CN114196595A

CN114196595A - 一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）及含有该菌株的土壤改良剂

Info

Publication number: CN114196595A
Application number: CN202111680408.4A
Authority: CN
Inventors: 麻林涛; 王莉
Original assignee: Henan Dr Ma Xiwanjia Biotechnology Co ltd
Current assignee: Henan Dr Ma Xiwanjia Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2041-12-30
Also published as: CN114196595B

Abstract

本发明“一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及含有该菌株的土壤改良剂”，涉及土壤改良技术，所述菌株的保藏号为CGMCC No.22965；其16SrRNA内具有Seq ID No.3所示的特征序列；其发酵产物可作为土壤脲酶促进剂、有机污染改良剂。

Description

一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）及含有该菌株的土壤改良剂

技术领域

本发明涉及土壤改良技术，特别是含有特定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株的土壤改良剂。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，为革兰氏阳性的好气性菌，普遍存在于土壤、植物体表以及在人体内。枯草芽孢杆菌菌体生长过程中会产生不同水平的多种代谢产物，比如枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽、α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、B族维生素等，一些优良菌种根据其特性被制成动物体(人体)益生菌、饲料添加剂、污水处理剂、生物肥发酵、土壤改良剂等产品，并得到广泛应用。

在土壤改良和调节方面，枯草芽孢杆菌的应用已经比较成熟，比如抑制农作物对硝态氮、重金属、农药的吸收，净化和修复土壤，降低农作物病害发生，促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用等。但是枯草芽孢杆菌制剂产品的品质和功效主要依赖于菌种本身的特性，筛选到好的菌种是提供优质产品的前提。菌种在传代过程中可能会发生退化、变异等，因此，有必要持续开发筛选优良菌种，作为枯草芽孢杆菌制剂产品提供候选材料。

发明内容

发明人在研发过程中偶然分离到一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，经试验检测发现其具理想的内切纤维素酶(CMCA)活力和滤纸酶(FPA)活力,其发酵液对多种土壤有害微生物具有抑制/溶菌作用，促进植物生长，并且对多环芳烃污染土壤中具有显著的净化作用，是优良的土壤改良剂候选微生物，因此将该分离菌株送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，据此请求保护一下技术方案：

本发明的第一方面，提供一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KC202015-6，保藏号为 CGMCC No.22965；其16SrRNA内存在Seq ID No.3所示的特征序列。

本发明的第二方面，提供一种含上述枯草芽孢杆菌及其代谢产物的发酵剂。

本发明的第三方面，提供上述发酵剂的制备方法，其特征在于

(1)将菌种进行斜面培养活化、再用无菌水冲洗斜面，形成菌悬液，

(2)在预装有1号液体培养基的容器中按照菌悬液与1号液体培养基的体积比1：20接种所述菌悬液，摇床培养8-10小时，培养条件为37摄氏度，180-220rpm的一级菌种液；

(3)将所述一级菌种液接种到预装有2号液体培养基的容器中进行扩繁，接种比例为体积比1:20；摇床培养8-10小时，培养条件为37摄氏度，180-220rpm的二级菌种液；

(4)将二级菌种液全部接种到预装有3号液体培养基的发酵罐中进行进一步发酵扩繁，接种比例为体积比1:20；发酵条件为：36-38摄氏度，罐压0.5kg/cm，通气量20立方/h，10-15 小时，得发酵剂；

所述斜面培养基配方为:海藻酸钠2g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾2g/L,氯化钠3g/L，牛肉膏5g/L，琼脂1.5％-2.0％，PH调至6.5-7.2。

所述1号液体培养基配方为:海藻酸钠2g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾1.5g/L,氯化钠3g/L，牛肉膏5g/L，PH调至6.5-7.2。

所述2号液体培养基:海藻酸钠2g/L，淀粉5g/L，蔗糖1g/L，酵母浸出汁0.2g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾1.5g/L，硫酸镁0.2g/L, 氯化钠5g/L，PH调至6.5-7.2。

所述3号液体培养基配方为:海藻酸钠5g/L，淀粉10g/L，蔗糖5g/L，酵母浸出汁0.1g/L，蛋白胨0.5g/L，豆饼粉10g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾2g/L，氯化钠5g/L，PH调至6.5-7.2。

本发明的第四方面，提供一种土壤改良剂，其特征在于，其活性成分为上述发酵剂。

本发明的第五方面，提供专门用于培养上述菌株的培养基：

斜面培养基:海藻酸钠2g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾2g/L,氯化钠3g/L，牛肉膏5g/L，琼脂1.5％-2.0％，PH调至6.5-7.2。

优选地，还包括一级扩繁液体培养基:海藻酸钠2g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾1.5g/L,氯化钠3g/L，牛肉膏5g/L，PH调至6.5-7.2。

优选地，还包括二级扩繁液体培养基:海藻酸钠2g/L，淀粉5g/L，蔗糖1g/L，酵母浸出汁0.2g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾1.5g/L，硫酸镁0.2g/L,氯化钠5g/L，PH调至6.5-7.2。

优选地，还包括三级扩繁液体培养基:海藻酸钠5g/L，淀粉10g/L，蔗糖5g/L，酵母浸出汁0.1g/L，蛋白胨0.5g/L，豆饼粉10g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾2g/L，氯化钠5g/L，PH调至6.5-7.2。

本发明从农田土壤分离鉴定到一株枯草芽孢杆菌KC202015-6，在分类鉴定中发现其16sRNA中存在一段碱基变异；对其进行酸性耐受性测试、产酶试验、土壤酶测试、农田污染物耐受性测试发现，该菌株具有良好酸性耐受能力、产纤维素酶活力强于同批后选菌株，能够显著正向刺激土壤脲酶活力(表3)，并且在土壤有机污染降解方面表现突出(表4，5，和图2，3)；可以作为土壤改良微生物，应用于土壤改良剂中，修复/调理农田土壤，提高农作物的产出和品质。

保藏信息：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101

保藏日期：2021年7月27日

菌株名称为：KC202015-6

保藏号为：CGMCC No.22965.

分类命名：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis

附图说明

图1.本发明所选菌株与两株已知枯草芽孢杆菌16S rRNA片段同源比对结果其中红框显示变异区域；

图2.土壤污染物菲吸附和降解功能测试结果

图3.土壤污染物苯并[a]芘吸附和降解功能测试结果

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明进行说明。

1.菌株的分离

将郑州工业区多处农田土壤进行取样，每处5-10g，那个样品装入一个三角瓶中，加入 200ml灭菌水，搅拌均匀后，震荡10分钟；然后在75-95摄氏度水浴锅中煮15-25分钟杀死土壤中其它微生物，确保仅存活芽孢杆菌的芽孢；自然冷却，然后用双蒸水进行梯度稀释；稀释液涂布于LB平板培养基上25-37摄氏度培养20-50小时，挑取形态一致的优势菌落进行纯培养，挑取单菌落进行分析、检测和筛选。

2.菌株发现和鉴定

2.1形态鉴定

观察菌落形态及革兰染色效果：

白色近似圆形，不透明，表面干燥没有光泽，中间褶皱边缘不整齐；革兰染色结果为阳性，在显微镜下观察芽孢为椭圆形，侧生、中生或近中生，孢囊膨大，游离芽孢一边比另一边厚(独木舟形)。

用PhoenixTM 100型全自动微生物分析仪对进行鉴定，参照《伯杰细菌鉴定手册》及仪器分析结果，初步鉴定确定本发明选出的菌株KC202015-6为枯草芽孢杆菌。

2.2 16S rRNA序列分析鉴定

16S rRNA序列扩增特异性引物如下，为委托合成：

正向引物Primer A 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(Seq ID No.1)，

反向引物Primer B：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′(Seq ID No.2)。

用TaKaRa^TM细菌基因组DNA提取试剂盒提取候选菌株的基因组DNA，以此为模板进行PCR扩增。

PCR反应体系(50μL)：TaKaRa LA-Taq 0.5μL，DNA模板2μL，10×PCR Buffer 5μL，dNTP Mixture 8μL，上、下游引物各2μL，双蒸水30.5μL。

PCR程序：94℃预变性5min，94℃30s，54℃30s，72℃1min，30个循环；72℃延伸7min。

PCR产物纯化后进行测序，测序结果通过NCBI数据库进行Blast比对分析。

结果表明：本发明选出的菌株KC202015-6的16S rRNA片段大小为1533bp，如SeqID No.3所示，将其与已知菌株Bacillus subtilis IAM 12118(登录号：NR_112116.2)的序列进行比对，相似性为99％；与B.subtilis AER314-2(登录号：KR967391.1)的序列进行比对，相似性为98％；比对结果如图1所示。

通过MEGA5.0软件分析进化关系，结果显示，KC202015-6与枯草芽孢杆亲缘关系最近确定为枯草芽孢杆。

在同源比对中发现，KC202015-6菌株的16S rRNA片段(Seq ID No.3)在其第194～217 碱基区间，存在显著变异，见图1。

对该分离菌株送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，菌株名称为：KC202015-6，保藏号为：CGMCC No.22965.

后续该菌株进行生化检测，未发现代谢、传代方面的异常，遂对其进行酸性耐受性测试、产酶试验、土壤酶测试、农田污染物耐受性测试。

3.菌株检测

3.1酸性耐受性试验

将受试芽孢杆菌菌悬液分别接种到pH为3.0、4.0、5.0的液体LB培养基中，使芽孢杆菌初始浓度约为1×10⁶cfu·mL^-1，37℃条件下120rpm摇床中培养1小时，取200μL涂布于LB固体培养基上，进行平板计数，计算存活率，每个试验重复3次。

本发明所选芽孢杆菌KC202015-6分别在pH 3.0、4.0、5.0条件下处理1h后的存活率分别是95.24％、97.15％和99.31％，说明有较好的酸性耐受能力。

3.2平板法胞外酶活性测定

挑选单菌落点种于纤维素酶筛选培养基(NaNO₃ 2g,K₂HPO₄ 1g,KCl 0.5g,MgSO₄0.5g, FeSO₄0.01g,CMC-Na 10g,琼脂10g,蒸馏水1000mL)37℃条件下培养48h后观察，如有透明圈则表示细菌产酶。计算水解圈与菌落直径的比值，其大小表示初筛酶活性。

结果如下表1所示，

表1菌株胞外酶活性初筛结果(水解圈与菌落直径比值平均值)

菌株	纤维素酶
		KC202015-6	4.95
候选菌株2	4.11
		候选菌株3	4.05
候选菌株4	3.58
		候选菌株5	3.75

结果显示，KC202015-6在产纤维素酶上呈现明显优势。

3.3发酵法测定胞外纤维素酶活性

3.3.1菌株发酵：

(1)将保存在斜面培的单菌落，划线接入斜面培养基，暗黑30-30摄氏度条件下培养 18小时，用无菌水冲洗斜面，形成菌悬液，作为原始菌液

3.3.2将发酵剂用4层纱布过滤，滤液在4℃，8000r/min条件下离心15min，上清液即为纤维素酶粗酶液。

按照国标(QB 2583.2003)相关方法对真菌M1的纤维素酶活性进行测定。按附录B所述方法，通过测定纤维素酶降解底物滤纸和羧甲基纤维素钠生成的还原糖来反映纤维素酶的总酶活力。酶活定义为1mL粗酶液在50摄氏度pH 6.0，1小时水解底物(滤纸或CMC-Na)，生成1ug葡萄糖还原糖为1个美国单位，以U/mL表示。采用二硝基水杨酸试剂测定产生的还原糖的量，具体如下：

取0.5mL的待测液加入25mL的比色管内，然后加入1.5mL浓度为1％的CMC柠檬酸缓冲液，50℃恒温水浴60min，取出后立即采用二硝基水杨酸法测定还原糖的含量，即加入1.5mL的二硝基水杨酸混匀，100℃沸水浴中煮沸10min，然后立即用流水冷却至室温后用超纯水定容至25mL；以不加待测液的相同底物为空白对照组，采用分光光度计在540 nm波长条件下，测定OD值。1mL待测液每分钟产生1μg还原糖的酶量定义为一个酶活力单位U.结果如表2所显示：

表2.发酵法测定胞外CMCA活性

菌株	CMCA活性U/mL
		KC202015-6	231
候选菌株2	185
		候选菌株3	179
候选菌株4	165
		候选菌株5	175

表2显示，KC202015-6的体外产纤维素酶活性具有显著优势。

3.3.3对土壤脲酶活性影响

应用土壤酶作为监测指标，评价农药的生态毒理效应已成为环境科学领域的研究热点之一。而脲酶属于土壤中研究得比较深入的一种水解酶类，是惟一对尿素在土壤中转化及尿素利用率有重大影响的酶。

在实验中偶然发现，本发明所选菌株加入受试土壤后，其中脲酶活性增强，具体如下：

脲酶含量测定：采用土壤脲酶(S-UE)活性检测试剂盒(Solarbio，货号：BC0120)，操作步骤完全依据其说明书进行。

取常规的农田土壤10kg，测定初始脲酶活性为。

将土壤分为5份，每份2kg，其中1份为对照，其余4份(每份4个重复)加入3.3.1 中所得菌液发酵剂(按每kg土壤加入50mL菌液)混匀后在25-35摄氏度环境中放置，在第 10天，20天和30天是测定脲酶含量。

结果如下表3：

表3.脲酶活性测定

测定结果发现，经本发明的菌液处理的土壤，在第20～30天时，脲酶活性提到幅度达到6.8％～7.9％。

推测本发明提供的菌液具有良好的产酶活性及代谢物，为土壤中产生脲酶的微生物生长提供丰富的碳源、氮源等营养，从而刺激产脲酶微生物数量增长，活性增强，因而土壤中脲酶的活性也相应增强。

3.3.4对土壤污染物吸附和降解功能测试

前人研究发现枯草芽孢杆菌对菲和笨并[a]芘都可进行吸附和生物降解，土壤中PAHs降低的主要是由枯草芽孢杆菌的吸附和生物利用造成；枯草芽孢杆菌的存在显著改变土壤的吸附特性，这些研究提示开发合适的微生物菌株，可用于改良受污染的农田土壤使其中有机污染物得以迁移转化。

本发明中测试了所选菌株对土壤有机污染物吸附和降解功能

实验过程如下：

取常规大田土壤，在室温条件下风干，研磨过100目筛，低温保存备用。

取过量的多环芳烃化合物菲(CAS号：85-01-8)、苯并[a]芘(CAS#:50-32-8)分别加入含0.1％甲醇的1％氯化钠溶液中，振荡24h，用玻璃纤维滤膜过滤去除不溶晶体,得饱和滤液作为PAHs储备液(菲或苯并[a]芘)，取样测初始浓度，其余避光密封保存备用；

实验设计：

实验组1.在250mL具塞三角瓶中，加入100g土壤样品，加入3.3.1中得到的发酵液5mL，然后加入PAHs储备液的稀释液100mL(浓度为0.90ug/mL)；然后置于37摄氏度水浴恒温振荡器中培养，于不同时间点取样在4，000g转速离心20分钟，取上清测定PAHs浓度；

实验组2.在250mL具塞三角瓶中，加入3.3.1中得到的发酵液5mL和PAHs储备液的稀释液100mL(浓度为0.90ug/mL)；然后置于37摄氏度水浴恒温振荡器中培养，于不同时间点取样在4，000g转速离心20分钟，取上清测定PAHs浓度；

对照组：在250mL具塞三角瓶中，加入100g土壤样品，加入PAHs储备液的稀释液100mL (浓度为0.90μg/mL)；然后置于37摄氏度水浴恒温振荡器中培养，于不同时间点取样在4， 000g转速离心20分钟，取上清测定PAHs浓度；

PAHs浓度的测定利用高效液相色谱仪，荧光检测器474测定，色谱柱为C¹⁸反相色谱柱，定量方法为标准曲线法。色谱条件：流动相甲醇：水为95:5，进样体积20μL，流速 1mL/min，菲、苯并[a]芘检测波长分别为292/366nm、296/408nm。

测定结果如下表4。

表4.菲浓度动态变化

测定结果显示，见图2，实验组1，2和对照组在24小时达到平衡；在6个小时，实验组1中Phe的浓度已经比初始减少了75％，达到平衡时，减少98.8％；不加土壤的实验组2 的结果接近于实验组1。说明菲浓度的减少，主要是被所加微生物(3.3.1发酵液)生物利用，而不是土壤吸附。

表5苯并[a]芘浓度动态变化

测定结果显示，实验组1，2和对照组在12小时达到平衡；在1个小时时，实验组1中苯并[a]芘的浓度比初始减少了75％以上，达到平衡时，比初始浓度降低了80％；

不加土壤的实验组2的结果优于实验组1，在达到平衡时，比初始浓度降低了86％。说明书本发明的菌株能够有效地生物利用苯并[a]芘。

而对照组优于实验组1和2，在1个小时时，苯并[a]芘的浓度比初始减少了97％以上，达到平衡时，比初始浓度降低了99％。说明土壤吸附可以消除苯并[a]芘。

与实验组1和对照组相比，实验组1的结果说明微生物的存在在一定程度上会阻碍了土壤对苯并[a]芘的吸附。该结论与前人研究一致。

总的来说，在受多环芳烃污染的土壤中施加本发明的菌剂，能够快速有效地降低菲污染，土壤对苯并[a]芘的吸附作用虽然会被阻碍，但是并不明显。因此本发明提供的菌剂可以作为污染土壤的改良剂。

序列表

Seq ID No.1 16S rRNA序列扩增特异性正向引物

AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

Seq ID No.2 16S rRNA序列扩增特异性反向引物

AAGGAGGTGATCCAGCCGCA

Seq ID No.3 16s RNA特征序列；

1 agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc

61 ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa

121 cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat gcttgtttga

181 accgcatggt tcattcataa aagatatctt tcgttaccac ttacagatgg acccgcggcg

241 cattagctag ttggtgaggt aatggctcac caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag

301 ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg

361 gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt

421 cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt

481 gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag

541 gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct

601 gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca

661 gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc

721 agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg

781 aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg

841 tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc

901 aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa

961 ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag

1021 gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg

1081 agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt

1141 tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc

1201 atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg

1261 aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac

1321 tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt

1381 tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt

1441 gaggtaacct tttaggagcc agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcgta

1501 acaaggtagc cgtatcggaa ggtgcggctg gatcacctcc tt

Claims

1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KC202015-6，保藏号为CGMCC No.22965；其16SrRNA内具有Seq ID No.3所示的特征序列。

2.一种含权利要求1所述的枯草芽孢杆菌及其代谢产物的发酵剂。

3.权利要求1所述的发酵剂的制备方法，其特征在于

(4)将二级菌种液全部接种到预装有3号液体培养基的发酵罐中进行进一步发酵扩繁，接种比例为体积比1:20；发酵条件为：36-38摄氏度，罐压0.5kg/cm，通气量20立方/h，10-15小时，得发酵剂；

所述斜面培养基配方为:海藻酸钠2g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾2g/L,氯化钠3g/L，牛肉膏5g/L，琼脂1.5％-2.0％，PH调至6.5-7.2；

所述1号液体培养基配方为:海藻酸钠2g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾1.5g/L,氯化钠3g/L，牛肉膏5g/L，PH调至6.5-7.2；

所述2号液体培养基:海藻酸钠2g/L，淀粉5g/L，蔗糖1g/L，酵母浸出汁0.2g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾1.5g/L，硫酸镁0.2g/L,氯化钠5g/L，PH调至6.5-7.2；

4.一种用于提高脲酶活性的土壤调理剂，其特征在于，其活性成分包含权利要求2所述的发酵剂。

5.一种用于降低有机污染物的土壤调理剂，其特征在于，其活性成分包含权利要求2所述的发酵剂。

6.一种用于培养权利要求1所述的菌株的培养基，其特征在于，包括斜面培养基，所述斜面培养基的配方为:海藻酸钠2g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾2g/L,氯化钠3g/L，牛肉膏5g/L，琼脂1.5％-2.0％，PH调至6.5-7.2。

7.根据权利要求6所述的培养基，其特征在于，还包括一级扩繁液体培养基，所述一级扩繁液体培养基的配方:海藻酸钠2g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾1.5g/L,氯化钠3g/L，牛肉膏5g/L，PH调至6.5-7.2。

8.根据权利要求6所述的培养基，其特征在于，还包括二级扩繁液体培养基，所述二级扩繁液体培养基的配方:海藻酸钠2g/L，淀粉5g/L，蔗糖1g/L，酵母浸出汁0.2g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾1.5g/L，硫酸镁0.2g/L,氯化钠5g/L，PH调至6.5-7.2。

9.根据权利要求6所述的培养基，其特征在于，还包括三级扩繁液体培养基，所述三级扩繁液体培养基的配方:海藻酸钠5g/L，淀粉10g/L，蔗糖5g/L，酵母浸出汁0.1g/L，蛋白胨0.5g/L，豆饼粉10g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾2g/L，氯化钠5g/L，PH调至6.5-7.2。