KR20170058197A - 항 노로바이러스 활성을 갖는 락토바실러스 속 균주 및 이를 포함하는 항바이러스 조성물 - Google Patents
항 노로바이러스 활성을 갖는 락토바실러스 속 균주 및 이를 포함하는 항바이러스 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 노로바이러스의 증식을 억제시키는 락토바실러스 속 균주, 및 상기 균주를 포함하는 항바이러스 조성물, 노로바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 또는 노로바이러스(norovirus) 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 노로바이러스의 증식을 억제시키는 락토바실러스 속 균주, 및 상기 균주를 포함하는 항바이러스 조성물, 노로바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 또는 노로바이러스(norovirus) 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
노로바이러스는 바이러스성 장염을 유발하는 대표적인 원인균으로, 주로 오염된 음식이나 지하수를 통해 전파되며 그 감염력이 매우 높은 것으로 알려져 있다. 식품 위해 병원체 노로바이러스는 선진국의 경우 비세균성 장염의 90% 이상 발병원인으로 알려져 있으며, 전 세계 모든 연령층에 발생하는 식중독의 주요 원인이다.
미국 질병관리본부 2011년 1월 보고에 따르면, 식중독 원인 가운데 노로바이러스가 46%로 1위를 차지하고 있으며, 노로바이러스 식중독 발생 시설은 장기요양원이 가장 높았고, 식당, 선박 및 학교 순으로 나타나 노로바이러스 식중독은 주로 집단급식 시설에서 발생함을 알 수 있다. 미국에서 매년 미국인 6명 중 1명에 해당하는 4천8백만 명이 식중독에 걸리고, 128,000명이 입원하며 3,000명이 사망하며, 이러한 사망 환자의 90%는 노로바이러스 병원체에 의한 것이다(CDC December 15, 2010).
우리나라의 경우, 노로바이러스 식품 위해 환자 수는 계속적으로 증가하여 2006년 이후 신종플루 영향을 받은 2009년을 제외하고는 전체 식중독 환자 대비 약 30%를 차지하며, 병원성 대장균과 함께 집단급식소 식중독 발생의 주요 원인체로 집계되고 있다.
노로바이러스 식중독은 감염된 환자의 토사물, 분변 및 신체접촉에 의한 것이며 식수 및 어패류, 과일, 채소 등 즉석섭취가 가능한 식품이 오염된 경우 10 내지 100개의 작은 입자로도 질병을 일으킬 수 있으며, 입자가 매우 작아 공기 중에 에어로졸 형태로 부유하기 때문에 집단감염이 급속도로 발생하여 공중보건학상 큰 위협이 되고 있다. 노로바이러스 식중독 발생 시설은 장기요양원이 가장 높았고, 식당, 선박 및 학교 순으로 나타나 노로바이러스 식중독은 주로 집단급식 시설에서 발생함을 알 수 있다.
또한, 노로바이러스는 건조하고 기온이 낮은 겨울철에 생존할 수 있는 바이러스로 물리·화학적으로 안정한 구조를 가지고 있어 실온에서 10일, 10 해수 등에서 30 내지 40일 동안 생존할 수 있으며, 영하 20 이하의 조건에서도 장기간 생존할 수 있다.
구체적으로, 노로바이러스는 단일 가닥(single strand) 양성(positive) RNA 바이러스로서 7.5 kb RNA 게놈(genome)을 갖고 있으며, 3개의 주된 ORF 중에서 ORF2와 ORF3가 캡시드(capsid) 단백질 유전정보를 갖고 있다. ORF2와 ORF3는 각각 VP1, VP2를 발현하며, VP1은 주요 캡시드(major capsid) 단백질로 바이러스 캡시드 어셈블리(capsid assembly)에 관여하며, VP2의 기능은 아직까지 불확실하며, 이는 노로바이러스는 다양한 유전형(genotype) 종류를 갖고 있지만, 여러 세포주(strain)에 대한 연구가 아직까지 제한적인 것은 그만큼 바이러스 세포배양이 어렵기 때문이다.
비타민 A는 점막면역에 필수적인 영양소로 박테리아 감염으로 인한 장염 등을 예방하는데 효과적이라고 알려졌으며, 비타민 A로 인한 RIG-1와 MDA5 수용체의 활성화가 바이러스 감염으로 인한 면역반응에 중요한 역할을 한다. 최근 사람을 대상으로 실시된 역학 연구를 통해 비타민 A의 섭취가 노로바이러스로 인한 장염 발병과 줄이는 효과를 보였고, 또한 다양한 싸이토카인의 변화를 유도하였다. 하지만, 그 메커니즘은 아직까지 확실히 밝혀지지 않았다.
장내 미생물의 군집변화는 비만 등의 대사질환뿐만 아니라 자가면역질환, 감염등 다양한 질병과 밀접한 연관이 있음이 최근 연구를 통해 밝혀졌다. 이는 최근 NGS (Next-generation sequencing) 기법을 이용하여 환경에 존재하는 미생물을 신속하고 고효율으로 파악할 수 있어 가능해졌다. 이 중에서, 락토바실러스는 대표적인 프로바이오틱으로, 유산 분비를 통한 유해균의 억제로 다양한 병원성 미생물의 예방 및 치료에 이용되고 있다.
사람에게 실제로 장염을 유발하는 노로바이러스는 다양한 유전형을 가지고 있어 아직까지 치료제 및 백신이 개발되지 못하고 있고, 환경에 존재하는 노로바이러스를 저감하기 위해 사용 가능한 물리 화학적 방법은 대부분 UV, 오존, TiO2 등으로 사람에게는 매우 치명적이기에 적용하기는 불가능하다. 그러므로 이미 노로바이러스로 감염된 사람에게는 안전하게 사용하여 저감 할 수 있는 방법이 보건학적으로 매우 중요하다.
그러나 환경에 존재하는 노로바이러스를 UV나 TiO2 등의 물리 화학적 방법을 이용하여 효과적으로 저감할 수 있으나 감염된 사람에게 적용하기는 불가능하여 현재까지 전파는 막는 예방법이 최선이며, 식중독 치료와 관련하여 항생제(antibiotic drug)는 박테리아로 인한 식중독을 치료함에 있어서 탁월한 효과를 발휘하지만 바이러스성 식중독에는 치료효과가 없으며, 특히 바이러스로 인한 식중독의 주된 원인이 되는 노로바이러스의 감염을 예방할 수 있는 백신 또는 치료제가 아직 개발되지 않은 실정이다.
본 발명의 목적은 항 노로바이러스 활성을 갖는 락토바실러스 속 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주의 균체, 상기 균주 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 노로바이러스(norovirus)에 대한 항바이러스 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주의 균체, 상기 균주 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 노로바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주의 균체, 상기 균주 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 노로바이러스(norovirus) 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래 기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력하여, 항 노로바이러스 활성을 갖는 락토바실러스속 균주, 예를 들면 락토바실러스 루미니스 SNUG001(Lactobacillus ruminis SNUG001), 락토바실러스 류테리 SNUG50382(Lactobacillus reuteri SNUG50382) 및 락토바실러스 람노수스 SNUG50070(Lactobacillus rhamnosus SNUG50070) 를 선택하고, 이들 락토바실러스 속 균주가 노로바이러스의 증식을 저감하는 것으로 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 일 구현예는 항 노로바이러스 활성을 갖는 락토바실러스 속 균주에 관한 것이다. 상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 루미니스 SNUG001 (Lactobacillus ruminis SNUG001), 락토바실러스 류테리 SNUG50382 (Lactobacillus reuteri SNUG50382) 또는 락토바실러스 람노수스 SNUG50070 (Lactobacillus rhamnosus SNUG50070) 균주일 수 있다. 또한, 상기 락토바실러스 속 균주는 사람의 장 내 균총에서 분리된 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예는 항 노로바이러스 활성을 갖는 락토바실러스속 균주의 균체, 상기 균주 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 노로바이러스(norovirus)에 대한 항바이러스 조성물에 관한 것이다. 상기 항바이러스 조성물은 노로바이러스의 증식과 복제를 저해함으로써 항바이러스 활성을 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예는 항 노로바이러스 활성을 갖는 락토바실러스 속 균주의 균체, 상기 균주 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 노로바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예는 항 노로바이러스 활성을 갖는 락토바실러스 속 균주의 균체, 상기 균주 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 노로바이러스(norovirus) 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다. 상기 식품은 식품 첨가제, 음료, 또는 음료 첨가제일 수 있다.
상기 노로바이러스 감염 질환은 장염, 식중독, 유행성 바이러스성 위장관염, 구역 구토, 근육통, 복통, 또는 설사일 수 있다.
상기 조성물에서, 균주의 균체, 상기 균주 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상은 0.00001 중량% 내지 100 중량% 로 포함될 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명은 항노로바이러스 활성을 갖는 락토바실러스 속 균주, 상기 균주의 균체, 상기 균주 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 노로바이러스(norovirus)에 대한 항바이러스 조성물, 노로바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 및 노로바이러스(norovirus) 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항노로바이러스 활성을 갖는 락토바실러스 속 균주는 예를 들면 항노로바이러스 효과가 있다고 알려진 비타민 A를 먹인 쥐에 노로바이러스를 감염시켰을 때 장내 미생물에서 중 락토바실러스가 유의하게 증가하였으며, 상기 증가된 락토바실러스속 균주를 선택하여 본 발명에 따른 항노로바이스 활성을 갖는 락토바실러스속 균주로 채택하였다. 본 발명에 따른 항노로바이스성 락토바실러스속 균주는 장내균총에서 유래될 것일 수 있다.
상기 항노로바이스성 락토바실러스속 균주는 노로바이러스의 증식과 복제를 저해함으로써 항바이러스 활성을 나타낼 수 있다. 구체적으로, 락토바실러스 속 균주가 노로바이러스의 저감 효과를 나타내는 지를 확인하기 위해 마우스 대식세포인 RAW264.7 세포를 이용하여 in vitro 실험을 실시를 수행한 결과, 락토바실러스 루미니스 SNUG001(Lactobacillus ruminis SNUG001) 균주를 처리한 경우 처리하지 않은 대조군(NC)에 비해 1000배 이상 노로바이러스의 증식이 감소하는 것을 확인하였고, 또한 대장균(E. coli), 바실러스 섭틸리스(B.subtilis ATCC6633)을 처리했을 때 보다 50배를 넘는 저감효과를 보인 것으로, 노로바이러스 저감 효과가 현저함을 확인할 수 있었다(도 7 참조).
본 발명의 일례에 따른 락토바실러스 속 균주는 노로바이러스의 증식과 복제를 저해함으로써 항바이러스 활성을 나타내므로, 항 노로바이러스 활성을 갖는 락토바실러스 속 균주의 균체, 상기 균주 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 노로바이러스(norovirus)에 대한 항바이러스 조성물을 제공할 수 있다.
상기 항바이러스 조성물은 상기 조성물이 적용되는 분야에서 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제 등을 더욱 포함할 수 있으며, 척추동물, 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류에 투여되는 의약 조성물의 형태 또는, 식기, 주방용품, 생활용품, 기타 각종 물건의 세척제, 소독제, 통상의 항바이러스제 등 통상적으로 알려진 모든 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 일 예에서, 상기 항 노로바이러스 활성을 갖는 락토바실러스 속 균주의 균체, 상기 균주 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 노로바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공될 수 있다.
본 발명의 일 예에서, 상기 항 노로바이러스 활성을 갖는 락토바실러스 속 균주의 균체, 상기 균주 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 노로바이러스(norovirus) 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물이 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 노로바이러스(norovirus)에 대한 항바이러스 조성물, 노로바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 노로바이러스(norovirus) 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 있어서, 락토바실러스 속 균주는 상술한 바와 같다.
상기 조성물의 유효성분인 락토바실러스 속 균주의 균체, 상기 균주 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상은 0.00001 중량% 내지 100 중량%, 0.001 중량% 내지 99.9 중량 %, 0.1 중량% 내지 99 중량 %, 더욱 바람직하게는 1 중량% 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
상기 락토바실러스 속 균주는 균주를 포함하거나, 균주를 포함하지 않는 cell-free 형태일 수 있다. 상기 파쇄물은 상기 락토바실러스 속 균주를 파쇄한 파쇄물 또는 상기 파쇄물을 원심분리하여 얻어진 상등액을 의미하는 것이다. 본 명세서에 있어서, 별도의 언급이 없는 한, 항바이러스성 락토바실러스 속 균주는 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 의미하는 것으로 사용된다.
상기 노로바이러스 감염 질환은 장염, 식중독, 유행성 바이러스성 위장관염, 구역 구토, 근육통, 복통, 또는 설사일 수 있다. 본 발명의 일례에 따른 락토바실러스 속 균주는 노로바이러스의 증식과 복제를 저해함으로써 항바이러스 활성을 나타내므로, 상기 노로바이러스 감염 질환을 치료, 개선 또는 예방할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구, 피부, 정맥, 근육, 피하 등의 경로로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 경구로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물을 인간에게 적용하는 구체예에 있어서,
본 발명의 항바이러스 조성물은 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제 등의 보조제를 추가로 함유하는 것일 수 있다.
상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 보다 상세하게, 상기 담체는 결합제, 활탁제, 현탁용제, 가용화제, 완충제, 보존제, 윤활제, 등장제, 부형제, 안정화제, 분산제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연고제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 또는 경피제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물을 비경구용으로 제공하는 경우, 일 예로 액제, 겔(gel)제, 세정 조성물, 정제, 좌제 형태, 크림, 연고, 드레싱 용액, 분무제, 기타 도포제 등의 국소 투여제, 용액형, 현탁형, 유제형 등의 액상 제형일 수 있으며, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제, 크림, 연고, 젤리, 거품, 또는 세척제, 바람직하게는 액제, 겔(gel)제, 세정 조성물 등의 피부 외용제가 포함될 수 있다. 상기 제형은 일 예로 멸균수에 용해보조제, 유화제, pH 조절을 위한 완충제 등을 첨가하여 제조할 수 있다.
상기 비수성용제 또는 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다. 예컨대, 유효성분 함량을 기준으로 1일 투여량이 0.1 내지 500 ㎎/kg, 바람직하게는 0.5 내지 300 ㎎/kg일 수 있다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 투여량이 높거나 낮을 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물의 1일 투여량이 상기 투여 용량 미만이면 유의성 있는 효과를 얻을 수 없으며, 그 이상을 초과하는 경우 비경제적일 뿐만 아니라 상용량의 범위를 벗어나므로 바람직하지 않은 부작용이 나타날 우려가 발생할 수 있으므로, 상기 범위로 하는 것이 좋다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따른 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 있어서, 식품이란 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서의 식품, 식품 첨가제, 건강 기능성 식품, 음료 및 음료 첨가제 등을 모두 포함하는 의도이다. 본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함하는 의도이다.
상기 식품 조성물에 함유된 유효성분으로서의 락토바실러스 속 균주의 함량은 식품의 형태, 소망하는 용도 등에 따라 적절하게 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 전체 식품 중량의 유효성분인 락토바실러스 속 균주의 균체, 상기 균주 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상은 0.00001 중량% 내지 100 중량%, 0.001 중량% 내지 99.9 중량 %, 0.1 중량% 내지 99 중량 %, 더욱 바람직하게는 1 중량% 내지 50 중량%, 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있다. 예를 들어, 식품 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
상기 음료는 필수 성분으로서 상기 락토바실러스 속 균주를 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한은 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 식품 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 노로바이러스의 증식을 억제시키는 락토바실러스 속 균주 및 이를 포함하는 항바이러스 조성물은 노로바이러스 증식 억제 활성이 있어 약학 조성물 및/또는 건강기능식품 등의 다양한 형태로 사람이 섭취하여 노로바이러스로 인한 감염 질환의 예방, 치료 및/또는 개선에 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 레티노산 투여 및 노로바이러스 감염에 의한 장내 미생물군집 다양성의 차이를 보여주는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 레티노산 투여 및 노로바이러스 감염에 의한 장내 미생물군집의 상대적인 비율을 보여주는 그래프이다.
도 3는 본 발명의 일 실시예에 따라 레티노산 투여 및 노로바이러스 감염에 의한 장내 미생물 중 락토바실러스의 상대적인 비율을 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리한 락토바실러스 루미니스 SNUG001 (Lactobacillus ruminis SNUG001)의 동정결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리한 락토바실러스 류테리 SNUG50382 (Lactobacillus reuteri SNUG50382)의 동정결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리한 락토바실러스 람노수스 SNUG50070 (Lactobacillus rhamnosus SNUG50070)의 동정결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 의한 락토바실러스 속 균주의 항 노로바이러스 활성 평가 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 레티노산 투여 및 노로바이러스 감염에 의한 장내 미생물군집의 상대적인 비율을 보여주는 그래프이다.
도 3는 본 발명의 일 실시예에 따라 레티노산 투여 및 노로바이러스 감염에 의한 장내 미생물 중 락토바실러스의 상대적인 비율을 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리한 락토바실러스 루미니스 SNUG001 (Lactobacillus ruminis SNUG001)의 동정결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리한 락토바실러스 류테리 SNUG50382 (Lactobacillus reuteri SNUG50382)의 동정결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리한 락토바실러스 람노수스 SNUG50070 (Lactobacillus rhamnosus SNUG50070)의 동정결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 의한 락토바실러스 속 균주의 항 노로바이러스 활성 평가 결과를 보여주는 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 장내 미생물 균총 변화 관찰
노로바이러스에 대한 항바이러스 활성을 평가하기 위해, 인체 노로바이러스의 대체물로서 쥐노로바이러스를 이용하여 장내 미생물 군집에서의 락토바실러스의 변화 및 노로바이러스이 저감효과를 확인하였다.
1-1. 시료 준비
ICR 마우스(KOATECH, 한국) 에 비타민 A의 활성물질인 레티노산(retinoic acid)(R-2625; Sigma-Aldrich)을 corn oil에 첨가하여 1mg/kg/day로 8일간 경구 투여 후, 7번째 날, 인체 노로바이러스의 대체물인 MNV-1(Dr. Herbert W. Virgin , Washington University School of Medicine)을 5 x 106 PFU로 위관 영양법을 통해 경구 투여하여 감염시켰다.
감염 3일 후, 장내 균총 분석을 위해 마우스의 맹장시료를 적출하였다. 맹장 시료는 균질기(PT-200 E; POLYTRON)로 균질화 시켰으며, PowerBead Tube(MOBio Laboratories Inc.)를 이용하여 파쇄하였다. 그 다음, QIAamp DNA Stool Mini Kit(Qiagen)과 QIAcube system(Qiagen)을 사용하여 total DNA를 추출하였다.
1-2. 시료 DNA의 증폭 및 서열분석
상기 추출된 시료 DNA를 Earth Microbiome Project의 16S rRNA Amplification 프로토콜에 따라 증폭시켰다. 각 시료의 16S rRNA유전자를 하기 표 1에 기재된 515F/806R 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였고, V4 region을 사용하여 tagging PCR을 수행하였다.
| Primer | 서열 (5'-3') | 서열 번호 |
| 515F forward | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATGGTAATTGTGTGCCAGCMGCCGCGGTAA | 1 |
| 806R reverse | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNNNNNAGTCAGTCAGCCGGACTACHVGGTWTCTAAT | 2 |
상기 프라이머의 염기서열 중, "N"은 A, C, G 또는 T 중에서 선택된다. "M"은 A 또는 C 중에서 선택된다. "H"는 A, C 또는 T 중에서 선택된다. "V"는 A, C 또는 G 중에서 선택된다. "W"는 A 또는 T 중에서 선택된다.
증폭된 PCR산물은 UltraClean PCR clean-up Kit(Mobio Laboratories Inc.)를 사용하여 정제하였고, Miseq Reagent Kit V3 (600cycles)와 Miseq platform(Illumina)로 16S rRNA의 부분 유전자의 서열을 분석하였다.
1-3. 16S rRNA 서열정보에 기초한 장내 균총 변화분석
그 다음, Miseq platform에서 얻은 BCL 파일을 CASAVA-1.8.2를 이용하여 FASTQ 파일로 변환하여, quality filtering과 trimming 과정을 거쳤다. QIIME 1.7.0 소프트웨어를 이용하여 기존 유전 정보 데이터베이스와 97% 이상 일치하는 유전자만 선택하였고, 이후, 그룹 간 alpha-diversity, beta diversity, taxonomic abundance, 및 LEfSe 분석을 실시하였다. 그 결과를 표 2 및 도 1 내지 3에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, unweighted PCoA 분석 결과보다 weighted 결과에서 다양성의 차이가 높은 것을 확인하였다. 이는 계통학적인 미생물군집의 다양성에는 큰 차이가 없었으나, 실제로 존재하는 미생물 다양성에서는 큰 차이가 나타났음을 의미한다. 본 결과에서는, 비타민 A를 섭취하면서 쥐노로바이러스에 감염되었을 때 그렇지 않은 군에 비해 존재하고 있는 미생물군집의 다양성에 유의한 변화가 일어났음을 알 수 있었으며, 항노로바이러스 효과가 있다고 알려진 비타민 A를 섭취하면서 쥐노로바이러스를 감염시켰을 때, 쥐노로바이러스만 감염시켰을 때와 달리 장내 미생물 군집 다양성의 변화가 일어나는 것을 확인함으로써, 장내미생물 군집의 변화가 쥐노로바이러스 저감에 중요한 역할을 하고 있다고 예상할 수 있었다.
또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, LDA 점수가 3인 이상인 미생물 중 락토바실러스균의 비중이 전체 장내 미생물 가운데 유의하게 증가한 것을 확인하였다.
| RA | MNV | Relative abundance (%) |
| - | + | 1.2%(±0.5) |
| + | + | 10.3%(±10.2) |
| - | - | 6.7%(±3.1) |
또한, 도 3 및 이를 수치화한 상기 표 2에 나타낸 배와 같이, 레티노산을 처리하지 않고 MNV만 처리한 마우스의 장내 균총에서 락토바실러스 속 균이 차지하는 비율이 5%가 안 되었지만, 레티노산을 처리하고 MNV를 감염시킨 마우스에서 두 배 이상 증가한 약 10%의 abundance를 보임을 확인하였다. 즉, 전혀 처리하지 않은 음성대조군에서는 락토바실러스가 6.7%(±3.1)이었고, 쥐노로바이러스를 감염시켰을 때는 1.2%(±0.5)로 감소하였으나, 비타민 A를 투여하면서 쥐노로바이러스를 감염시켰을 때는 10.3%(±10.2)로 증가하였다.
실시예 2. 균주의 동정
생후 3개월 된 영아의 분변시료를 서울삼성병원을 통해 제공받아, 선택 배지(TOS-propionate agar medium; 43314 Transgalactosylated oligiosaccharide agar medium, Fluka)에 시료를 선조 접종하여 37℃ 혐기성 환경에서 48시간 배양 후 colony picking으로 순수 배양하여 균을 분리하였다. 그 다음, 분리된 균주 중 항바이러스 효과(antiviral effect)를 가진 균주를 선별하여 동정하였다.
구체적으로, 균주를 각각 37℃ CO2 배양기에 혐기성 환경에서 하루 배양한 후, 4℃에서 13,000rpm으로 원심분리를 수행하여 균주만 수득하였다. 그 다음, 용해 버퍼(pH10; 2.5M Nacl, 100mM EDTA, 10mM Trizma base, 1% Triton X-100) 25ul에 균주 pellet 0.2ul을 넣고 95℃에서 10분간 열처리를 하여 template를 얻었다. 그 후 G-Taq PCR kit를 사용하여 중합효소 연쇄반응으로 16S rRNA의 V4region을 증폭시켜 PCR 산물을 수득하였다. 사용한 프라이머의 염기서열은 하기 표 3에 나타내었다.
| Primer | 서열 (5'-3') | 서열 번호 |
| 27F forward | AGAGTTTGATCMTGGCTCAG | 3 |
| 492R reverse | TACGGYTACCTTGTTACGACTT | 4 |
상기 프라이머의 염기서열 중, "M"은 A 또는 C 중에서 선택된다. "Y"는 C 또는 T 중에서 선택된다.
그 다음, PCR 산물을 Ultra Clean PCR clean-up Kit(Mobio Laboratories Inc.)을 사용하여 정제하였고, ㈜마크로젠(sequencing@macrogen.com)에 유전자 서열분석을 의뢰하여 균주를 동정하였다.
그 결과를 도 4 내지 도 6에 나타내었으며, 그 결과, 상기 동정된 균체들이 신규한 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 균주임을 확인하고, 상기 균주를 각각 락토바실러스 루미니스 SNUG001 (Lactobacillus ruminis SNUG001), 락토바실러스 류테리 SNUG50382 (Lactobacillus reuteri SNUG50382), 락토바실러스 람노수스 SNUG50070 (Lactobacillus rhamnosus SNUG50070) 균주로 명명하였다.
그 다음, 상기 균주를 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture)에 기탁하고, 수탁번호 KCTC18370P (Lactobacillus ruminis SNUG001, 2015.05.26. 기탁), KCTC18428P (Lactobacillus reuteri SNUG50382, 2015.11.18. 기탁), KCTC18427P (Lactobacillus rhamnosus SNUG50070, 2015.11.18. 기탁)를 부여 받았다.
실시예 3. 항 노로바이러스 활성 확인
실시예 2에서 얻어진 락토바실러스 속 균주가 노로바이러스의 저감 효과를 나타내는지를 확인하기 위해 마우스 대식세포인 RAW264.7 세포를 이용하여 in vitro 실험을 실시하였다.
구체적으로, 락토바실러스 속 균주인 락토바실러스 루미니스 (Lactobacillus ruminis), 락토바실러스 류테리 SNUG50382(Lactobacillus reuteri SNUG50382) 및 락토바실러스 람노수스 SNUG50070(Lactobacillus rhamnosus SNUG50070)를, 각각 37℃ CO2 배양기에 혐기성 환경에서 하루 배양한 후 OD 값을 측정하여 1x106 CFU/ml를 준비하였다.
그 다음, RAW264.7에 쥐노로바이러스를 0.01 MOI로 1시간 동안 감염시킨 후, 준비한 락토바실러스 균주를 각각 처리하였다. 균의 급속 성장을 막고 처리 당시의 농도를 유지하기 위해 배지에 gentamycin(100ug/ml)을 처리하였다. 24시간 후 쥐노로바이러스를 plaque assay 방법을 통해 정량 분석을 실시하여 그 저감 효과를 확인하였다. 그 결과를 하기 표 4 및 도 7에 나타내었다.
| 균주 | Murine norovirus (log of PFU) |
| NC (대조군) | 0 |
| E.coli | -1.58804601120659 |
| B.subtilus | -0.59362798780896 |
| L.ruminis | -3.72729128064649 |
| L.reuteri | -3.16007623524189 |
| L.rhamnosus | -3.89748808917292 |
상기 표 4 및 도 7에서 확인할 수 있듯이, 락토바실러스 루미니스 SNUG001(Lactobacillus ruminis SNUG001) 균주를 처리한 경우 처리하지 않은 대조군(NC)에 비해 1000배 이상 노로바이러스의 증식이 감소하는 것을 확인하였고, 또한 대장균(E. coli), 바실러스 섭틸리스(B.subtilis ATCC6633)을 처리했을 때보다 50배를 넘는 저감 효과를 보인 것으로, 노로바이러스 저감 효과가 현저함을 확인하였다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation
<120> Lactobacilli having anti-norovirus activity and antiviral
composition compromising the same
<130> DPP20152777KR
<160> 7
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 515F forward
<220>
<221> variation
<222> (50)
<223> M is 'A' or 'C'
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact atggtaattg tgtgccagcm gccgcggtaa 60
60
<210> 2
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 806R reverse
<220>
<221> variation
<222> (25)..(36)
<223> N is 'A', 'C', 'G' or 'T'
<220>
<221> variation
<222> (56)
<223> H is 'A', 'C' or 'T'
<220>
<221> variation
<222> (57)
<223> V is 'A', 'C' or 'G'
<220>
<221> variation
<222> (61)
<223> W is 'A' or 'T'
<400> 2
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nnnnnnagtc agtcagccgg actachvggt 60
wtctaat 67
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 27F forward
<220>
<221> variation
<222> (12)
<223> M is 'A' or 'C'
<400> 3
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 492R reverse
<220>
<221> variation
<222> (6)
<223> Y is 'C' or 'T'
<400> 4
tacggytacc ttgttacgac tt 22
<210> 5
<211> 1116
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lactobacillus ruminis SNUG001
<400> 5
attcaccgaa agaagcttag tggcgaacgg gtgagtaaca cgtaggcaac ctgcccaaaa 60
gagggggata acacttggaa acaggtgcta ataccgcata accatgaaca ccgcatgatg 120
ttcatgtaaa agacggcttt tgctgtcact tttggatggg cctgcggcgt attaacttgt 180
tggtggggta acggcctacc aaggtgatga tacgtagccg aactgagagg ttgatcggcc 240
acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac 300
aatggacgaa agtctgatgg agcaacgccg cgtgaatgaa gaaggccttc gggtcgtaaa 360
attctgttgt cagagaagaa cgtgcgtgag agtaactgtt cacgtattga cggtatctga 420
ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcgagcgtt 480
gtccggattt attgggcgta aagggaacgc aggcggtctt ttaagtctga tgtgaaagcc 540
ttcggcttaa ccgaagtagt gcattggaaa ctggaagact tgagtgcaga agaggagagt 600
ggaactccat gtgtagcggt gaaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaagc 660
ggctctctgg tctgtaactg acgctgaggt tcgaaagcgt gggtagcaaa caggattaga 720
taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg ttggagggtt tccgcccttc 780
agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact 840
caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg 900
cgaagaacct taccaggtct tgacatcttc tgacaattcc agagatggaa cgttcccttc 960
ggggacagaa tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcctgaa atgtttgggt 1020
taagtcccgc aacgagcgca acccttattg tcagttgcca tcattaaatt gggcactctg 1080
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<210> 6
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<213> Artificial Sequence
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<223> Lactobacillus reuteri SNUG50382
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tgtctggtct gcaactgacg ctgaggctcg aaagcatggg tagcgaacag gattagatac 720
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<210> 7
<211> 1367
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lactobacillus rhamnosus SNUG50070
<400> 7
aattttgaac gagtggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgccct taagtggggg 60
ataacatttg gaaacagatg ctaataccgc ataaatccaa aaaccgcatg gttcttggct 120
gaaagatggc gtaagctatc gcttttggat ggacccgcgg cgtattagct agttggtgag 180
gtaacggctc accaaggcaa tgatacgtag ccgaactgag aggttgatcg gccacattgg 240
gactgaaaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cacaatggac 300
gcaagtctga tggagcaacg ccgcgtgagt gaagaaggct ttcgggtcgt aaaactctgt 360
tgttggagaa gaatggtcgg cagaataact gttgtcggcg tgacggtatc caaccagaaa 420
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catgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatat ggaagaacac cagtggcgaa ggcggctgtc 660
tggtctgtaa ctgacgctga ggctcgaaag catgggtagc gaacaggatt agataccctg 720
gtagtccatg ccgtaaacga tgaatgctag gtgttggagg gtttccgccc ttcagtgccg 780
cagctaacgc attaagcatt ccgcctgggg agtacgaccg caaggttgaa actcaaagga 840
attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa 900
ccttaccagg tcttgacatc ttttgatcac ctgagagatc aggtttcccc ttcgggggca 960
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cgcccgtcac accatgagag tttgtaacac ccgaagccgg tggtcag 1367
Claims (15)
- 항 노로바이러스 활성을 갖는 락토바실러스 속 균주.
- 제1항에 있어서, 상기 균주는 락토바실러스 루미니스 (Lactobacillus ruminis) SNUG001 (수탁번호: KCTC18370P), 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) SNUG50382 (수탁번호: KCTC18428P) 또는 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) SNUG50070 (수탁번호: KCTC18427P)인 것인, 락토바실러스 속 균주.
- 항 노로바이러스 활성을 갖는 락토바실러스 속 균주의 균체, 상기 균주 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 노로바이러스(norovirus)에 대한 항바이러스 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 균주는 락토바실러스 루미니스 (Lactobacillus ruminis) SNUG001 (수탁번호: KCTC18370P), 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) SNUG50382 (수탁번호: KCTC18428P) 또는 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) SNUG50070 (수탁번호: KCTC18427P)인 것인, 항바이러스 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 조성물은 노로바이러스의 증식과 복제를 저해함으로써 항바이러스 활성을 나타내는 것인, 항바이러스 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 조성물은 항 노로바이러스 활성을 갖는 락토바실러스 속 균주의 균체, 상기 균주 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 0.00001 중량% 내지 100 중량% 로 포함하는 것인, 항바이러스 조성물.
- 항 노로바이러스 활성을 갖는 락토바실러스 속 균주의 균체, 상기 균주 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 노로바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 균주는 락토바실러스 루미니스 (Lactobacillus ruminis) SNUG001 (수탁번호: KCTC18370P), 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) SNUG50382 (수탁번호: KCTC18428P) 또는 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) SNUG50070 (수탁번호: KCTC18427P)인 것인, 약학 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 노로바이러스 감염 질환은 장염, 식중독, 유행성 바이러스성 위장관염, 구역 구토, 근육통, 복통, 또는 설사인 것인, 약학 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 조성물은 항 노로바이러스 활성을 갖는 락토바실러스 속 균주의 균체, 상기 균주 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 0.00001 중량% 내지 100 중량% 로 포함하는 것인, 약학 조성물.
- 항 노로바이러스 활성을 갖는 락토바실러스 속 균주의 균체, 상기 균주 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 노로바이러스(norovirus) 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 균주는 락토바실러스 루미니스 (Lactobacillus ruminis) SNUG001 (수탁번호: KCTC18370P), 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) SNUG50382 (수탁번호: KCTC18428P) 또는 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) SNUG50070 (수탁번호: KCTC18427P)인 것인, 식품 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 노로바이러스 감염 질환은 상기 노로바이러스 감염 질환은 장염, 식중독, 유행성 바이러스성 위장관염, 구역 구토, 근육통, 복통, 또는 설사인 것인, 식품 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 조성물은 항 노로바이러스 활성을 갖는 락토바실러스 속 균주의 균체, 상기 균주 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 0.00001 중량% 내지 100 중량% 로 포함하는 것인, 식품 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 식품은 식품 첨가제, 음료, 또는 음료 첨가제인 것인, 식품 조성물.
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|---|
| Korean Journal of Bacteriology. 2011, vol. 193, no. 18, p. 5034. * |
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