KR20150009015A - 콕사키 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 나타내는 비피도박테리움 아돌레센티스 spm1605 - Google Patents

콕사키 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 나타내는 비피도박테리움 아돌레센티스 spm1605 Download PDF

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Abstract

본 발명은 콕사키바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는 신규 유산균에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 콕사키바이러스 B3(Coxsackie virus B3; CVB3)에 대해 항바이러스 활성을 나타내는 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1605(Bifidobacterium adolescentis SPM 1605)에 관한 것이다.
본 발명에 의한 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1605(Bifidobacterium adolescentis SPM 1605)은 장내에서 분리된 유산균이면서도 콕사키바이러스 B3에 대해 우수한 항바이러스 활성을 나타냄에 따라 프로바이오틱스 등의 항바이러스 조성물에 응용할 수 있다.

Description

콕사키 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 나타내는 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1605 {Bifidobacterium adolescentis SPM 1605 having antiviral activity against Coxsackie virus}
본 발명은 콕사키바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는 신규 유산균에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 콕사키바이러스 B3(Coxsackie virus B3; CVB3)에 대해 항바이러스 활성을 나타내는 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1605(Bifidobacterium adolescentis SPM 1605)에 관한 것이다.
콕사키바이러스(Coxsackie virus)는 분류상 피코르나바이러스과(Picornaviridae)의 인간 장바이러스(human Enterovirus)로 single-stranded positive-sense RNA genome와 이를 둘러싼 네 개의 캡시드 단백질 (VP1-4)로 된 외피 미보유(non enveloped) 구조를 갖는다. 콕사키바이러스는 크게 콕사키바이러스 A와 B로 나뉘며(Pabbaraju et al. 2010) 다시 이들은 몇 개 유형으로 분류된다. 콕사키바이러스는 병인학적인 면에서 수족구병을 비롯한 다양한 질병에 관련되며(Yang et al. 2012) 이들 각각이 관여하는 질병의 사례 역시 다양하다고 알려져 있다.
콕사키바이러스 B3 감염의 스펙트럼들은 다양한 편으로 두드러진 증상이 없는 경증부터 심각한 사례까지, 환자군으로는 영아부터 소아, 성인에 이르기까지(Nielsen et al. 2012) 임상적으로는 위장관의 문제만이 아니라 간염, 뇌염, 급성 심부전(acute heart failure)부터 무균수막염(aseptic meningitis)까지도 나타날 수 있다. 특히 심장근육 관련 질환의 20~30%정도가 콕사키바이러스 B3와 관련이 있다는 보고도 있으며 콕사키바이러스에 의한 수막염의 증상은 우선 고열, 두통 뿐만 아니라 기침 콧물 같은 감기증상을 통해 나타나고, 특히 장바이러스이기 때문에 복통이나 설사를 유발하기도 하는 것으로 알려져 있다.
현재 유아와 소아에서 콕사키바이러스 B3감염은 사망률을 감소시키고 회복을 돕는 효과가 있는 항바이러스제인 플레코나릴(pleconaril)로 치료하고 있다. 플레코나릴은 바이러스 표면의 수용체에 우선적으로 결합해 숙주를 감염시키는데 필요한 캡시드 단백질의 기능을 저해해 바이러스의 복제를 억제하는 효과가 있으나 구조 일부가 변형된 내성 바이러스 사례가 보고되었다.(Ledford et al. 2005) 현재까지 콕사키바이러스 B3감염을 해소하기 위한 마땅한 백신과 치료제는 없는 상황으로 초기에 시도된 불활성화 또는 온도 민감성을 이용한 백신 개발은 성공을 거두지 못하고 있어 콕사키바이러스 B3를 제어하는 새로운 전략이 필요하다.
프로바이오틱스(Probiotics)는 건강에 유익한 효과를 주는 미생물로 정의되며, 특히 장내 환경에서 유해 세균 억제에 의해 질병의 예방 및 치료를 개선시키는 것으로 알려져 있었다. 그리고, 최근 몇몇 연구에서 프로바이오틱스가 인플루엔자 바이러스와 헤르페스 바이러스, 설사의 원인이 되는 콕사키바이러스, 로타바이러스(rotavirus)를 비롯한 장바이러스(enterovirus) 감염으로부터 보호해주는 항바이러스 활성을 갖는 것(Maragkoudakis et al. 2010)을 보여줬으며 바이러스성 호흡기 감염 사례 상당수에서도 위험성을 감소할 수 있다는 보고와 함께 HIV 감염과 호흡기계 감염에 대해 면역 보조효과를 기대하는 연구 역시 진행되고(Pang & Iwasaki, 2012) 있다. 그외에도 프로바이오틱스 중 하나인 B. longum이 콕사키 바이러스에 의해 유발된 심근염의 증상을 감소시킬 수 있다는 보고(Yu et al. 2011)가 나오는등 프로바이오틱스는 치료물질로의 잠재적 가치를 가진 것으로 여겨지고 있다.
본 발명은 콕사키바이러스를 프로바이오틱스에 의해 치료할 수 있는 콕사키바이러스에 대해 항바이러스 활성을 나타내는 신규한 유산균을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위해 콕사키바이러스에 항바이러스 활성을 나타내는 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1605(Bifidobacterium adolescentis SPM 1605)(KCTC 12417BP)을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 콕사키바이러스는 콕사키바이러스 B3(Coxsackie virus B3; CVB3)인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 의한 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1605 또는 이의 배양물을 유효성분으로 하는 콕사키바이러스 감염증의 치료 또는 예방용 약제학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 의한 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1605(KCTC 12417BP) 또는 이의 배양물을 유효 성분으로 하는 콕사키바이러스 감염증의 치료 또는 예방용 생균제 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 의한 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1605(KCTC 12417BP) 또는 이의 배양물을 유효 성분으로 하는 콕사키바이러스 감염증의 치료 또는 예방용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 의한 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1605(KCTC 12417BP) 또는 이의 배양물을 유효 성분으로 하는 콕사키바이러스 감염증의 치료 또는 예방용 의약외품 조성물을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 의약외품 조성물은 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 및 필터충진제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제조에 사용되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1605는 콕사키바이러스 B3에 대해 우수한 항바이러스 활성을 나타냄에 따라 콕사키 바이러스에 대한 항바이러스 조성물에 응용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 의하여 선별된 프로바이오틱스들의 헬라 세포(Hela cell)에 대한 세포독성을 관찰한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 의하여 선별된 유산균들의 콕사키바이러스 B3에 대한 항바이러스 활성을 관찰한 것이다.
이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이하의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 유산균 샘플 수집 및 시료 추출
채식위주의 식습관을 가진 건강한 한국인 청년의 소화관 미생물총으로부터 유산균을 분리하고 업계에 공지된 방법인 APIⓡ 50 CH kit를 사용하여 탄수화물 대사 능력을 알아보았으며, 분리해 낸 Bifidobacterium spp .의 level을 실험하기 위해 업계에 공지된 16S rRNA sequencing을 수행하여, 아래 표 1과 같이 9개의 B. adolescentis계통, 3개의 B. longum계통과 2 개의 B. pseudocatenulatum계통, 및 1개의 Bifidobacterium spp를 분리하였다.
Strains Origin
Kind Sex Age
Bifidobacterium adolescentis
SPM 0212 Human Female 21
SPM 0214 Human Female 21
SPM 0308 Human Female 22
SPM 1005 Human Male 25
SPM 1601 Human Male 20
SPM 1604 Human Male 20
SPM 1605 Human Male 20
SPM 1606 Human Male 20
SPM 1608 Human Male 20
상기 표 1과 같이 분리된 유산균은 general anaerobic medium (GAM)를 사용하여 Bactron Anaerobic Chamber에서 37℃, 혐기 상태로 48시간 동안 배양되었다.
배양된 유산균으로부터 유산균 시료 추출을 위하여 배양액을 4,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액과 균체를 분리, 수거하고 균체는 PBS로 한번 세척한 뒤 다시 PBS에 재현탁시킨 후 Sonicator를 이용하여 amplitude 100%, pulse on-60s, pulse off-60s, 6 cycle 조건으로 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄물과 배양 상등액은 0.45 ㎛ 사이즈의 실린지 필터로 여과한 뒤 여액을 실험에 사용하였다.
< 실시예 2> MTT 시험( MTT assay )
상기 실시예 1에서 제조된 유산균 추출물의 세포독성을 확인하고자 MTT assay를 실시하였다.
실험에 이용된 자궁경부암 세포주인 헬라 세포(Hela cell)는 10% FBS (Fetal Bovine Serum)와 10,000 Units/ml 페니실린과 10,000 ㎍/ml 스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Lonza, USA) 배지에서 5%의 CO2 농도로 맞추어진 배양기에서 배양하였다. 96-well plate를 이용하여 1 x 105 cells/well의 농도로 배양된 Hela 세포에 1 x 109 colony forming unit (CFU)의 세포 추출물을 처리하고 24시간 동안 배양한 후, MTT(5mg/ml) 를 well당 10ul 주입 후 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 DMSO 100 ul를 첨가하고 ELISA reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 결과를 도1로 나타내었다.
도 1에서 SPM 1605 는 세포 독성이 없다는 것을 알 수 있다.
< 실시예 3> 플라크 감소 시험( Plaque reduction assay )
상기 실시예 1에서 제조된 유산균 추출물을 콕사키바이러스에 처리하여 플라크 감소 시험을 통해 콕사키바이러스 저해 활성을 측정하였다.
콕사키바이러스 B3는 가톨릭대학교 남재환 교수님으로부터 분양 받은 virus를 사용하였으며, DMEM 배지를 이용하여 Hela 세포를 6-well에 단층으로 90 % 이상 키운 후, 콕사키바이러스 B3 100 ul와 유산균 세포 추출물 100 ul를 동시처리 후 37℃ 배양기에서 1시간 20분 동안 감염 시켰다.
이후 10% FBS가 포함된 DMEM(10% FBS)를 넣고 배양한 후, 세포 표면을 세척한 뒤 2X DMEM 배지에 1% 아가로스(agarose)를 넣고 4일 동안 배양하였다. 배양 후 메탄올과 아세트산을 3 : 1 로 혼합해 넣고 5분간 고정 후 한천(agar)을 제거하였다. 1% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색 후 관찰하여 결과를 도2로 나타내었다.
도 2에서 콕사키바이러스 B3에 대해 가장 높은 항바이러스 활성을 갖는 균주가 SPM 1605임을 확인할 수 있다.
이에 본 발명자는 상기 유산균을 '비피도박테리움 아돌레센티스 SPM 1605'라 명명하여 한국생명공학연구원 생물자원센터(주소:305-806 대전광역시 유성구 과학로 125)에 2013년 6월 7일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC 12417BP).
한국생명공학연구원 KCTC12417BP 20130607

Claims (7)

  1. 콕사키 바이러스에 대해 항바이러스 활성을 나타내는 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1605(Bifidobacterium adolescentis SPM 1605)(KCTC 12417BP).
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 콕사키바이러스는 콕사키바이러스 B3(Coxsackie virus B3; CVB3)인 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1605(KCTC 12417BP) 또는 이의 배양물.
  3. 제 1항에 의한 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1605(KCTC 12417BP) 또는 이의 배양물을 유효 성분으로 하는 콕사키바이러스 감염증의 치료 또는 예방용 약제학 조성물.
  4. 제 1항에 의한 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1605(KCTC 12417BP) 또는 이의 배양물을 유효 성분으로 하는 콕사키바이러스 감염증의 치료 또는 예방용 생균제 조성물.
  5. 제 1항에 의한 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1605(KCTC 12417BP) 또는 이의 배양물을 유효 성분으로 하는 콕사키바이러스 감염증의 치료 또는 예방용 식품 조성물.
  6. 제 1항에 의한 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1605(KCTC 12417BP) 또는 이의 배양물을 유효 성분으로 하는 콕사키바이러스 감염증의 치료 또는 예방용 의약외품 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 의약외품 조성물은 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 및 필터충진제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제조에 사용되는 것인 콕사키바이러스 감염증의 치료 또는 예방용 의약외품 조성물.
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