KR102597724B1 - 혈중 요산 저감 효능 및 신장 보호 효능을 갖는 신규 스트렙토코커스 살리바리우스 균주, 및 이의 용도 - Google Patents

혈중 요산 저감 효능 및 신장 보호 효능을 갖는 신규 스트렙토코커스 살리바리우스 균주, 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 퓨린(purine) 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주(수탁번호 : KACC 81243BP) 및 이의 다양한 용도를 제공한다. 본 발명에 따른스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주(수탁번호 : KACC 81243BP)는 프로바이오틱 특성을 만족하기 때문에 인체에 안전하고, 혈중 요소 저감 활성, 잔틴산화효소(xanthine oxidase) 억제 활성 및/또는 신장 손상 억제 활성과 같은 다양한 기능성을 가지기 때문에 고요산혈증, 고요산혈증 관련 대사 장애 또는 신장 손상을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 의약품 내지 건강기능식품의 유용한 소재로 사용될 수 있다.

Description

혈중 요산 저감 효능 및 신장 보호 효능을 갖는 신규 스트렙토코커스 살리바리우스 균주, 및 이의 용도{Novel Streptococcus salivarius strain with serum uric acid level reducing effect and renal protective effect, and use of the same}
본 발명은 신규 균주에 관한 것으로서, 더 상세하게는 혈중 요산 저감 효능 및 신장 보호 효능과 같은 다양한 기능성을 가진 신규 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 균주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신규 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 균주의 다양한 용도에 관한 것으로서, 더 상세하게는 신규 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 균주의 고요산혈증, 통풍 또는 신장 손상에 대한 예방, 개선 또는 치료 용도에 관한 것이다.
요산(C5H4N4O3)은 생체내 퓨린 대사과정 중 하이포잔틴(hypoxanthine; C5H4N4O) 또는 잔틴으로부터 잔틴산화효소(xanthine oxidase, XO) 또는 잔틴탈수효소(xanthine dehydrogenase, XDH)에 의해 생성되는 것으로서, 혈중 요산의 70% 가량은 세포의 턴오버(turn-over)에 따른 내인성 퓨린 대사에 의해 만들어지고, 30%는 음식으로 섭취된 퓨린으로부터 형성되어 대부분 신장을 통해 배설된다.
고요산혈증(hyperuricemia)은 체내에서 요산이 과잉 생성되거나 잘 배출되지 않아 혈액 내에 요산 농도가 비정상적으로 높은 상태인 질환으로서, 혈중 요산 농도가 남성에서는 7.0 mg/dL 이상, 여성에서는 6.5 mg/dL 이상인 경우가 이에 해당한다. 요산 농도의 증가는 요산 결정(urate crystal)이 관절막에 침착되면서 염증반응을 유발하는 통풍(gout)의 원인이 되는 것으로 알려져 있으며, 최근 요산과 신장병, 고혈압을 포함한 심혈관계 질환 그리고 대사증후군 및 당뇨병의 발생/악화 사이의 연관에 대한 흥미로운 역학 또는 임상 연구가 발표되고 있다. 한편, 고요산혈증인 사람에게서 발생하는 대표적인 질환인 통풍(gout)은 여러 요인에 의해 생성된 요산 결정을 면역반응에 의해 백혈구가 탐식하면서 관절과 관절 주위 조직에 재발성 발작성 관절염을 일으키고, 요산의 과잉이 지속되는 경우에는 축적된 요산결절에 의해서 관절의 장애를 일으키는 만성 전신성 대사성 질환이다.
이러한 고요산혈증 또는 통풍의 치료를 위한 치료제로 잔틴산화효소 억제제(xanthine oxidase inhibitors), 요산 배설 촉진제(Uricosuric agents), 및 요산 분해제(Uricolytic drugs, urozyme) 등이 사용되고 있다. 잔틴산화효소 억제제는 요산 합성을 억제하는 것으로서, 이를 사용할 경우 요산 대사가 억제되고 혈중 요산 농도가 감소되어 고요산혈증 및 통풍을 치료할 수 있다. 요산 배설 촉진제는 신장의 근위세뇨관에 작용하여 요산의 재흡수를 억제함으로써 소변으로의 배설을 촉진하는 기능을 한다. 요산 분해제는 요산을 알라토닌(allantoin)으로 산화시키는 효소이고, 알라토닌은 요산에 비해 용해도가 높아 신장으로 배설되기 용이하다. 예를 들어, 통풍의 치료를 위해 잔틴산화효소(xanthine oxidase, XO) 억제제인 알로퓨리놀, 페복소스타트 등의 약물이 사용되고 있다.
그러나, 고요산혈증 또는 고요산혈증 관련 대사 장애에 이용하고 있는 치료제들 중의 다수는 여러 가지 부작용들이 알려져 있다. 예를 들면, 알로퓨리놀과 같은 잔틴산화효소 억제제는 과민성 맥관염, 스티븐스-존슨 증후군, 탈락성 피부염, 재생불량성 빈혈 및 간 기능부전과 관련이 있다. 프로베네시드 및 벤즈브로마론과 같은 요산 배설 촉진제는 위장 장애, 요로 결석증 및 특이체질 환자에서의 전격성 간부전과 같은 부작용이 있다. 또한, 비스테로이드성 항염증 약물(NSAID)의 장기적 사용은 궤양성 천공 및 상부 위장관 출혈을 포함하는 부작용을 초래할 수 있다.
고요산혈증 또는 고요산혈증 관련 대사 장애인 통풍 치료와 관련하여, 최근 식이요법의 새로운 방향이 제시되고 기존에 사용하던 약물에 저항을 보이는 환자에 대하여 사용할 수 있는 새로운 요산 강하제가 개발되는 등의 변화를 보이고 있다. 이와 더불어, 천연물을 이용한 요산 저하 효과를 유발하는 물질에 대한 연구개발이 활발히 이루어지고 있다. 또한, 유산균을 이용하여 비만, 고지혈증과 같은 질환을 개선 또는 치료할 수 있는 건강기능식품 또는 의약품 개발이 이루어지고 있다.
유산균을 이용한 고요산혈증 또는 통풍 치료와 관련하여 대한민국 등록특허공보 제10-1584380호에는 혈중 요산치 상승을 억제하고 고요산혈증을 치료하기 위한 용도로 사용될 수 있는 수탁번호:NITE BP-462로서 기탁되어 있는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 유산균 OLL2922주가 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1450511호에는 혈중 요산치 상승을 억제하고 고요산혈증을 치료하기 위한 용도로 사용될 수 있는 Lactobacillus oris OLL2779(수탁번호:NITE BP-223)가 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1385864호에는 혈중 요산치 상승을 억제하고 고요산혈증을 치료하기 위한 용도로 사용될 수 있는 Lactobacillus gasseri OLL2959(수탁번호:NITE BP-224)가 개시되어 있다.
본 발명은 종래의 기술적 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 안전성이 높고 혈중 요산 저감 효능 및 신장 보호 효능과 같은 다양한 기능성을 가진 신규 유산균을 제공하는데에 있다. 또한, 본 발명의 목적은 신규 유산균의 다양한 용도를 제공하는데에 있다.
본 발명의 발명자들은 합성 화학물질에 비해 안전성이 높고 고요산혈증 또는 통풍 치료에 사용할 수 있는 신규 소재를 발굴하기 위해 인체 또는 발효식품에서 분리한 15종의 유산균으로부터 퓨린 분해 활성이 우수한 2개의 균주를 스크니링하고 프로바이오틱스 특성,고요산혈증 동물모델을 이용한 생체내 실험 등을 통해 특정 스트렙토코커스 살리바리우스 균주가 식품학적으로 안전하고 프로바이오틱스로서 필요한 활성을 가지며 동시에 고요산혈증, 고요산혈증 관련 대사 장애 및 신장 손상 개선 효능과 같은 다양한 기능성을 가진다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 퓨린(purine) 분해 활성을 가지는 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주(수탁번호 : KACC 81243BP)를 제공한다.
본 발명의 일 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주(수탁번호 : KACC 81243BP, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 고요산혈증 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주(수탁번호 : KACC 81243BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 고요산혈증 관련 대사 장애 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주(수탁번호 : KACC 81243BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 신장 손상 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주(수탁번호 : KACC 81243BP)는 프로바이오틱 특성을 만족하기 때문에 인체에 안전하고, 혈중 요소 저감 활성, 잔틴산화효소(xanthine oxidase) 억제 활성 및/또는 신장 손상 억제 활성과 같은 다양한 기능성을 가지기 때문에 고요산혈증, 고요산혈증 관련 대사 장애 또는 신장 손상을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 의약품 내지 건강기능식품의 유용한 소재로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에서 선발된 균주인 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주 및 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MJM60662 균주의 세포 파쇄물에 대해 퓨린 분해능을 측정한 결과이다.
도 2는 본 발명의 실시예에서 선발된 2종의 균주인 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주 및 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MJM60662 균주를 퓨린 화합물이 존재하는 배지에서 배양하였을 때의 증식 특성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 혈중 요산 함량을 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 혈중 잔틴산화효소(xanthine oxidase, XO) 수준을 분석한 결과이다.
도 5는 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 혈중 크레아티닌 함량을 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 혈중 요소질소(Urea nitrogen)를 분석한 결과이다.
도 7은 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 적출한 신장의 조직을 Hematoxylin & eosin(H&E) 염색한 후 관찰한 사진이다.
도 8은 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 적출한 신장 사구체 다발 면적을 분석한 결과이다.
도 9는 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 적출한 신장에서 mOAT1(Mouse organic anion transporter 1)의 mRNA 발현 수준을 분석한 결과이다.
도 10은 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 적출한 신장에서 mOAT3(Mouse organic anion transporter 3)의 mRNA 발현 수준을 분석한 결과이다.
도 11은 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 적출한 신장에서 mURAT1(Mouse urate transporter 1)의 mRNA 발현 수준을 분석한 결과이다.
도 12는 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 적출한 소장의 조직을 알리샨 블루 염색(Alcian blue stain) 후 관찰한 사진이다.
도 13은 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 적출한 소장에서 밀착연접단백질인 ZO-1 및 Occludin의 mRNA 발현 수준을 분석한 결과이다.
도 14는 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 적출한 소장에서 밀착연접단백질인 ZO-1 및 Occludin의 발현량을 분석한 결과이다.
도 15는 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 장내 미생물 군집 분석 결과를 문(Phylum) 수준에서 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 장내 미생물 군집 분석 결과를 과(Family) 수준에서 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 장내 미생물 군집 분석 결과를 Firmicutes/Bacteroidetes (F/B) 비로 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 장내 미생물 군집 분석 결과를 Clostridia vadinBB60 group과 Oscillospiraceae의 상대적 풍부성으로 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 장내 미생물 군집 분석한 결과를 Shannon index에 의해 표시되는 Alpha-diversity로 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 장내 미생물 군집 분석한 결과를 Beta-diversity로 나타낸 것이다.
도 21은 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주의 계통분류학적 비교분석 결과를 나타내는 진화관계 트리이다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "배양물"은 미생물을 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양시켜 수득한 산물을 의미하여, 배양된 미생물이 포함되는 개념이이다. 구체적으로 상기 배양물은 미생물 배양액일 수도 있고, 미생물 배양액을 고형화한 고체상일 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "조성물"은 2가지 이상의 성분이 균일하게 혼합되어 있는 상태의 물질을 의미하며, 완제품뿐만 아니라 완제품 제조를 위한 중간 소재를 포함하는 개념이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한" 및 "식품학적으로 허용가능한"이란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 활성 물질의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 억제하거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 호전 또는 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소 또는 완화시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 이때, 개체는 본 발명의 조성물을 투여하여 특정 질환의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.
본 발명에서 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면은 프로바이오틱스로서의 필요한 특성과 함께 인체에 유익한 다양한 기능성을 가지면서 식품학적으로 안전한 신규 유산균에 관한 것이다.
본 발명의 일 예에 따른 신규 유산균은 퓨린(purine) 분해 활성을 가지는 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주(수탁번호 : KACC 81243BP)이다. 상기 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주(수탁번호 : KACC 81243BP)는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 16S rDNA를 갖는다. 또한, 상기 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주(수탁번호 : KACC 81243BP)는 퓨린(purine) 분해 활성 외에 혈중 요소 저감 활성, 잔틴산화효소(xanthine oxidase) 억제 활성 또는 신장 손상 억제 활성에서 선택되는 적어도 2개 이상의 활성을 더 갖는다. 또한, 상기 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주(수탁번호 : KACC 81243BP)는 퓨린(purine)는 장내 미생물 군집 중에서 피르미쿠테스(Firmicutes) 문에 속하는 세균을 증가시키고 박테로이데테스(Bacteroidetes) 문에 속하는 세균을 감소 시킨다. 특히, 상기 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주(수탁번호 : KACC 81243BP)는 피르미쿠테스(Firmicutes) 문의 Clostridia vadinBB60 group, Oscillospiraceae 과에 속하는 세균을 증가시켜 요산 생성을 억제하고 요산의 배출을 원활하게 한다.
본 발명의 다른 측면은 신규 유산균인 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주(수탁번호 : KACC 81243BP)의 다양한 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일 예는 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 고요산혈증 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 예는 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 고요산혈증 관련 대사 장애 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 고요산혈증 관련 대사 장애는 급성 또는 만성통풍, 통풍성 발적, 통풍성 관절염, 통풍성 신결석증 및 통풍성 신병증 중에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다. 상기 통풍성 발적은 통풍에 의한 염증 등으로 붉어지는 증상을 의미한다.
또한, 본 발명의 일 예는 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 신장 손상 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 신장 손상은 요산에 의해 유발되는 것으로서, 구체적으로 혈중 요산 수준의 증가로 인해 유발되고, 혈중 요산 수치의 증가로 인한 보우만 캡슐 공간(bowman's capsule space)의 감소, 근위 세관 세포(proximal tubule's cell)의 팽창, 사구체의 비대화 등을 포함한다.
본 발명에서 배양물은 미생물을 배지에서 배양시켜 수득한 산물로서, 상기 배지는 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 선택될 수 있으며, 예를 들어 MRS 액체 배지, MRS 한천 배지, BL 한천 배지일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 조성물은 사용 목적 내지 양상에 따라 약학 조성물, 건강기능식품 조성물 등으로 구체화될 수 있고, 조성물 내에서 유효성분인 특정 락토바실러스속 균주 등의 함량도 조성물의 구체적인 형태, 사용 목적 내지 양상에 따라 다양한 범위에서 조정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물에서 유효성분인 신규 유산균, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물의 함량은 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~99 중량%, 바람직하게는 0.5~50 중량%, 더 바람직하게는 1~30 중량%일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분 외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 같은 첨가제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 신규 유산균, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물 외에 고요산혈증 또는 통풍 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 의해 경구 투여를 위한 제형 또는 비경구 투여를 위한 제형으로 제제화될 수 있고, 제제화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 인간을 포함한 포유류에 경구 투여되거나 비경구 투여될 수 있으며, 비경구 투여 방식으로는 피부 외용, 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식 등이 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 약학적으로 유효한 양이라면 크게 제한되지 않으며, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 약학 조성물의 통상적인 1일 투여량은 크게 제한되지 않으나 바람직하게는 유효성분을 기준으로 할 때 0.01 내지 3000 ㎎/㎏ B.W.이고, 더 바람직하게는 0.1 내지 2000 ㎎/㎏ B.W.이며, 하루 1회 또는 수회로 나누어 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 통상적인 1일 투여량은 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주(수탁번호 : KACC 81243BP)를 기준으로 할 때 1×106 CFU/kg B.W. 내지 1×1012 CFU/kg B.W.이고 바람직하게는 1×108 CFU/kg B.W. 내지 1×1010 CFU/kg B.W.이다.
또한, 본 발명에 따른 건강기능식품 조성물에서 유효성분인 신규 유산균, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물의 함량은 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~50 중량%, 바람직하게는 0.1~25 중량%, 더 바람직하게는 0.5~10 중량%이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 건강기능식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐, 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 구체적인 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품(health functional food) 외에 이와 유사한 개념을 갖는 식이보충제(dietary supplement) 및 식품보충제(food supplement)를 모두 포함한다. 본 발명의 건강기능식품 조성물은 유효성분 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 상기 보조 첨가제에는 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제 등이 있다. 본 발명의 건강기능식품 조성물은 유효성분 외에 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분들은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 향미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 향미제 등을 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것 일뿐, 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.
1. 퓨린 분해 활성을 가진 유산균의 스크리닝
명지대학교 자연캠퍼스 내에 위치하고 있는 유용미생물추출물은행(ECUM; 경기도 용인시 처인구 남동 산 38-2 행정동 1층 17102호)로부터 제공받은 15종의 유산균에 대해 퓨린 분해 활성을 측정하고 퓨린 분해 활성이 우수한 유산균을 스크리닝하였다. 상기 15종의 유산균은 발효 음식 및 인체로부터 분리한 것이다.
먼저, 이노신(inosine) 33.7㎎ 및 구아노신(guanosine) 35.7 ㎎을 인산칼륨(K3PO4) 용액 100 ㎖에 첨가하고 용해시켜 이노신 농도 및 구아노신 농도가 각각 1 mM인 이노신-구아노신 용액을 제조하고 멸균하였다. 15여종의 유산균을 각각 MRS 배지에 접종하고 37℃에서 48 hr 동안 무산소 조건으로 배양한 후, 배양액 2 ㎖를 4000×g의 조건에서 10분 동안 원심분리하여 배양된 균체를 수득하였다. 이후, 수득한 균체를 0.85% 염화나트륨(NaCl) 용액 1 ㎖로 3번 세척한 후 균체를 이노신-구아노신 용액 750 ㎕에 현탁하고 37℃에서 120분 동안 배양하였다. 이후, 배양액에서 상등액 270 ㎕를 취한 후 여기에 0.1M 농도의 HClO4 용액 30 ㎕를 첨가하여 뉴클레오사이드 분해 반응을 중단시키고 0.22 ㎛ 필터로 여과한 후 여과액을 HPLC로 분석하여 유산균의 뉴클레오사이드 분해능을 확인하였다.
HPLC 분석에 사용된 조건은 다음과 같다.
* 컬럼 : YMC-Pack ODS-A 컬럼(AA12S05-2546WT S-5 ㎛, 12 ㎜, 250×4.6 ㎜ column); 컬럼 온도 : 37℃; 유속 : 1 ㎖/min; 이동상 : NaClO4-H3PO4 용액(dH2O 중 0.1 mM NaClO4 및 0.187 mM H3PO4); 검출파장 : 254 nm
하기 표 1에 15종의 유산균에 대해 진행한 구아노신 분해능 및 이노신 분해능 측정 결과를 요약하였다.
균주 퓨린 분해능
구아노신 분해능(%) 이노신 분해능
Weissella viridescens MJM60546 34.1 23.5
Lactobacillus curvatus MJM60554 48.5 39.0
Lactobacillus sakei MJM60556 28.2 17.7
Lactobacillus brevis MJM60559 34.8 30.5
Lactobacillus plantarum MJM60561 55.0 44.4
Streptococcus thermophilus MJM60587 16.9 17.3
Lactobacillus plantarum MJM60379 19.7 17.1
Enterococcus fecium MJM60380 52.5 44.7
Lactobacillus plantarum MJM60381 30.0 23.3
Lactobacillus plantarum MJM60382 29.4 20.7
Lactobacillus sakei MJM60352 37.2 37.8
Lactobacillus curvatus MJM60354 22.4 21.6
Streptococcus salivarius MJM61033 100.0 100.0
Lactobacillus gasseri MJM60662 100.0 100.0
Lactobacillus rhamnosus GG 81.16 78.53
상기 표 1에서 보이는 바와 같이 15종의 유산균 모두에서 구아노신 및 이노신 분해능을 보였고, HPLC 피크 크기로 정량분석을 진행하여 구아노닌 및 이노신 분해율이 100%에 가까운 총 2개의 균주를 선발하였다. 선발된 균주는 인체 구강에서 분리한 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 및 요산 저감 효능을 가진 발효유제품에서 분리한 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MJM60662이다. 상기 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MJM60662는 퓨린 분해 효능이 있는 것으로 알려진 균주이다. 선발된 2종의 균주인 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 및 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MJM60662에 대해 이후의 실험을 진행하였다.
2. 선발된 균주의 세포 파쇄물을 이용한 퓨린 분해능 측정 실험
선발된 균주의 퓨린 분해 원인 물질을 탐색하기 위하여, 균주를 배양한 후, 배양액을 원심분리하여 균체를 수득하였다. 이후, 균체를 PBS로 세척하고 소니케이터(sonicator)를 이용하여 PBS에 용해시킨 후, 1,500 rpm의 속도로 10분 동안 원심분리하여 시토솔(cytosol)을 포함하는 세포 파쇄 상등액(Lysis supernatant)와 세포벽 잔해(debri)를 포함하는 세포 파쇄 불용물(Lysis pellet)을 각각 수득하였다. 이후, 아데노신도신(adenosine), 구아노신(guanosine) 및 이노신(inosine)이 용해되어 있는 뉴클레오사이드 용액에 균체, 세포 파쇄 상등액 또는 세포 파쇄 불용물을 첨가하고 37℃에서 120분 동안 배양한 후 뉴클레오사이드 용액에 남아있는 뉴클레오사이드 종류 및 양을 측정하였다.
도 1은 본 발명의 실시예에서 선발된 균주인 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주 및 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MJM60662 균주의 세포 파쇄물에 대해 퓨린 분해능을 측정한 결과이다. 도 1의 A는 아데노신 분해능 측정 결과이고, B는 구아노신 분해능 측정 결과이고, C는 이노신 분해능 측정 결과이다.도 1에서 MJM61033은 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주를 나타내고, MJM60662는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MJM60662 균주를 나타낸다. 도 1에서 "Live"는 파쇄되지 않은 균체를 나타낸다. 도 1에서 보이는 바와 같이 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주의 퓨린 분해능은 주로 세포 파쇄 불용물(Lysis pellet)에 의해 발휘되는 것으로 나타났다. 반면, 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MJM60662 균주는 세포 파쇄 상등액(Lysis supernatant) 및 세포 파쇄 불용물(Lysis pellet) 모두에서 균체에 비해 퓨린 분해 효율이 크게 떨어지는 것으로 나타났다.
3. 선발된 균주의 안전성 및 프로바이오틱스 특성 규명
(1) 구강-위장관 통과 조건에서의 내성 평가
선발된 2종의 균주인 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주 및 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MJM60662 균주에 대해 구강-위장관 통과 내성 어세이(Oro-gastrointestinal transit tolerance assay)를 수행하였다.
먼저, 구강 통과 스트레스를 주기 위해, 150 ㎎/ℓ의 라이소자임(lysozyme)을 포함하는 전해질 용액(NaCl, 6.2g/ℓ; KCl, 2.2g/ℓ; CaCl2, 0.22g/ℓ; NaHCO3, 1.2g/ℓ)에 선발된 2종의 균주를 MRS 배지를 사용하여 각각 1×108 CFU/㎖씩 접종하고 37℃에서 5분 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후 배양액을 연속희석법을 이용하여 MRS 한천 배지에 도포한 후 계수하였다.
이후, 구강 통과 스트레스 조건에서 배양된 균체를 원심분리(1,800 × g, 5분) 하여 구강 스트레스 용액으로부터 분리하고, 위 통과 스트레스를 주기 위해 분리된 균체를 0.3% 펩신(pepsin)을 포함하고 pH가 2인 전해질 용액에 접종한 후 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후 배양액을 연속희석법을 이용하여 MRS 한천 배지에 도포한 후 계수하였다.
이후, 위 통과 스트레스 조건에서 배양된 균체를 원심분리(1,800 × g, 5분) 하여 위 스트레스 용액으로부터 분리하고, 소장 통과 스트레스를 주기 위해 분리된 균체를 0.1% 판크레아틴(pancreatin) 및 0.3% 담즙염(bile oxgall)을 포함하고 pH가 7인 전해질 용액(NaCl, 5g/ℓ; KCl, 0.6g/ℓ; CaCl2, 0.25g/ℓ)에 접종하고 37℃에서 1 hr 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후 배양액을 연속희석법을 이용하여 MRS 한천 배지에 도포한 후 계수하였다.
스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주는 구강-위-장 스트레스를 통과한 후에도 상당수가 생존하는 것으로 나타났다.
(2) 항생제 감수성 평가
선발된 2종의 균주인 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주 및 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MJM60662 균주의 항생제 감수성은 유럽식품안전청(European Food Safety Authority, EFSA, 2012) 기준을 사용하여 평가하였다. 검증한 항생제는 Chloramphenicol, Ampicillin, Tetracycline, Gentamycin, Kanamycin, Streptomycin, Erythromycin, Clindamycin, Vancomycin 이다.
유산균을 MRS 배지에서 배양한 후 MacFarland 0.5로 MRS 배지에 현탁하여 유산균 현탁액을 준비하였다. 512 ㎍/mL 농도의 항생제를 2-fold dilution 형식으로 항생제 농도가 0.25가 될 때까지 희석하여 항생제 희석액을 준비하였다. 이후, 96-well plate에 항생제 희석액 100 ㎕와 유산균 현탁액 100 ㎕를 혼합후 37℃에서 24 hr 동안 배양하였다. 이후, 육안으로 유산균의 생육을 확인하고 유산균이 자라지 않는 최고 농도를 최저저해농도((MIC)로 설정하였다.
스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주에 대한 최소저해농도는 EFSA에서 권장하는 최소저해농도 이하로 나타났고, 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주는 항생제 감수성을 갖고 있는 것으로 확인되었다.
(3) Caco-2 세포주를 이용한 장내 부착능 평가
인간 상피조직 유사 Caco-2 세포주를 한국세포주은행으로부터 분양받아 상피세포 부착능 실험에 사용하였다.
먼저, 20%(v/v)의 비활성화 FBS(fetal bovine serum), 100 U/㎖의 페니실린 및 100 ㎎/㎖의 스트렙토마이신 항생제가 첨가된 DMEM 배지에 Caco-2 세포를 접종하고 37℃의 온도 및 5%의 CO2 농도 환경을 가진 배양기에서 배양하였다. 이후, 잘 분화된 Caco-2 세포를 12-웰 플레이트(Well Plates)에 웰당 2×105 cells의 양으로 분주하고 매일 배지를 교환하면서 24 hr 동안 배양하여 80%가 채워진 단일층(monolayer)을 형성시켰다. 이후, Caco-2 세포 단일층을 PBS로 3번 세척하고 항생제가 없는 DMEM 배지로 교환한 후, 시험 균주를 최종 농도가 2×108 CFU/㎖가 되게 접종하고 37℃, 5% CO2 환경에서 2 hr 동안 배양하였다. 이후, 단일층을 PBS로 3번 세척하여 부착되지 않은 시험 균주를 제거하고 1% Triton-X 100(Sigma-Aldrich) 200 ㎕를 첨가하여 시험 균주가 부착된 단일층을 파쇄하였다. 이후, 파쇄액 1 ㎖를 연속희석법을 이용하여 MRS 한천 배지에 도포한 후 37℃에서 48 hr 동안 배양한 후 균수를 확인하였다. 시험 균주의 부착능은 부착된 시험 균주의 콜로니 형성 단위(colony forming units, CFU)를 계산하여 평가하였다. 시험 균주의 Caco-2 세포주에 대한 부착 %는 아래의 식을 사용하였다.
스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주는 Caco-2 세포에 대해 약 13.75%의 부착능을 나타내었다.
(4) 생체 유래 아민(Biogenic amine) 생성 평가
L-tyrosine, L-histidine, L-ornithine, L-phenylalanine, L-lysine과 같은 아미노산을 각각 첨가한 decarboxylase 배지(Tryptone : 0.5 wt%; yeast extract : 0.5 wt%; beef extract : 0.5 wt%; sodium chloride : 0.25 wt%; glucose : 0.05 wt%; tween 80 : 0.1 wt%, MgSO4 : 0.02 wt%; MnSO4 : 0.005 wt%; FeSO4 : 0.004 wt%; Ammonium citrate : 0.2 wt%; Thiamine : 0.001 wt%; dipotassium phosphate : 0.2 wt%; calcium carbonate : 0.01 wt%; pyridoxal 5-phosphate : 0.005 wt%; Amino acid(one of the amino acid listed above) : 1 wt%; bromocresol purple : 0.006 wt%; agar 2 wt%; pH : 5.3)에 시험 균주를 접종하고 37℃에서 16~24 hr 동안 배양한 후, 콜로니 주변의 보라색 색소 생성 유무로 생체 유래 아민 생성 여부를 확인하였다. 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주는 생체 유래 아민을 생성하지 않는 것으로 확인되었다.
(5) 용혈 활성 평가
균주가 용혈 활성을 가지고 있는 경우 숙주의 적혈구를 파괴시키므로 프로바오틱스로 사용되는 유산균은 용혈 활성을 가지지 않아야 한다.
혈액 한천 배지(TSA blood agar)에 균주를 도말하고 37℃에서 24 hr 동안 배양한후 투과광으로 용혈반응을 확인하였다. 혈액 한천 배지(TSA blood agar)는 TSA 한천 배지를 멸균하고 40~50℃로 냉각시킨 후에 멸균된 양 혈액(sheep blood)을 5% 첨가하여 제조하였다. 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주는 용혈 활성이 없는 것으로 확인되었다.
(6) D-Lactate 생산 여부
인체는 L-lactate를 대사할 수 있지만, L-lactate의 이성질체인 D-lactate를 대사할 수 없다. 유산균의 경우, L-lactate를 D-lactate로 변환하는 효소인 DL-lactate recamase를 가지고 있고, 유산균의 DL-lactate recamase 활성이 강한 경우, 유산균을 섭취하는 신생아, 어린아이 및 선천성 단장증후군환자에게 D-Lactate가 축적되어 산독증(acidosis)을 유발시킬 수 있다.
시험 균주를 37℃에서 24 hr 동안 배양한 후 상등액을 회수하고, D-lactate enzyme test kit(Megazyme, Ireland)를 사용하여 D-lactate 함량을 측정하였다. 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주는 D-Lactate를 생산하지 않는 것으로 확인되었다.
(7) 담즙산 분해능(Bile salt deconjugation) 평가
담즙산(Bile salt)은 지방을 유화시키고 lipase의 작용을 촉진하여 지방산 분해에 도움을 준다. 프로바이오틱스에 존재하는 담즙산 가수분해효소(bile salt hydrolase)는 담즙산(bile salt)로부터 프로바이오틱스를 보호하여 장내 정착을 늘리기도 하지만, 담즙산(bile salt)을 분해(deconjugation)시켜 담즙산(bile salt)의 지방 유화 기능을 없애기 때문에 지방산 분해를 어렵게 한다. 또한, 분해된 담즙산은 다른 장내 미생물의 대사에 의해 독성을 가진 2차 대사산물을 전환되며, 이는 잠재적으로 위험성을 가질 수 있다.
0.5% TDCA(taurodeoxycholic acid)가 첨가된 MRS 한천 배지에 시험 균주를 도말하고, 혐기 조건 및 37℃에서 48 hr 동안 배양한 후, 콜로니 주변에 불투명한 하얀색 콜로니의 형성 여부를 관찰였다. 하얀색 콜로니가 형성되면 양성으로 판단한다. 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주는 하얀색 콜로니가 형성되지 않았고 음성으로 판정되었다.
하기 표 2에 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주 및 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MJM60662 균주의 프로바이오틱스 특성 및 안전성 검증 결과를 정리하였다.
평가 항목 Streptococcus salivarius MJM61033 Lactobacillus gasseri MJM60662
Adhesion rate to Caco-2 cell (%)
 13.75 23.57
OGI transit
(Log10 CFU/mL)		 Initial 8.19 8.91
Oral stress 8.26 8.23
Gastric stress 7.59 7.35
Intestinal stress 7.74 7.35
Hemolytic activity - -
D-lactate production - -
Bile salt deconjugation - -
Bioamine production L-Phenylalanine - -
L-Lysine - -
L-Ornithine - -
L-Histidine - -
L-Tyrosine - -
Antibiotics susceptibility* Chloramphenicol 2 4
Ampicillin 1 0.25
Tetracycline 0.5 2
Vancomycin 0.5 128 (R)
Gentamycin 4 4
Kanamycin 8 32 (R)
Streptomycin 4 16
Erythromycin 0 0.25
Clindamycin 0 4 (R)
* R : resistant
(8) 장내 유해균에 대한 항균 활성 평가
선발된 2종의 균주인 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주 및 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MJM60662 균주의 항균 활성을 평가하기 위해 인간, 동물 또는 음식에서 기인되는 병원균인 Salmonella typhi KCTC 2514, Salmonella chloeraesuis KCTC 2932, Pseudomonas aeruginosa KCCM 11802, Salmonella gallinarum KCTC 2931, Escherichia coli O1 KCTC 2441 등을 사용하였다.
선발된 2종의 균주를 각각 MRS 배지에 접종하고 37℃에서 24 hr 동안 배양하였다. 이후, 배양액 50 ㎕를 8 ㎜ 직경의 필터 페이퍼 디스크(filter paper disk)에 로딩하고 건조하였다. 이후, 필터 페이퍼 디스크를 유해 미생물이 1×106 CFU/㎖ 농도로 도포된 MRS 한천 플레이트 상에 위치시키고 37℃에서 배양한 후 저해 구역을 확인하여 항균 활성을 평가하였다. 하기 표 3에 선발된 2종의 균주인 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주 및 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MJM60662 균주의 항균 활성 평가 결과를 요약하였다.
병원균 Diameter of Zone Inhibition (mm)
Streptococcus salivarius MJM61033 Lactobacillus gasseri MJM60662
Salmonella gallinarum KCTC 2931 6 6
Salmonella chloeraesuis KCTC 2932 6 4
Salmonella typhi KCTC 2514 6 6
Escherichia coli K99 8 8
Escherichia coli O1 KCTC 2441 8 6
Escherichia coli 0138 6 6
Escherichia coli ATCC 25922 8 8
Pseudomonas aeruginosa KCCM 11802 4 4
상기 표 3에서 보이는 바와 같이 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주는 다양한 병원균에 대해 항균 활성을 보였고, 특히 병원성 대장균에 대해 강한 항균 활성을 보였다.
4. 선발된 균주의 퓨린 화합물 이용성 및 세포증식 실험
최소 배지인 DM 배지에 Adenine, Adenosine, AMP(adenine monophosphate), Guanine, guanosine, GMP(guanosine monophosphate), hypoxanthine, inosine, IMP( inosine monophosphate)를 각각 400 μM 농도로 첨가하여 세포증식 실험용 배지를 준비하였다. 또한, 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드와 같은 퓨린 화합물이 첨가되지 않은 DM 배지를 대조군(Control)으로 사용하였다. 이후, 세포증식 실험용 배지에 시험 균주를 2×108 CFU/㎖의 양으로 접종하고 37℃에서 혐기 조건을 유지하면서 배양하였다. 배양 시간에 따른 시험 균주의 증식 여부를 스펙트로포토미터를 이용하여 OD 650 nm에서 측정하였다.
도 2는 본 발명의 실시예에서 선발된 2종의 균주인 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주 및 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MJM60662 균주를 퓨린 화합물이 존재하는 배지에서 배양하였을 때의 증식 특성을 나타낸 그래프이다. 도 2에서 보이는 바와 같이 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주는 adenine, adenosine, AMP, guanosine, guanine, hypoxanthine, inosine, IMP를 생장에 이용하는 것으로 확인되었고, 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MJM60662 균주는 adenine, adenosine, AMP, GMP, inosine, IMP를 생장에 이용하는 것으로 확인되었다. 균주별로 생장에 사용하는 핵산의 종류가 다른 것을 알 수 있다.
5. 고요산혈증 동물모델을 이용한 선발된 균주의 고요산혈증 개선 효능 평가(In-vivo test)
(1) 실험 방법
7주령 된 C57BL/6 수컷 마우스(공급사 : 라온바이오)에 물과 사료를 자유롭게 공급하고 22±2℃, 습도 55±5% 및 명암 주기(light-dark cycle) 12 hr 단위의 사육실 환경하에서 1주일 동안 적응시켰다. 1주일 동안의 적응기를 거친 마우스들을 정상군(Control Group), 음성대조군(Hyperuricemia Group), Allopurinol 처리군(Allopurinol Gooup), Lactobacillus gasseri MJM60662 처리군(MJM60662 Group), Streptococcus salivarius MJM61033 처리군(MJM61033 Group)과 같이 총 5개의 군(n=8)으로 나누고, 정상군(Control Group)에는 기본식이(제품명 : AIN-93M; 공급사 : 라온바이오; L-cystine 1.8 g, Corn starch 150 g, Sucrose 90 g, Dextrose 60, Cellulose 50 g, Soybean oil 40 g, t-Butylhydroquinone 0.008 g, AIN-93M mineral mix 35 g, AIN-93 Vitamin mix 10 g, Choline bitartrate 2.5 g; 1㎏ 기준)를 14일 동안 제공하고, 정상군을 제외한 나머지 군의 마우스들에게 고퓨린함량 식이를 14일 동안 제공하여 고요산혈증을 유도하였다. 상기 고퓨린함량 식이는 기본식이(제품명 : AIN-93M; 공급사 : 라온바이오)에 효모 추출물을 첨가한 것으로서 고퓨린함량 식이 1 ㎏ 기준으로 효모 추출물 함량은 570 g이다. 기본적으로 마우스 같은 설치류들은 요산을 분해할 수 있는 유리케이즈(uricase)라는 효소를 만들어 혈액 내에 요산 수치를 감소시킨다. 이를 막기 위해 음성대조군(Hyperuricemia Group), Allopurinol 처리군(Allopurinol Gooup), Lactobacillus gasseri MJM60662 처리군(MJM60662 Group), Streptococcus salivarius MJM61033 처리군(MJM61033 Group)에 potassium oxonate 용액을 potassium oxonate 기준 300 mg/kg B.W. 용량으로 14일 동안 매일 1회 복강주사 투여하였다. 또한, Allopurinol 처리군에는 Allopurinol을 비히클(vehicle)인 식염수에 용해시킨 후 Allopurinol 기준 5 mg/kg B.W. 용량으로 14일 동안 매일 1회 경구투여하였다. 또한, Lactobacillus gasseri MJM60662 처리군에는 Lactobacillus gasseri MJM60662 균체를 식염수에 현탁한 후 3×109 CFU/mouse 용량으로 14일 동안 매일 1회 경구투여하였다. 또한, Streptococcus salivarius MJM61033 처리군에는 Streptococcus salivarius MJM61033 균체를 식염수에 현탁한 후 3×109 CFU/mouse 용량으로 14일 동안 매일 1회 경구투여하였다. 한편, 정상군 및 음성대조군에는 약물 시료 대신 비히클(vehicle)로 사용한 식염수를 경구투여 하였다.
(2) 혈장 분석
약물 시료를 마지막으로 투여한 다음날인 15일차에 마우스를 이소플로렌으로 마취시킨 후 심장에서 700 ㎕를 채혈하였다. 채혈된 샘플을 원심분리하여 혈장을 수득하고 수득한 혈장을 -80℃에서 보관하면서 이후의 분석에 사용하였다. 혈액분석기(FUJIFILM DRI-CHEM NX500i)를 이용하여 요산, 크레아티닌 및 요소질소(Urea nitrogen)의 함량을 측정하였다. 또한, 잔틴산화효소 활성 분석 키트(MAK078-1 KIT; Sigma-Aldrich)를 이용하여 잔틴산화효소(xanthine oxidase, XO) 수준을 분석하였다.
도 3은 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 혈중 요산 함량을 분석한 결과이다. 도 3에서 보이는 바와 같이 음성대조군(Hyperuricemia Group)에서는 혈중 요산 수치가 정상군(Control Group) 대비 약 1.8배 증가되었고, 이는 고요산혈증 동물모델이 확립되었음을 의미한다. 또한, Allopurinol 처리군(Allopurinol Gooup), Lactobacillus gasseri MJM60662 처리군(MJM60662 Group) 및 Streptococcus salivarius MJM61033 처리군(MJM61033 Group)에서는 혈중 요산 수치가 음성대조군(Hyperuricemia Group) 대비 각각 50%, 28% 및 62% 감소하였다.
도 4는 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 혈중 잔틴산화효소(xanthine oxidase, XO) 수준을 분석한 결과이다. 잔틴산화효소(xanthine oxidase, XO)는 Hypoxantine을 xanthine으로, xanthine을 uric acid로 바꾸어 주는 효소로서 혈중 XO 수준이 높은 경우 요산의 양이 증가하게 된다. 도 4에서 보이는 바와 같이 음성대조군(Hyperuricemia Group)에서는 혈중 XO 수준이 정상군(Control Group) 대비 약 18% 증가하였다. 또한, Allopurinol 처리군(Allopurinol Gooup), Lactobacillus gasseri MJM60662 처리군(MJM60662 Group) 및 Streptococcus salivarius MJM61033 처리군(MJM61033 Group)에서는 혈중 XO 수준이 음성대조군(Hyperuricemia Group) 대비 각각 53%, 69% 및 68% 감소하였다.
도 5는 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 혈중 크레아티닌 함량을 분석한 결과이다. 도 6은 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 혈중 요소질소(Urea nitrogen)를 분석한 결과이다. 혈중 크레아티닌(Creatinine)과 요소질소(BUN)는 신장 독성을 확인하는 표적물질로서 그 수치가 높을 경우 신장에 독성을 일으킬 수 있다. 도 5 및 도 6에서 보이는 바와 같이 Lactobacillus gasseri MJM60662 처리군 및 Streptococcus salivarius MJM61033 처리군은 모두 정상군과 비슷한 혈중 크레아티닌(Creatinine)과 요소질소(BUN) 수치를 보여 상기 유산균이 체내에 미치는 신장 독성은 없는 것으로 확인되었다.
도 3 내지 도 6의 결과에 의할 때 Streptococcus salivarius MJM61033 균주는 고요산혈증 개선 효능이 Allopurinol 및 Lactobacillus gasseri MJM60662보다 더 높은 것으로 나타났다.
(3) 신장 분석
약물 시료를 마지막으로 투여한 다음날인 15일차에 채혈을 마치고 난 후 경추탈골로 마우스를 희생시키고 장을 분리한 후 바로 신장을 적출하였다. 적출한 신장을 세척하고 4% 파라포름알데히드 용액에 고정시키고 이후 paraffin 포매 및 Hematoxylin & eosin(H&E) 염색한 후 조직을 관찰하였다. 또한, 신장 사구체(glomerulus) 형태 변화와 비대 수준을 정량화하기 위해 신장 사구체 이미지를 20개의 이미지로 분할하고 CaseViewer(3DHISTECH)의 draw closed polygon tool을 이용하여 면적을 계산하였다.
도 7은 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 적출한 신장의 조직을 Hematoxylin & eosin(H&E) 염색한 후 관찰한 사진이다. 도 7에서 보이는 바와 같이 고요산혈증이 유도된 음성대조군에서는 신장 사구체의 모양이 찌글어지고 경계가 불규칙적으로 변하는 등 신장 손상이 발생하였다. 반면, Streptococcus salivarius MJM61033 처리군은 정상군과 유사한 형태의 신장 이미지를 보였다.
도 8은 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 적출한 신장 사구체 다발 면적을 분석한 결과이다. 도 8에서 보이는 바와 같이 음성대조군 (Hyperuricemia group)에서는 고요산 유도로 인해 신사구체가 비대해지고 면적이 증가하였다. 반면, Streptococcus salivarius MJM61033 처리군에서의 신장 사구체 다발 면적은 정상군과 거의 같으며, 나머지 군에서는 신장 사구체 다발 면적이 정상군보다 높게 나타났다. 결론적으로 Streptococcus salivarius MJM61033은 마우스에 고요산혈증을 유도할 때 신장의 형태학적 변화를 최소화하고 신장의 기능을 정상적으로 유지시키는 효과를 가진다고 볼 수 있다.
또한, 적출한 신장에서의 mOAT1(Mouse organic anion transporter 1), mOAT3(Mouse organic anion transporter 3) 및 mURAT1(Mouse urate transporter 1)의 mRNA 발현 수준을 RT-PCR을 이용하여 측정하였다. OAT1과 OAT3는 신장에서 요산의 배출에 관련된 단백질이며, URAT1은 신장에서 요산 재흡수와 관련된 단백질이다. 도 9는 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 적출한 신장에서 mOAT1(Mouse organic anion transporter 1)의 mRNA 발현 수준을 분석한 결과이다. 도 10은 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 적출한 신장에서 mOAT3(Mouse organic anion transporter 3)의 mRNA 발현 수준을 분석한 결과이다. 도 11은 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 적출한 신장에서 mURAT1(Mouse urate transporter 1)의 mRNA 발현 수준을 분석한 결과이다. 도 9 내지 도 11에서 보이는 바와 같이 Streptococcus salivarius MJM61033 처리군 및 Lactobacillus gasseri MJM60662 처리군에서는 요산 배출과 관련된 OAT1과 OAT3의 발현이 증가되고, 요산 재흡수와 관련된 단백질의 발현이 감소하는 것을 확인 할 수 있다. Streptococcus salivarius MJM61033 투여를 통해 요산 배출과 요산 재흡수에 관련된 유전자의 발현이 조절되고 혈중 요산 농도가 개선되는 것으로 볼 수 있다.
(4) 소장 분석
약물 시료를 마지막으로 투여한 다음날인 15일차에 채혈을 마치고 난 후 경추탈골로 마우스를 희생시키고 장을 분리한 후 소장을 적출하였다. 적출한 소장을 세척하고 알리샨 블루 염색(Alcian blue stain) 후 조직을 관찰하였다. 또한, 적출한 소장에서의 밀착연접단백질(tight junction protein) 유전자의 mRNA 발현 수준을 RT-PCR을 이용하여 측정하였고, 밀착연접단백질(tight junction protein)의 발현량을 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다.
도 12는 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 적출한 소장의 조직을 알리샨 블루 염색(Alcian blue stain) 후 관찰한 사진이다.
도 13은 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 적출한 소장에서 밀착연접단백질인 ZO-1 및 Occludin의 mRNA 발현 수준을 분석한 결과이다. 도 14는 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 적출한 소장에서 밀착연접단백질인 ZO-1 및 Occludin의 발현량을 분석한 결과이다. 도 12 내지 도 14에서 보이는 바와 같이 정상군에서 촘촘하고 가지런하고 두툼한 소장의 융모 구조가 음성 대조군 (Hyperuricemia group)에서는 느슨해지고 얇아지는 경향을 나타났다. Allopurinol처리군에서는 소장의 이런 파괴 현상이 회복되지 못하였지만 Streptococcus salivarius MJM61033 처리군에서는 융모구조가 가지런해지고 두터워지는 것을 확인할 수 있다. 이는 Streptococcus salivarius MJM61033 균주의 투여로 장 벽의 온전성이 개선됨을 나타낸다. Occludin, ZO-1 단백질은 장벽 상피세포의 치밀이음부에 존재하는 주요 접합분자로 상피세포의 극성을 유지하고 세포사이를 통과하는 물질의 이동을 차단하는 역할을 하는 단백질이다. 소장조직에서 Occludin, ZO-1 단백질들의 양과 mRNA 발현량을 검증한 결과, 음성 대조군 (Hyperuricemia group)에서는 단백질량과 mRNA 발현량이 크게 감소함을 알 수 있다. 하지만 Streptococcus salivarius MJM61033 처리군에서는 관련 단백질과 mRNA의 발현량이 증가되는 것을 확인 할 수 있다. 양성 대조군인 Allopurinol group에서는 발현이 증가 하지 않았다. 이러한 결과는 Streptococcus salivarius MJM61033 균주 투여로 장벽 상피세포의 치밀이음부의 구조가 회복되고 이로 인해 장벽의 온전성이 회복되었을 가능성을 시사한다.
(5) 대변 분석
약물 시료를 마지막으로 투여한 다음날인 15일차에 채혈을 마치고 난 후 경추탈골로 마우스를 희생시키고 장을 분리한 후 장내에 있는 대변을 튜브에 모은 후 -80℃에서 보관하면서 이후의 분석에 사용하였다.
장내 미생물 군집을 분석하기 위해 Exgen Stool DNA Mini Kit(GeneAll)를 이용하여 대변 샘플에서 DNA를 추출하고 16S rRNA 유전자의 V3-V4 영역을 증폭시킨 후 16S-기반 Microbial Taxonomic Profiling platform인 EzBioCloud Apps(ChunLab Inc., Republic of Korea)를 이용하여 Microbiome profiling을 수행하였다.
도 15는 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 장내 미생물 군집 분석 결과를 문(Phylum) 수준에서 나타낸 것이다. 도 16은 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 장내 미생물 군집 분석 결과를 과(Family) 수준에서 나타낸 것이다. 도 17은 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 장내 미생물 군집 분석 결과를 Firmicutes/Bacteroidetes (F/B) 비로 나타낸 것이다. 도 18은 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 장내 미생물 군집 분석 결과를 Clostridia vadinBB60 group과 Oscillospiraceae의 상대적 풍부성으로 나타낸 것이다. 도 19는 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 장내 미생물 군집 분석한 결과를 Shannon index에 의해 표시되는 Alpha-diversity로 나타낸 것이다. 도 20은 본 발명의 실시예에서 고요산혈증 동물모델을 이용하여 선발된 2종의 균주(Lactobacillus gasseri MJM60662, Streptococcus salivarius MJM61033)의 고요산혈증 개선 효능 평가 실험(In-vivo test)을 진행하였을 때 15일차 실험군별 장내 미생물 군집 분석한 결과를 Beta-diversity로 나타낸 것이다. 도 15 내지 도 20에서 보이는 바와 같이 정상군보다 음성대조군 (Hyperuricemia group)에서 Bacterroidetes의 비율이 증가하고 Firmicutes의 비율이 크게 감소하였다. 또한, 음성대조군 (Hyperuricemia group)에서는 butyric acid 등 short chain fatty acid의 생산성과 관련된 Clostridia vadin BB60 group와 Oscillospiraceae 균주의 비율이 감소하였다. Streptomyces salivariums MJM61033 처리군에서는 Firmicutes의 비율이 회복되고 Clostridia vadin BB60 group와 Oscillospiraceae 균주의 비율이 증가하는 것을 확인 할 수 있다. 또한, Streptomyces salivariums MJM61033 처리군에서는 음성대조군 (Hyperuricemia group)에서 변화되었던 균총 다양성 (α-diveristy, β-diversity)가 회복되는 것을 확인할 수 있다. Streptomyces salivariums MJM61033 균주 투여를 통해 고요산증과 관련된 장내 균총의 불균형이 회복되어 고요산증이 개선되었음을 확인할 수 있다.
6. MJM61033 균주의 동정 및 기탁 정보
혈중 요소 저감 활성, 잔틴산화효소(xanthine oxidase) 억제 활성 및/또는 신장 손상 억제 활성이 가장 우수한 MJM61033 균주를 분자생물학적인 방법으로 동정하였다. MJM61033 균주로부터 genomic DNA isolation kit를 사용하여 유전체 DNA를 분리하고 이를 주형으로 한 PCR을 진행하여 16S ribosomal DNA를 증폭하였다. 이 때 PCR primer로는 범용 프라이머인 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 1492R(5'-GTTACCTTGTTACGACTT-3')을 사용하였다. 증폭된 DNA를 클로닝(cloning) 하여 염기서열을 분석한 결과, MJM61033 균주의 16S rDNA는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것으로 나타났다. MJM61033 균주의 16S rDNA를 Ezbiocloud 데이터베이스(ChunLab Inc., Seoul, South Korea)에서 표준 균주의 16S rDNA와 비교하여 유사성을 탐색하고, Clustral X를 사용하여 다수 균주의 연관관계 있는 서열을 배치하였고, MEGA X 소프트웨어를 사용하여 계통분류학적 비교분석을 한 후 이웃 종과의 진화관계 트리를 만들었다. 그 결과, MJM61033 균주의 종은 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius)로 판명되었다. 도 21은 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주의 계통분류학적 비교분석 결과를 나타내는 진화관계 트리이다.
또한, 본 발명의 발명자들은 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주를 2022년 11월 18일에 공인기탁기관인 국립농업과학원 미생물은행(Korean Agricultural Culture Collection, KACC; 주소 : 대한민국 전라북도 완구군 이서면 농생명로 166)에 부다페스트 조약에 의거한 국제특허기탁을 진행하여 수탁번호 KACC 81243BP를 부여받았다. 상기 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주(수탁번호 : KACC 81243BP)는 부다페스트 조약에 규정된 절차 내에서 제3자에게 분양될 수 있다.
이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
농촌진흥청 국립농업과학원 미생물은행(KACC) KACC81243BP 20221118

Claims (12)

  1. 퓨린(purine) 분해 활성을 가지는 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주(수탁번호 : KACC 81243BP).
  2. 제1항에 있어서, 혈중 요소 저감 활성, 잔틴산화효소(xanthine oxidase) 억제 활성 또는 신장 손상 억제 활성에서 선택되는 적어도 2개 이상의 활성을 더 갖는 것을 특징으로 하는 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주(수탁번호 : KACC 81243BP).
  3. 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주(수탁번호 : KACC 81243BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 고요산혈증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주(수탁번호 : KACC 81243BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 고요산혈증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  5. 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주(수탁번호 : KACC 81243BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 고요산혈증 관련 대사 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 고요산혈증 관련 대사 장애는 통풍, 통풍성 발적, 통풍성 관절염, 통풍성 신결석증 또는 통풍성 신병증 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  7. 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주(수탁번호 : KACC 81243BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 고요산혈증 관련 대사 장애 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  8. 제7항에서, 상기 고요산혈증 관련 대사 장애는 통풍, 통풍성 발적, 통풍성 관절염, 통풍성 신결석증 또는 통풍성 신병증 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
  9. 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주(수탁번호 : KACC 81243BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는, 요산에 의해 유발되는 신장 손상 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 삭제
  11. 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) MJM61033 균주(수탁번호 : KACC 81243BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는, 요산에 의해 유발되는 신장 손상 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  12. 삭제
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