑之一部分。舉例而言，在一些實施例中，布勞特氏菌屬細菌菌株與來自與其可在活體內在腸道中共生生活之其他屬的一或多個(例如至少2、3、4、5、10、15或20個)其他細菌菌株組合存在。舉例而言，在一些實施例中，組合物包含布勞特氏菌屬之細菌菌株與來自不同屬之細菌菌株的組合。在一些實施例中，微生物菌劑包含獲自單一有機體(例如人類)之糞便樣品之兩個或更多個細菌菌株。在一些實施例中，微生物菌劑不一起存在於自然界中。舉例而言，在一些實施例中，微生物菌劑包含獲自至少兩個不同有機體之糞便樣品之細菌菌株。在一些實施例中，兩個不同有機體係來自相同物種，例如兩個不同人類。在一些實施例中，兩個不同有機體為嬰兒人類及成年人類。在一些實施例中，兩個不同有機體為人類及非人類哺乳動物。
在一些實施例中，本發明之組合物另外包含與菌株MRX006具有相同安全性及治療功效特徵之細菌菌株，但其不為以NCIMB 42381保藏之MRX006，或其不為糞便布勞特氏菌。在一些實施例中，本發明之組合物另外包含與菌株MRX008具有相同安全性及治療功效特徵之細菌菌株，但其不為以NCIMB 42486保藏之MRX008，或其不為韋克斯勒布勞特氏菌。
在一些實施例中，本發明之組合物另外包含與以DSM 10507/14294保藏之嗜氫布勞特氏菌菌株具有相同安全性及治療功效特徵之細菌菌株，但其不為以DSM 10507/14294保藏之嗜氫布勞特氏菌菌株，或其不為嗜氫布勞特氏菌。
在一些實施例中，本發明之組合物不包含芽孢桿菌屬(Bacillus )之細菌菌株。在一些實施例中，本發明之組合物不包含枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis )及/或不包含凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans )。在一些實施例中，要藉由本發明之組合物治療之CNS病症不為雙極性障礙。在一些實施例中，要藉由本發明之組合物治療之患者不具有真菌感染。在一些實施例中，要藉由本發明之組合物治療之患者未罹患念珠菌病。在一些實施例中，要藉由本發明之組合物治療之患者尚未診斷為具有真菌感染及/或尚未診斷為罹患念珠菌病。在較佳之此類實施例中，要藉由本發明之組合物治療之患者從未診斷為具有真菌感染及/或從未診斷為罹患念珠菌病。
在本發明之組合物包含超過一個細菌菌株、種類或屬之一些實施例中，個別細菌菌株、種類或屬可用於分開、同時或依序投與。舉例而言，組合物可包含該超過一個細菌菌株、種類或屬中之全部，或細菌菌株、種類或屬可分開儲存且分開、同時或依序投與。在一些實施例中，該超過一個細菌菌株、種類或屬係分開儲存，但在使用之前混合在一起。
在一些實施例中，用於本發明中之細菌菌株係獲自成年人類糞便。 在本發明之組合物包含超過一個細菌菌株之一些實施例中，所有細菌菌株均獲自成年人類糞便，或若存在其他細菌菌株則其僅以微量存在。可在自成年人類糞便獲得之後已對細菌進行培養且用於本發明之組合物中。
如上文所提到，在一些實施例中，一或多個布勞特氏菌屬細菌菌株為本發明之組合物中僅有之治療活性劑。在一些實施例中，組合物中之細菌菌株為本發明之組合物中僅有之治療活性劑。
根據本發明使用之組合物可能需要或可能不需要市場批准。
在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中該細菌菌株經凍乾。在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中該細菌菌株經噴霧乾燥。在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中細菌菌株經凍乾或噴霧乾燥且其中其為活的。在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中細菌菌株經凍乾或噴霧乾燥且其中其為有活力的。在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中細菌菌株經凍乾或噴霧乾燥且其中其能夠部分或完全定植於腸道。在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中細菌菌株經凍乾或噴霧乾燥且其中其為有活力的且能夠部分或完全定植於腸道。
在一些情況下，在投與之前使經凍乾或噴霧乾燥之細菌菌株復水。在一些情況下，復水係藉由使用本文所描述之稀釋劑來進行。
本發明之組合物可包含醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
在某些實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含：如本發明中所用之細菌菌株；及藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中細菌菌株呈當向有需要之個體投與時足以治療病症之量；且其中病症係選自由以下各項組成之群：自閉症譜系病症(ASD)；兒童發育障礙；強迫症(OCD)；重度抑鬱障礙；抑鬱；季節性情感障礙；焦慮障礙；精神分裂症譜系病症；精神分裂症；雙極性障礙；精神病；情緒障礙；慢性疲勞症候群(肌痛性腦脊髓炎)；壓力障礙； 創傷後壓力障礙；癡呆；阿爾茨海默氏病；帕金森氏病；及/或慢性疼痛；運動神經元病；亨廷頓氏病；格林-巴利症候群及/或腦膜炎。
在某些實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含：如本發明中所用之細菌菌株；及藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中細菌菌株呈足以治療或預防中樞神經系統病症或病狀，特定而言為由微生物叢-腸-腦軸介導之中樞神經系統病症或病狀之量。在較佳實施例中，該疾病或病狀係選自由以下各項組成之群：自閉症譜系病症(ASD)；兒童發育障礙；強迫症(OCD)；重度抑鬱障礙；抑鬱；季節性情感障礙；焦慮障礙；精神分裂症譜系病症；精神分裂症；雙極性障礙；精神病；情緒障礙；慢性疲勞症候群(肌痛性腦脊髓炎)；壓力障礙；創傷後壓力障礙；癡呆；阿爾茨海默氏病；帕金森氏病；及/或慢性疼痛。在其他實施例中，本發明之組合物可適用於治療或預防運動神經元病；亨廷頓氏病；格林-巴利症候群及/或腦膜炎。
在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中細菌菌株之量為相對於組合物之重量每公克約1×103 至約1×1011 個菌落形成單位。
在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中組合物係以1g、3g、5g或10g之劑量投與。
在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中組合物係藉由選自由以下各項組成之群的方法來投與：經口、經直腸、經皮下、經鼻、經頰及經舌下。
在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其包含選自由以下各項組成之群的載劑：乳糖、澱粉、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、甘露糖醇及山梨糖醇。
在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其包含選自由以下各項組成之群的稀釋劑：乙醇、甘油及水。
在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其包含選自由以下各項組成之群的賦形劑：澱粉、明膠、葡萄糖、無水乳糖、自由流動乳糖、β-乳糖、玉米甜味劑、阿拉伯膠、黃蓍膠、海藻酸鈉、羧甲基纖維素、聚乙二醇、油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉及氯化鈉。
在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其進一步包含以下各項中之至少一者：防腐劑、抗氧化劑及穩定劑。
在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其包含選自由以下各項組成之群的防腐劑：苯甲酸鈉、山梨酸及對羥基苯甲酸之酯。
在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中當組合物在約4℃或約25℃下儲存於密封容器中且容器放置於具有50%相對濕度之氛圍中時，在至少約1個月、3個月、6個月、1年、1.5年、2年、2.5年或3年之時間之後如以菌落形成單位所量測剩餘至少80%之細菌菌株。
在一些實施例中，本發明之組合物係提供於包含如本文所描述之組合物的密封容器中。在一些實施例中，密封容器為香囊或瓶子。在一些實施例中，本發明之組合物係提供於包含如本文所描述之組合物的注射器中。
在一些實施例中，本發明之組合物可以醫藥調配物形式提供。舉例而言，組合物可以錠劑或膠囊形式提供。在一些實施例中，膠囊為明膠膠囊(「gel-cap」)。
在一些實施例中，本發明之組合物係投與經口。經口投與可涉及吞咽，使得化合物進入胃腸道；及/或經頰、經舌或經舌下投與，藉此化合物自口腔直接進入血流。
適合用於經口投與之醫藥調配物包括固體塞劑、固體微粒、半固體及液體(包括多個相或分散系統)，諸如錠劑；含有多或奈米微粒、液體(例如水溶液)、乳液或粉末之軟膠囊或硬膠囊；糖錠(包括液體填充的)；咀嚼物；凝膠； 快速分散劑型；膜劑；珠劑；噴霧；及頰/黏膜黏附貼片。
在一些實施例中，醫藥調配物為腸溶調配物，亦即胃部抗性調配物(例如對胃部pH值具抗性)，其適合用於藉由經口投與將本發明之組合物遞送至腸道。當細菌或組合物之另一組分具酸敏性，例如在胃部條狀下傾向於降解時，腸溶調配物可特別適用。
在一些實施例中，腸溶調配物包含腸溶衣。在一些實施例中，調配物為腸溶包衣劑型。舉例而言，調配物可為腸溶包衣錠劑或腸溶包衣膠囊或類似物。腸溶衣可為習知腸溶衣，例如用於供口腔遞送之錠劑、膠囊或類似物的習知包衣。調配物可包含薄膜包衣，例如腸溶聚合物(例如酸不溶性聚合物)之薄膜層。
在一些實施例中，腸溶調配物固有地為腸溶的，例如具胃部抗性，而不需要腸溶衣。因此，在一些實施例中，調配物為不包含腸溶衣之腸溶調配物。在一些實施例中，調配物為由熱凝膠材料製成之膠囊。在一些實施例中，熱凝膠材料為纖維素材料，諸如甲基纖維素、羥甲基纖維素或羥丙基甲基纖維素(HPMC)。在一些實施例中，膠囊包含不含任何成膜聚合物之外殼。在一些實施例中，膠囊包含外殼且外殼包含羥丙基甲基纖維素且不包含任何成膜聚合物(例如參見[43])。在一些實施例中，調配物為固有腸溶膠囊(例如來自Capsugel之Vcaps®)。
在一些實施例中，調配物為軟膠囊。軟膠囊為可由於添加存在於膠囊殼中之軟化劑(諸如甘油、山梨糖醇、麥芽糖醇及聚乙二醇)而具有一定彈性及軟度的膠囊。軟膠囊可例如基於明膠或澱粉而製備。基於明膠之軟膠囊可自各種供應商商購獲得。視投藥方法(諸如經口或經直腸)而定，軟膠囊可具有各種形狀，其可為例如圓形、橢圓形、長方形或魚雷狀。軟膠囊可藉由習知方法來製備，諸如藉由謝勒法(Scherer process)、艾可傑爾法(Accogel process)或液滴或吹 製法。
培養方法
用於本發明中之細菌菌株可使用如例如參考文獻[44]、[45]及[46]中詳述之標準微生物學技術來培養。
用於培養之固體或液體培養基可為YCFA瓊脂或YCFA培養基。YCFA培養基可包括(每100ml，近似值)：酪腖(1.0g)、酵母萃取物(0.25g)、NaHCO3 (0.4g)、半胱胺酸(0.1g)、K2 HPO4 (0.045g)、KH2 PO4 (0.045g)、NaCl(0.09g)、(NH4 )2 SO4 (0.09g)、MgSO4 ˙7H2 O(0.009g)、CaCl2 (0.009g)、刃天青(0.1mg)、氯化血紅素(1mg)、生物素(1μg)、鈷胺(1μg)、對胺基苯甲酸(3μg)、葉酸(5μg)及吡哆胺(15μg)。
用於疫苗組合物中之細菌菌株
本發明人已確定本發明之細菌菌株適用於治療或預防中樞神經系統病症或病狀，特定而言為由微生物叢-腸-腦軸介導之中樞神經系統病症或病狀。此可能為本發明之細菌菌株對宿主中樞神經系統、自主性神經系統及/或腸道神經系統；HPA路徑之活性；神經免疫及神經內分泌路徑；及宿主胃腸道中共生代謝產物之含量及/或宿主之胃腸道滲透性之影響的結果。因此，本發明之組合物當作為疫苗組合物投與時亦可適用於預防中樞神經系統病症或病狀，特定而言為由微生物叢-腸-腦軸介導之中樞神經系統病症或病狀。在某些此類實施例中，本發明之細菌菌株為有活力的。在某些此類實施例中，本發明之細菌菌株能夠部分或完全定植於腸道。在某些此類實施例中，本發明之細菌菌株為有活力的且能夠部分或完全定植於腸道。在其他某些此類實施例中，本發明之細菌菌株可經殺死、去活化或減毒。在某些此類實施例中，組合物可包含疫苗佐劑。在某些實施例中，組合物係用於經由注射，諸如經由皮下注射來投與。
一般說明
除非另外指出，否則本發明之實踐將採用此項技術範圍內之習知化學、生物化學、分子生物學、免疫學及藥理學方法。此類技術在文獻中有充分解釋。參見例如參考文獻[47]及[48-54]等。
術語「包含」涵蓋「包括」以及「由...組成」，例如「包含」X之組合物可排他地由X組成或可包括其他東西，例如X+Y。
關於數值x之術語「約」為視情況存在的且意謂例如x±10%。
在某些實施例中，術語「調節」意謂增加或活化。在替代實施例中，術語「調節」意謂降低或抑制。
字語「實質上」不排除「完全」，例如「實質上不含Y」之組合物可為完全不含Y。必要時，字語「實質上」可自本發明之定義中省去。
提及兩個核苷酸序列之間的序列一致性百分比意謂當比對時，該百分比之核苷酸在比較該兩個序列時為相同的。此比對及同源性或序列一致性百分比可使用此項技術中已知之軟體程式(例如描述於參考文獻[55]之部分7.7.18中的彼等軟體程式)來測定。較佳比對係藉由史密斯-沃特曼同源性檢索算法(Smith-Waterman homology search algorithm)使用仿射空隙檢索來測定，空隙開口罰分為12且空隙延伸罰分為2，BLOSUM矩陣為62。史密斯-沃特曼同源性檢索算法揭示於參考文獻[56]中。
除非特別陳述，否則包括許多步驟之製程或方法可在方法開始或結束時包括其他步驟，或可包括其他中間步驟。另外，若適當，則可將步驟組合、省去或以替代順序進行。
本文描述了本發明之各種實施例。應瞭解，可將各實施例中所規定之特徵與其他所規定之特徵組合，以提供其他實施例。特定而言，可將本文中強調為適合、典型或較佳之實施例彼此組合(除了當其互相排斥時)。
用於執行本發明之模式
本研究之目標為評估在展示與神經發育及精神病症相關之動態特徵的兩種不同小鼠模型中活生物治療劑對精神及神經病症之治療的影響。特定而言，研究集中於(i)C57BL/6wt小鼠模型、(ii)BTBR近交、基因修飾小鼠模型及(iii)母體免疫活化(MIA)小鼠模型中之孤獨症相關行為。研究了長期MRX006與媒劑處理在三種小鼠模型中在焦慮、抑鬱及認知及社交範圍之行為中之影響。此外，進行生理及解剖學分析以及循環細胞因子及催產素含量之偵測。
關於用於治療自閉症譜系病症之醫學產品之臨床開發的EMA準則說明，歸因於疾病之異質性，使用單一化合物可能不會對全部核心症狀達成顯著影響，且因此必定展現對至少一種核心症狀之短期功效。實例中所測試之活生物治療劑已顯示有效治療自閉症譜系病症之至少一種核心症狀，因此此等菌株及相關布勞特氏菌屬菌株預期針對人類疾病為有效的。類似地，其他中樞神經系統病症或病狀展示具有多種不同症狀之複雜病變，且經批准之治療較少。因此，應瞭解，有效治療不需要治療中樞神經系統病症或病狀之全部症狀。若一治療將治療與中樞神經系統病症或病狀相關之症狀中之一者，則其將被視為在治療上適用。
實例1-評估C57BL/6小鼠之焦慮、抑鬱、認知及社交領域之行為 實例1a-用於C57BL/6小鼠實驗之材料及方法 小鼠
雄性C57BL/6小鼠係購自Harlan UK。使動物居住在按12h暗循環(7：00-19：00h開燈)之溫度及濕度受控之房間中。全部實驗係根據歐洲指令2010/63/EEC 2012年之S.I.編號543之要求來進行，且由科克大學(University College Cork)之動物實驗倫理委員會(Animal Experimentation Ethics Committee)批准。
菌株
MRX006：以登錄號NCIMB 42381保藏之糞便布勞特氏菌細菌。
生物治療劑係提供於甘油儲備液中。使活生物治療劑在設備中在厭氧條件下生長。
活生物治療劑投與
當小鼠7週齡時開始使用MRX006或媒劑(對照)進行給藥。在開始行為系列之前每天用MRX006或磷酸鹽緩衝溶液(PBS)將此等小鼠處理一次，持續4週。在行為系列期間每天將小鼠再處理一次。在投與之前將MRX006(1×109 CFU，經口投與)溶解於PBS中。
投與時間表
以下顯示用於研究之處理組。用於經口投與之媒劑為PBS。經由口服灌胃進行每天經口投與。
不處置原初組直至開始行為系列。
糞便收集
每週自個別小鼠收集新鮮糞便樣品直至研究結束。將至少20mg之新鮮糞便放置於微量離心管中，即刻放置於冰上且然後儲存在-80℃下。
實驗設計及方法
如上文所概述，當小鼠7週齡時開始使用MRX006進行給藥。在行為實驗之前，進行4週初始給藥。行為系列按以下順序進行：在第5週時埋珠及3室測試；在第6週時高架十字迷宮及懸尾測試；在第8週時曠場及新穎物體識別測試；在第9週時壓力誘導之體溫過高測試；在第10週時恐懼條件化測試；及在第11週時強迫游泳測試。在第9週時進行螢光素腸道滲透性分析。最後， 在12週時，撲殺小鼠並解剖得到腦、近端及遠端結腸、腎上腺及脾臟區，以及血漿樣品。
圖解設計及統計分析
全部圖係在graphpad prism軟體(版本5)上產生。使用IBM SPSS Statistic 22.0(EEUU)分析資料。使用柯爾莫哥洛夫-斯米爾諾夫正態性檢驗(Kolmogorov-Smirnov normality test)分析資料分佈。使用雙因素ANOVA及費雪最小顯著差異(Fisher’s least significant difference，LSD)事後檢驗對比較媒劑組與MRX006組之資料進行分析。藉由未配對史都登氏t檢驗(unpaired Student t test)對比較媒劑組與原初小鼠之資料進行分析。藉由克魯斯卡爾-沃利斯(Kruskal-Wallis)及非參數曼-惠特尼U檢驗(non-parametric Mann-Whitney U test)分析非正態分佈之資料。P<0.05為統計顯著性之準則。
實例1b-社交互動行為之評估-三室測試 基本原理
3-室社交互動測試(3-CSIT)為經充分驗證之行為學相關模型，其評估性匹配同種個體之間的社交互動且允許讀出小鼠之社交新穎性及社交偏好。該測試用於表徵及展示此行為讀出之變化。該測試允許小鼠在無生命物體或性匹配之同種小鼠之間自由探索。
此外，3-室測試(3-CHT)為用以評估在囓齒動物模型中呈一般社交性形式之認知及對社交新穎事物之興趣的測試。囓齒動物一般偏好用比物體更多之時間與另一囓齒動物在一起(社交性)。此外，相較於熟悉之小鼠，囓齒動物偏好研究新穎小鼠(社交新穎性)。基於此等傾向，3-CHT可幫助鑑定在社交性及/或社交新穎性方面具有缺陷之囓齒動物。
方法
將動物放置於矩形設備中，該矩形設備由具有小圓孔從而允許方便 進出所有區室之隔板劃分成三個室(左室及右室及較小之中間室)。該測試由三個依序進行之10min試驗組成：(1)習慣(允許測試動物探索三個空室)；(2)社交性(將不熟悉之動物放置於左室或右室中之內部網線籠中)；(3)社交新穎性偏好(將新穎動物放入室中先前為空的相反地現在有熟悉之動物的內部籠中)。原初動物應不具有對習慣階段之任一室的偏好、對社交性階段之小鼠的偏好及對社交新穎性階段之新穎小鼠的偏好。辨別比率增加將表明社交行為增加。全部動物為年齡及性別匹配的，在各30分鐘試驗之後清潔各個室且墊上新鮮墊草。對於三個階段中之每一者，藉由安裝在設備上之攝像機記錄行為。
結果
組內之史都登氏t檢驗表明，所有組均用相較於物體更多之時間研究小鼠(**p<0.01)，表明社交性無缺陷(圖1)。每天灌胃未影響社交性。有趣的是，MRX006使研究新穎小鼠所用之時間相較於熟悉之小鼠有所增加，表明增加之社交新穎性(p<0.05；圖1)。
結論
在三室測試中用MRX006長期處理使C57BL/6小鼠對社交新穎事物之偏好增強。
實例1c-評估抑鬱樣行為-強迫游泳測試(FST) 基本原理
強迫游泳測試(FST)為最廣泛用於評估抗抑鬱活性之實驗範式。在適應不動之浮起姿勢之前，原初動物將以游泳、攀爬及潛水之形式展示逃避行為。不動之持續時間指示行為絕望程度。抗抑鬱藥物使在此測試中不動所用之時間減少。
方法
迫使小鼠在用23-25℃自來水填充至17cm深之玻璃筒中(24×21cm) 游泳6min。由裝在頂板上之照相機錄像記錄FST。評分之行為參數為在6-min測試之最後4min期間的不動。
結果
每天灌胃使不動時間增加，表明與原初小鼠相比之抑鬱樣行為(t史都登氏檢驗，t(190=4.565；p<0.01；圖2)。用MRX006長期處理使不動顯著降低，表明與媒劑組相比之抗抑鬱樣作用(F(2.29)=14.992；**p<0.01)。
結論
在強迫游泳測試中用MXR006長期處理誘導抗抑鬱樣行為。
實例1d-評估抑鬱樣行為-懸尾測試 基本原理
懸尾測試為經充分表徵之用以評估抗抑鬱樣行為之測試。不動所用之時間為抑鬱樣行為之指示。用抗抑鬱藥物處理使不動所用之時間減少。
方法
將小鼠藉由黏附在尾部尖端之前1cm的一片膠帶懸掛至抬高之棒(60cm)上持續6min之時間。以此類方式懸掛小鼠，使其無法逃脫或抓住附近表面。在此測試期間，持續六分鐘，對所得逃避取向行為進行定量。評分之行為參數為不動所用之時間。藉由三腳架照相機對測試進行錄像記錄且由不知曉實驗條件之研究者對不動之時間進行人工評分。
結果
在懸尾測試中每天灌胃處置(史都登氏t檢驗，t(20)=0.9405；p=0.3582)及用MRX006長期處理(單因素ANOVA，F(2.30)=2.014；p=0.152)未誘導任何顯著作用(圖3)。
結論
在懸尾測試中用MRX006長期處理在C57BL/6小鼠中未誘導任何可 觀測之抗抑鬱樣行為。
實例1e-評估認知-恐懼條件化測試 基本原理
使用情景恐懼條件化作為海馬依賴性記憶之量測。恐懼條件化為一種聯想學習形式，其量測由動物對非條件刺激(US)(諸如電擊)加上條件刺激(CS)、特定音調或光或氣味展示之僵直反應。利用量測僵直水準來評估動物對US及CS刺激之反應。此測試量測小鼠如何高效忘記其在獲得日所獲得之內容。該測試評估小鼠對與非條件刺激相關之條件刺激的焦慮程度以及小鼠在存在條件刺激之情況下在重複的不存在配對非條件刺激之情況下顯示降低之焦慮及/或壓力(僵直水準)之速度。
方法
用於此測試之設備由上面有燈之小室組成。各個室定位於較大之室內部，該較大之室防止其受外部燈及雜訊影響。在第一天(訓練或獲得階段)，將小鼠放入室中且紀錄其僵直行為3min(基線)，隨後以長至2min之間隔進行多至6次光/音調[條件刺激(CS-30s)]及足部電擊[非條件刺激(US-2s)]配對。配對由提示[例如組合光(約260lx)及音調暴露(80分貝)]20s及在提示之最後2s內足部電擊組成。足部電擊使僵直行為增加。電流強度為0.6mA。使用誘發僵直反應之最小電流。在最後配對之後兩分鐘，使小鼠回到其正常居住條件。在條件化之後24及48h(分別為2天(提取階段)及3天(消退階段))時，在不存在足部電擊之情況下重複相同實驗程序，以測試記憶保持及經條件化之恐懼記憶的消退(消退階段)。情景記憶保持之特徵為當在不存在足部電擊之情況下將動物放置於該情景(亦即足部電擊室)中時的僵直行為。
結果
量測獲得階段(暴露於結合在一起之CS與US兩者)、提取及消退階 段(CS不與US結合)中之僵直水準(參見圖4)。在此研究中，在獲得階段中每天灌胃誘導僵直水準與原初動物相比之顯著增加(階段1 #p<0.05；階段2 ###p<0.001；階段3-4 ##p<0.01)。當與媒劑組相比時，在獲得階段期間MRX006長期處理未改變僵直水準。獲得階段後面為提取階段，其在訓練期之後耗費24小時(CS後面沒有US)。資料顯示在媒劑組中階段1(暴露於第一音調)中之僵直水準與原初組相比顯著增加(p<0.05)。有趣的是，當與媒劑組相比時，在MRX006處理之小鼠中在階段1觀測到僵直水準顯著降低(*p<0.05)。總地來說，在提取階段中，經MRX006處理者當與媒劑組相比時展示僵直水準降低之傾向，表明用MRX006長期處理可增強學習。提取階段後面為消退階段(24小時後，CS並且無US)。此測試量測小鼠如何高效忘記其在獲得日所獲得之內容。在階段3之消退階段中媒劑組當與原初組相比時顯示增加之僵直水準(p<0.05)。用MRX006長期處理在消退階段中未誘導任何顯著變化。
結論
用MRX006長期處理在取回階段中降低僵直水準，表明MRX006可增強學習。總地來說，用MRX006長期處理不可觀測地顯著改變恐懼條件化行為。
實例1f-評估認知-新穎物體識別(NOR)測試 基本原理
所用方案係改編自Bevins及Besheer(2006)，且用以測試認知，尤其識別記憶。此測試係基於與熟悉物體相比囓齒動物用更多時間探索新穎物體之自發傾向。選擇探索新穎物體反映使用學習及識別記憶。此外，改善之記憶反映減輕之抑鬱樣行為。
方法
所用方案係改編自Bevins及Besheer(2006)。其進行超過3天。在第 1天，允許動物適應測試環境10分鐘，該測試環境為配備有頂部照相機之大容器。未使用墊草且在各動物之間將容器用70%乙醇進行擦拭。在第2天，允許動物適應測試設備10分鐘。在此時間之後，將動物自容器中移出且將兩個相同物體引入環境中。使動物回到該容器且允許其再探索10分鐘。在各試驗之前用70%乙醇溶液清潔物體。在訓練期之後，將囓齒動物自環境移出進入24小時之延遲期。在第3天，使囓齒動物回到該容器，該容器此時僅含有前一天之1個熟悉物體及1個新穎物體。記錄動物對2個物體之活性持續5分鐘。藉由人工觀察記錄囓齒動物探索各物體所用時間之量且產生對應於相較於總互動時間與新穎物體互動所用之時間的辨別指數(DI)值。與對照大鼠相比DI降低指示此類型記憶之缺陷。
結果
每天灌胃處置未影響C57Bl/6小鼠之識別記憶(圖5)。實際上，兩組均顯示相較於熟悉物體偏好探索新穎物體更多之模式(不過未達到統計學顯著性)。長期用MRX006處理之小鼠展示相較於熟悉物體探索新穎物體之偏好顯著增加(p<0.05)(圖5)。
結論
用MRX006長期處理產生用相較於熟悉物體顯著更多之時間研究新穎物體之C57Bl/6小鼠，表明增強識別記憶。
實例1g-評估焦慮樣行為-埋珠測試 基本原理
埋珠測試為新事物恐懼症、焦慮及強迫強制性行為之適用模型。其亦用以測試新穎抗抑鬱劑、抗焦慮劑及抗精神病劑。用諸如抗焦慮劑之藥理學藥劑預處理之小鼠與對照小鼠相比顯示減輕之埋珠行為。
方法
將小鼠個別地放入新穎聚丙烯籠(35×28×18.5cm，L×W×H)中，該新穎聚丙烯籠含有標準囓齒動物(硬木)墊草(5cm)及其頂部之20個彈珠(五列彈珠有規律地間隔2cm，遠離籠壁且相隔2cm)。在1000勒克司(lux)之光強度下進行實驗。30分鐘後，將小鼠自此等籠中移出且對埋藏超過表面2/3之彈珠數目進行評分。
結果
史都登氏t檢驗(媒劑相較於原初；t(20)=0.1308；p=0.8973)及單因素ANOVA分析(F(2.38)=0.992；p=0.384)表明用MRX006長期處理與每天灌胃均未改變埋藏彈珠之數目，表明焦慮樣基線沒有改變(圖6)。
結論
在埋珠測試中用MRX006長期處理不可觀測地改變C57Bl/6小鼠之焦慮樣行為。
實例1h-評估焦慮樣行為-高架十字迷宮測試 基本原理
高架十字迷宮(EPM)為廣泛用於評估囓齒動物之焦慮樣行為之試驗。EPM評估一般焦慮行為，其中較不焦慮之小鼠在迷宮之開放臂中耗費更多時間。開放臂活性(持續時間)增加反映抗焦慮行為。
方法
設置由自地板升高1公尺之灰色塑膠十字形迷宮組成，所述灰色塑膠十字形迷宮包括兩個開放(嫌惡)臂及兩個封閉(安全)臂(50×5×15cm壁)。實驗在紅光(7勒克司)下進行。將小鼠面向開放臂(以避免直接進入封閉臂)放入迷宮中央且允許其探索場地六分鐘之持續時間。使用裝在頂板上之照相機錄像記錄實驗以允許量測若干行為參數。在各個體之後用70%(體積/體積)乙醇清潔設備以防止來自先前小鼠之嗅覺提示。對在開放/封閉臂中所用之時間、在中央所 用之時間及轉向次數進行人工分析。分別針對焦慮樣行為及自主活動量測在各臂中所用時間之百分比及進入各臂之次數。進入臂定義為四隻爪全部在臂內部。開放臂活性(持續時間)增加反映抗焦慮行為。
結果
史都登氏t檢驗分析表明每天灌胃未影響在開放臂中所用之時間(圖7)。單因素ANOVA分析表明當與對照組相比時用MRX006長期處理未改變高架十字迷宮中之行為(圖7)。特定而言，用Mrx006長期處理未改變在開放臂中及在封閉臂中所用之時間。
結論
用MRX006長期處理不可觀測地改變C57Bl/6小鼠在高架十字迷宮中之行為。
實例1i-在壓力誘導之體溫過高(SIH)測試中評估焦慮水準 基本原理
SIH范式為充分表徵之焦慮指示。在此測試中，壓力係簡單地藉由量測直腸溫度來觸發。
方法
簡單來說，在測試之前使動物單獨居住1天。使用潤滑之溫度敏感探針以15min間隔量測直腸溫度兩次。歸因於在第一次溫度量測期間經歷之壓力，第二次量測之溫度(T2)高於第一次(T1)。此溫度差(△T=T2-T1)定義為SIH反應。SIH反應因不同類別之抗焦慮劑而降低。
結果
每天灌胃處置增加△T，表明焦慮樣行為(史都登氏t檢驗，t(19)=2.121，p=0.047)。當與媒劑組相比時，用MRX006長期處理未誘導△T變化(單因素ANOVA，F(2.29)=1.215；p=0.312)(圖8)。
結論
在壓力誘導之體溫過高測試中，在C57Bl/6小鼠中用MRX006長期處理不可觀測地改變壓力誘導之溫度變化。
實例1j-生理分析-血漿催產素含量 方法及結果
量測原初、媒劑及MRX006處理之小鼠中的催產素含量(圖9)。在雄性及雌性之中樞神經系統中起作用之催產素肽對於包括聯絡、性行為、社交識別、攻擊性及信賴之多種複雜社交行為來說為重要的。放射免疫分析(RIA)為用於量測血液中非常小量之肽及代謝產物的靈敏方法。製備用於RIA之樣品且快遞用於通過RIA技術(RIAgnosis,Sinzing,Germany)進行催產素量測。在C57Bl/6小鼠中用MRX006長期處理顯示催產素含量降低(p<0.05)。
實例1k-生理分析-壓力誘導之皮質固酮血漿含量 方法及結果
皮質固酮為響應於壓力釋放之主要囓齒動物激素。在此研究中，在原初、媒劑及MRX006處理之小鼠中在基線處及強迫游泳測試(急性壓力暴露)之後量測皮質固酮含量變化(圖10)。皮質固酮量測係在不同時間點進行，亦即在T0(強迫游泳測試之前)及暴露於強迫游泳測試後30min(T30)、90min(T90)及120min(T120)時進行。資料顯示在T30時與原初組相比在媒劑組中壓力誘導之皮質固酮含量顯著增加(p<0.05)。有趣的是，在T30時當與對照組相比時在MRX006處理之小鼠中觀測到壓力誘導之皮質固酮含量顯著增加。在其他時間點未觀測到顯著變化。此等結果可表明在媒劑組與MRX006處理組中對壓力之敏感性增加。
實例1l-生理分析-活體內胃腸道滲透性分析 基本原理
此程序用於評估活體內腸道活力。在不同長期處理之間通過經口投與螢光素衍生物後定量血液中之異硫氰酸螢光素(FITC)來定量腸道滲透性。其為經確立用於定量腸道滲透性之方法，該方法係基於經口投與之螢光素衍生物通過腸道滲漏至周圍系統中之原理。
方法
使測試小鼠單獨居住且空腹隔夜。第二天早上(約9am)，藉由口服灌胃投與小鼠FITC右旋糖酐((600mg/kg)。兩小時後，在肝素塗佈之毛細管中收集100μl之血液樣品且轉移至深色艾本德管(darkened eppendorf)中且放置於冰上。將樣品3500×g離心15分鐘，吸出血漿且將樣品儲存在-80℃下長久儲存。
使用未稀釋之血漿來定量FITC濃度。將25μl之FITC一式兩份移液至384孔板(Greiner bio one)中。用Victor光譜儀在490nm-520nm之範圍之間量測FITC。對於標準曲線，在PBS(pH7.4)中製備FITC之連續稀釋液。吸收率增加指示障壁完整性降低。
結果
資料顯示在每天灌胃情況下腸道滲透性增加之傾向(p=0.051)，但其未能達到顯著性(圖11)。MRX006組之間的總腸道滲透性保持不變。
結論
用MRX006長期處理對腸道滲透性未展示可觀測之影響。
實例1m-生理分析-器官重量及結腸長度
每天灌胃處置及用MRX006長期處理未誘導盲腸重量、脾臟重量及腎上腺重量之變化(圖12)。
C57Bl/6小鼠模型之結論
在廣泛用於篩選抗抑鬱樣活性之測試強迫游泳測試中用MRX006長期處理誘導抗抑鬱樣作用。此外，用MRX006長期處理增強C57Bl/6小鼠之社 交行為，在3-室測試中其用相較於熟悉小鼠更多之時間與新穎小鼠互動，表明MRX006逆轉社交損傷，社交損傷為自閉症譜系病症之核心症狀。此外，在恐懼條件化測試中用MRX006長期處理傾向於降低僵直水準，表明投與此等菌株改善記憶之認知功能且降低C57Bl/6小鼠之焦慮。
需要其他研究來表徵當短期或亞長期投與時MRX006對催產素含量及皮質固酮含量之影響。證據表明MRX006調節下丘腦垂體軸(HPA)之信號傳導。
因此，MRX006之投與引起抗抑鬱作用，增強社交新穎性且引起促認知作用。
實例2-BTBR小鼠模型
BTBR小鼠模型使用展示穩健孤獨症樣表型之近交、基因修飾小鼠。在此品系中已報道社交行為缺陷、增加之重複行為及增加之焦慮相關行為(Meyza及Blanchard,2017)。歸因於此穩健行為表型，BTBR小鼠為用於評估新穎治療劑用於治療孤獨症相關行為之功效的理想動物模型。藉由活生物治療劑來緩解此類症狀亦可指示生物治療劑在治療其他精神病學或神經疾病方面之功效。
實例2a-用於BTBR小鼠模型之材料及方法 小鼠
在室內培育雄性BTBR小鼠。使動物居住在按12h暗循環(7：00-19：00h開燈)之溫度及濕度受控之房間中。全部實驗係根據歐洲指令2010/63/EEC 2012年之S.I.編號543之要求來進行，且由科克大學之動物實驗倫理委員會批准。
菌株
MRX006：以登錄號NCIMB 42381保藏之糞便布勞特氏菌細菌。
生物治療劑係提供於甘油儲備液中。使活生物治療劑在設備中在厭 氧條件下生長。
活生物治療劑投與
當小鼠8週齡時開始使用MRX006或媒劑進行給藥。在開始行為系列之前每天用MRX006或磷酸鹽緩衝溶液(PBS)將此等小鼠處理一次，持續3週。在行為系列期間每天將小鼠再處理一次。在投與之前將MRX006(1×107 至1×109 CFU，經口投與)溶解於PBS中。
投與時間表
以下顯示用於研究之處理組。用於經口投與之媒劑為PBS。經由口服灌胃進行每天經口投與。
糞便收集
每週自個別小鼠收集新鮮糞便樣品直至研究結束。將至少20mg之新鮮糞便放置於微量離心管中，即刻放置於冰上且然後儲存在-80℃下。
實驗設計及方法
如上文所概述，當小鼠8週齡時開始使用MRX006進行給藥。在行為實驗之前，進行3週初始給藥。行為系列按以下順序進行：在第4週時埋珠測試；在第5週時高架十字迷宮；在第6週時曠場及新穎物體識別測試以及食物偏好社交傳遞測試；在第7週時雌性尿液嗅聞及社交互動測試及在第9週時強迫游泳測試。胭脂紅胃腸道活力分析及胃腸道滲透性分析尾部放血分別在第8週及第9週期間進行。最後，在第10週至第11週，將小鼠殺死用於脾細胞刺激及迴腸及結腸中之FITC的離體量測。
在BTBR模型中活生物治療劑處理對刻板、社交及抑鬱樣行為以及 胃腸道參數(滲透性及活力)的影響概述於以下實例中。
上表中所列之組1代表對照BTBR小鼠，其將預期顯示與自閉症譜系病症相關之表型。處理對自閉症譜系病症之行為症狀之任何影響將藉由組1及組2之間的差異來鑑定。
圖解設計及統計分析
全部圖係在graphpad prism軟體(版本5)上產生。使用IBM SPSS Statistic 22.0(EEUU)分析資料。使用柯爾莫哥洛夫-斯米爾諾夫正態性檢驗分析資料分佈。使用單因素ANOVA及費雪最小顯著差異(LSD)事後檢驗對比較媒劑組與MRX006組之資料進行分析。若ANOVA未揭示處理之顯著影響，則針對對照組進行事前成對比較測試。藉由克魯斯卡爾-沃利斯及非參數曼-惠特尼U檢驗分析非正態分佈之資料。P<0.05為統計顯著性之準則。
實例2b-社交行為之評估-三室社交互動測試 基本原理
3-室社交互動測試(3-CSIT)為充分驗證之行為學相關模型，其評估性匹配同種個體之間的社交互動且允許讀出小鼠之社交新穎性及社交偏好。該測試允許小鼠在無生命物體或性匹配之同種小鼠之間自由探索。
方法
將動物放置於矩形設備中，該矩形設備由具有小圓孔從而允許方便進出所有區室之隔板劃分成三個室(左室及右室及較小之中間室)。該測試由三個依序進行之10min試驗組成：(1)習慣(允許測試動物探索三個空室)；(2)社交性(將不熟悉之動物放置於左室或右室中之內部網線籠中)；(3)社交新穎性偏好(將新穎動物放入室中先前為空的相反地現在有熟悉之動物的內部籠中)。原初動物應不具有對習慣階段中之任一室的偏好、對社交性階段之小鼠的偏好及對社交新穎性階段之新穎小鼠的偏好。辨別比率增加將表明社交行為增加。全部動物為年 齡及性別匹配的，在各30分鐘試驗之後清潔各個室且墊上新鮮墊草。對於三個階段中之每一者，藉由安裝在設備上之攝像機記錄行為。
結果
關於評估社交性，組內之史都登氏t檢驗揭示對於MRX006組相對於物體對新穎同種(CS)小鼠之偏好增加[t(22)=5.281；P<0.0001](圖13A)。關於評估社交新穎性，組內之史都登氏t檢驗揭示僅在媒劑組中對新穎同種小鼠之偏好增加[t(22)=3.452；P<0.001]。與新穎同種小鼠之互動時間的ANOVA示揭示處理之影響[F(3,47)=2.492；P=0.43；圖13B]。然而，事前成對比較測試表明用MRX006(t(22)=0.7497；P=0.4614)處理當與媒劑組相比時使與新穎同種小鼠之互動時間減少。研究新穎同種小鼠所用時間百分比之ANOVA揭示處理之影響[F(3,47)=2.942；P=0.0433；圖13C]。事後比較揭示用MRX006處理降低研究新穎同種小鼠之時間的百分比(p<0.05)。
雙因素ANOVA分析[物體/同種(CS)：[F(1,47)=21.164；P<0.0001；處理：F(1,47)=0.56；P=0.815；物體/CS x處理：F(1,47)=5.414；P=0.025]繼之以事後分析表明MRX006處理之小鼠用相較於物體更多之時間研究同種小鼠(p<0.01；圖13D)。雙因素ANOVA分析[熟悉相較於新穎：F(1,47)=3.454；P=0.070；處理：F(1,47)=0.360；P=0.552；F/N x處理：F(1,47)=8.627；P=0.005]繼之以事後比較表明用MRX006處理之小鼠用相較於熟悉之小鼠顯著更少之時間研究新穎小鼠(p<0.05；圖13E)。相比之下，媒劑小鼠用相較於熟悉之同種小鼠更多之時間研究新穎小鼠(p<0.05；圖13E)。百分比分析表明當與媒劑組相比較時，MRX006處理之小鼠用更少之時間與新穎同種小鼠互動(t=2.480 df=22；P=0.0213；圖13F)。
結論
在三室測試中用MRX006長期處理降低BTBR小鼠之社交新穎性且 降低社交認知。
實例2c-社交行為之評估-強迫入侵者測試 基本原理
此程序評估囓齒動物之間的社交互動行為。藉由將入侵者小鼠放入居留小鼠之居住籠中，可評估社交互動及攻擊行為。
方法
各時期由將入侵者小鼠放入居留小鼠之居住籠中10分鐘之時間組成。使用裝在頂板上之照相機錄像記錄實驗以允許量測若干行為參數。記錄動物用於互動之時間量。
結果
互動時間之ANOVA未揭示處理之影響[F(3,45)=2.327；P=0.088；圖14]。類似地，事前成對比較測試表明用MRX006處理(t=1.425 df=22；P=0.1682)當與媒劑組相比時未影響社交互動行為。
結論
在社交互動測試中用MRX006長期處理不影響BTBR小鼠之社交行為。
實例2d-刻板行為之評估-埋珠測試 基本原理
此測試評估重複、強迫及焦慮行為。埋藏彈珠之數目較高指示更加焦慮或刻板之行為。實際上，用諸如抗焦慮劑之藥理學藥劑處理之小鼠與對照小鼠相比顯示減輕之埋珠行為。
方法
將小鼠個別地放入新穎聚丙烯籠(35×28×18.5cm，L×W×H)中，該新穎聚丙烯籠含有標準囓齒動物(硬木)墊草(5cm)及其頂部之20個彈珠(五列 彈珠有規律地間隔2cm，遠離籠壁且相隔2cm)。在1000勒克司之光強度下進行實驗。30分鐘後，將小鼠自此等籠中移出且對埋藏超過表面2/3之彈珠數目進行評分。
結果
如藉由ANOVA所測定，處理對埋藏彈珠之數目無影響[F(3,45)=1.64；P=0.193]。然而，事前成對比較測試表明MRX006(t=2.276 df=21，p<0.05)使埋藏彈珠之數目減少(圖15)。
結論
在埋珠測試中用MRX006處理使BTBR小鼠之重複行為減輕。
實例2e-刻板行為之評估-梳理測試 基本原理
此測試用作刻板及重複行為之指示。梳理所用時間增加指示刻板或重複行為增加。
方法
將小鼠個別地放入新穎玻璃燒杯(500mL)中，該新穎玻璃燒杯用樹脂玻璃(Plexiglas)頂部覆蓋。在60勒克司之光強度下進行實驗。使用附接至三腳架之手持攝像機錄像記錄實驗。記錄梳理行為20分鐘。
結果
如藉由ANOVA[F(3,47)=4.174；P=0.011]所測定活生物治療劑對梳理活性存在顯著影響。事後比較表明相對於媒劑組用MRX006處理顯著減少梳理所用時間之量(p<0.05)(圖16)。類似地，事前成對比較測試表明與媒劑組相比MRX006(t=2.895 df=22，p<0.01)減少梳理所用時間。
結論
在梳理測試中用MRX006長期處理使BTBR小鼠之重複行為減輕。
實例2f-焦慮樣行為之評估-高架十字迷宮 基本原理
高架十字迷宮(EPM)為廣泛用於評估囓齒動物之焦慮樣行為之試驗。EPM評估一般焦慮行為，其中較不焦慮之小鼠在迷宮之開放臂中耗費更多時間。開放臂活性(持續時間)增加反映抗焦慮行為。
方法
設置由自地板升高1公尺之灰色塑膠十字形迷宮組成，所述灰色塑膠十字形迷宮包括兩個開放(嫌惡)臂及兩個封閉(安全)臂(50 x 5 x 15cm壁)。實驗在紅光(7勒克司)下進行。將小鼠面向開放臂(以避免直接進入封閉臂)放入迷宮中央且允許其探索場地五分鐘之持續時間。使用裝在頂板上之照相機錄像記錄實驗以允許量測若干行為參數。分別針對焦慮樣行為及自主活動量測在各臂中所用時間之百分比及進入各臂之次數。進入臂定義為四隻爪全部在臂內部。
結果
ANOVA分析揭示活生物治療劑處理對在封閉臂中所用時間之百分比無影響[F(3.47)=0.885；P=0.457；圖17A)。開放臂中所用時間百分比之克魯斯卡爾沃利斯非參數分析揭示處理無影響[卡方(chi-squared)=1.220；df=3；P=0.748；圖17B]。進入封閉臂之次數的ANOVA揭示處理無影響[F(3,44)=1.82；P=0.159；圖17C]。進入開放臂之次數的克魯斯卡爾沃利斯非參數分析揭示處理無影響[卡方=2.045；df=3；P=0.563；圖17D]。
結論
在高架十字迷宮中用MRX006長期處理對BTBR小鼠之焦慮樣行為無影響。
實例2g-焦慮樣行為之評估-曠場場地 基本原理
使用曠場場地來評估暴露於新穎壓力環境之反應及自主活動。原初小鼠天然地將大多數時間耗費在場地壁旁邊，因為其與場地中央相比暴露較少。在中央所用時間之持續時間增加表示焦慮樣行為減輕。
方法
將小鼠個別地放入曠場場地(43×35×25，L×w×h)中且允許其探索10分鐘。實驗在60勒克司之光強度下進行。使用裝在頂板上之照相機錄像記錄實驗以允許使用Ethovision軟體量測若干行為參數。對行進距離進行評分以得到自主活動。
結果
移動距離之ANOVA未揭示處理對在曠場場地中之自主活動之影響[F(3,47)=0.317；P=0.813；圖18A及圖18D]。在外部區域所用時間之ANOVA未揭示處理之影響[F(3,46)=2.217；P=0.100；圖18B]。然而，事前成對比較測試表明MRX006處理(t=2.791 df=21；p<0.05；圖18E)使在曠場場地外部區域所用之時間減少。在內部區域所用時間之ANOVA未揭示處理之影響[F(3,46)=2.217；P=0.100；圖18C]。然而，事前成對比較測試表明MRX006處理(t=2.791 df=21；p<0.05；圖18F)使在曠場場地內部區域所用之時間增加。
結論
在曠場場地測試中用MRX006長期處理使BTBR小鼠之焦慮樣行為減輕。
實例2h-抑鬱樣行為之評估-強迫游泳測試 基本原理
強迫游泳測試(FST)為最廣泛用於評估抗抑鬱活性之實驗範式。在適應不動之浮起姿勢之前，原初動物將以游泳、攀爬及潛水之形式展示逃避行為。不動之持續時間指示行為絕望程度。抗抑鬱藥物使在此測試中不動所用之時間 減少。
方法
迫使小鼠在用23-25℃自來水填充至17cm深之玻璃筒中(24×21cm)游泳6min。由裝在頂板上之照相機錄像記錄FST。評分之行為參數為在6-min測試之最後4min期間的不動。
結果
不動時間之ANOVA未揭示處理之影響[F(3,46)=1.309；P=0.284；圖19]。
結論
在強迫游泳測試中用MXR006長期處理不影響BTBR小鼠之不動時間。
實例2i-抑鬱樣行為之評估-雌性尿液嗅聞測試 基本原理
雌性尿液嗅聞測試(FUST)用於評估囓齒動物之快感缺乏樣行為。嗅聞時間減少表明社交回避/快感缺乏，而增加表示社交行為/快感行為增加。
方法
在測試之前使實驗小鼠單獨居住一週。在測試期間，將於無菌水中浸泡過之棉球棍放入居住籠中且允許小鼠嗅聞/研究三分鐘。在此三分鐘測試之後，將棉球棍移出。45分鐘後，將新的棉球棍浸入雌性尿液(自處於週期之發情期的相同品系之雌性小鼠收集)中，且放入籠中。允許小鼠對此再嗅聞/研究三分鐘。記錄嗅聞水及尿液所用之時間量。
結果
對於媒劑組，史都登氏t檢驗揭示相對於嗅聞水所用之時間嗅聞尿液所用之時間顯著增加[t(16)=2.611；P=0.0189；圖20A]。對於暴露於水，在 水組中嗅聞所用時間之ANOVA未揭示處理之影響[F(3,35)=0.875；P=0.464]。對於暴露於尿液，嗅聞所用時間之ANOVA未揭示處理之影響[F(3,34)=2.153；P=0.114]。然而，事前比較表明當與媒劑組相比時用MRX006長期處理(t=3.602 df=16；P=0.0024)使嗅聞尿液所用之時間增加。
雙因素ANOVA分析[尿液：[F(1,36)=44.118；P<0.0001]；處理：[F(1,36)=12.335；P=0.001]；尿液x處理：[F(1,36)=9.236；P=0.005]繼之以事後檢驗表明與媒劑組相比用MRX006處理之小鼠用更多時間嗅聞尿液(*p<0.01；圖20B)。重要地，正如所料媒劑小鼠用比水更多之時間嗅聞尿液(#p<0.05)。
結論
在雌性嗅聞尿液測試中用MRX006長期處理使BTBR小鼠嗅聞雌性尿液所用之時間顯著增加。
實例2j-抑鬱樣行為之評估-新穎物體識別測試 基本原理
所用之方案係改編自Bevins及Besheer(2006)，且用以測試識別記憶。改善之記憶反映減輕之抑鬱樣行為。
方法
所用方案係改編自Bevins及Besheer(2006)。其進行超過3天。在第1天，允許動物適應測試環境10分鐘，該測試環境為配備有頂部照相機之大容器。未使用墊草且在各動物之間將容器用70%乙醇進行擦拭。在第2天，允許動物適應測試設備10分鐘。在此時間之後，將動物自容器中移出且將兩個相同物體引入環境中。使動物回到該容器且允許其再探索10分鐘。在各試驗之前用70%乙醇溶液清潔物體。在訓練期之後，將囓齒動物自環境移出進入24小時之延遲期。在第3天，使囓齒動物回到該容器，該容器此時僅含有前一天之1個熟悉物體及1個新穎物體。記錄動物對2個物體之活性持續5分鐘。藉由人工觀察 記錄囓齒動物探索各物體所用時間之量且產生對應於相較於總互動時間與新穎物體互動所用之時間的辨別指數(DI)值。與對照大鼠相比DI降低指示此類型記憶之缺陷。
結果
組內之史都登氏t檢驗在新穎物體識別測試之第一天未揭示對物體A或B之偏好(圖21A)。組內之史都登氏t檢驗未揭示相對於熟悉物體對新穎物體之偏好。對於新穎物體，互動時間之ANOVA未揭示處理之影響[F(3,46)=0.122；P=0.946；圖21B]。此外，藉由ANOVA分析揭示處理對辨別指數無影響[F(3,47)=0.535；P=0.661；圖21C]。
結論
在新穎物體識別測試中用MRX006長期處理對BTBR小鼠之認知行為無影響。
實例2k-活體內胃腸道滲透性分析 基本原理
此程序用於評估活體內腸道活力。
方法
使測試小鼠單獨居住且空腹隔夜。第二天早上(約9am)，藉由口服灌胃投與小鼠FITC右旋糖酐((600mg/kg)。兩小時後，在肝素塗佈之毛細管中收集100μl之血液樣品且轉移至深色艾本德管中且放置於冰上。將樣品3500×g離心15分鐘，吸出血漿且將樣品儲存在-80℃下長久儲存。
使用未稀釋之血漿來定量FITC濃度。將25μl之FITC一式兩份移液至384孔板(Greiner bio one)中。用Victor光譜儀在490nm-520nm之範圍之間量測FITC。對於標準曲線，在PBS(pH7.4)中製備FITC之連續稀釋液。吸收率增加指示障壁完整性降低。
結果
通過經口投與螢光化合物異硫氰酸螢光素(FITC)，隨後後續尾部放血以評估血漿中之FITC含量來評估腸道障壁功能。FITC濃度之ANOVA未揭示處理之顯著影響[F(3,47)=1.366；P=0.266；圖23]。
結論
用MRX006長期處理未影響BTBR小鼠之腸道滲透性。
實例2l-離體胃腸道滲透性分析 基本原理及方法
使用尤斯灌流室(Ussing chamber)離體評估迴腸及結腸之滲透性。自小鼠切除結腸及迴腸且收集至含有克雷布氏緩衝液(Kreb's buffer)之5mL管子中。沿腸系膜線切割結腸與迴腸兩者且安裝至尤斯灌流室設備上。對於結腸，將4mL之含有右旋葡萄糖之克雷布氏溶液添加至尤斯灌流室設備之兩側。對於迴腸，將4mL之含有D-甘露糖醇之克雷布氏溶液添加至黏膜側，同時將相等體積之含右旋葡萄糖之克雷布氏溶液添加至漿膜側。將灌流室用卡波金氣體(carbogen gas)(95% O2及5% CO2)充氧且保持在37℃下以維持組織完整性。將2.5mg/mL FITC-右旋糖酐添加至黏膜室中。在時間點0min(基線)、60min、90min及120min自漿膜室取得樣品。將25μl之FITC一式兩份移液至384孔板(Greiner bio one)中。用Victor光譜儀在490nm-520nm之範圍之間量測FITC。對於標準曲線，在PBS(pH7.4)中製備FITC之連續稀釋液。
結果
在離體腸道滲透性分析中，重複量測ANOVA揭示時間對結腸[F(3,87)=64.197；P<0.0001]與迴腸[F(3,87)=34.572；P<0.0001]兩者之影響。重複量測ANOVA未揭示處理相對於時間對結腸[F(9,87)=1.184；P=0.316；圖23A]或迴腸[F(9,87)=0.810；P=0.609；圖22B]之影響。
結論
用MRX006長期處理不影響結腸或迴腸之滲透性。
實例2m-活體內胃腸道活力分析 基本原理
此程序用於評估活體內腸道活力。
方法
在開始測試之前使小鼠單獨居住。為小鼠經口灌胃給予不可吸收之有色染料(胭脂紅)。記錄排泄第一團有色糞便之時間且用作整個腸道之蠕動活力的指示。
結果
藉由口服灌胃投與小鼠不可吸收之有色染料(胭脂紅)。記錄排泄第一團有色糞便之時間且用作整個腸道之蠕動活力的指示。活力時間之ANOVA揭示處理無影響[F(3,47)=2.097；P=0.114]。然而，事前成對比較測試表明當與媒劑組相比時用MRX006處理之小鼠(t=2.270 df=22，p<0.05；圖24)展示改變之腸道活力。
結論
在BTBR小鼠中用MRX006長期處理顯示降低之腸道活力。
實例2n-壓力誘導之循環皮質固酮測定 基本原理
暴露於FST產生HPA軸之穩健活化，其中應激激素皮質固酮之含量增加。將在暴露於FST之前及之後得到之血漿皮質固酮濃度用作壓力誘導之下丘腦垂體腎上腺(HPA)軸活化之指示。
方法
在FST當天，將小鼠自其居住籠移出且移至手術室，在其中取得基 礎血液樣品。使用解剖刀片去除尾部之最尖端(1mm)。使用經肝素化之毛細管收集血液且然後轉移至微量離心管中。亦在暴露於FST之後30、60、90及120分鐘時取得血液樣品以評估峰值皮質固酮含量及回收皮質固酮含量。將血液保持在冰上且然後在4℃下在2,500×g下離心15分鐘。遵循供應商說明書(ENZO皮質固酮ELISA，ADI-900-097，Enzo Life Sciences)，藉由ELISA評估血漿皮質固酮。
結果
重複量測ANOVA揭示時間之顯著影響[F(4,164)=127.127；P<0.0001；圖25]。事後比較揭示所有組在30分鐘時間點之循環皮質固酮顯著增加。重複量測ANOVA未揭示處理相對於時間之顯著影響[F(12,164)=0.561；P=0.871]。
結論
用MRX006長期處理不影響暴露於強迫游泳測試之BTBR小鼠中的壓力誘導之皮質固酮含量。
實例2o-器官重量及結腸長度
按%體重計之器官重量之ANOVA未揭示處理對腎上腺[F(3,44)=1.480；P=0.234；圖26A}、脾臟[F(3,43)=0.779；P=0.513；圖26B]或盲腸[F(3,44)=0.441；P=0.725；圖26C]之影響。結腸長度之ANOVA未揭示處理之影響[F(3,46)=0.826；P=0.487；圖26D]。
結論
用MRX006處理不影響選擇性解剖學標記物。
實例2p-體重監測
在實驗之持續時間內每週一次評估動物體重以確定細菌菌株中之任一者是否影響此特定參數。重複量測ANOVA揭示時間之顯著影響[F(11,484)= 111.217；P<0.0001；圖27]。重複量測ANOVA未揭示處理相對於時間之影響[F(33,484)=0.581；P=0.971]。
結論
用MRX006長期處理不影響BTBR小鼠之體重。
BTBR小鼠模型之結論
此研究之主要發現為用MRX006處理使刻板及焦慮相關行為減弱。特定而言，MRX006使埋珠測試中埋葬彈珠之數目減少並且使動物用於梳理之時間的量減少。此外，用此活生物治療劑處理使在曠場中央所用時間之量增加，此與在周邊所用時間之量減少一致，此指示抗焦慮樣作用。然而，在高架十字迷宮測試中觀測到對焦慮樣行為無影響。MRX006改善BTBR小鼠之刻板及焦慮相關行為之能力為有前景的且表明其可為有效治療劑。
MRX006亦使嗅聞來自雌性小鼠之尿液所用之時間增加。最初將雌性尿液嗅聞測試設計為評估囓齒動物之快感樣行為的測試，其中將嗅聞尿液所用時間增加解釋為尋求獎賞行為增加(Malkesman等人，2010)。鑒於未報道BTBR小鼠展示抑鬱樣表型，在當前實驗中在用MRX006處理之後觀測到嗅聞尿液所用時間增加可能不反映快感行為之改善。相反地，可能MRX006增加此等小鼠識別及加工社交資訊(亦即雌性費洛蒙)之能力。然而，在3室測試及社交互動測試中未觀測到組間社交行為之差異。用MRX006處理使小鼠研究新穎同種小鼠所用之時間量相對於熟悉之同種小鼠有所減少。
除了腸道活力，當前研究中所評估之活生物治療劑未影響所量測之若干生理參數。舉例而言，在壓力誘導之皮質固酮分泌、解剖重量、腸道滲透性或總體重中觀測到活生物治療劑無影響。在腸道活力分析中，用MRX006處理使以胭脂紅染料口服灌胃之後第一團紅色球粒出現所用之時間延長。此類結果表明MRX006延長腸道活力。
實例3-母體免疫活化(MIA)小鼠模型
MIA小鼠模型使用妊娠小鼠之環境免疫激發以在後代中觸發自閉症譜系病症之核心症狀。MIA小鼠典型地展示刻板行為(如由梳理及埋珠測試所示)及社交溝通缺陷(如由社交玩耍、3-室社交互動及食物偏好社交傳遞測試所顯示)。後代展示自閉症之三種核心症狀(溝通減少；社交性降低；及重複或刻板行為增加)且因此提供適合用於確定投與治療劑是否可緩解與自閉症譜系病症相關且確實存在於許多其他神經病症中之行為表型的模型。充分確定的是，不管瞭解潛在生物機制抑或生理機制，動物模型中行為表型之改變指示潛在臨床相關干預(Crawley 2012)。
實例3a-用於MIA小鼠模型之材料及方法 小鼠
如先前所描述進行母體免疫活化(環境ASD小鼠模型)方案(Hsiao,McBride等人2013)。簡單來說，根據(Hsiao,McBride等人2013)中所描述之方法在E12.5為妊娠C57BL/6N小鼠(ENVIGO,UK)腹膜內注射鹽水或20mg/kg聚(I：C)。此等小鼠在以下實驗中列為MLA小鼠。雄性小鼠在8週齡時開始行為。使動物居住在按12h暗循環(7：00-19：00h開燈)之溫度及濕度受控之房間中。全部實驗係根據歐洲指令2010/63/EEC 2012年之S.I.編號543之要求來進行，且由科克大學之動物實驗倫理委員會批准。
菌株
MRX006：以登錄號NCIMB 42381保藏之糞便布勞特氏菌細菌。
使活生物治療劑在設備中在厭氧條件下生長。
活生物治療劑投與
當小鼠8週齡時開始使用MRX006或媒劑進行給藥。在開始行為系列之前每天用MRX006或磷酸鹽緩衝溶液(PBS)將此等小鼠處理一次，持續3 週。在行為系列期間將小鼠每天再處理一次，持續5週。在投與之前將MRX006(1×107 至1×109 CFU，經口投與)溶解於PBS中。
投與時間表
以下顯示用於研究之處理組。用於經口投與之媒劑為PBS。經由口服灌胃進行每天經口投與。
糞便收集
每週自個別小鼠收集新鮮糞便樣品直至研究結束。將至少20mg之新鮮糞便放置於微量離心管中，即刻放置於冰上且然後儲存在-80℃下。
實驗設計及方法
如上文所概述，當小鼠8週齡時開始使用MRX006或媒劑進行給藥。行為系列按以下順序進行：在第4週時曠場場地，在第5週時埋珠測試；在第6週時食物偏好社交傳遞測試及在第7週時雌性尿液嗅聞測試。胭脂紅胃腸道活力分析及胃腸道滲透性分析尾部放血分別在第7週及第8週期間進行。最後，在第9週，將小鼠殺死用於脾細胞刺激及迴腸及結腸中之FITC的離體量測。
在MIA模型中活生物治療劑處理對刻板、社交及抑鬱樣行為以及胃腸道參數(滲透性及活力)的影響概述於以下實例中。
上表中所列之組2代表母體免疫活化小鼠，其母體在妊娠期間經聚(I：C)處理。此等小鼠將預期與對照小鼠(組1)相比顯示與自閉症譜系病症相關之表型，此對照確保聚(I：C)投與在母體小鼠後代中引起預期行為症狀。處理對自閉症譜系病症之行為症狀之任何影響將藉由組2與組3之間的差異來鑑定。
圖解設計及統計分析
全部圖係在graphpad prism軟體(版本5)上產生。使用IBM SPSS Statistic 22.0(EEUU)分析資料。使用柯爾莫哥洛夫-斯米爾諾夫正態性檢驗分析資料分佈。使用單因素ANOVA及費雪最小顯著差異(LSD)事後檢驗對比較媒劑組與MRX006組之資料進行分析。若ANOVA未揭示處理之顯著影響，則針對對照組進行事前成對比較測試。藉由克魯斯卡爾-沃利斯及非參數曼-惠特尼U檢驗分析非正態分佈之資料。P<0.05為統計顯著性之準則。
實例3b-刻板行為之評估-埋珠測試 基本原理
此測試評估重複、強迫及焦慮行為。埋藏彈珠之數目較高指示更加焦慮或刻板之行為。實際上，與對照小鼠相比發，用諸如抗焦慮劑之藥理學藥劑處理之小鼠顯示減少之埋珠行為。
方法
將小鼠個別地放入新穎聚丙烯籠(35×28×18.5cm，L×W×H)中，該新穎聚丙烯籠含有標準囓齒動物(硬木)墊草(5cm)及其頂部之20個彈珠(五列彈珠有規律地間隔2cm，遠離籠壁且相隔2cm)。在1000勒克司之光強度下進行實驗。30分鐘後，將小鼠自此等籠中移出且對埋藏超過表面2/3之彈珠數目進行評分。
結果
對照組與媒劑MIA組之間的史都登氏t檢驗分析表明與對照組相比媒劑MIA小鼠埋藏更多彈珠(t(21)=2.751，P=0.011；圖28)。埋藏彈珠之數目的ANOVA揭示處理之顯著影響[F(3,48)=18.39；P<0.001]。事後比較表明用MRX006長期處理使埋藏彈珠之數目減少(p<0.01；圖28)。
結論
媒劑MIA組顯示埋藏了比對照組顯著更多之彈珠，表明MIA模型在小鼠中成功觸發自閉症譜系病症樣症狀。用MRX006長期處理使MIA小鼠之重複、強迫及焦慮行為減輕。
實例3c-社交行為之評估-食物偏好社交傳遞 基本原理
食物偏好社交傳遞為嗅覺記憶之相關測試，其在小鼠中用於評估社交行為。在此測試中，觀察者小鼠與最近吃過新穎食物之展示者小鼠互動。當觀察者小鼠面對展示者吃過之食物與另外一些新穎食物之間的選擇時，觀察者小鼠會偏愛展示者吃過之食物。降低之食物偏好將指示降低之社交性。
方法
如先前所描述進行此測試(Desbonnet,Clarke等人2015)。簡單來說，在測試之前18小時時，剝奪小鼠之食物，而水任意獲取。食物選擇由與經研磨之小鼠食物一起製備之1%經研磨肉桂或2%粉末可可組成。自各籠中隨機選擇展示者小鼠且用藍色標記物標記尾部以能夠在後續社交互動期間加以鑑定。在1小時取樣期之前及之後將展示者食物容器稱重。包括在測試中需要消耗最少0.2g之食物。將展示者小鼠放回其各別居住籠進入與籠同伴之30分鐘互動期。隨後，個別測試籠同伴對提示之食物或新穎食物之偏好。在即將進入各選擇期之前及之後將容器稱重。然後將所觀測之小鼠放回其各別居住籠且在24小時後重複選擇期。測試小鼠將在不存在展示者小鼠作為社交提示之情況下嗅聞肉桂或可可，且當給出兩者之間的選擇時優先選擇相同食物。
結果
食物偏好百分比之史都登氏t檢驗揭示在0小時(t(22)=0.3325，P=0.7427)或24小時(t(21)=0.2878，P=0.7763)評估時對照與媒劑MIA組之間無差異。展示者提示之食物偏好的ANOVA揭示當觀察者暴露於食物選擇時在0小時 [F(3,48)=1.49，P=0.228；圖29A]或24小時評估[F(3,47)=2.66，P=0.059；圖29B]時無顯著差異。在食物偏好社交傳遞測試中用MRX006處理未改變對提示之食物之偏好。
結論
媒劑MIA組未展示降低之食物偏好社交傳遞(MIA媒劑展示與對照相比食物偏好無改變)，表明MIA模型尚未觸發降低之社交性表型。用MRX006長期處理對食物偏好無影響。然而，由於MIA模型在此測試中似乎未引起降低之社交性表型，故不可能在食物偏好社交傳遞測試中測定用MRX006長期處理對社交性之影響。
實例3d-焦慮樣行為之評估-曠場場地 基本原理
使用曠場場地來評估暴露於新穎壓力環境之反應及自主活動。原初小鼠天然地將大多數時間耗費在場地壁旁邊，因為其與場地中央相比暴露較少。在中央所用之持續時間增加表示焦慮樣行為減輕。
方法
將小鼠個別地放入曠場場地(43×35×25，L×w×h)中且允許其探索10分鐘。實驗在60勒克司之光強度下進行。使用裝在頂板上之照相機錄像記錄實驗以允許使用Ethovision軟體量測若干行為參數。對行進距離進行評分以得到自主活動。
結果
史都登氏t檢驗揭示對照與媒劑MIA組之間的移動總距離無顯著差異(t(22)=0.9357，P=0.3596)。移動總距離之ANOVA揭示處理之顯著影響[F(3,47)=4.36，P=0.003，圖30A]。事後比較表明相對於媒劑處理之動物用MRX006處理使行進之總距離減小(p<0.05)。史都登氏t檢驗揭示相對於對照組由媒劑 MIA組在曠場外部區域所用之時間顯著增加(t(21)=3.337，P=0.003)。在曠場外部區域所用之時間的ANOVA揭示處理無影響[F(3,47)=0.093，圖30B]。史都登氏t檢驗揭示相對於對照小鼠由媒劑MIA組在內部區域所用之時間顯著減少(t(21)=3.337，P=0.003)。在內部區域所用之時間的ANOVA揭示處理無影響[F(3,47)=0.93，P=0.96，圖30C]。
結論
用MRX006處理使MIA小鼠在曠場場地中行進之距離減小。因此，MRX006可使由暴露於曠場場地引起之壓力誘導之自主活動減弱。
實例3e-抑鬱樣行為之評估-雌性尿液溴聞測試 基本原理
雌性尿液嗅聞測試(FUST)用於評估囓齒動物之快感缺乏樣行為。嗅聞時間減少表明社交回避/快感缺乏，而增加表示社交行為/快感行為增加。
方法
在測試之前使實驗小鼠單獨居住一週。在測試期間，將於無菌水中浸泡過之棉球棍放入居住籠中且允許小鼠嗅聞/研究三分鐘。在此三分鐘測試之後，將棉球棍移出。45分鐘後，將新的棉球棍浸入雌性尿液(自處於週期之發情期的相同品系之雌性小鼠收集)中，且放入籠中。允許小鼠對此再嗅聞/研究三分鐘。記錄嗅聞水及尿液所用之時間量。
結果
曼-惠特尼U檢驗表明對照[曼-惠特尼U值=7，P=0.0123]與媒劑MIA[曼惠特尼U值=57；P=0.0201]組均用比水更多之時間嗅聞尿液(圖31)。對於嗅聞尿液所用之時間，克魯斯卡爾-沃利斯非參數分析未揭示處理之影響[df=4，P=0.3293]。
結論
在雌性嗅聞尿液測試中用MRX006長期處理不影響MIA小鼠之抑鬱樣行為。
實例3f-活體內腸道活力分析 基本原理
已報道MIA模型引起腸道障壁功能之變化。因此，確定用生物治療劑長期處理是否改變腸道活力為重要的。
方法
在開始測試之前使小鼠單獨居住。為小鼠經口灌胃給予不可吸收之有色染料(胭脂紅)。記錄排泄第一團有色糞便之時間且用作整個腸道之蠕動活力的指示。
結果
史都登氏t檢驗分析表明當與對照組相比時媒劑MIA組未展現改變之腸道活力(在較少時間內偵測到紅色球粒)(t(22)=0.006，P=0.9950)。活力時間之ANOVA揭示處理無影響[F(3,50)=0.99；P=0.404，圖32]。
結論
在此實驗中，媒劑MIA組與對照相比未展現改變之腸道活力。與對照或媒劑MIA組相比，用MRX006長期處理未影響腸道活力。
實例3g-器官重量及結腸長度
對於結腸長度，史都登氏t檢驗未揭示媒劑MIA與對照組之間的任何顯著差異(t(21)=1.26，P=0.26)。結腸長度之ANOVA未揭示處理之影響[F(3,49)=0.69，P=0.57；圖33A]。對於按%體重計之盲腸重量，史都登氏t檢驗未揭示媒劑MIA與對照組之間的顯著差異(t(22)=0.56，P=0.58)。ANOVA揭示處理對盲腸重量無顯著影響[F(3,48)=0.84，P=0.48，圖33B]。對於按%體重計之脾臟重量，史都登氏t檢驗未揭示媒劑MIA與對照組之間的顯著差異(t(22)=0.64，P =0.53)。ANOVA揭示處理對脾臟重量無顯著影響[F(3,48)=2.25，P=0.09，圖33C)。
結論
在自閉症之MIA小鼠模型中用MRX006處理不影響結腸長度或器官重量。
MIA小鼠模型之結果的討論
用MRX006長期處理能夠逆轉在埋珠測試中在MIA小鼠中所觀測到之表型。用MRX006長期處理能夠使埋藏彈珠之數目減少，表明刻板樣行為減輕。此外，用MRX006長期處理使行進距離減小，而對在曠場場地中在內部及外部區域中所用之時間沒有任何影響。因此，用MRX006處理可使由暴露於曠場場地引起之壓力誘導之自主活動減弱。在食物社交傳遞及雌性尿液嗅聞測試中觀測到處理無顯著影響，表明在MIA小鼠模型中在社交及抑鬱樣行為中無直接可觀測之影響。所測試之活生物治療劑未影響腸道活力或滲透性。因此，已證實MIA模型適合用於評估刻板樣、重複及焦慮行為，但其不再形成與自閉症譜系病症相關之許多其他症狀。然而，結果顯示用MRX006長期處理可對自閉症譜系病症之症狀具有積極作用。
關於自閉症譜系病症之治療中的MRX006的總結論
MRX006顯示在BTBR與MIA小鼠模型中在治療刻板及焦慮樣行為方面為有效的。在自閉症之小鼠模型中逆轉行為及生物表型的療法預期對人類疾病有效。
關於用於治療自閉症譜系病症之醫學產品之臨床開發的EMA準則說明，歸因於疾病之異質性，使用單一化合物可能不會對全部核心症狀達成顯著影響，且因此必定展現對至少一種核心症狀之短期功效。MRX006活生物治療劑已顯示有效治療自閉症譜系病症之至少一種核心症狀，因此其及相關布勞 特氏菌屬及糞便布勞特氏菌菌株預期對人類疾病有效。類似地，其他中樞神經系統病症或病狀展示具有多種不同症狀之複雜病變，且經批准之治療較少。因此，應瞭解，有效治療不需要治療中樞神經系統病症或病狀之全部症狀。若一治療將治療與中樞神經系統病症或病狀相關之症狀中之一者，則其將被視為在治療上適用。
實例4-BTBR小鼠中之循環細胞因子之量測 方法及結果
在實驗結束時在各動物撲殺當天自軀幹血(trunk blood)收集血漿。使用市售電致化學發光多重系統(MSD，GaIthersberg,MSD,USA)評估來自媒劑及MRX006組之血漿樣品中的循環細胞因子。分析以下細胞因子：IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-21、IL-23、TNF-α及IFN-γ。多重分析表明在媒劑與MRX006處理之動物中IL-1β、IL-4、IL-17A、IL-21及IL-23之含量低於偵測限。對於循環TNF-α，史都登氏t檢驗未揭示用MRX006處理之顯著影響(t(21)=0.4264，P=0.6742，圖34A)。對於循環IFN-，史都登氏測試未揭示用Mrx006處理之顯著影響(t(17)=0.4103，P=0.6867，圖34B)。對於循環IL-6，史都登氏t檢驗未揭示用MRX006處理之顯著影響(t(11)=0.020，P=0.98，圖34C)。對於循環IL-10，用MRX006長期處理引起IL-10含量之非顯著增加(t(13)=1.396，P=0.1861，圖34D)。
結論
雖然就調控循環細胞因子濃度而言MRX006不存在顯著影響，但在用活生物治療劑處理之後存在明顯的非顯著循環IL-10增加傾向。此類結果表明MRX006具有免疫調控特性且可增加抗炎性細胞因子之產量。雖然多重分析係對含有基礎、未經刺激細胞因子濃度之血漿樣品進行，但評估MRX006在經刺激條件下是否能夠調節IL-10及其他細胞因子將為有趣的。
實例5-評估用MRX006亞短期處理對C57BL/6小鼠中之中樞及外周催產素含量之影響
製備細菌菌株且如以上實例中所概述進行投與。在各具有10-12隻小鼠之7個實驗處理組中，將C57BL/6小鼠用活生物治療劑處理六天。隨後，自小鼠解剖下丘腦且藉由放射免疫分析(RIA)偵測下丘腦中之催產素含量，此外，藉由RIA偵測血漿中之催產素含量。此外，藉由RIA及其他分析方法偵測催產素受體、白介素及其他炎性標記物及升壓素激素之含量。
實例6-穩定性測試
在25℃或4℃下將含有本文所描述之至少一種細菌菌株的本文所描述之組合物儲存於密封容器中且將容器放置於具有30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%或95%相對濕度之氛圍中。在1個月、2個月、3個月、6個月、1年、1.5年、2年、2.5年或3年之後，如藉由標準方案所測定以菌落形成單位所量測至少50%、60%、70%、80%或90%之細菌菌株將保留。
實例7-MIA小鼠模型中另一活生物治療劑之投與 實例7a-用於MIA小鼠模型之材料及方法
此實例中所用之小鼠、活生物治療劑投與及糞便收集與以上實例3中所用之彼等相同。
菌株
MRX008：韋克斯勒布勞特氏菌，以登錄號NCIMB 42486保藏之細菌。
投與時間表
以下顯示用於研究之處理組。用於經口投與之媒劑為PBS。經由口服灌胃進行每天經口投與。
實驗設計及方法
當小鼠8週齡時開始使用MRX008或媒劑進行給藥。行為系列按以下順序進行：在第5週時埋珠測試；在第6週時食物偏好社交傳遞及在第8週時強迫游泳測試。胭脂紅胃腸道活力分析及胃腸道滲透性分析尾部放血分別在第7週及第8週期間進行。最後，在第9週，將小鼠殺死用於脾細胞刺激及迴腸及結腸中之FITC的離體量測。
在MIA模型中活生物治療劑處理對刻板、社交及抑鬱樣行為以及胃腸道參數(滲透性及活力)的影響概述於以下實例中。
上表中所列之組2代表母體免疫活化小鼠，其母體在妊娠期間經聚(I：C)處理。此等小鼠將預期與對照小鼠(組1)相比顯示與自閉症譜系病症相關之表型，此對照確保聚(I：C)投與在母體小鼠後代中引起預期行為症狀。處理對自閉症譜系病症之行為症狀之任何影響將藉由組2與組3之間的差異來鑑定。
圖解設計及統計分析
全部圖係在graphpad prism軟體(版本5)上產生。使用IBM SPSS Statistic 22.0(EEUU)分析資料。使用柯爾莫哥洛夫-斯米爾諾夫正態性檢驗分析資料分佈。使用單因素ANOVA及費雪最小顯著差異(LSD)事後檢驗對比較媒劑組與MRX008組之資料進行分析。若ANOVA未揭示處理之顯著影響，則針對對照組進行事前成對比較測試。藉由克魯斯卡爾-沃利斯及非參數曼-惠特尼U檢驗分析非正態分佈之資料。P<0.05為統計顯著性之準則。
實例7b-刻板行為之評估-埋珠測試 基本原理及方法
參見以上實例3b。
結果
對照組與媒劑MIA組之間的史都登氏t檢驗分析表明與對照組相比，媒劑MIA小鼠埋藏更多之彈珠(t(19)=3.00，P=0.007；圖35)。埋藏彈珠之數目的ANOVA揭示處理之影響[F(3,42)=6.37；P=0.001]。相對於媒劑MIA組，用MRX008長期處理顯示埋藏彈珠之數目減少。
結論
媒劑MIA組顯示埋藏了比對照組顯著更多之彈珠，表明MIA模型在小鼠中成功觸發自閉症譜系病症樣症狀。在用MRX008長期處理後在MIA小鼠中存在重複、強迫及焦慮行為減輕之傾向。
實例7c-社交行為之評估-食物偏好社交傳遞 基本原理及方法
參見以上實例3c。
結果
展示者提示之食物偏好的ANOVA揭示不管是投與媒劑抑或是MRX008，當觀察者在展示者互動之後即刻(T0)(F(3,34)=0.38，P=0.77；圖36A)或24h後(F(3,34)=0.85，P=0.48；36B)暴露於食物選擇時無顯著差異。
結論
媒劑MIA組未展示降低之食物偏好社交傳遞(MIA媒劑展示與對照相比食物偏好無改變)，表明MIA模型尚未觸發降低之社交性表型。因此，不可能使用MIA小鼠模型來測定用MRX008長期處理對社交性之影響。
實例7d-抑鬱樣行為之評估-強迫游泳測試 基本原理
強迫游泳測試(FST)為最廣泛用於評估抗抑鬱活性之實驗範式 ([57])。在此測試中，迫使小鼠游泳6min且評分之行為參數為在6-min測試之最後4min期間之不動。在適應不動之浮起姿勢之前，原初動物將以游泳、攀爬及潛水之形式展示逃避行為。不動之持續時間指示行為絕望程度。抗抑鬱藥物使在此測試中不動所用之時間減少。
方法
迫使小鼠在用23-25℃自來水填充至17cm深之玻璃筒中(24×21cm)游泳6min。由裝在頂板上之照相機錄像記錄FST。評分之行為參數為在6-min測試之最後4min期間的不動。
結果
史都登氏t檢驗分析揭示在對照組與媒劑MIA組之間關於不動時間無顯著差異(t=0.8968 df=20；0.3805)。不動時間之ANOVA未揭示用MRX008處理之影響，不過在投與MRX008之後不動所用之時間似乎略微傾向於減少[F(3,42)=1.803；P=0.1625；圖37]。
結論
在強迫游泳測試中媒劑MIA組未展示不動時間增加(MIA媒劑展示與對照相比不動時間無改變)，表明MIA模型未增加抑鬱樣症狀。因此，不可能使用MIA小鼠模型來測定用MRX008長期處理對抑鬱樣行為之影響。
實例7e-活體內腸道滲透性分析 基本原理
已報道MIA模型引起腸道障壁功能之變化。因此，確定用生物治療劑長期處理是否影響腸道滲透性為重要的。
方法
將測試小鼠單個關籠且移去食物隔夜。第二天(在約9am時)藉由口服灌胃投與小鼠FITC右旋糖酐(異硫氰酸螢光素；MW：4kDa，Sigma；濃度： 每一動物600mg/kg之80mg/ml FITC PBS(pH7.4)溶液)。在FITC投與之後兩小時時，在肝素塗佈之毛細管中由尾部放血收集100μl之血液樣品且轉移至琥珀艾本德管且放置於冰上。將樣品3500×g離心15分鐘，吸出血漿且將樣品儲存在-80℃下長久儲存。
使用未稀釋之血漿來定量FITC濃度。將25μl之FITC一式兩份移液至384孔板(Greiner bio one)中。用Victor光譜儀在490nm-520nm之範圍之間量測FITC。對於標準曲線，在PBS(pH7.4)中製備FITC之連續稀釋液。
此外，在第9週撲殺小鼠之後，進行迴腸及結腸中之FITC的離體量測。
結果
史都登氏t檢驗分析揭示對照組與MIA媒劑組之間無差異(t(20)=0.56，P=0.58；圖38)。FITC濃度之ANOVA未揭示處理之顯著影響[F(3,39)=2.23，P=0.08]。
結論
在此實驗中，媒劑MIA組未展示改變之腸道滲透性(MIA媒劑展示與對照相比滲透性無改變)。此外，用MRX008長期處理未影響MIA小鼠之腸道滲透性。
實例7f-活體內腸道活力分析 基本原理及方法
參見以上實例3f。
結果
史都登氏t檢驗分析表明當與對照組相比時媒劑MIA組展現增加之腸道活力(在較少時間內偵測到紅色球粒)(t(19)=3.00，P=0.007)。活力時間之ANOVA揭示處理無影響[F(3,38)=0.74，P=0.54；圖39]。
結論
在此實驗中，媒劑MIA組與對照相比展示增加之腸道活力。用MRX008長期處理與對照相比未影響腸道活力。
實例8-在BTBR小鼠模型中另一活生物治療劑之投與 實例8a-用於BTBR小鼠模型之材料及方法
此實例中所用之小鼠、活生物治療劑投與及糞便收集與以上實例2中所用之彼等相同。
菌株
MRX008：韋克斯勒布勞特氏菌，以登錄號NCIMB 42486保藏之細菌。
投與時間表
以下顯示用於研究之處理組。用於經口投與之媒劑為PBS。經由口服灌胃進行每天經口投與。
實驗設計及方法
如上文所概述，當小鼠8週齡時開始使用MRX008進行給藥。在涵蓋社交性、焦慮、刻板(stereopathy)及認知測試之行為實驗之前進行3週初始給藥。行為系列按以下順序進行：在第4週時埋珠測試；在第5週時高架十字迷宮；在第6週時曠場及新穎物體識別測試以及食物偏好社交傳遞測試；在第7週時雌性尿液嗅聞及社交互動測試及在第9週時強迫游泳測試。胭脂紅胃腸道活力分析及胃腸道滲透性分析尾部放血分別在第8週及第9週期間進行。最後，在第 10週至第11週，將小鼠殺死用於脾細胞刺激及迴腸及結腸中之FITC的離體量測。
在BTBR模型中活生物治療劑處理對刻板、社交及抑鬱樣行為以及胃腸道參數(滲透性及活力)的影響概述於以下實例中。
上表中所列之組1代表對照BTBR小鼠，其將預期顯示與自閉症譜系病症相關之表型。處理對自閉症譜系病症之行為症狀之任何影響將藉由組1及組2之間的差異來鑑定。
圖解設計及統計分析
全部圖係在graphpad prism軟體(版本5)上產生。使用IBM SPSS Statistic 22.0(EEUU)分析資料。使用柯爾莫哥洛夫-斯米爾諾夫正態性檢驗分析資料分佈。使用單因素ANOVA及費雪最小顯著差異(LSD)事後檢驗對比較媒劑組與MRX008組之資料進行分析。若ANOVA未揭示處理之顯著影響，則針對對照組進行事前成對比較測試。藉由克魯斯卡爾-沃利斯及非參數曼-惠特尼U檢驗分析非正態分佈之資料。P<0.05為統計顯著性之準則。
實例8b-社交行為之評估-食物偏好社交傳遞 基本原理
食物偏好社交傳遞為嗅覺記憶之相關測試，其在小鼠中用於評估社交行為。在此測試中，觀察者小鼠與最近吃過新穎食物之展示者小鼠互動。當觀察者小鼠面對展示者吃過之食物與另外一些新穎食物之間的選擇時，觀察者小鼠會偏愛展示者吃過之食物。降低之食物偏好將指示降低之社交性。
方法
如先前所描述進行此測試(Desbonnet,Clarke等人2015)。簡單來說，在測試之前18小時時，剝奪小鼠之食物，而水任意獲取。食物選擇由與經研磨之小鼠食物一起製備之1%經研磨肉桂或2%粉末可可組成。自各籠中隨機選擇 展示者小鼠且用藍色標記物標記尾部以能夠在後續社交互動期間加以鑑定。在1小時取樣期之前及之後將展示者食物容器稱重。包括在測試中需要消耗最少0.2g之食物。將展示者小鼠放回其各別居住籠進入與籠同伴之30分鐘互動期。隨後，個別測試籠同伴對提示之食物或新穎食物之偏好。在即將進入各選擇期之前及之後將容器稱重。然後將所觀測之小鼠放回其各別居住籠且在24小時後重複選擇期。測試小鼠將在不存在展示者小鼠作為社交提示之情況下嗅聞肉桂或可可，且當給出兩者之間的選擇時優先選擇相同食物。
結果
展示者提示之食物偏好的ANOVA揭示當觀察者在展示者互動之後即刻(T0)(F(3,36)=1.123；P=0.354；圖40A)或24h後(F(3,38)=0.138；P=0.936；圖40B)暴露於食物選擇時無顯著差異。
結論
在社交傳遞食物偏好測試中用MRX008處理未影響BTBR小鼠之社交性。
實例8c-社交行為之評估-強迫入侵者測試 基本原理及方法
參見以上實例2c。
結果
互動時間之ANOVA未揭示處理之影響[F(3,36)=1.905；P=0.1462；圖41]。
結論
在社交互動測試中用MRX008處理未影響BTBR小鼠之社交行為。
實例8d-刻板行為之評估-埋珠測試 基本原理及方法
參見以上實例2d。
結果
埋藏彈珠之數目的ANOVA未揭示處理之顯著影響[F(3,39)=0.835；P=0.483；圖42]，不過用MRX008長期處理展示由BTBR小鼠埋藏之彈珠數目減少的傾向。
結論
用MRX008長期處理未顯著影響BTBR小鼠之重複、強迫及焦慮行為，不過其展示此行為水準降低之傾向。
實例8e-焦慮樣行為之評估-高架十字迷宮 基本原理及方法
參見以上實例2f。
結果
在封閉臂中所用時間之百分比的ANOVA揭示處理無影響[F(3,39)=0.556；P=0.647；圖43A]。用MRX008處理之小鼠與媒劑組相比似乎在開放臂中耗費更多時間(圖43b)。與此一致，與媒劑組相比，用MRX008長期處理似乎使進入開放臂之次數增加(圖43D)。進入封閉臂之次數的ANOVA揭示處理無影響[F(3,39)=0.556；P=0.647；圖43C]。
結論
用MRX008長期處理在高架十字迷宮中在BTBR小鼠中顯示非顯著抗焦慮行為傾向。
實例8f-焦慮樣行為之評估-曠場場地 基本原理及方法
參見以上實例2g。
結果
移動距離之ANOVA未揭示處理對在曠場場地中之自主活動之顯著影響[F(3,37)=1.325；P=0.282，圖44A]，不過MRX008似乎使移動距離減小，表明壓力誘導之自主活動降低。在外部區域所用之時間的ANOVA未揭示處理之影響[F(3,37)=1.598；P=0.208；圖44B]。事前成對比較表明用Mrx008處理使在內部區域所用之時間減少[t=2.388 df=17；P=0.0288；圖44C]。
結論
用MRX008長期處理顯示壓力誘導之自主活動降低的傾向，但顯示在內部區域中之時間減少，暗示焦慮樣行為。
實例8g-抑鬱樣行為之評估-強迫游泳測試 基本原理及方法
參見以上實例2h。
結果
不動時間之ANOVA未揭示處理對在FST中BTBR小鼠之不動時間之影響[F(3,38)=1.879；P=0.151；圖45]，不過用MRX008長期處理引起不動所用之時間減少的傾向，表明抗抑鬱劑行為。
結論
在強迫游泳測試中用MRX008處理非顯著地減少BTBR小鼠之不動時間，暗示處理之抗抑鬱作用。
實例8h-抑鬱樣行為之評估-雌性尿液嗅聞測試 基本原理及方法
參見以上實例2i。
結果
對於媒劑組，曼-惠特尼U檢驗揭示相對於嗅聞水所用之時間嗅聞尿液所用之時間顯著增加[t=2.976 df=18；P=0.0081]。對於暴露於水，嗅聞所用 時間之克魯斯卡爾沃利斯非參數分析未揭示處理在水組中之影響[卡方：6.352；df=3；P=0.096]。對於暴露於尿液，嗅聞所用時間之克魯斯卡爾沃利斯非參數分析未揭示處理之影響[卡方：3.639；df=3；P=0.303，圖46]。
結論
用MRX008處理對BTBR小鼠嗅聞尿液所用之時間無影響。
實例8i-活體內胃腸道活力分析 基本原理及方法
參見以上實例2m。
結果
活力時間之ANOVA揭示處理無影響[F(3,39)=2.072；P=0.121；圖47]。
結論
用MRX008處理未影響腸道活力。
實例8j-器官重量及結腸長度
按%體重計之器官重量之ANOVA未揭示處理對腎上腺[F(3,37)=0.208；P=0.890；圖48A]、脾臟F(3,35)=0.629；P=0.601；圖48B]或盲腸[F(3,37)=0.883；P=0.460；圖48C]之影響。結腸長度之ANOVA未揭示處理之影響[F(3,37)=5.635；P=0.003；圖48D]。
關於自閉症譜系病症之治療中的MRX008的總結論
本文所揭示之實驗展示如下證據，在小鼠模型中投與另一布勞特氏菌屬種類(亦即韋克斯勒布勞特氏菌MRX008)可適用於治療神經發育及神經精神病症。特定而言，在BTBR小鼠模型中，用MRX008處理分別在高架十字迷宮及強迫游泳測試中展示潛在抗抗焦慮作用以及抗抑鬱作用之傾向，不過曠場場地分析表明MRX008未影響焦慮樣行為。此外，在MIA與BTBR小鼠模型中 如藉由埋珠測試所示MRX008可減輕刻板、重複及焦慮行為。用MRX008生物治療劑處理未改變此等研究中所量測之若干生理參數。
關於用於治療自閉症譜系病症之醫學產品之臨床開發的EMA準則說明，歸因於疾病之異質性，使用單一化合物可能不會對全部核心症狀達成顯著影響，且因此必定展現對至少一種核心症狀之短期功效。MRX008活生物治療劑已顯示有效治療自閉症譜系病症之至少一種核心症狀，因此其及相關布勞特氏菌屬及韋克斯勒布勞特氏菌菌株預期對人類疾病有效。類似地，其他中樞神經系統病症或病狀展示具有多種不同症狀之複雜病變，且經批准之治療較少。因此，應瞭解，有效治療不需要治療中樞神經系統病症或病狀之全部症狀。若一治療將治療與中樞神經系統病症或病狀相關之症狀中之一者，則其將被視為在治療上適用。
實例9-評估用MRX008亞短期處理對C57BL/6小鼠中之中樞及外周催產素含量之影響
製備細菌菌株且如以上實例中所概述進行投與。在各具有10-12隻小鼠之7個實驗處理組中，將C57BL/6小鼠用活生物治療劑處理六天。隨後，自小鼠解剖下丘腦且藉由放射免疫分析(RIA)偵測下丘腦中之催產素含量，此外，藉由RIA偵測血漿中之催產素含量。此外，藉由RIA及其他分析方法偵測催產素受體、白介素及其他炎性標記物及升壓素激素之含量。
實例10-評估用MRX006長期處理對BTBR小鼠之下丘腦及杏仁核中之催產素、升壓素及其各別受體之基因表現水準的影響
用MRX006長期處理使BTBR小鼠之下丘腦中的催產素及升壓素之基因表現水準增加(參見圖49C及D)。對此組織中催產素及升壓素受體之含量的影響顯示於圖49A及B中。
用MRX006長期處理對BTBR小鼠之杏仁核中的催產素、升壓素或 其各別受體之基因表現水準的影響顯示於圖50中。
因此，用MRX006長期處理使BTBR小鼠之下丘腦中升壓素及催產素之表現增加。此突出結果提供在投與活生物治療劑後腦中之化學變化與行為變化之間的相關性。此為首次有任何研究報導活生物治療劑能夠改變中樞催產素/升壓素系統，並且在改善胃腸道功能之情況下同時改變社交、焦慮樣及刻板行為。
實例11-C57BL/6及BTBR小鼠模型中嗜氫布勞特氏菌之投與
在使用BTBR小鼠作為自閉症譜系病症及其他神經病症之模型的行為實驗中，將投與PBS與LYO兩者之C57BL/6小鼠用作對照來證實BTBR小鼠模型有效展現增加之焦慮、降低之社交嫌惡及增加之刻板行為。此允許評估細菌處理對此等ASD相關行為缺陷之影響。
實例11a-焦慮樣行為之評估-曠場場地 基本原理及方法
參見以上實例2g。水平活動量為小鼠在曠場場地中行進之距離。垂直活動量為小鼠用後腿站起之發生次數。高頻率之此等行為指示增加之移動及探索及/或較低之焦慮水準。在場地中央區域此等行為之頻率增加指示高探究行為及低焦慮水準。
PBS 為丁酸鹽投與之陰性對照，因為丁酸鹽係在PBS中投與。LYO 為嗜氫布勞特氏菌投與之陰性對照。在第一次分析(圖51A、C及E)之後，將C57BL/6與BTBR模型中之PBS 及LYO 之陰性對照的值組合且取平均值，以在第二次分析(圖51B、D及F)中提供簡化比較。
結果 水平活動量
如由焦慮及/或自閉症相關模型將預期，BTBR小鼠與C57BL/6小鼠 相比展示顯著降低之水平活動量。與PBS對照相比，LYO 陰性對照顯示對C57BL/6小鼠之水平活動量無影響。與PBS對照相比，在頭30分鐘內，用LYO 對照或單獨丁酸鹽處理之BTBR小鼠顯示行進距離無顯著差異，而在第二個30分鐘內，LYO 對照使BTBR小鼠行進之距離減少。然而，用細菌菌株處理之小鼠與BTBR對照小鼠相比顯示行進距離顯著增加(圖51A)。
為提供對照與實驗值之間的進一步比較，如上文所概述，在第二次分析中將PBS 及LYO 對照之值組合。類似於第一次分析，投與丁酸鹽未影響水平活動量。然而，與BTBR模型對照相比，投與細菌菌株顯著增加水平活動量(圖51B)。
垂直活動量
與C57BL/6小鼠相比，BTBR小鼠展示顯著降低之垂直活動量(站起)。與PBS 對照相比，LYO 陰性對照顯示對C57BL/6小鼠之垂直活動量無影響。與BTBRPBS 對照小鼠相比，用單獨丁酸鹽處理之BTBR小鼠顯示站起無差異，而LYO 對照使BTBR小鼠之垂直活動量降低。然而，與BTBRLYO 對照小鼠相比，用細菌菌株處理之小鼠顯示垂直活動量顯著增加(圖51C)。
為提供對照與實驗值之間的進一步比較，如上文所概述，在第二次分析中將PBS 及LYO 對照之值組合。類似於第一次分析，投與丁酸鹽未影響BTBR小鼠之垂直活動量。然而，與BTBR對照相比，投與細菌菌株顯著增加垂直活動量(圖51D)。
在頭5分鐘內在曠場中央之行進距離%
如將預期，在分析之頭五分鐘內，與C57BL/6小鼠相比，BTBR小鼠顯示其在曠場場地中央之行進距離百分比增加。此反映展示增加之焦慮行為的BTBR小鼠行進之總距離減少，且反映以下事實，在分析之頭5分鐘內，更焦慮之BTBR小鼠更可能使自己熟悉其初始環境，而不是進入探索階段(圖51E)。
為提供對照與實驗值之間的進一步比較，如上文所概述，在第二次分析中將PBS 及LYO 對照之值組合(圖51F)。
在曠場場地中央所用之時間%
當考慮全部分析時間時，與C57BL/6小鼠相比，BTBR小鼠顯示在場地中央所用時間之百分比降低。此反映BTBR小鼠增加之焦慮及降低之水平活動量。LYO對照與單獨丁酸鹽均未影響在場地中央所用之時間。然而，在BTBR小鼠中，與LYO對照相比，投與細菌菌株使在場地中央所用之時間量顯著增加(圖51G)。
為提供對照與實驗值之間的進一步比較，如上文所概述，在第二次分析中將PBS 及LYO 對照之值組合。類似於第一次，與BTBR對照相比，投與丁酸鹽未影響在場地中央所用之時間。投與細菌菌株使在曠場中央所用之時間量增加。
結論
在BTBR小鼠模型中在曠場場地測試中用嗜氫布勞特氏菌之組合物長期處理使探索性活性增加且使焦慮樣行為減輕。重要地，與BTBR對照相比，向BTBR小鼠模型投與細菌菌株使水平及垂直活動量增加且使在場地中央所用之時間總量增加。因此，在代表中樞神經系統病症(例如自閉症譜系病症)之小鼠模型中，此細菌菌株具有抗焦慮作用且改善探究行為。
實例11b-刻板行為之評估-埋珠測試 基本原理及方法
參見以上實例2d。PBS 為丁酸鹽投與之陰性對照。LYO 為嗜氫布勞特氏菌菌株投與之陰性對照。在第一次分析(圖52A)之後，將C57BL/6與BTBR模型中之PBS及LYO 之陰性對照的值組合且取平均值，以在第二次分析(圖52B)中提供簡化比較。
結果
如將預期，與C57BL/6模型對照相比，BTBR模型小鼠展示重複行為增加，顯示埋藏了顯著更多之彈珠(圖52B)。投與丁酸鹽及細菌菌株使埋藏彈珠之數目減少(圖52A及B)。
結論
投與丁酸鹽及/或細菌菌株使埋藏彈珠之數目減少，指示焦慮或刻板行為減輕。
實例11c-刻板行為之評估-挖掘測試 基本原理及方法
類似於埋珠測試之基本原理，增加之挖掘行為對應於重複及刻板行為增加。
結果
如將預期，與C57BL/6對照菌株相比，在BTBR模型中，挖掘所用之時間存在顯著增加(圖53A)。然而，在C57BL/6及BTBR菌株之間挖掘次數不顯著地不同(圖53B)。因此，不可能評估細菌菌株或丁酸鹽在此分析中預防重複行為之作用。
實例11d-刻板行為之評估-自我梳理測試 基本原理及方法
參見以上實例2e。PBS 為丁酸鹽投與之陰性對照。LYO 為嗜氫布勞特氏菌投與之陰性對照。在第一次分析(圖54A、C及E)之後，將C57BL/6與BTBR模型中之PBS 及LYO 之陰性對照的值組合且取平均值，以在第二次分析(圖54B、D及F)中提供簡化比較。
結果
與用於刻板行為之BTBR模型一致，與C57BL/6小鼠模型相比，在PBS 與LYO 對照兩者中，BTBR小鼠顯示增加之梳理所用時間以及增加之梳理次數。與PBS 對照相比，單獨投與丁酸鹽顯示梳理所用時間、梳理次數及每次梳理所用之時間減少。投與細菌菌株使每次梳理之梳理所用時間減少(圖54A、C及E)。
為提供對照與實驗值之間的進一步比較，如上文所概述，在第二次分析中將PBS 及LYO 對照之值組合。此第二次分析提供類似於第一次分析之結果(圖54B、D及F)。
結論
投與丁酸鹽或嗜氫布勞特氏菌使每次梳理之梳理所用時間量減少。
實例11e-嗜氫布勞特氏菌實驗之總結論
在曠場場地測試中，嗜氫布勞特氏菌顯著改善BTBR小鼠之探究行為。此外，此細菌菌株減輕此等小鼠之焦慮樣行為。因此，很明顯投與此細菌調節BTBR小鼠之展示自閉症樣特徵的行為。因此，將預期此等細菌適合用於治療及/或預防中樞神經系統病症或病狀，包括神經發育及/或神經精神病症或病狀。
在自我梳理測試中投與此細菌菌株亦似乎使每次梳理進行刻板行為之時間量減少。
實例11f-丁酸鹽實驗之總結論
刻板行為分析之資料預示丁酸鹽在中樞神經系統病症中之治療作用。
與BTBR對照相比，投與丁酸鹽使埋藏彈珠之數目減少，且使平均數目恢復至類似於在C57BL/6野生型對照小鼠中所觀測到之水準。此外，與BTBR對照相比，單獨投與丁酸鹽使總梳理所用時間及梳理次數減少。
此等結果提供關於丁酸鹽在動物模型中減輕重複及刻板行為之作用 的指示。
實例12-細菌凍乾物對健康大鼠之SCFA產量的影響
研究了慢性投與嗜氫布勞特氏菌菌株DSM 10507/14294之凍乾物對健康HIM大鼠中之SCFA產量的影響且將結果報道於圖55中。關於實驗之其他細節提供於上文之附圖描述中。圖55表明投與BH誘導乙酸鹽以及丁酸鹽產量之顯著增加。
實例13-所研究之嗜氫布勞特氏菌在人類微生物叢相關大鼠(HMA大鼠)模型中之功效 概述
為由每組16個無菌大鼠(包含對照組中之8個大鼠及處理組中之8個大鼠)組成之組接種來自人類IBS個體(IBS-HMA大鼠)之糞便微生物叢。使用來自3個不同IBS患者之糞便樣品進行三次連續實驗。用健康個體(n=2個體；2組健康HMA大鼠)之糞便樣品接種另外兩組之大鼠(n=10)作為內臟敏感性對照。因此，存在24個IBS微生物叢相關大鼠(對照)，24個用Blautix處理之IBS微生物叢相關大鼠及20個健康微生物叢相關大鼠。然後為一半之IBS-HMA大鼠投與根據本發明之包含嗜氫布勞特氏菌細菌菌株之組合物持續28天，而另一半動物接受對照溶液。
菌株
嗜氫布勞特氏菌(BH)菌株DSM 10507T /14294。
組合物及投與
將BH凍乾物懸浮於無菌礦物質溶液中至每毫升1010 個細菌之濃度。每一IBS-HMA大鼠藉由口服灌胃每天投與兩毫升此懸浮液，持續28天之時間。
對照溶液為無菌礦物質溶液，其藉由口服灌胃每天(每一大鼠2ml) 投與對照組之IBS-HMA大鼠。
大鼠
為無菌雄性費舍爾大鼠(Fisher rat)(10週齡)接種來自IBS個體(IBS-HMA大鼠)之人類糞便微生物叢。為十六隻大鼠接種相同人類糞便接種體。使用來自三個不同IBS個體之糞便樣品進行三次連續實驗。為每組十隻大鼠之另外兩組接種來自2個健康個體之糞便樣品(標準敏感性對照組)。
研究設計
第14天-為無菌大鼠接種人類糞便微生物叢。
第0天至第28天-藉由口服灌胃給予日劑量之BH凍乾物(分析組)，或對照溶液(對照組)
第14天與第22天之間-進行操作以將電極植入腹部(用於擴張分析)
第22天至第28天-使大鼠適應以避免與擴張測試相關之壓力。
第28天-擴張分析且使動物安樂死以收集用於硫化物及短鏈脂肪酸(SCFA)分析之盲腸樣品。
第0天、第14天及第28天-收集糞便樣品用於微生物分析：用於評估BH群體及其他微生物共生群之qPCR及使用選擇培養基及嚴格厭氧法列出微生物之官能基。
結果
圖56 呈現來自接受對照溶液或BH凍乾物之IBS-HMA大鼠的糞便樣品中之嗜氫布勞特氏菌群體之qPCR分析的結果。在投藥期結束時(第28天)在接受BH凍乾物之大鼠中觀測到BH群體顯著增加，此證實結腸中BH之成功遞送。
圖57 報道投與BH對IBS-HMA大鼠之盲腸樣品中之主要醱酵代謝產物短鏈脂肪酸的影響。投與BH使得乙酸鹽濃度顯著增加並且丁酸鹽濃度顯著 增加(圖57B)。
實例14-在三室測試中對社交互動行為之評估 基本原理及方法
參見以上實例1b。在此實驗中，記錄之數據為探索時間，其由在頭5-min時間內及在10-min時期內對圓筒(含有物體、同種物)之嗅聞時間來定義。
讀出：
●測試1，社交性(同種物相較於物體)：
○社交性指數：同種物嗅聞時間%(若>50%：具社交性，亦即相較於物體偏愛同種物)
○其他讀出，探究行為指數：同種物探索時間、物體探索時間之總探索時間
●測試2，社交新穎性偏好(新的同種物相較於熟悉的同種物)：
○社交新穎性偏好(或嫌惡)指數：新同種物嗅聞時間%
○其他讀出，探究行為指數：新同種物探索時間及熟悉同種物探索時間、總探索時間
結果
測試1：社交性(圖58A)：
在C57BL/6小鼠中，在PBS及LYO 處理之小鼠中社交性並不不同。如將預期，在PBS對照中BTBR小鼠顯示降低之社交性。出人意料地，當用LYO 處理時BTBR小鼠展示改善之社交性。然而，BTBR-PBS與C57-PBS、BTBR-LYO與C57-LYO及BTBR-PBS與BTBR-LYO之間的差異不顯著。有趣的是，投與丁酸鹽改善BTBR小鼠之社交性(BTBR-PBS與BTBR-BUT之間顯著不同。與細菌PBS對照相比，投與嗜氫布勞特氏菌使社交性增加。
測試2：社交新穎性(圖58B)：
在用PBS 處理之C57BL/6小鼠中存在社交新穎性偏好，但在投與LYO 之C57BL/6小鼠中此偏好降低(此等差異不顯著)。在10min時期內，當用PBS 或LYO 處理時，BTBR小鼠與C57BL/6小鼠相比顯示降低之社交新穎性偏好。BTBR-PBS與C57-PBS、BTBR-LYO與C57 LYO及BTBR-PBS與BTBR-LYO之間的差異不顯著。因此，圖58B中所示之結果難以解釋。
關於自閉症譜系病症之治療中的嗜氫布勞特氏菌的總結論
本文所揭示之實驗展示如下證據，在小鼠模型中投與另一布勞特氏菌屬種類(亦即嗜氫布勞特氏菌)可適用於治療神經發育及神經精神病症。特定而言，用嗜氫布勞特氏菌處理減輕焦慮樣、刻板及重複行為，且增加小鼠之社交性。
關於用於治療自閉症譜系病症之醫學產品之臨床開發的EMA準則說明，歸因於疾病之異質性，使用單一化合物可能不會對全部核心症狀達成顯著影響，且因此必定展現對至少一種核心症狀之短期功效。嗜氫布勞特氏菌活生物治療劑已顯示有效治療自閉症譜系病症之至少一種核心症狀，因此其及相關布勞特氏菌屬及嗜氫布勞特氏菌菌株預期對人類疾病有效。類似地，其他中樞神經系統病症或病狀展示具有多種不同症狀之複雜病變，且經批准之治療較少。因此，應瞭解，有效治療不需要治療中樞神經系統病症或病狀之全部症狀。若一治療將治療與中樞神經系統病症或病狀相關之症狀中之一者，則其將被視為在治療上適用。
實例15-評估用MRX006長期處理對下丘腦細胞株中催產素及其各別受體之基因表現水準的影響
用MRX006長期處理使下丘腦細胞株中催產素及其受體之mRNA表現水準顯著增加(圖59A及B)。
此突出結果提供在投與MRX006後腦中之化學變化與行為變化之間的相關性。此為首次有任何研究報導活生物治療劑能夠改變中樞催產素系統， 並且在改善胃腸道功能之情況下同時改變社交、焦慮樣及刻板行為。
實例16-BALBc小鼠模型 實例16a-用於BALBc小鼠模型之材料及方法 小鼠
使BALBc(Envigo,UK)成年雄性小鼠成組居住在12h明-暗循環(7：00-19：00h開燈)下；標準囓齒動物食物及水任意獲取。全部實驗係根據歐洲指令2010/63/EEC 2012年之S.I.編號543之要求來進行，且由科克大學之動物實驗倫理委員會批准。在開始實驗時動物為8週齡。
菌株
MRX006：以登錄號NCIMB 42381保藏之糞便布勞特氏菌細菌。
細菌係提供於甘油儲備液中且在設備中在厭氧條件下生長。
MRX006投與
在到達動物單位後允許動物習慣其等候室一週。當小鼠8週齡時開始使用MRX006或媒劑進行給藥。在投與之前將MRX006(1×107 至1×109 CFU)溶解於PBS中。小鼠在15：00與17：00之間以1×109 CFU之劑量接受MRX006口服灌胃(200μL劑量)連續6天。在第7天，將動物去頭且收穫組織用於實驗。
組織收集
考慮處理及測試條件以隨機方式將動物處死；在9.00a.m.與2：30p.m.之間進行取樣。在EDTA(乙二胺四醋酸)鉀管中收集軀幹血且在4000g下旋轉15min。分離血漿且儲存在-80℃下用於進一步分析。將腦快速切除，解剖且將各腦區在乾冰上快速冷凍且儲存在-80℃下用於進一步分析。去除脾臟，收集於5mL RPMI培養基(含有L-麩醯胺及碳酸氫鈉，R8758 Sigma+10% FBS(F7524，Sigma)+1% Pen/Strep(P4333，Sigma))中且在撲殺之後即刻加工用於離體免疫刺激。將腸道組織(將迴腸及結腸中最靠近盲腸之2cm區段切除，且使用離盲腸最 遠之1cm的組織)安裝至尤斯灌流室中用於腸道滲透性分析。再取1cm之迴腸及結腸組織用於緊密連接基因表現分析。去除盲腸，稱重且儲存在-80℃下用於SCFA分析。
統計分析
正態分佈之資料以平均值±SEM之呈現；非參數數據集以具有四分位間距之中值形式呈現。應用未配對雙尾t檢驗來分析參數資料且對於非參數使用曼-惠特尼檢驗。在所彙集之數據集中採用斯皮爾曼秩相關係數(Spearman's rank correlation coefficient)進行相關性分析。在所有情況下，p值<0.05被視為顯著。
實例16b-評估用MRX006長期處理對離體胃腸道滲透性及緊密連接表現之影響 方法
藉由頸椎脫位使小鼠安樂死，且去除迴腸末端及結腸，放置於冰凍之克雷布氏溶液中，沿腸系膜線打開且謹慎沖洗。然後如先前所描述(Hyland及Cox，2005[58])將製劑與維持在37℃下之充氧(95% O2，5% CO2)克雷布氏緩衝液一起放置於尤斯灌流室(Harvard Apparatus,Kent,UK，暴露面積為0.12cm2 )中。以2.5mg/mL之最終濃度將4kDa FITC-右旋糖酐添加至黏膜室中；在隨後3h內每30min自漿膜室收集200μL樣品。
結果
使用FITC自管腔傳送至尤斯灌流室之漿膜側作為腸道滲透性之指示(如實例2l中所描述)，確定MRX006對迴腸或結腸組織滲透性無影響。圖60A及61A證實用MRX006長期處理不影響結腸或迴腸之滲透性。
MRX006對迴腸或結腸組織中緊密連接蛋白(參與維持腸道障壁之完整性)閉合蛋白、酶IDO-1(吲哚胺-吡咯2,3-加雙氧酶-1，色胺酸/犬尿胺酸路徑中之第一及限速酶)以及TPH1(色胺酸羥化酶1，色胺酸羥化酶之同功異構物， 其負責血清素之合成)之mRNA表現均無影響(圖60及61B、C及E)。然而，MRX006使迴腸中TJP-1(緊密連接蛋白1，一種緊密連接蛋白)之mRNA表現增加，但不使結腸中之mRNA表現增加(圖60D及61D)。
討論
MRX006對迴腸或結腸滲透性無影響，但增加TJP1表現。TJP1為與維持腸道完整性相關之許多緊密連接蛋白中之一者，且雖然吾等確定看到了此mRNA表現增加，但此可能不一定反映此緊密連接之蛋白質表現，亦不反映其併入內皮中。用MRX006處理6天不改變滲透性之發現表明其不負面地影響腸道滲透性及完整性。MRX006同樣未改變IDO-1亦未改變TPH1，表明其不改變血清素產量亦不改變腸道中之色胺酸/犬尿胺酸路徑。
此等資料證實，用MRX006長期處理不改變腸道滲透性且不影響腸道障壁之完整性。這表明MRX006使刻板及焦慮相關行為減弱之能力不引起腸道障壁完整性之缺陷。
實例16c-評估用MRX006長期處理對盲腸短鏈脂肪酸產量之影響 方法
將盲腸內容物混合且與MilliQ水一起渦旋並在室溫下孵育10min。藉由離心(10000g，5min，4℃)以使細菌及其他固體集結成粒且0.2μm過濾來獲得上清液。將其轉移至透明GC小瓶中且使用2-乙基丁酸(Sigma)作為內標。使用裝配有ZB-FFAP管柱(30m×0.32mm×0.25mm；Phenomenex)之Varian 3500 GC火焰-電離系統分析SCFA之濃度。使用不同濃度之含有乙酸鹽、丙酸鹽、異丁酸鹽、正丁酸鹽、異戊酸鹽及戊酸鹽之標準混合物(Sigma)構建標準曲線。藉由使用Varian Star層析工作站版本6.0軟體將峰整合。全部SCFA資料以μmol/g表示。
結果
當來自膳食之不易消化之纖維由腸道中之細菌醱酵時產生短鏈脂肪酸(SCFA)。當與媒劑PBS投與相比時，6天之MRX006投與對乙酸鹽(t12=0.959，p=0.357)、丙酸鹽(t12=1.033，p=0.322)、異丁酸鹽(t12=1.859，p=0.090)、丁酸鹽(t12=0.857，p=0.408)、異戊酸鹽(t12=1.757，p=0.107)或戊酸鹽(t12=0.434，p=0.672)無影響(圖62)。
討論
投與MRX006對盲腸SCFA產量無影響。此表明6天MRX006方案未改變醱酵，或該細菌負責來自膳食之不易消化之纖維的醱酵。
實例16d-評估用MRX006長期處理對脾細胞之細胞因子表現之影響 基本原理/方法
離體脾細胞分析涉及使用細菌或病毒模擬物激發來激發脾細胞(自參與免疫防護之主要器官脾臟分離之細胞)。
在處死之後即刻將脾臟收集於5mL RPMI培養基中且即刻培養。首先將脾臟細胞在RPMI培養基中均質化。勻漿步驟隨後為RBC溶解步驟，其中將細胞在1ml之RBC溶解緩衝液(11814389001 ROCHE,Sigma)中孵育5min。添加10ml之培養基以停止溶解且隨後200g離心5min。此後為最後一步，在該步中使細胞穿過40μm過濾器。然後在40μm過濾器上過濾勻漿，在200g下離心5min且再懸浮於培養基中。對細胞進行計數並接種(每毫升培養基4,000,000個)。在適應2.5h之後，用脂多醣(LPS-2μg/ml)或伴刀豆球蛋白A(ConA-2.5μg/ml)刺激細胞24h。在刺激之後，收穫上清液以使用促炎性組1(小鼠)V-PLEX套組(Meso Scale Discovery,Maryland,USA)針對TNFα、IL-10、IL-1β、干擾素γ、CXCL2及IL6評估細胞因子釋放。使用MESO QuickPlex SQ 120、SECTOR成像器2400、SECTOR成像器6000、SECTOR S 600進行分析。
結果
MRX006對響應於LPS(模擬細菌感染)或伴刀豆球蛋白A(模擬病毒感染)刺激之促炎性(IFNγ、TNFα、IL-1β)與抗炎性(IL-10、IL-6)或CXCL1(免疫反應活化之標記物)無影響(圖63)。
討論
MRX006亦對在用LPS或伴刀豆球蛋白A激發之後脾細胞之細胞因子表現無影響。此證實6-天MRX006投與不負面地影響先天外周免疫反應。此表明MRX006處理不活化全身性免疫活化。
實例16e-評估用MRX006長期處理對胺基酸之血漿含量的影響 基本原理及方法
在實驗結束時，收集軀幹血用於血漿中之胺基酸分析。此將給出因微生物叢之變化而生物合成及分解代謝必需胺基酸之指示。
考慮處理及測試條件以隨機方式將動物處死；在9.00a.m.與2：30p.m.之間進行取樣。在EDTA(乙二胺四醋酸)鉀管中收集軀幹血且在4000g下旋轉15min。分離血漿且儲存在-80℃下用於進一步分析。將血漿用0.2mol/L檸檬酸鈉緩衝液(pH 2.2)稀釋，得到250nmol之各胺基酸殘基。將樣品用內標正白胺酸稀釋，得到125nm/mL之最終濃度。使用裝配有Jeol Na+高效能陽離子交換管柱之Jeol JLC-500/V胺基酸分析器(Jeol Ltd,Garden City,Herts,UK)定量胺基酸。
結果
MRX006使血漿中之脯胺酸及苯丙胺酸含量減少。
討論
在6天MRX006投與之後胺基酸之血漿含量大體不變。存在九種不能從頭合成且必須直接在膳食中或藉由膳食分解供應之必需胺基酸。此等胺基酸包括纈胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、異白胺酸、離胺酸及組胺酸。另外六種胺基酸被視為在人類膳食中為有條件地必需的，意 味著在特殊病理生理學條件下其合成可能受限，諸如嬰兒早熟或處於嚴重分解代謝痛苦中之個體。此六種胺基酸包括精胺酸、半胱胺酸、甘胺酸、麩醯胺、脯胺酸及酪胺酸。五種胺基酸在人類中為非必需的，意謂其可在體內足量合成。此五者為丙胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺、麩胺酸及絲胺酸。
在此研究中，必需胺基酸苯丙胺酸及另一重要胺基酸脯胺酸在MRX006投與之後減少，表明此益生菌可在來自膳食之主要胺基酸之代謝中起作用。
實例16f-評估用MRX006長期處理對腦幹中之神經遞質含量的影響 方法
藉由HPLC對來自腦幹之樣品分析神經遞質濃度。簡單來說，在摻加有4ng/40μl之N-甲基5-HT(Sigma Chemical Co.,UK)作為內標之500μl冰凍移動相中將腦幹組織超音處理。移動相含有0.1M檸檬酸、5.6mM辛烷-1-磺酸(Sigma)、0.1M磷酸二氫鈉、0.01mM EDTA(Alkem/Reagecon,Cork)及9%(v/v)甲醇(Alkem/Reagecon)，且使用4N氫氧化鈉(Alkem/Reagecon)調節至pH 2.8。然後將勻漿在4℃下在22,000×g下離心15min且將40μl上清液注射至HPLC系統上，該HPLC系統由SCL 10-Avp系統控制器、LECD 6A電化學偵測器(Shimadzu)、LC-10AS泵、CTO-10A烘箱、SIL-10A自動注射器(具有維持在40 C下之樣品冷卻器)及在線Gastorr脫氣器(ISS,UK)組成。在分離(流速0.9ml/min)時採用維持在30℃下之逆相管柱(Kinetex 2.6u C18 100×4.6mm，Phenomenex)。在+0.8V下操作與Ag/AgCl參比電極(Shimdazu)組合之玻璃碳工作電極且使用Class-VP 5軟體(Shimadzu)分析所產生之層析圖。藉由如藉由標準注射所測定之特徵滯留時間來鑑定神經遞質，該等標準注射在樣品分析期間以常規間隔進行操作。量測分析物相較於內標之峰高比率且與標準注射相比較。結果以每公克組織鮮重之神經遞質奈克數表示。
結果
如藉由未配對雙尾t檢驗所測定，6天MRX006投與對去甲基腎上腺素、多巴胺、血清素、5-HIAA(5-羥基吲哚-乙酸；5-HT(5-羥基-色胺(血清素)之代謝產物)之含量或血清素周轉(5-HIAA：5-HT之比率)無影響(圖65)。去甲基腎上腺素(t12=0.307，p=0.764)、多巴胺(t12=0.957，p=0.357)、血清素(t12=0.745，p=0.074)、5-HIAA(t12=0.379，p=0.711)含量或腦幹中之血清素周轉(t12=0.683，p=0.507)。
討論
在6-天MRX006投與之後腦幹中之神經遞質含量不變。此等資料表明，MRX006不負面地影響由在腦幹水準之單胺含量控制的行為。
實例16g-評估用MRX006長期處理對中樞及胃腸道基因表現之影響 基本原理
在來自杏仁核、前額葉皮質及海馬之腦組織中分析神經遞質受體[血清素受體1a(5-HT1a)、多巴胺D1受體、GABAB受體亞單位B1、GABAA受體、NMDA2A及NMDA2B受體]、炎性標記物[IL-1β、IL6、CD11b、TNFα及TLR4]及內分泌標記物[皮質固酮釋放因子(CRF)、皮質固酮釋放因子受體1及2(CRFR1、CRFR2)、腦源性神經營養素因子(BDNF)、升壓素受體、催產素受體、糖皮質素受體及礦物皮質素受體]之基因表現。
方法
根據製造商建議使用mirVanaTM miRNA分離套組(Ambion/Llife technologies,Paisley,UK)萃取總RNA且處理DNA酶(Turbo DNA-free，Ambion/life technologies)。使用NanoDropTM 分光光度計(Thermo Fisher Scientific Inc.,Wilmington,Delaware,USA)根據製造商之說明書定量RNA。使用Agilent生物分析儀(Agilent,Stockport,UK)根據製造商之程序評估RNA品質且計算 RNA完整指數(RIN)。RIN值>7之RNA用於後續實驗。使用應用生物系統高容量cDNA套組(Applied Biosystems,Warrington,UK)根據製造商之說明書將RNA逆轉錄至cDNA。簡單來說，添加Multiscribe逆轉錄酶(50U/μL)(1)(2)(1)(10)作為RT預混液之一部分，25℃孵育10min，37℃孵育2h，85℃孵育5min且在4℃下儲存。使用由Applied Biosystems針對小鼠特定目標基因設計之探針(6羧基螢光素-FAM)，同時使用β-肌動蛋白作為內源性對照進行定量PCR。擴增反應物含有1μl cDNA、5μl之2X PCR預混液(Roche)、900nM之各引物且藉由添加無RNA酶水達到總共10μl。全部反應使用96-孔板在LightCycler®480系統上一式三份地進行。熱循環條件如製造商(Roche)關於55次循環所建議。為了檢查擴增子污染，不含模板對照之每次運行針對所用之各探針一式三份地進行。記錄循環臨限值(Ct)之值。使用β-肌動蛋白正規化資料且使用2-△△CT法轉化且呈現為相較於對照組之變化倍數。
結果
圖66表明，MRX006對神經遞質受體血清素1a(5-HT1a)(t11 =0.742，p=0.474)、多巴胺D1受體(t10 =1.426，p=0.184)、GABAB 受體B1亞單位(t12 =1.871，p=0.086)、GABAA 受體(t12 =0.017，p=0.987)、NMDA受體亞單位2A(t11 =1.275，p=0.229)、NMDA受體亞單位2B(t11 =1.39，p=0.192)之海馬基因表現無影響。
圖67表明MRX006對神經遞質受體多巴胺D1受體(t11 =0.429，p=0.677)、GABAB 受體B1亞單位(t11 =0.998，p=0.344)、GABAA 受體(t11 =1.145，p=0.277)、NMDA受體亞單位2A(t12 =0.852，p=0.411)、NMDA受體亞單位2B(t12 =0.395，p=0.707)之杏仁核基因表現無影響。
圖68表明MRX006對神經遞質受體多巴胺D1受體(t11 =0.583，p=0.571)、GABAB 受體B1亞單位(t12 =1.304，p=0.217)、GABAA 受體(t10 =2.043， p=0.068)、NMDA受體亞單位2A(t11 =0.177，p=0.104)、NMDA受體亞單位2B(t11 =1.235，p=0.243)之前額葉皮質基因表現無影響。
MRX006對神經遞質受體在所研究之腦區中之任一者中之mRNA表現無影響(圖66-68)。
在海馬及杏仁核中(圖69及70)，對各種炎性標記物之mRNA表現無影響。MRX006對炎性標記物IL-1β(t10 =1.346，p=0.208)、IL-6(t12 =1.041，p=0.308)、CD11b(t12 =1.195，p=0.255)、TNFα(t11 =0.816，p=0.342)、TLR4(t12 =0.521，p=0.612)之海馬基因表現無影響。MRX006對炎性標記物IL-1β(t11 =1.53，p=0.988)、IL-6(t11 =1.145，p=0.217)、CD11b(t11 =1.143，p=0.275)、TLR4(t11 =0.971，p=0.532)之杏仁核基因表現無影響。
在前額葉皮質中，MRX006降低TLR4之mRNA表現，而其他炎性標記物無任何變化(圖71)。MRX006使前額葉皮質中TLR4(t12 =2.639，p=0.0216)之mRNA表現顯著降低，但對IL-6(t11 =1.145，p=0.217)或CD11b(t11 =2.175，p=0.523)之前額葉皮質基因表現無進一步影響。
MRX006使海馬中升壓素受體之mRNA表現顯著降低(t12 =2.389，p=0.0342)，但對內分泌標記物CRF(t12 =0.767，p=0.458)、CRFR1(t12 =0.174，p=0.865)、CRFR2(t11 =0.238，p=0.816)、BDNF(t12 =1.548，p=0.148)、催產素受體(t12 =0.762，p=0.461)、糖皮質素受體(t12 =0.607，p=0.556)、礦物皮質素受體(t12 =0.67，p=0.516)之mRNA表現無進一步影響(圖72)。
MRX006對杏仁核內分泌標記物CRFR1(t12 =0.226，p=0.825)、CRFR2(t11 =0.78，p=0.451)、BDNF(t12 =0.201，p=0.844)、升壓素受體(t12 =0.756，p=0.465)、催產素受體(t11 =0.167，p=0.87)、糖皮質素受體(t11 =1.027，p=0.327)、礦物皮質素受體(t11 =1.448，p=0.175)之mRNA表現無影響(圖73)。
MRX006對前額葉皮質內分泌標記物CRFR1(t12 =1.666，p=0.122)、 CRFR2(t11 =1.179，p=0.261)、BDNF(t11 =1.065，p=0.310)、催產素受體(t11 =1.037，p=0.322)、糖皮質素受體(t12 =1.185，p=0.259)、礦物皮質素受體(t11 =1.910，p=0.083)之mRNA表現無影響(圖74)。
在杏仁核及前額葉皮質中(圖73及74)，任何內分泌標記物之mRNA表現均無變化，而在海馬中(圖72)存在升壓素受體之mRNA表現的降低，而對所分析之其他內分泌標記物無任何影響。
討論
在6-天MRX006投與之後，炎性、內分泌及神經遞質受體之中樞基因表現大體不變。
關於MRX006投與針對生理參數之總結論
總地說來，此等資料證實MRX006投與不負面地影響全身性及中樞生理事件。此等資料表明MRX006可在極小非所需副作用情況下具有高耐受性型態。
實例17-母體免疫活化(MIA)小鼠模型
所用之MIA小鼠與實例3a中所描述相同。
實例17a-在MIA模型中評估用MRX006長期處理對活體內胃腸道滲透性之影響
如實例2k中所描述使用尤斯灌流室活體內評估迴腸及結腸之滲透性。圖75證實在MIA模型中用MRX006長期處理不影響結腸或迴腸之滲透性。
此證實用MRX006長期處理不改變腸道滲透性，此表明MRX006之有益社交行為、減輕焦慮樣行為及刻板行為的作用不引起腸道完整性之缺陷。
實例17b-社交行為之評估-三室社交互動測試
如關於實例1a所描述進行3-室社交互動測試(3-CSIT)，然而由不知曉處理之研究者對此資料進行人工評分。實例1a中之資料係藉由電腦跟蹤軟體自動產生，該電腦跟蹤軟體不能在與小鼠互動與僅僅同小鼠位於同一室中之間 加以區別。
在社交新穎性測試中(圖76)，不存在MIA-誘導之社交辨別缺陷且MRX006對社交新穎性無進一步影響。
圖77表明在社交性測試中，MRX006能夠逆轉MIA-誘導之社交行為缺陷。此類似於在MRX006可逆轉社交性缺陷之BTBR模型中所見到的資料。
實例17c-社交行為之評估-梳理測試
如實例2e中所描述進行梳理測試。在梳理測試中用MRX006長期處理不引起MIA小鼠之重複行為的變化(圖78)。
實例17d-社交行為之評估-高架十字迷宮
如實例2f中所描述進行高架十字迷宮測試。用MRX006處理對MIA小鼠在高架十字迷宮中之焦慮樣行為無影響(圖79)。
實例17e-社交行為之評估-強迫游泳測試
如實例2h中所描述進行強迫游泳測試。在強迫游泳測試中用MRX006長期處理使MIA小鼠之不動時間減少(圖80)。
實例17f-壓力誘導之循環皮質固酮測定
如實例2n中所描述量測皮質固酮之含量。用MRX006長期處理不影響在暴露於強迫游泳測試之MIA小鼠中壓力誘導之皮質固酮含量(圖81)。
結論
用MRX006處理逆轉MIA-誘導之社交行為缺陷且使強迫游泳測試中之不動時間減少。此證實MRX006改善社交性之能力及其抗抑鬱活性。
除上文在實例3中所描述之結果之外，已證實MRX006自閉症譜系病症之症狀具有積極影響。
序列
SEQ ID NO：1( 糞便布勞特氏菌菌株GAM6-1 16S核糖體RNA基因，部分序列-HM626177)
SEQ ID NO：2(糞便布勞特氏菌MRX006(菌株830)之共同16S rRNA序列)
SEQ ID NO：3( 韋克斯勒布勞特氏菌菌株WAL 14507 16S核糖體RNA基因，部分序列-EF036467)
SEQ ID NO：4(韋克斯勒布勞特氏菌菌株MRX008之共同16S rRNA序列)
SEQ ID NO：5(MRX006(菌株830)染色體序列)-參見電子序列表。
SEQ ID NO：6(MRX006(菌株830)質粒序列)-參見電子序列表。
SEQ ID NO：7( 嗜氫布勞特氏菌菌株S5a36 16S核糖體RNA基因，部分序列-X95624.1)
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GB英國；National Collections of Industria,Food and Marine Bacteria(NCIMB)；2015/11/16；NCIMB 42486
國內寄存
食品工業發展研究所；105年9月20日；BCRC 910744
食品工業發展研究所；105年9月20日；BCRC 910745
<110> 英商4D製藥研究有限公司
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<170> SeqWin2010，版本1.0
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<211> 1372
<212> DNA
<213> 糞便布勞特氏菌
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<211> 1481
<212> DNA
<213> 糞便布勞特氏菌
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<212> DNA
<213> 韋克斯勒布勞特氏菌
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<212> DNA
<213> 韋克斯勒布勞特氏菌
<400> 4
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<211> 3415035
<212> DNA
<213> 糞便布勞特氏菌菌株830染色體
<400> 5
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<212> DNA
<213> 糞便布勞特氏菌菌株830質粒
<400> 6
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<211> 1458
<212> DNA
<213> 嗜氫布勞特氏菌菌株S5a36
<400> 7

Claims (81)

  1. 一種包含布勞特氏菌屬( Blautia )之細菌菌株的組合物，其用於治療或預防中樞神經系統病症或病狀之方法中。
  2. 如申請專利範圍第1項之組合物，其中該中樞神經系統病症或病狀係由微生物叢-腸-腦軸介導。
  3. 如申請專利範圍第1項或申請專利範圍第2項之組合物，其中該組合物係用於治療或預防神經發育障礙或神經精神病狀之方法中。
  4. 如申請專利範圍第1項或第2項之組合物，其中該組合物係用於治療或預防選自由以下各項組成之群的病症或病狀之方法中：自閉症譜系病症(ASD)；兒童發育障礙；強迫症(OCD)；重度抑鬱障礙；抑鬱；季節性情感障礙；焦慮障礙；慢性疲勞症候群(肌痛性腦脊髓炎)；壓力障礙；創傷後壓力障礙；精神分裂症譜系病症；精神分裂症；雙極性障礙；精神病；情緒障礙；癡呆；阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s)；帕金森氏病(Parkinson’s disease)；慢性疼痛；運動神經元病；亨廷頓氏病(Huntington’s disease)；格林-巴利症候群(Guillain-Barre syndrome)及腦膜炎。
  5. 如申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物係用於治療或預防自閉症譜系病症之方法中。
  6. 如申請專利範圍第5項之組合物，其中該組合物係用於減輕或預防自閉症之方法中。
  7. 如前述申請專利範圍中任一項之組合物，其中該組合物預防、減輕或緩解刻板、重複、強迫及/或焦慮行為。
  8. 如申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物係用於治療或預防強迫症之方法中。
  9. 如申請專利範圍第8項之組合物，其中該組合物預防、減輕或緩解 重複、強迫及/或焦慮行為。
  10. 如申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物係用於治療或預防重度抑鬱障礙之方法中。
  11. 如申請專利範圍第10項之組合物，其中該組合物治療或預防急性重度抑鬱事件及/或預防新的事件(復發預防)。
  12. 如申請專利範圍第10項或第11項之組合物，其中該組合物預防、減少或緩和輕度、中度或重度MDD事件之發生。
  13. 如申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物係用於治療或預防焦慮障礙之方法中。
  14. 如申請專利範圍第13項之組合物，其中該焦慮障礙為廣泛性焦慮障礙(GAD)；特定恐懼症；社交焦慮障礙；分離焦慮障礙；廣場恐懼症；恐慌障礙及/或選擇性緘默症。
  15. 如申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物係用於治療或預防神經認知障礙之方法中。
  16. 如申請專利範圍第15項之組合物，其中該神經認知障礙為血管性癡呆；阿爾茨海默氏病及血管性癡呆混合形式；路易體病(Lewy body disease)；額顳癡呆；帕金森氏癡呆(Parkinson’s dementia)；克羅伊茨費爾特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)；亨廷頓氏病；及韋尼克-柯沙可夫症候群(Wernicke-Korsakoff syndrome)。
  17. 如前述申請專利範圍中任一項之組合物，其中該組合物係用於調節該微生物叢-腸-腦軸之方法中。
  18. 如前述申請專利範圍中任一項之組合物，其中該細菌菌株屬於糞便布勞特氏菌( Blautia stercoris )。
  19. 如申請專利範圍第1項至第17項中任一項之組合物，其中該細 菌菌株屬於韋克斯勒布勞特氏菌( Blautia wexlerae )。
  20. 如申請專利範圍第1項至第17項中任一項之組合物，其中該細菌菌株屬於嗜氫布勞特氏菌( Blautia hydrogenotrophica )。
  21. 如申請專利範圍第1項至第18項中任一項之組合物，其中該細菌菌株具有與糞便布勞特氏菌之細菌菌株的16s rRNA序列至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列。
  22. 如申請專利範圍第1項至第18項中任一項之組合物，其中該細菌菌株具有與SEQ ID NO：1或2至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列。
  23. 如申請專利範圍第22項之組合物，其中該細菌菌株具有與SEQ ID NO：2至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列，或其中該細菌菌株具有由SEQ ID NO：2表示之16s rRNA序列。
  24. 如申請專利範圍第1項至第17項或第19項中任一項之組合物，其中該細菌菌株具有與韋克斯勒布勞特氏菌之細菌菌株的16s rRNA序列至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列。
  25. 如申請專利範圍第1項至第17項或第19項中任一項之組合物，其中該細菌菌株具有與SEQ ID NO：3或4至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列。
  26. 如申請專利範圍第25項之組合物，其中該細菌菌株具有與SEQ ID NO：4至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列，或其中該細菌菌株具有由SEQ ID NO：4表示之16s rRNA序列。
  27. 如申請專利範圍第1項至第17項或第20項中任一項之組合物，其中該細菌菌株具有與嗜氫布勞特氏菌之細菌菌株的16s rRNA序列至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列。
  28. 如申請專利範圍第1項至第17項或第20項中任一項之組合物，其中該細菌菌株具有與SEQ ID NO：7至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列。
  29. 如申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物包含糞便布勞特氏菌種類之細菌菌株，其用於治療或預防自閉症譜系病症之方法中。
  30. 如申請專利範圍第29項之組合物，其中該組合物係用於減輕或預防自閉症之方法中。
  31. 如申請專利範圍第29項或第30項之組合物，其中該組合物包含預防、減輕或緩解刻板、重複、強迫及/或焦慮行為之糞便布勞特氏菌種類之細菌菌株。
  32. 如申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物包含糞便布勞特氏菌種類之細菌菌株，其用於治療或預防強迫症之方法中。
  33. 如申請專利範圍第32項之組合物，其中該組合物包含預防、減輕或緩解重複、強迫及/或焦慮行為之糞便布勞特氏菌種類之細菌菌株。
  34. 如申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物包含糞便布勞特氏菌種類之細菌菌株，其用於治療或預防重度抑鬱障礙之方法中。
  35. 如申請專利範圍第34項之組合物，其中該組合物包含治療或預防急性重度抑鬱事件及/或預防新的事件(復發預防)之糞便布勞特氏菌種類之細菌菌株。
  36. 如申請專利範圍第34項或第35項之組合物，其中該組合物預防、減少或緩和輕度、中度或重度MDD事件之發生。
  37. 如申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物包含糞便布勞特氏菌種類之細菌菌株，其用於治療或預防焦慮障礙之方法中。
  38. 如申請專利範圍第37項之組合物，其中該焦慮障礙為廣泛性焦 慮障礙(GAD)；特定恐懼症；社交焦慮障礙；分離焦慮障礙；廣場恐懼症；恐慌障礙及/或選擇性緘默症。
  39. 如申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物包含糞便布勞特氏菌種類之細菌菌株，其用於治療或預防神經認知障礙之方法中。
  40. 如申請專利範圍第39項之組合物，其中該神經認知障礙為血管性癡呆；阿爾茨海默氏病及血管性癡呆混合形式；路易體病；額顳癡呆；帕金森氏癡呆；克羅伊茨費爾特-雅各布病；亨廷頓氏病；及韋尼克-柯沙可夫症候群。
  41. 如申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物包含韋克斯勒布勞特氏菌種類之細菌菌株，其用於治療或預防自閉症譜系病症之方法中。
  42. 如申請專利範圍第41項之組合物，其中該組合物係用於減輕或預防自閉症之方法中。
  43. 如申請專利範圍第41項或第42項之組合物，其中該組合物包含預防、減輕或緩解刻板、重複、強迫及/或焦慮行為之韋克斯勒布勞特氏菌種類之細菌菌株。
  44. 如申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物包含韋克斯勒布勞特氏菌種類之細菌菌株，其用於治療或預防強迫症之方法中。
  45. 如申請專利範圍第44項之組合物，其中該組合物包含預防、減輕或緩解重複、強迫及/或焦慮行為之韋克斯勒布勞特氏菌種類之細菌菌株。
  46. 如申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物包含韋克斯勒布勞特氏菌種類之細菌菌株，其用於治療或預防重度抑鬱障礙之方法中。
  47. 如申請專利範圍第46項之組合物，其中該組合物包含治療或預防急性重度抑鬱事件及/或預防新的事件(復發預防)之韋克斯勒布勞特氏菌種類之細菌菌株。
  48. 如申請專利範圍第46項或第47項之組合物，其中該組合物預防、減少或緩和輕度、中度或重度MDD事件之發生。
  49. 如申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物包含韋克斯勒布勞特氏菌種類之細菌菌株，其用於治療或預防焦慮障礙之方法中。
  50. 如申請專利範圍第49項之組合物，其中該焦慮障礙為廣泛性焦慮障礙(GAD)；特定恐懼症；社交焦慮障礙；分離焦慮障礙；廣場恐懼症；恐慌障礙及/或選擇性緘默症。
  51. 如申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物包含韋克斯勒布勞特氏菌種類之細菌菌株，其用於治療或預防神經認知障礙之方法中。
  52. 如申請專利範圍第51項之組合物，其中該神經認知障礙為血管性癡呆；阿爾茨海默氏病及血管性癡呆混合形式；路易體病；額顳癡呆；帕金森氏癡呆；克羅伊茨費爾特-雅各布病；亨廷頓氏病；及韋尼克-柯沙可夫症候群。
  53. 如申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物包含嗜氫布勞特氏菌種類之細菌菌株，其用於治療或預防自閉症譜系病症之方法中。
  54. 如申請專利範圍第53項之組合物，其中該組合物係用於減輕或預防自閉症之方法中。
  55. 如申請專利範圍第53項或第54項之組合物，其中該組合物包含預防、減輕或緩解刻板、重複、強迫及/或焦慮行為之嗜氫布勞特氏菌種類之細菌菌株。
  56. 如申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物包含嗜氫布勞特氏菌種類之細菌菌株，其用於治療或預防強迫症之方法中。
  57. 如申請專利範圍第56項之組合物，其中該組合物包含預防、減輕或緩解重複、強迫及/或焦慮行為之嗜氫布勞特氏菌種類之細菌菌株。
  58. 如申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物包含嗜氫布勞特氏菌種類之細菌菌株，其用於治療或預防重度抑鬱障礙之方法中。
  59. 如申請專利範圍第58項之組合物，其中該組合物包含治療或預防急性重度抑鬱事件及/或預防新的事件(復發預防)之嗜氫布勞特氏菌種類之細菌菌株。
  60. 如申請專利範圍第58項或第59項之組合物，其中該組合物預防、減少或緩和輕度、中度或重度MDD事件之發生。
  61. 如申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物包含嗜氫布勞特氏菌種類之細菌菌株，其用於治療或預防焦慮障礙之方法中。
  62. 如申請專利範圍第61項之組合物，其中該焦慮障礙為廣泛性焦慮障礙(GAD)；特定恐懼症；社交焦慮障礙；分離焦慮障礙；廣場恐懼症；恐慌障礙及/或選擇性緘默症。
  63. 如申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物包含嗜氫布勞特氏菌種類之細菌菌株，其用於治療或預防神經認知障礙之方法中。
  64. 如申請專利範圍第63項之組合物，其中該神經認知障礙為血管性癡呆；阿爾茨海默氏病及血管性癡呆混合形式；路易體病；額顳癡呆；帕金森氏癡呆；克羅伊茨費爾特-雅各布病；亨廷頓氏病；及韋尼克-柯沙可夫症候群。
  65. 如申請專利範圍第20項、第27項及第28項中任一項之組合物，其中該細菌菌株使丁酸鹽之含量增加。
  66. 如前述申請專利範圍中任一項之組合物，其中該組合物係用於經口投與。
  67. 如前述申請專利範圍中任一項之組合物，其中該組合物包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。
  68. 如前述申請專利範圍中任一項之組合物，其中該細菌菌株經凍乾。
  69. 如前述申請專利範圍中任一項之組合物，其中該細菌菌株為有活力的且能夠部分或完全定植於腸道。
  70. 如前述申請專利範圍中任一項之組合物，其中該組合物包含布勞特氏菌屬之單一菌株。
  71. 如前述申請專利範圍中任一項之組合物，其包含作為微生物菌劑之一部分的該布勞特氏菌屬細菌菌株。
  72. 一種包含如前述申請專利範圍中任一項之組合物的食物產品，其用於如前述申請專利範圍中任一項之用途。
  73. 一種包含如前述申請專利範圍中任一項之組合物的疫苗組合物，其用於如前述申請專利範圍中任一項之用途。
  74. 一種治療或預防中樞神經系統病症或病狀之方法，其包括向有需要之患者投與包含糞便布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物。
  75. 一種治療或預防中樞神經系統病症或病狀之方法，其包括向有需要之患者投與包含韋克斯勒布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物。
  76. 一種治療或預防中樞神經系統病症或病狀之方法，其包括向有需要之患者投與包含嗜氫布勞特氏菌種類之細菌菌株的組合物。
  77. 一種以登錄號NCIMB 42381保藏之糞便布勞特氏菌菌株或其衍生物的細胞，其用於如申請專利範圍第1項至第18項、第20項至第22項、第26項至第37項及第50項至第55項中任一項之用途。
  78. 一種以登錄號NCIMB 42486保藏之韋克斯勒布勞特氏菌菌株或其衍生物的細胞，其用於如申請專利範圍第1項至第17項、第19項、第23項至第25項及第38項至第55項中任一項之用途。
  79. 一種包含如申請專利範圍第77項中任一項之細胞的組合物，其用於如申請專利範圍第1項至第18項、第20項至第22項、第26項至第37項及第50項至第55項中任一項之用途。
  80. 一種包含如申請專利範圍第78項中任一項之細胞的組合物，其用於如申請專利範圍第1項至第17項、第19項、第23項至第25項及第38項至第55項中任一項之用途。
  81. 如申請專利範圍第79項或第80項之組合物，其包含醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
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