CN113817810A - 一种检测发酵乳中乳酸菌的新型qPCR方法 - Google Patents

一种检测发酵乳中乳酸菌的新型qPCR方法 Download PDF

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CN113817810A CN202110905979.7A CN202110905979A CN113817810A CN 113817810 A CN113817810 A CN 113817810A CN 202110905979 A CN202110905979 A CN 202110905979A CN 113817810 A CN113817810 A CN 113817810A
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Abstract

本发明提供了一种检测发酵乳中乳酸菌的新型qPCR方法，包括以下步骤：S1.提取6株乳酸菌的DNA，测定其浓度及纯度；S2.引物的设计和合成；S3.质粒的提取、酶切、连接与转化；S4.建立qPCR标准曲线；S5.分别测定单菌种发酵液和混合发酵酸奶中乳酸菌的含量；S6.使用流式细胞术对酸奶中乳酸菌进行计数；S7.SYTO9与PI染色剂结合激光共聚焦，区分活菌和死菌；与现有技术相比，本发明可以对酸奶中6种不同的乳酸菌进行定性定量计数，解决了现有技术中一次qPCR法只能计数一种乳酸菌的缺点，还可以对酸奶中活死菌分布进行统计，并对qPCR法计数结果中活死菌分布进行矫正，解决了qPCR法不区分活死菌的问题。

Description

一种检测发酵乳中乳酸菌的新型qPCR方法
技术领域
本发明涉及农业食品检测技术领域，具体涉及一种检测发酵乳中乳酸菌的新型qPCR方法。
背景技术
酸奶是采用优质纯鲜牛奶加入白糖均质，经超高温灭菌后接入乳酸菌发酵后制成的一种发酵型乳制品。乳酸菌对人体具有抗结肠癌、抑制腹泻、防止肠道发炎等功能。经有许多临床实验表明，日常服用乳酸菌产品对许多疾病具有潜在的影响。酸奶及奶制品是乳酸菌最好的来源。益生乳酸菌在人体肠道内定植发挥作用需要一定的数量，明确酸奶中乳酸菌数量至关重要。酸奶中乳酸菌含量一直是一个重要指标，国标规定发酵乳中乳酸菌含量不低于1×106CFU/mL。
传统发酵乳中含有嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌，现在市场上含有益生菌的发酵乳种类不断增多，除了含嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌外，还会含有发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌等。现阶段对酸奶中乳酸菌计数普遍采用涂布平板法，虽然涂布平板法具有简便易操作等优点，但是对含有多种乳酸菌的酸奶进行计数时，由于其原理是采用选择性培养基，而乳酸菌大部分性质相近，选择性培养基无法严格区分，且一般耗时长达72h左右。
现有技术中，还有基于16S rRNA基因对酸奶中某种乳酸菌进行计数的qPCR法。中国发明专利CN202010843095公开了一种快速、高灵敏性检测和定量酸奶中动物双歧杆菌BB-12的方法，但只能对单一菌种进行检测，如换成乳双歧杆菌此方法则不适用，需要重新构建标曲换算拷贝数，因为其模板是16S rRNA，即使同种方法其拷贝数也会不同，故不能作为模式菌株对所有双歧杆菌计数；且该专利的方法无法区分活菌与死菌。
发明内容
为了解决现有技术存在的不足之处，本发明提供了一种检测发酵乳中乳酸菌的新型qPCR方法，可以对酸奶中6种不同的乳酸菌(嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、发酵乳杆菌、嗜热链球菌)进行定性定量计数，解决了现有技术中一次qPCR法只能计数一种乳酸菌的缺点，还可以对酸奶中活死菌分布进行统计，并对qPCR法计数结果中活死菌分布进行矫正，解决了qPCR法不区分活死菌的问题。
本发明采用以下技术方案：一种检测发酵乳中乳酸菌的新型qPCR方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.提取6种乳酸菌的DNA，6种乳酸菌为嗜酸乳杆菌(LA)、短乳杆菌(LB)、干酪乳杆菌(LC)、保加利亚乳杆菌(LD)、发酵乳杆菌(LF)、嗜热链球菌(ST)；
S2.设计6种乳酸菌特异性引物并合成；
S3.质粒的提取、酶切、连接与转化；
S4.建立qPCR标准曲线；
S5.分别测定单菌种发酵液和混合发酵酸奶中乳酸菌的含量；
S6.使用流式细胞术对酸奶中乳酸菌进行计数；
S7.SYTO9与PI染色剂结合激光共聚焦，区分活菌和死菌。
与现有技术相比，本发明解决了在混合发酵酸奶中菌群复杂不容易区分计数的难题，首次在混合发酵酸奶中使用qPCR定性定量计数发酵过程中的6种乳酸菌；另外，通过流式细胞术、激光共聚焦结合SYTO9与PI染色剂对酸奶中乳酸菌计数，并矫正qPCR法计数结果中活菌与死菌分布，实现对酸奶中活菌与死菌计数；再者，本发明的检测发酵乳中乳酸菌新型qPCR方法，可将传统涂布平板法的检测时间从72h降至12h，并且能够满足多菌株同时计数，填补流式细胞术不能对多菌种定性缺陷。
进一步地，步骤S1的具体步骤为：将酸奶稀释15倍，然后加入蛋白酶K和SDS(8.0％)，用细菌DNA提取试剂盒提取6株乳酸菌DNA，测定其浓度及纯度，提取的DNA保存在-20℃的冰箱中。
进一步地，步骤S2的具体步骤为：选择tuf基因作为靶基因，利用引物设计软件Primer Premier 6，设计6种乳酸菌特异性引物，并将引物在NCBI的BLAST数据库中比对，验证其特异性，将设计完成的引物委托生工生物工程有限公司合成。通过使用tuf基因替代16S rRNA基因可以使该方法所绘制的标准曲线适用于同种所有乳酸菌。6种乳酸菌特异性引物系列如下：
LA引物1(F)：GTGACAAGGAAGCTCAAGACCAA，
LA引物1(R)：CCACGACCAGTGATAGTGAATACG，
LA引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcATGGCAGAAAAAGAACATTACGTTAG，
LA引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttTTAGTCGTCAATTTCAGTAACTTGGC，
LB引物1(F)：AAGCCATTCTTGATGCCAGTTGA，
LB引物1(R)：ACCAGTAACCGTCGTCTTCAGT，
LB引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcATGGCTGAAAAAGAACATTATGAAAG，
LB引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttTTAGTCGTCAATTTCCGTAACGG，
LC引物1(F)：TGAAGGCGACAAGGAACAGGAA，
LC引物1(R)：AAGCAACAGTACCACGACCAGT，
LC引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcATGGCTGAAAAAGAACACTATGAACG，
LC引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttTTAGTCAAGAATTTCGGAAACAACG，
LD引物1(F)：TGACGAATACATTCCAACTCCAGAAC，
LD引物1(R)：TCAACGCTGTCGCCAACCT，
LD引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcATGGCAGAAAAAGAACATTACGTTAG，
LD引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttTTAGTCGTCAATTTCAGTAACTTGGC，
LF引物1(F)：GGAAGTCGTATTCGGACAGAAGGT，
LF引物1(R)：CTCGCCAGGTCGGTGTTGAA，
LF引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcTTAGTCGAGCACTTCGGATACCA，
LF引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttATGGCAGAAAAAGAACATTATGAACG，
ST引物1(F)：CGTGGTGTTGTTCGTGTTAATGA，
ST引物1(R)：CGGCAATACCTTCATCAAGTTGT，
ST引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcATGGCAAAAGAAAAATACGATCG，
ST引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttTTAAGCTTCGATTTCAGATACGATACC。
进一步地，步骤S3的具体步骤为：从大肠杆菌中提取了质粒pUC19，用引物2对目的基因进行PCR扩增和割胶回收，将PCR反应产物进行凝胶电泳，切割完全分离的DNA片段，用DNA攻丝回收试剂盒回收DNA。
进一步地，步骤S4的具体步骤为：将生长在含氨苄青霉素的LB固体平板上的阳性菌落挑选出来，转接到含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm摇床培养24h；从阳性菌中提取质粒、酶切、回收酶切产物，根据所提质粒的浓度，计算出标准质粒原液中拷贝数浓度；将含有目的片段的单拷贝克隆质粒按照10倍系列稀释，将其作为模板进行荧光定量PCR，绘制标准曲线，以阈值循环数Cq为纵坐标，以参考物质浓度的对数为横坐标。
进一步地，步骤S5单菌种发酵液中乳酸菌的含量测定方法为：挑取6种菌株的单菌落，放入MRS培养基中，在37℃下培养12h，10倍连续稀释后，将菌液在8000×g、4℃下离心5min，提取目标菌株的DNA用于qPCR，同时对平板上的菌落进行计数、比较。
进一步地，步骤S5中混合发酵酸奶中乳酸菌的含量测定方法为：将全脂奶粉加入65℃水中，65℃下均质，95℃下灭菌5min，然后在42℃下浸泡20min，得到重组的牛奶；配置乳酸菌组合，将乳酸菌组合重悬于重组的牛奶中，42℃发酵6h，发酵后的酸奶10倍系列稀释，10000×g、4℃下离心5min，收集菌体，细菌DNA提取试剂盒提取酸奶中所有乳酸菌的DNA，进行荧光定量PCR，与标准曲线比对。
进一步地，乳酸菌组合的制备方法如下：每个纯种乳酸菌的数量控制在5×106CFU/ml，菌液在8000×g、4℃下离心5min，收集菌体，将收集来的各个纯种菌体组合，并用无菌生理盐水(0.85％，w/v)洗涤2次，得到乳酸菌组合，包括：ST+LD、ST+LD+LB、ST+LD+LA、ST+LD+LF、ST+LD+LC。
进一步地，步骤S6的具体步骤为：发酵后的酸奶样品用无菌PBS稀释100倍，均质后通过48μm无菌滤膜，然后分别取3μL SYTO9和PI染料到1mL样品中，避光孵育15min，然后再次通过滤膜，根据SYTO9单染中绿色荧光染料的最大激发波长483nm和最大发射波长503nm选择FL1检测通道，同样，PI红色荧光染料的FL3检测通道，1mL悬浮液中的细菌细胞数可以通过以下公式计算：
Ns＝(Vs×Nd)/(vd×td)
其中Ns(细胞/ml)是悬浮液中的细胞数；Vs(ml)是悬浮液的体积；νd(μl/min)是流式细胞仪中设定的流速30μl/min；Nd(细胞/ml)是检测的细胞数；td(s)是检测时间。
进一步地，步骤S7的具体步骤为：将酸奶用无菌PBS稀释10-3倍，同时，将细菌DNA提取试剂盒中的A液和B液按1:1的比例加入微量离心管中，混匀之后，在每ml酸奶稀释液中加入3uL混合染料，搅拌混合均匀，在室温下黑暗中静置15min，取5uL酸奶稀释液染色到玻璃片上，装上盖玻片，此后用激光共聚焦显微镜观察乳酸菌染色，选择SYTO9和PI双染色程序。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是本发明实施例中乳酸菌模式菌的16S rRNA基因和tuf基因的多重序列比对，其中，A为6株乳酸菌模式菌的16S rRNA基因的多重序列比对，B为6株乳酸菌模式菌的tuf基因的多重序列比对；
图2是本发明实施例中引物特异性验证的条带图；
图3是本发明实施例中质粒pUC19割胶回收和目的基因连接转化的结果图，其中，A表示质粒pUC19割胶回收的结果，B表示质粒pUC19和目的基因连接转化后，大肠杆菌在氨苄青霉素平板上生长的结果；
图4是本发明实施例中6种菌株的扩增曲线(左图)和熔解曲线(右图)，其中，A、B、C、D、E、F分别代表嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、发酵乳杆菌、嗜热链球菌；
图5是本发明实施例中单菌种发酵液和混合发酵酸奶中乳酸菌的计数数据图，其中，A表示计数单菌种发酵液中的6种菌种，B表示计数不同组合发酵酸奶中的ST，LC:ST，LF:ST，LB:ST,LA:ST，ST分别表示计数组合LC+LD+ST、LF+LD+ST、LB+LD+ST、LA+LD+ST、LD+ST，C表示计数不同组合发酵酸奶中的LD，D表示计数不同组合发酵酸奶中的LC、LA、LB、LF；
图6是本发明实施例中流式细胞仪对酸奶中的乳酸菌计数数据，其中，A和E分别是SYTO9和PI单染阴性对照的FCM分布，B和F分别是SYTO9和PI单染阴性对照细胞的分布和荧光强度，C和G分别是SYTO9和PI单染阳性对照流细胞的分布，D和H分别是SYTO9和PI单染阳性对照细胞的分布和荧光强度。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
本发明中的以下缩略语具体定义为：
qPCR，荧光定量PCR，其中PCR是指聚合酶链式反应；
FCM，流式细胞术；
PBS，磷酸盐缓冲盐溶液；
PI，碘化丙啶；
SDS，十二烷基硫酸钠；
LA，嗜酸乳杆菌；
LB，短乳杆菌；
LC，干酪乳杆菌；
LD，保加利亚乳杆菌；
LF，发酵乳杆菌；
ST，嗜热链球菌。
实施例1
现有技术采用16S rRNA基因作为靶基因设计引物，但此方法只能对单一菌种进行检测。本发明为了同时对多个同种菌种进行检测，从乳酸菌中提取DNA并将其中的16S rRNA基因与tuf基因进行基因多重序列比对，以验证tuf基因适用于多个同种菌种的检测。由于混合发酵酸奶中蛋白质和脂肪含量较高，且酸奶呈胶体状，对酸奶中乳酸菌DNA的提取有一定影响，因此，本实施例先将酸奶稀释15倍，加入蛋白酶K和SDS(8.0％)，以水解蛋白质和脂肪，释放出被包裹的乳酸菌，然后经过高速离心，避免损伤、影响DNA纯度和产量，获得高纯度DNA，再用细菌DNA提取试剂盒提取6株乳酸菌的DNA，保存在-20℃的冰箱中，最后使用rnDB数据库比较6株乳酸菌中16S rRNA基因和tuf基因的拷贝数及可变区，数据如图1和表1所示。
表1. 6株乳酸菌的16S rRNA基因拷贝数
Figure BDA0003201491380000061
Figure BDA0003201491380000071
对图1的数据进行统计，16S rRNA基因序列非常保守，相似度高，只有6个可变区，总长度为213bp，占14.2％；而tuf基因有9个可变区，总长度为253bp，占21.22％。
表1列出了6种乳酸菌中5个典型代表菌株的16S rRNA基因拷贝数，数据表明，对于同一个乳酸菌，其拷贝数是不一样的。以嗜酸乳杆菌为例，数据库中共有8种基因组，其16SrRNA拷贝数在4-5之间，中位数为4，平均数为4.1，但tuf基因拷贝数只有1。在qPCR反应中，通常使用16S rRNA序列和一些特定的基因序列作为目标DNA序列来设计引物或探针，但同一菌株的16S rRNA基因拷贝数并不相同，而乳酸菌物种之间的16S rRNA序列同源性很高。因此，16S rRNA基因的选择会给后续的计算带来一定的误差，但tuf基因拷贝数都只有1，具有高度保守性。
实施例2
一种检测发酵乳中乳酸菌的新型qPCR方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.提取6种乳酸菌的DNA，测定其浓度及纯度，6种乳酸菌为嗜酸乳杆菌(LA)、短乳杆菌(LB)、干酪乳杆菌(LC)、保加利亚乳杆菌(LD)、发酵乳杆菌(LF)、嗜热链球菌(ST)；
将酸奶稀释15倍，然后加入蛋白酶K和SDS(8.0％)，用细菌DNA提取试剂盒提取6株乳酸菌DNA，测定其浓度及纯度，提取的DNA保存在-20℃的冰箱中。
S2.设计6种乳酸菌特异性引物并合成；
选择tuf基因作为靶基因，应用引物设计软件Primer Premier 6设计6株乳酸菌特异性引物：保加利亚乳杆菌CICC 6045(LD)、嗜热链球菌CGMCC1.1864(ST)、嗜酸乳杆菌CICC6074(LA)、发酵乳杆菌CGMCC1.7434(LF)、Lactobacillus brevis CGMCC1.5954(LB)、Lactobacillus casei CGMCC1.5956(LC)，引物的扩增片段长度约为150bp，然后采用NCBI网站上的Blast数据库进行引物特异性评价，再利用CE Design软件设计带有同源臂的克隆引物，之后委托生工生物工程有限公司对设计的引物进行合成，然后，利用实验室分离和保存的已知菌种的DNA，以及菌种保藏中心购买的乳酸菌，对所设计的引物的特异性进行了实验验证。其中，6种乳酸菌特异性引物系列如下：
LA引物1(F)：GTGACAAGGAAGCTCAAGACCAA，
LA引物1(R)：CCACGACCAGTGATAGTGAATACG，
LA引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcATGGCAGAAAAAGAACATTACGTTAG，
LA引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttTTAGTCGTCAATTTCAGTAACTTGGC，
LB引物1(F)：AAGCCATTCTTGATGCCAGTTGA，
LB引物1(R)：ACCAGTAACCGTCGTCTTCAGT，
LB引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcATGGCTGAAAAAGAACATTATGAAAG，
LB引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttTTAGTCGTCAATTTCCGTAACGG，
LC引物1(F)：TGAAGGCGACAAGGAACAGGAA，
LC引物1(R)：AAGCAACAGTACCACGACCAGT，
LC引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcATGGCTGAAAAAGAACACTATGAACG，
LC引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttTTAGTCAAGAATTTCGGAAACAACG，
LD引物1(F)：TGACGAATACATTCCAACTCCAGAAC，
LD引物1(R)：TCAACGCTGTCGCCAACCT，
LD引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcATGGCAGAAAAAGAACATTACGTTAG，
LD引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttTTAGTCGTCAATTTCAGTAACTTGGC，
LF引物1(F)：GGAAGTCGTATTCGGACAGAAGGT，
LF引物1(R)：CTCGCCAGGTCGGTGTTGAA，
LF引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcTTAGTCGAGCACTTCGGATACCA，
LF引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttATGGCAGAAAAAGAACATTATGAACG，
ST引物1(F)：CGTGGTGTTGTTCGTGTTAATGA，
ST引物1(R)：CGGCAATACCTTCATCAAGTTGT，
ST引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcATGGCAAAAGAAAAATACGATCG，
ST引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttTTAAGCTTCGATTTCAGATACGATACC。
在6组反应体系中，7个试管被平行设置，每组反应体系中的模板是6种菌株的提取的DNA，以及1管阴性对照。在反应系统1-6中，引物为LA、LB、LC、LD、LF、ST。PCR反应条件和程序见表2，PCR反应产物用1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检查，电泳条件为130V恒压30min，用凝胶成像系统分析检测结果，结果见图2。从图2的条带结果可以看出，该引物特异性非常好，仅能克隆目标菌株的靶基因，对于其他5种乳酸菌均不能克隆。因此，当酸奶中同时含有这6种菌时，设计的引物可以将其精确地鉴定及区分出来，避免计数结果出现误差。
表2.PCR反应条件
Figure BDA0003201491380000091
S3.质粒的提取、酶切、连接与转化
从大肠杆菌中提取质粒pUC19，然后通过PCR验证提取结果，选择SacI和HindIII作为双限制位点进行酶切，酶切反应体系如表3所示，然后，加入样品反复移液并搅拌均匀，在37℃的水浴中保持10min后，80℃灭酶15min，最后用凝胶电泳观察酶切结果。
将目的基因与引物2连接，进行PCR扩增，PCR反应体系如表4所示，PCR扩增程序如表5所示，再将PCR反应产物进行凝胶电泳，分离DNA片段，当条带分离充分，切除DNA片段，称取凝胶重量，采用凝胶回收试剂盒回收DNA。结果如图3所示，可以看出，没有被pUC19转化的大肠杆菌在含有氨苄青霉素的平板上没有生长，被pUC19(携带目标菌株的DNA片段)转化了的大肠杆菌正常生长，6种菌株的目的基因都已成功转化。
表3.酶切反应体系
Figure BDA0003201491380000092
表4.PCR反应体系
Figure BDA0003201491380000093
表5.PCR扩增程序
Figure BDA0003201491380000094
Figure BDA0003201491380000101
S4.建立qPCR标准曲线
将生长在含氨苄青霉素的LB固体平板上的阳性菌落挑选出来，转接到含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm摇床培养24h；从阳性菌中提取质粒、酶切、回收酶切产物，根据所提质粒的浓度，计算出标准质粒原液中拷贝数浓度；将含有目的片段的单拷贝克隆质粒按照10倍系列稀释，将其作为模板进行荧光定量PCR，绘制标准曲线，以阈值循环数Cq为纵坐标，以参考物质浓度的对数为横坐标。荧光定量反应体系(20μL)：ddH2O 3μL，PCR引物2μL，Master Mix，2x 10μL，DNA 5μL。
结果如图4所示，6种菌株的熔解曲线是单一的，说明没有引物二聚体的干扰，所扩增产物均为目的产物，扩增效果很好。6种菌株的标准曲线分别为：
LA：y＝-3.203x+34.08(R2＝0.9977)；
LB：y＝-3.1011x+32.72(R2＝0.9981)；
LC：y＝-3.2385x+38.66(R2＝0.9993)；
LD：y＝-3.171x+34.18(R2＝1.0000)；
LF：y＝-3.4382x+35.85(R2＝0.9972)；
ST：y＝-3.1994x+33.85(R2＝0.9969)。
当标准曲线的斜率在-3.1至-3.6之间，且相关系数R2≥0.99时，符合上述条件的标准曲线可用于菌株的定量分析。此外，熔解曲线中只出现一个熔解峰，没有非特异性二聚体产生，说明定量系统的特异性良好，所用引物和PCR反应条件适合qPCR反应。表明模板在稀释范围内有良好的线性关系，检测线为1×103～1×108copies/μL。
S5.分别测定单菌种发酵液和混合发酵酸奶中乳酸菌的含量
单菌种发酵液中乳酸菌的含量测定方法为：挑取6种菌株的单菌落，放入MRS培养基中，在37℃下培养12h，10倍连续稀释后，将菌液在8000×g、4℃下离心5min，提取目标菌株的DNA用于qPCR，同时对平板上的菌落进行计数、比较。
混合发酵酸奶中乳酸菌的含量测定方法为：将全脂奶粉加入65℃水中，65℃下均质，95℃下灭菌5min，然后在42℃下浸泡20min，得到重组的牛奶。每个纯种乳酸菌的数量控制在5×106CFU/ml，菌液在8000×g、4℃下离心5min，收集菌体，将收集来的各个纯种菌体组合，并用无菌生理盐水(0.85％，w/v)洗涤2次，得到乳酸菌组合，包括：ST+LD、ST+LD+LB、ST+LD+LA、ST+LD+LF、ST+LD+LC。将乳酸菌组合重悬于重组的牛奶中，42℃发酵6h，发酵后的酸奶10倍系列稀释，10000×g、4℃下离心5min，收集菌体，细菌DNA提取试剂盒提取酸奶中所有乳酸菌的DNA，进行荧光定量PCR，与标准曲线比对。
酸奶均质后，用无菌生理盐水稀释109倍，以计数酸奶中各单菌种：
在M17培养基上37℃培养24h，以计数酸奶中的嗜热链球菌；
使用MRS培养基，将涂布的平板倒置，在36±1℃的厌氧培养箱中培养72h±2h，以计数酸奶中的发酵乳杆菌；
在MRS培养基上于30℃有氧条件下培养36h，以计数短乳酸菌；
在37℃厌氧培养48h后，加入50mg/L万古霉素，然后在37℃厌氧环境下培养72h，以计数酸奶中的嗜酸乳杆菌；
通过MRS麦芽糖琼脂平板在37℃厌氧培养48至72h，以计数酸奶中干酪乳杆菌。
各类样品中的保加利亚乳杆菌的计数方法如下：
将MRS培养基的pH值调至5.7，然后在37℃厌氧培养48h，以计数ST-LD；
将MRS培养基的pH值调至4.58，然后在43℃的厌氧培养箱中培养72h，以计数LA-LD；
使用MRS培养基在37℃厌氧培养48h，以计数LF-LD；
将稀释的酸奶或溶液涂在MRS平板上，pH值调至5.2，在43℃下厌氧培养72h，以计数LC-LD；
在37℃的MRS培养基上厌氧培养5天，以计数LB-LD。
结果如图5所示，对6种单菌发酵液中的乳酸菌在平板菌落上的数量进行计数时，挑选菌落数在30-300cfu的平板，计数板上出现了典型的单一纯种的菌落，图5A表明，采用qPCR方法的计数结果均高于平板菌落计数法的计数结果，且LA、ST、LD、LC、LF在P<0.05水平上有显著差异，但对于LB两种方法均在P<0.05，差异水平没有意义。在单菌种发酵液中，qPCR方法得到的计数结果略高于平板菌落计数法的计数结果，因为平板菌落计数法只计算活菌，而发酵液中存在死亡但未分解的乳酸菌的DNA；虽然qPCR有不能区分活菌和死菌的问题，但酸奶一般在6h后发酵，这种酸奶中的乳酸菌处于对数生长阶段，对不良环境的抵抗力最强，死菌的数量相对较少。
图5B显示，两种方法在发酵6h后，在5种酸奶中检测的ST含量中，除LA:ST外，平板菌落计数法的结果高于qPCR法，且LF:ST、LB:ST两组在P<0.05水平上有显著差异，其他三组无显著差异。图5C所示的酸奶LD计数表明，平板菌落计数法的测定结果高于qPCR法，除LF：LD组有明显差异外，其他四组均无明显差异。图5D显示，酸奶中的4种乳酸菌菌种中，平板菌落计数的计数结果明显高于qPCR的计数结果。可见，当对混合发酵酸奶中的6种乳酸菌菌种分别进行计数时，平板菌落计数结果要高于qPCR的计数结果，这是因为当用选择性计数板来计数酸奶中的每一种乳酸菌菌种时，不能严格区分，所以在同一个计数板中，有两种或三种乳酸菌(Shah 2000)；除嗜酸乳杆菌的特殊形态外，6种乳酸菌的形态大多相似，在计数板上很难用肉眼严格区分，造成计数结果偏大。
S6.使用FCM(流式细胞术)对酸奶中乳酸菌进行计数
发酵后的酸奶样品用无菌PBS(磷酸盐缓冲盐溶液)缓冲液稀释100倍，均质后通过48μm无菌滤膜，然后分别取3μL SYTO9和PI染料到1mL样品中，避光孵育15min，然后再次通过滤膜，根据SYTO9单染中绿色荧光染料的最大激发波长483nm和最大发射波长503nm选择FL1检测通道，同样，PI红色荧光染料的FL3检测通道，1mL悬浮液中的细菌细胞数可以通过以下公式计算：
Ns＝(Vs×Nd)/(vd×td)
其中Ns(细胞/ml)是悬浮液中的细胞数；Vs(ml)是悬浮液的体积；νd(μl/min)是流式细胞仪中设定的流速30μl/min；Nd(细胞/ml)是检测的细胞数；td(s)是检测时间。
结果如图6和表6所示，从宏观上可以看到，与空白组相比，检测到的活菌信号数量远远多于死菌信号的数量。用FCM测试的五种酸奶中的活菌和死菌数量列于表9.其中活菌数量在7.76至7.99lg(cfu/ml)之间，死菌数量在6.85至6.97lg(cfu/ml)之间，结果与qPCR方法的结果相似。本步骤目的是验证本发明方法检测准确度以及酸奶中活死菌分布情况，验证结果显示本发明方法准确可靠。
表6.使用FCM对酸奶中LAB进行的计数
Figure BDA0003201491380000121
S7.SYTO9与PI染色剂结合激光共聚焦，区分活菌和死菌
将酸奶用无菌PBS稀释10-3倍，同时，将细菌DNA提取试剂盒中的A液和B液按1:1的比例加入微量离心管中，混匀之后，在每ml酸奶稀释液中加入3uL混合染料，搅拌混合均匀，在室温下黑暗中静置15min，取5uL酸奶稀释液染色到玻璃片上，装上盖玻片，此后用激光共聚焦显微镜观察乳酸菌染色，选择SYTO9和PI双染色程序。
结果显示活菌的比例分别为92％、94.31％、90.4％、91.3％和93.4％。使用FCM结合SYTO9和PI染料对酸奶中的LAB进行检测，以区分活菌和死菌的数量，结果显示对总细菌的检测与qPCR方法相似，这证明qPCR的计数结果是可靠的。虽然流式细胞仪可以区分活菌和死菌，但在酸奶这样的多菌种发酵样品中不可能定性地检测LAB。在激光共聚焦图像中，代表酸奶中活体LAB的绿色荧光点都在90％以上，这也与FCM检测结果一致，说明发酵后的酸奶中活菌数量比较多。通过流式细胞术与激光共聚焦结果可以对本方法计数结果中的活菌与死菌含量进行矫正，当使用本qPCR法对酸奶中6种乳酸菌进行计数时其计数结果的92.282％为活菌，7.718％为死菌。
与现有技术相比，本发明解决了在混合发酵酸奶中菌群复杂不容易区分计数的难题，首次在混合发酵酸奶中使用qPCR定性定量计数发酵过程中的6种乳酸菌；另外，通过流式细胞术、激光共聚焦结合SYTO9与PI染色剂对酸奶中乳酸菌计数，并矫正qPCR法计数结果中活菌与死菌分布，实现对酸奶中活菌与死菌计数；再者，本发明的检测发酵乳中乳酸菌新型qPCR方法，可将传统涂布平板法的检测时间从72h降至12h，并且能够满足多菌株同时计数，填补流式细胞术不能对多菌种定性缺陷。
以上就本发明较佳的实施例作了说明，但不能理解为是对权利要求的限制。本发明不仅局限于以上实施例，其具体方法允许有变化，凡在本发明独立要求的保护范围内所作的各种变化均在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种检测发酵乳中乳酸菌的新型qPCR方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.提取6种乳酸菌的DNA，所述6种乳酸菌为嗜酸乳杆菌(LA)、短乳杆菌(LB)、干酪乳杆菌(LC)、保加利亚乳杆菌(LD)、发酵乳杆菌(LF)、嗜热链球菌(ST)；
S2.设计6种乳酸菌特异性引物并合成；
S3.质粒的提取、酶切、连接与转化；
S4.建立qPCR标准曲线；
S5.分别测定单菌种发酵液和混合发酵酸奶中乳酸菌的含量；
S6.使用流式细胞术对酸奶中乳酸菌进行计数；
S7.SYTO9与PI染色剂结合激光共聚焦，区分活菌和死菌。
2.根据权利要求1的一种检测发酵乳中乳酸菌的新型qPCR方法，其特征在于，所述步骤S1的具体步骤为：将酸奶稀释15倍，然后加入蛋白酶K和SDS(8.0％)，用细菌DNA提取试剂盒提取6株乳酸菌DNA，测定其浓度及纯度，提取的DNA保存在-20℃环境中。
3.根据权利要求1的一种检测发酵乳中乳酸菌的新型qPCR方法，其特征在于，所述步骤S2的具体步骤为：选择tuf基因作为靶基因，利用引物设计软件Primer Premier 6，设计6种乳酸菌特异性引物，并将引物在NCBI的BLAST数据库中比对，验证其特异性，6种乳酸菌特异性引物系列如下：
LA引物1(F)：GTGACAAGGAAGCTCAAGACCAA，
LA引物1(R)：CCACGACCAGTGATAGTGAATACG，
LA引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcATGGCAGAAAAAGAACATTACGTTAG，
LA引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttTTAGTCGTCAATTTCAGTAACTTGGC，
LB引物1(F)：AAGCCATTCTTGATGCCAGTTGA，
LB引物1(R)：ACCAGTAACCGTCGTCTTCAGT，
LB引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcATGGCTGAAAAAGAACATTATGAAAG，
LB引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttTTAGTCGTCAATTTCCGTAACGG，
LC引物1(F)：TGAAGGCGACAAGGAACAGGAA，
LC引物1(R)：AAGCAACAGTACCACGACCAGT，
LC引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcATGGCTGAAAAAGAACACTATGAACG，
LC引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttTTAGTCAAGAATTTCGGAAACAACG，
LD引物1(F)：TGACGAATACATTCCAACTCCAGAAC，
LD引物1(R)：TCAACGCTGTCGCCAACCT，
LD引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcATGGCAGAAAAAGAACATTACGTTAG，
LD引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttTTAGTCGTCAATTTCAGTAACTTGGC，
LF引物1(F)：GGAAGTCGTATTCGGACAGAAGGT，
LF引物1(R)：CTCGCCAGGTCGGTGTTGAA，
LF引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcTTAGTCGAGCACTTCGGATACCA，
LF引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttATGGCAGAAAAAGAACATTATGAACG，
ST引物1(F)：CGTGGTGTTGTTCGTGTTAATGA，
ST引物1(R)：CGGCAATACCTTCATCAAGTTGT，
ST引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcATGGCAAAAGAAAAATACGATCG，
ST引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttTTAAGCTTCGATTTCAGATACGATACC。
4.根据权利要求3的一种检测发酵乳中乳酸菌的新型qPCR方法，其特征在于，所述步骤S3的具体步骤包括：从大肠杆菌中提取了质粒pUC19，用引物2对目的基因进行PCR扩增和割胶回收，将PCR反应产物进行凝胶电泳，切割完全分离的DNA片段，用DNA攻丝回收试剂盒回收DNA。
5.根据权利要求1的一种检测发酵乳中乳酸菌的新型qPCR方法，其特征在于，所述步骤S4的具体步骤为：将生长在含氨苄青霉素的LB固体平板上的阳性菌落挑选出来，转接到含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm摇床培养24h；从阳性菌中提取质粒、酶切、回收酶切产物，根据所提质粒的浓度，计算出标准质粒原液中拷贝数浓度；将含有目的片段的单拷贝克隆质粒按照10倍系列稀释，将其作为模板进行荧光定量PCR，绘制标准曲线，以阈值循环数Cq为纵坐标，以参考物质浓度的对数为横坐标。
6.根据权利要求1的一种检测发酵乳中乳酸菌的新型qPCR方法，其特征在于，所述步骤S5单菌种发酵液中乳酸菌的含量测定方法为：挑取6种菌株的单菌落，放入MRS培养基中，在37℃下培养12h，10倍连续稀释后，将菌液在8000×g、4℃下离心5min，提取目标菌株的DNA用于qPCR，同时对平板上的菌落进行计数、比较。
7.根据权利要求1的一种检测发酵乳中乳酸菌的新型qPCR方法，其特征在于，所述步骤S5中混合发酵酸奶中乳酸菌的含量测定方法为：将全脂奶粉加入65℃水中，65℃下均质，95℃下灭菌5min，然后在42℃下浸泡20min，得到重组的牛奶；配置乳酸菌组合，将乳酸菌组合重悬于重组的牛奶中，42℃发酵6h，发酵后的酸奶10倍系列稀释，10000×g、4℃下离心5min，收集菌体，细菌DNA提取试剂盒提取酸奶中所有乳酸菌的DNA，进行荧光定量PCR，与标准曲线比对。
8.根据权利要求7的一种检测发酵乳中乳酸菌的新型qPCR方法，其特征在于，所述乳酸菌组合的制备方法如下：每个纯种乳酸菌的数量控制在5×106CFU/ml，菌液在8000×g、4℃下离心5min，收集菌体，将收集来的各个纯种菌体组合，并用无菌生理盐水(0.85％，w/v)洗涤2次，得到乳酸菌组合；所述乳酸菌组合包括：ST+LD、ST+LD+LB、ST+LD+LA、ST+LD+LF、ST+LD+LC。
9.根据权利要求1的一种检测发酵乳中乳酸菌的新型qPCR方法，其特征在于，所述步骤S6的具体步骤为：发酵后的酸奶样品用无菌PBS稀释100倍，均质后通过48μm无菌滤膜，然后分别取3μL SYTO9和PI染料到1mL样品中，避光孵育15min，然后再次通过滤膜，根据SYTO9单染中绿色荧光染料的最大激发波长483nm和最大发射波长503nm选择FL1检测通道，同样，PI红色荧光染料的FL3检测通道，1mL悬浮液中的细菌细胞数可以通过以下公式计算：
Ns＝(Vs×Nd)/(vd×td)
其中Ns(细胞/ml)是悬浮液中的细胞数；Vs(ml)是悬浮液的体积；νd(μl/min)是流式细胞仪中设定的流速30μl/min；Nd(细胞/ml)是检测的细胞数；td(s)是检测时间。
10.根据权利要求1的一种检测发酵乳中乳酸菌的新型qPCR方法，其特征在于，所述步骤S7的具体步骤为：将酸奶用无菌PBS稀释10-3倍，同时，将细菌DNA提取试剂盒中的A液和B液按1:1的比例加入微量离心管中，混匀之后，在每ml酸奶稀释液中加入3uL混合染料，搅拌混合均匀，在室温下黑暗中静置15min，取5uL酸奶稀释液染色到玻璃片上，装上盖玻片，此后用激光共聚焦显微镜观察乳酸菌染色，选择SYTO9和PI双染色程序。
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