CN110699270A

CN110699270A - 阿孙链霉菌、其代谢产物、其制备方法及其杀蚊子的应用

Info

Publication number: CN110699270A
Application number: CN201810749226.XA
Authority: CN
Inventors: 陈良荣; 陈柏儒; 朱炯寰; 刘鲁垣; 许玉霖; 林正伟; 路光晖; 饶圣慈
Original assignee: Bion Tech Inc
Current assignee: Bion Tech Inc
Priority date: 2018-07-10
Filing date: 2018-07-10
Publication date: 2020-01-17
Anticipated expiration: 2038-07-10
Also published as: TW202005538A; CN110699270B

Abstract

本发明提供了阿孙链霉菌、其代谢产物、其制备方法及其杀蚊子的应用，具体是关于一种新颖的阿孙链霉菌，另提供一种制备阿孙链霉菌的代谢产物与代谢萃取物的方法，本发明另关于利用前述方法得到的代谢产物与代谢萃取物，两者皆具杀蚊子的能力，本发明另关于代谢产物与代谢萃取物在杀蚊子的应用，以及将该代谢产物制备成商业可利用的生物制剂，并提升杀蚊子的能力。

Description

阿孙链霉菌、其代谢产物、其制备方法及其杀蚊子的应用

技术领域

本发明涉及一种新颖菌株，特别是指经分离而得的阿孙链霉菌BT00008(Streptomyces abikoensis BT00008)。本发明另涉及一种制备方法，特别是指制备阿孙链霉菌代谢产物与代谢萃取物的方法。本发明另涉及一种代谢产物，特别是指由前述方法所获得的代谢产物。本发明另涉及一种应用，特别是指前述代谢产物用于杀蚊子的应用。

背景技术

随着全球暖化、气候变迁的加剧，病媒蚊造成的公共卫生问题对于全球人口生命安全与经济发展一直是严苛且迫切的议题，随之而来的登革热感染通常造成人类的高死亡率，严重打击经济与生活水准，因此病媒蚊的活动对于人类的政治经济和社会秩序息息相关。

在病媒防治上，化学药剂一直是传统防治病媒蚊的利器，但化学药剂长期喷洒对于人体健康、环境都造成伤害，同时也容易导致环境害虫的抗药性产生，对于防治策略的拟定，造成很严重的困扰，因此投入友善环境的新型杀蚊药剂开发，对于未来用药及病媒蚊的控制，将是一项高度挑战性的工作。

目前常见防治环境中蚊虫的方式为降低蚊子幼虫的族群数，常见的杀蚊药为除虫菊精类型与昆虫生长调节剂等化学合成药剂或苏力菌，施用于水中。前者化学药剂大量且长期地施用于环境中，极有可能造成害虫产生抗药性、对非标的生物的危害以及对环境的污染；后者苏力菌在常见以色列品系(Bacillus thuringiensis israelensis,Bti)的效果良好，实验结果发现，其杀虫结晶蛋白(insecticidal crystal protein,ICP)对蚊子幼虫毒性高，专一性强，其药效不会影响水沟内其余生物生态，但却可有效扑灭幼虫。但是，Bti的毒蛋白在阳光下容易失效，使用时最好选择阴天、傍晚或添加保护剂喷洒。另外，国外曾有研究文献指出长期以苏力菌毒蛋白喂养热带家蚊(Culex quinquefasciatus)，可能会诱发其抗性的产生。

有鉴于此，为克服病媒蚊的危害，同时又能将环境污染、对人体的损害降到最低，并能提供专一及环境友善性等特性，现有技术实有待改善的必要。

发明内容

为了克服现有技术的缺点，本发明的目的为提供一种制备阿孙链霉菌BT00008(Streptomyces abikoensis BT00008)代谢产物及代谢萃取物的方法、代谢产物、代谢萃取物及其应用，并建立含有所述代谢产物的生物制剂，具有杀蚊的应用，用于蚊虫的防治，具有良好的契机应用于环境用生物制剂发展的潜力。

为达到上述目的，本发明提供了一种阿孙链霉菌BT00008菌株，所述菌株寄存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO:M2018126，保藏日期：2018年03月8日，分类命名：阿孙链霉菌BT00008(Streptomyces abikoensis BT00008)。较佳的，本菌株是用于杀蚊子的应用。

本发明另提供一种制备阿孙链霉菌代谢萃取物的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：

将阿孙链霉菌以培养基发酵，获得代谢产物；

将代谢产物以乙酸乙酯萃取，获得代谢萃取物。

较佳的，所述将阿孙链霉菌以培养基发酵步骤中，培养基组成物包含，但不限于酪蛋白、酵母提取物、麦芽精、右旋葡萄糖、燕麦、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸铵、碳酸钙、可溶性淀粉、七水硫酸镁、七水硫酸亚铁、四水氯化锰、L-天冬酰胺、甘油、牛肉提取物、蛋白胨、柠檬酸铁铵、硫代硫酸钠、L-酪氨酸、胰水解蛋白、大豆胨、番茄提取物、柠檬酸氢二铵、硫酸锰、乙酸钠、脱脂牛奶蛋白(Skim Milk Protein,SMP)或其组合；更佳的，所述将阿孙链霉菌以培养基发酵步骤中，培养基组成物选自于由酪蛋白、酵母提取物、麦芽精、右旋葡萄糖、燕麦、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸铵、碳酸钙、可溶性淀粉、七水硫酸镁、七水硫酸亚铁、四水氯化锰、L-天冬酰胺、甘油、牛肉提取物、蛋白胨、柠檬酸铁铵、硫代硫酸钠、L-酪氨酸、胰水解蛋白、大豆胨、番茄提取物、柠檬酸氢二铵、硫酸锰、乙酸钠、脱脂牛奶蛋白(Skim MilkProtein,SMP)或其组合。

较佳的，所述将阿孙链霉菌以培养基发酵步骤中，培养基包含ISP2[International Streptomyces Project(ISP)medium NO.2]、ISP5[InternationalStreptomyces Project(ISP)medium NO.5]或LB(Lysogeny broth)；

较佳的，所述将阿孙链霉菌以培养基发酵步骤中，培养基包含1％至5％酪蛋白、1％至5％酵母提取物或其组合。

更佳的所述将阿孙链霉菌以培养基发酵步骤中，培养基包含1.5％酪蛋白、2％酪蛋白0.5％酵母提取物或其组合。

较佳的，所述将阿孙链霉菌以培养基发酵步骤中，培养基发酵的时间为3至7天；更佳的，所述将阿孙链霉菌以培养基发酵步骤中，培养基发酵的时间为5天。

较佳的，所述将该代谢产物以乙酸乙酯萃取步骤中，该代谢产物与乙酸乙酯的比例为3：1。

本发明另提供一种阿孙链霉菌的代谢产物，由上述方法获得。

本发明另提供一种上述代谢产物用于杀蚊子的应用。

较佳的，上述蚊子包含蚊科(Culicidae)。

更佳的，上述蚊子包含，但不限于埃及斑蚊(Aedes aegypti)、白线斑蚊(Aedesalbopictus)、阿氏斑蚊(Aedes alcasidi)、安氏斑蚊(Aedes annandalei)、带纹斑蚊(Aedes desmotes)、加氏斑蚊(Aedes gardnerii imitator)、马氏斑蚊(Aedes malikuli)、巴氏斑蚊(Aedes patriciae)或伪白线斑蚊(Aedes pseudalbopicta)。

本发明另提供一种阿孙链霉菌的代谢萃取物，由上述方法所获得。

本发明另提供一种上述代谢萃取物用于杀蚊子的应用。

本发明另提供一种生物制剂，包含上述的代谢产物以及药学上可接受的载剂。

较佳的，上述生物制剂为粉剂或液剂。

本发明的优点在于本发明提供一新颖的阿孙链霉菌与制备阿孙链霉菌的代谢产物与代谢萃取物的方法，将前述霉菌生物发酵以获得代谢产物；该代谢产物萃取以获得代谢萃取物，两者皆具杀蚊子的能力，并可用于杀蚊子的应用。将所述代谢产物制备成商业可利用的生物制剂，提升杀蚊子的能力，以达成利用微生物的代谢产物杀蚊子的功效。

附图说明

图1为不同培养基经阿孙链霉菌发酵后的杀蚊能力柱状图；

图2A-图2C为ISP2、ISP5及LB不同培养基于不同时间的杀蚊能力柱状图；图2A为ISP2培养基，图2B为ISP5培养基，图2C为LB培养基；

图3为LB培养基水层萃取物与代谢产物水层萃取物的杀蚊能力柱状图；

图4为LB培养基乙酸乙酯萃取物与代谢产物乙酸乙酯萃取物的杀蚊能力柱状图；

图5A-图5B为不同萃取物UV图谱；图5A为LB培养基水层萃取物的UV图谱，图5B为代谢产物水层萃取物的UV图谱；

图6A-图6B为不同萃取物UV图谱；图6A为LB培养基乙酸乙酯萃取物的UV图谱，图6B为代谢产物乙酸乙酯萃取物的UV图谱。

用于专利程序的微生物保存：

保藏日期：2018年03月8日；

保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；

保藏单位地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072；

保藏编号：CCTCC NO:M2018126；

分类命名：阿孙链霉菌BT00008(Streptomyces abikoensis BT00008)。

具体实施方式

以下配合附图及本发明的较佳实施例，进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段。

制备例1新颖阿孙链霉菌BT00008(Streptomyces abikoensis BT00008)菌株鉴定方法

本案新颖菌株为阿孙链霉菌BT00008(Streptomyces abikoensis BT00008)，是分离自土壤样本，再经细胞壁成分比对为Chemotype IC型，属于Streptomyces属，再依据16SrDNA序列比对结果判定为Streptomyces abikoensis，寄存于中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072)，保藏号为CCTCC NO:M2018126，保藏日期为2018年03月8日，以下为菌株的鉴定方法。

1.细胞壁成分鉴定

以常规的细胞壁鉴定方法鉴定本发明的阿孙链霉菌，鉴定方法为本领域的习知技术，于此不再详述。结果显示此菌株细胞壁含L-二氨基庚二酸(L-diaminopimelic acid,L-DAP)，全细胞含糖为葡萄糖(Glucose)、甘露糖(Mannose)及核糖(Ribose)，不含特殊糖类，根据Lechevalier等人的分类，属于Chemotype IC型，由此判断其为Streptomyces属。

2.培养特性分析

以习知霉菌常用的ISP培养平板(ISP medium agar)培养以分析此菌株的特性。在ISP2至ISP5培养平板环境下生长，其生长情形、营养菌丝(Substrate mycelia)颜色、气生菌丝(Aerial mycelia)颜色、产孢情形如表1所示，菌株在ISP4培养平板生长及产孢良好，在ISP2及ISP3培养平板生长及产孢中等，在ISP5培养平板生长中等但不产孢。营养菌丝及气生菌丝颜色如表1。此菌株在ISPl、ISP6及ISP7均不产生黑色素。

表1、霉菌培养特性分析

3.细菌菌株16S核糖体RNA(rRNA)鉴定法

萃取获得该阿孙链霉菌BT00008之总DNA，设计一对16S rDNA引物对：正向引物16SF1:5`-AGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAAC-3`(F：SEQ ID NO.1)及反向引物16SR1:5`-AAGGAGGTGATCCAGCCGCACCTTC-3`(R：SEQ ID NO.2)，进行聚合酶连锁反应(Poly chainreaction,PCR)，16S rDNA引物对所获得的产物长度为1514碱基对(base pair,bp)。增殖后的DNA产物进行核苷酸定序(DNA sequencing)，并以NCBI BLAST的程式进行线上基因库(GenBank)的查询与比对，以进行菌属鉴定。分离萃取的总DNA菌株经以16S rDNA引物对进行16S rDNA基因进行增幅后，综合细胞壁成分鉴定与培养特性分析，并参考伯杰氏系统细菌学手册(Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology)与EzTaxon-e资料库比对后，可认定此菌株的型态、生理及生化特性最接近阿孙链霉菌Streptomyces abikoensis(1514bp，SEQ ID NO.3，相似度达100％)。(agtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgaacgatgaagcccttcggggtggattagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggcaatctgccctgcactctgggacaagccctggaaacggggtctaataccggataygaccksysrmygcatskykgskggtggaaagctccggcggtgcaggatgagcccgcggcctatcagcttgttggtggggtgatggcctaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgaaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagcagggaagaagcgaaagtgacggtacctgcagaagaagcgccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggcttgtcgcgtcggatgtgaaagcccggggcttaaccccgggtctgcattcgatacgggcaggctagagttcggtaggggagatcggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcggatctctgggccgatactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgttgggaactaggtgtgggcgacattccacgtcgtccgtgccgcagctaacgcattaagttccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcagcggagcatgtggcttaattcgacgcaacgcgaagaaccttaccaaggcttgacatacaccggaaacggccagagatggtcgcccccttgtggtcggtgtacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtcctgtgttgccagcatgcccttcggggtgatggggactcacaggagactgccggggtcaactcggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatgccccttatgtcttgggctgcacacgtgctacaatggccggtacaatgagctgcgatgccgtgaggtggagcgaatctcaaaaagccggtctcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaagttggagttgctagtaatcgcagatcagcattgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcacgaaagtcggtaacacccgaagccggtggcccaacccttgtggagggagccgtcgaaggtgggactggcgattgggacgaagtcgtaacaaggtagccgtaccggaaggtgcggctggatcacctcctt)

制备例2制备阿孙链霉菌生长培养基

为进行种菌放大培养与最佳培养基测试，所需的培养基与培养平板配方如表2所示，其配制方式为所属领域的技术人员经通常的知识可以独立完成，因此不再赘述。

表2、培养基与培养平板

ISP 1

酪蛋白[Tryptone(Pancreatic Digest of Casein)]	5.0g
		酵母提取物(Yeast Extract)	3.0g
一次水(Distilled water)	1.0L
		pH	7.0±0.2

ISP 2

酵母提取物	4.0g
		麦芽精	10.0g
右旋葡萄糖	4.0g
		一次水	1.0L
pH	7.0±0.2

ISP 3

燕麦[Oatmeal(Quaker white oats)]	20.0g
		微量盐溶液1	1.0mL
一次水	1.0L
		pH	7.0±0.2

ISP 4

磷酸氢二钾(K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>)	1.0g
		七水硫酸镁	1.0g
氯化钠(NaCl)	1.0g
		硫酸铵[(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>]	2.0g
碳酸钙(CaCO<sub>3</sub>)	2.0g
		微量盐溶液1	1.0mL
可溶性淀粉(Starch)	10.0g
		一次水	1.0L
pH	7.0±0.2

ISP 5

L-天冬酰胺(L-Asparagine)	1g
		磷酸氢二钾	1g
微量盐溶液1	1mL
		一次水	1L
pH	7.0±0.2

ISP 5G

L-天冬酰胺	1g
		甘油(Glycerol)	10g
磷酸氢二钾	1g
		微量盐溶液1	1mL
一次水	1L
		pH	7.0±0.2

ISP 6

牛肉提取物[Beef extract(Peptic digest of animal tissue)]	15.0g
		蛋白胨(Proteose peptone)	5.0g
酵母提取物	1.0g
		柠檬酸铁铵(Ferric ammonium citrate)	0.5g
磷酸氢二钾	1.0g
		硫代硫酸钠(Sodium thiosulfate)	0.08g
一次水	1L
		pH	6.7±0.2

ISP 7

L-天冬酰胺	1.0g
		L-酪氨酸(L-Tyrosine)	0.5g
磷酸氢二钾	0.5g
		七水硫酸镁	0.5g
氯化钠	0.5g
		微量盐溶液2	1mL
甘油	15.0g
		一次水	1L
pH	7.3±0.2

TSB(Tryptic Soy Medium Broth)

胰水解蛋白(Tryptone)	17.0g
		大豆胨(Soytone)	3.0g
葡萄糖	2.5g
		氯化钠	5.0g
磷酸氢二钾	2.5g
		一次水	1.0L
pH	7.3±0.2

TSA(Tryptic Soy Medium Agar)

PDB(Potato Dextrose Broth)

番茄提取物(Potato Extract)	4.0g
		右旋葡萄糖	20.0g
一次水	1.0L
		pH	7.3±0.2

PDA(Potato Dextrose Agar)

番茄提取物	4.0g
		右旋葡萄糖	20.0g
琼胶	20.0g
		一次水	1.0L
pH	7.3±0.2

MRS

柠檬酸氢二铵(Diammonium hydrogen citrate)	2.0g
		磷酸氢二钾	2.0g
葡萄糖	20.0g
		硫酸镁	0.1g
硫酸锰(Manganous sulfate)	0.05g
		肉提取物(Meat extract)	5.0g
乙酸钠(Sodium acetate)	5.0g
		普遍蛋白胨(Universal peptone)	10.0g
酵母提取物	5.0g
		一次水	1.0L
pH	6.5±0.2

NB(Nutrient Broth)

牛肉提取物	3.0g
		蛋白胨	5.0g
一次水	1.0L
		pH	6.8±0.2

NA(Nutrient Agar)

NY(Nutrient Yeast Medium)

NB(Nutrient broth)	8.0g
		酵母提取物	5.0g
七水硫酸镁	1.0g
		一次水	1.0L
pH	7.4±0.2

LB[Miller(Luria-Bertani)]

胰水解蛋白	10.0g
		酵母提取物	5.0g
氯化钠	10.0g
		一次水	1.0L
pH	7.0±0.2

SMP20YE05

脱脂牛奶蛋白(Skim Milk Protein,SMP)	20.0g
		酵母提取物	5.0g
一次水	1.0L
		pH	7.0±0.2

微量盐溶液1：

七水硫酸亚铁(FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O)	0.1g
		四水氯化锰(MnCl<sub>2</sub>·4H<sub>2</sub>O)	0.1g
七水硫酸镁(MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O)	0.1g
		一次水	100mL

微量盐溶液2：

一水硫酸亚铁	1.36g
		二水氯化铜	0.027g
六水氯化钴	0.04g
		氯化锌	0.02g
硼酸	2.85g
		氯化亚锰	1.8g
酒石酸钾钠	1.77g
		一次水	100mL

实施例1不同培养基的杀虫效力试验

阿孙链霉菌菌株活化后，取其分生孢子悬浮液，经定量以1％的接种源浓度制备于100mL的不同培养基中，于30℃，200RPM进行培养，分别培养120小时后试验培养基的杀虫效果。试验的蚊子为埃及斑蚊品系，分别采卵、饲育幼虫、采蛹与饲育成虫，以提供试验的虫体。实验时，取5mL的待测液体加入含有30只三龄幼虫(孵化后三天)的45mL曝气逆渗透水中，控制组则加入该待测液体的培养基5mL于上述的45mL曝气逆渗透水中，以保鲜膜封口后于特定时间观察个试验组的死亡虫数。

结果如图1所示，图1为10倍稀释的经阿孙链霉菌发酵5天的培养基，于24小时、48小时与72小时观察其杀孑孓的能力，从13种培养基中挑选杀虫活性较佳的3种培养基，分别为LB、ISP2与ISP5，将此三种培养基以相同条件进行不同时间(3天、5天、7天)培养比较不同稀释浓度(5倍或10倍)下杀蚊的效果，结果如图2A-图2B，图2A所示，阿孙链霉菌于ISP2培养至第5天其杀蚊效果约为95％，培养时间延长至7天后，其杀蚊效果为70％。而如图2B所示，ISP5在5倍稀释下三种培养时间(3天、5天、7天)后的杀蚊效果皆约为90％左右，稀释至10倍后杀蚊效力约80％。

最后，以如图2C所示，LB培养基进行发酵以5倍稀释进行测试，杀蚊效力皆位于90％左右，尽管稀释至10倍，比较3天、5天、7天的发酵时间，皆维持90％以上的杀蚊效果，显示以此培养基的配方可能可以提供相对稳定链霉菌杀蚊的作用机制。

接着，将制备例1的阿孙链霉菌加入LB培养基进行发酵，发酵方法如上所述，获得一LB发酵液，将该LB发酵液进行埃及斑蚊成虫与幼虫的致死效果试验，经试验得知LB发酵液对于孑孓的LC50浓度应为原液稀释2,879.2倍。

实施例2阿孙链霉菌的代谢产物萃取与杀蚊功效

取制备例1所获得的阿孙链霉菌菌株BT00008，以LB培养基(表2)于5L发酵槽中进行发酵，设定搅拌速度200rpm、进气速率1vvm、槽压0.5kg/cm²、温度30℃，发酵时间120小时，获得一代谢产物。

阿孙链霉菌的代谢萃取物

取阿孙链霉菌的该代谢产物以真空浓缩机进行浓缩，每次浓缩时取300mL发酵液浓缩至10mL。将浓缩液加入一百倍体积甲醇萃取过滤杂质,再以减压浓缩干燥,获得一代谢产物甲醇萃取物,甲醇萃取物以十倍体积溶于水中,以等水体积的乙酸乙酯萃取，收集水层减压浓缩干燥，获得一代谢产物水层萃取物；收集乙酸乙酯层减压浓缩干燥，获得一代谢产物乙酸乙酯萃取物，以进行杀蚊主成分分析。

亦将空白的LB培养基以乙酸乙酯萃取，收集水层获得一LB培养基水层萃取物、收集乙酸乙酯层获得一LB培养基乙酸乙酯萃取物。如图3与图4所示，图3为比较LB培养基水层萃取物与代谢产物水层萃取物的杀蚊功效，从结果可得知在代谢产物水层萃取物浓度为100ppm时，施予蚊虫72小时有25％的杀蚊功效，相同浓度的LB培养基水层萃取物接近20％；图4为比较LB培养基乙酸乙酯萃取物与代谢产物乙酸乙酯萃取物的杀蚊功效，从结果可得知在代谢产物乙酸乙酯萃取物浓度为100ppm时，有50％的杀蚊功效，相同浓度的LB培养基乙酸乙酯萃取物接近20％，综以上述，有机层与水层皆存在杀虫物质。将有机层与水层以HPLC分离并以UV图谱分析。如图5A-图5B与图6A-图6B所示，于图5A-图5B的LB培养基水层萃取物与代谢产物水层萃取物两者图谱之间相似，但于图6A-图6B的代谢产物乙酸乙酯萃取物相对于LB培养基乙酸乙酯萃取物的图谱有所差异。

实施例3最适化培养基的调整

在生物活性的测试过程中发现，LB培养基具有影响阿孙链霉菌代谢产物活性的能力。因此，希望除去LB培养基本身的干扰，而找出最适化杀蚊与最佳化培养基的平衡点。LB培养基中的组成成分为胰水解蛋白、酵母提取物与氯化钠，试验设计以LB培养基为基底，额外添加等量各组成成分，或加入氮源(硫酸铵、磷酸氢二铵以及硝酸铵)以测试其经实施例2的方法将阿孙链霉菌BT00008发酵后的本实施例发酵液对埃及斑蚊三龄幼虫的死亡率。

试验结果如表3所示，LB培养基在去除氯化钠时，埃及斑蚊三龄幼虫的死亡率与原培养基相似，其他试验组三龄幼虫死亡率均下降，根据试验结果推测，LB培养基成分中的氯化钠浓度会影响对三龄幼虫的杀虫效果，后续培养基将根据此结果设计并调整培养基成分，以降低培养基本身毒杀效果的干扰。

表3、修改LB培养基的本实施例发酵液对埃及斑蚊三龄幼虫死亡率的影响：

如表4所示，在LB培养基中添加0.5％碳源，测试本实施例发酵液对埃及斑蚊三龄幼虫的死亡率。试验结果显示，若添加0.5％葡萄糖或0.5％甘油于LB培养基中，所得本实施例发酵液对埃及斑蚊三龄幼虫的死亡率结果相似。添加0.5％麦芽精或0.5％蔗糖，所得本实施例发酵液则有次佳的埃及斑蚊三龄幼虫死亡率。

此外，若加入0.5％表4的其他碳源如糊精、乳糖、及淀粉，则本实施例发酵液与LB培养基发酵液相较之下，失去生物活性并呈现显著差异。综合以上结果，推测添加的十种碳源配方对于阿孙链霉菌BT00008菌种发酵后所获得的代谢产物较无显著提升杀蚊效果。

表4添加单一碳源培养基的本实施例发酵液对埃及斑蚊三龄幼虫死亡率的影响：

如表5所示，在LB培养基中添加0.5％氮源，测试本实施例发酵液对对埃及斑蚊三龄幼虫的死亡率。试验结果显示，若添加0.5％蛋白胨、脱脂牛奶蛋白(skim milk protein,SMP)或酵母粉于LB培养基中，所得本实施例发酵液对埃及斑蚊三龄幼虫的死亡率的结果相似；若加入0.5％天冬酰胺、酪蛋白或是黄豆蛋白(soybean protein,SP)，则其发酵液与LB培养基发酵液相较之下，失去对埃及斑蚊三龄幼虫的杀虫效果且呈现显著差异。

表5、添加单一氮源培养基的本实施例发酵液对埃及斑蚊三龄幼虫死亡率的影响：

比较表4及表5，添加0.5％碳源或氮源，如提供氮源的蛋白胨、脱脂牛奶蛋白或酵母粉、以及提供碳源的葡萄糖与甘油添加于LB培养基中，其发酵液对埃及斑蚊三龄幼虫死亡率具有效果，对于发酵培养基成分的选择，再次设计不同组合的培养基配方，以期能提高发酵对埃及斑蚊三龄幼虫的杀虫能力，培养基修改配方与观察数据整理如表6。

如表6所示，11种修改配方在第48小时杀蚊能力明显不同，LB培养基添加不同比例甘油，其发酵液对埃及斑蚊三龄幼虫的死亡率随甘油浓度于培养基中比例提升而上升；酪蛋白+酵母提取物或脱脂牛奶蛋白(SMP)+酵母提取物对蚊虫死亡率亦有提升效果。第72小时观察结果更具显著差异性。上述观察结果发现至少有七种培养基具有更好的杀虫效果。

表6、LB添加配方的本实施例发酵液对埃及斑蚊三龄幼虫死亡率的影响：

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110> 百泰生物科技股份有限公司

<120> 阿孙链霉菌、其代谢产物、其制备方法及其杀蚊子的应用

<130> GAI18TW3798

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 16S rDNA foward primer

<400> 1

agtttgatcc tggctcagga cgaac 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 16S rDNA reverse primer

<400> 2

aaggaggtga tccagccgca ccttc 25

<210> 3

<211> 1514

<212> DNA

<213> Streptomyces abikoensis

<220>

<221> misc_feature

<222> (164)..(186)

<223> y is c or t; k is g or t; s is c or g; r is a or g and m is a or

c

<400> 3

agtttgatcc tggctcagga cgaacgctgg cggcgtgctt aacacatgca agtcgaacga 60

tgaagccctt cggggtggat tagtggcgaa cgggtgagta acacgtgggc aatctgccct 120

gcactctggg acaagccctg gaaacggggt ctaataccgg ataygaccks ysrmygcats 180

kykgskggtg gaaagctccg gcggtgcagg atgagcccgc ggcctatcag cttgttggtg 240

gggtgatggc ctaccaaggc gacgacgggt agccggcctg agagggcgac cggccacact 300

gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg 360

gcgaaagcct gatgcagcga cgccgcgtga gggatgacgg ccttcgggtt gtaaacctct 420

ttcagcaggg aagaagcgaa agtgacggta cctgcagaag aagcgccggc taactacgtg 480

ccagcagccg cggtaatacg tagggcgcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagag 540

ctcgtaggcg gcttgtcgcg tcggatgtga aagcccgggg cttaaccccg ggtctgcatt 600

cgatacgggc aggctagagt tcggtagggg agatcggaat tcctggtgta gcggtgaaat 660

gcgcagatat caggaggaac accggtggcg aaggcggatc tctgggccga tactgacgct 720

gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac 780

gttgggaact aggtgtgggc gacattccac gtcgtccgtg ccgcagctaa cgcattaagt 840

tccccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca 900

caagcagcgg agcatgtggc ttaattcgac gcaacgcgaa gaaccttacc aaggcttgac 960

atacaccgga aacggccaga gatggtcgcc cccttgtggt cggtgtacag gtggtgcatg 1020

gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg 1080

tcctgtgttg ccagcatgcc cttcggggtg atggggactc acaggagact gccggggtca 1140

actcggagga aggtggggac gacgtcaagt catcatgccc cttatgtctt gggctgcaca 1200

cgtgctacaa tggccggtac aatgagctgc gatgccgtga ggtggagcga atctcaaaaa 1260

gccggtctca gttcggattg gggtctgcaa ctcgacccca tgaagttgga gttgctagta 1320

atcgcagatc agcattgctg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1380

cgtcacgaaa gtcggtaaca cccgaagccg gtggcccaac ccttgtggag ggagccgtcg 1440

aaggtgggac tggcgattgg gacgaagtcg taacaaggta gccgtaccgg aaggtgcggc 1500

tggatcacct cctt 1514

Claims

1.一种阿孙链霉菌菌株，其特征在于，所述菌株寄存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018126。

2.一种根据权利要求1所述的菌株用于杀蚊子的应用。

3.一种制备阿孙链霉菌代谢萃取物的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：

将阿孙链霉菌以培养基发酵，获得代谢产物；

将代谢产物以乙酸乙酯萃取，获得代谢萃取物。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养基包含酪蛋白、酵母提取物、麦芽精、右旋葡萄糖、燕麦、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸铵、碳酸钙、可溶性淀粉、七水硫酸镁、七水硫酸亚铁、四水氯化锰、L-天冬酰胺、甘油、牛肉提取物、蛋白胨、柠檬酸铁安、硫代硫酸钠、L-酪氨酸、胰水解蛋白、大豆胨、番茄提取物、柠檬酸氢二铵、硫酸锰、乙酸钠、脱脂牛奶蛋白或其组合。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包含以培养基发酵，发酵的时间为3至7天。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述培养基选自LB、甘油、脱脂牛奶蛋白、1％至5％酪蛋白、1％至5％酵母提取物及其组合。

7.一种阿孙链霉菌的代谢产物，其特征在于，所述代谢产物由权利要求3中所述将阿孙链霉菌以培养基发酵所获得。

8.一种根据权利要求7所述的代谢产物用于杀蚊子的应用。

9.一种阿孙链霉菌的代谢萃取物，其特征在于，所述代谢萃取物由权利要求3中所述将代谢产物以乙酸乙酯萃取所获得。

10.一种根据权利要求9所述的代谢萃取物用于杀蚊子的应用。

11.一种生物制剂，其特征在于，所述生物制剂包含根据权利要求3中所述的代谢产物以及药学上可接受的载剂。

12.根据权利要求11所述的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂为粉剂或液剂。