CN112899196B

CN112899196B - 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治十字花科根肿病中的应用

Info

Publication number: CN112899196B
Application number: CN202110207181.5A
Authority: CN
Inventors: 柴阿丽; 李宝聚; 张思雨; 芮婷婷; 李磊; 谢学文; 石延霞
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-02-08
Filing date: 2021-02-08
Publication date: 2022-03-08
Anticipated expiration: 2041-02-08
Also published as: CN112899196A

Abstract

本发明公开了一种贝莱斯芽孢杆菌ZF481及其应用，所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的菌株号为ZF481，已于2020年7月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCC No.20320。所述贝莱斯芽孢杆菌ZF481或/和贝莱斯芽孢杆菌ZF481的代谢物能够预防和/或治疗植物根肿病、或者制备用于预防和/或治疗植物根肿病的产品。该菌株对根肿菌休眠孢子的活力及萌发均具有抑制作用，对白菜等十字花科作物有很好的促生作用，此外，还对辣椒疫霉菌、茄匍柄霉、尖孢镰孢菌、茄链格孢菌、多主棒孢菌、灰葡萄孢菌、立枯丝核菌等都有较好的抑菌效果。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治十字花科根肿病中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中一株贝莱斯芽孢杆菌ZF481及其应用。

背景技术

由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woronin.)侵染所引起的十字花科蔬菜根肿病是世界性土传病害之一。该菌是一种专性寄生菌，不能离体培养，病原菌可以通过种子、土壤、病残体、灌溉水及动物粪便传播，农作物受根肿菌侵染后，根组织异常大量增生，膨大形成瘤状，使根的正常生理机能受阻，地上部植株生长迟缓、缺水蔫萎，造成品质下降减产，给生产带来巨大损失，素有“十字花科癌症”之称，严重威胁十字花科作物的可持续发展。

现阶段根肿病的防治主要是采用选育抗病品种、农业综合措施药剂防治以及生物防治。但农业综合措施药剂防治和选育抗病品种对根肿病的防治存在污染环境、成本较高和抗病品种长期单一使用会导致病原菌产生抗药性等问题，寻找有效防治根肿病的方法是迫在眉睫的。近年来，相继报道了采用生物防治十字花科根肿病，因其来源广泛、对人畜安全、高效环保的特点而备受研究者的青睐。

在十字花科根肿病生物防治方面，1998年，Arie最早报道头状茎点霉(Phomaglomerata)JCM 9972产生的顶环氧菌素可以抑制根肿菌休眠孢子的萌发，有效控制根肿病的发生(Arie et al.，1998)。此外，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(熊国如等，2009)、解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens、多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa(刘邮洲等，2014)、球毛壳菌Chaetomium globosum(印容等，2016)和淡紫紫孢菌Paecilomyceslilacinus(贾瑞敏等，2020)等生防真菌对十字花科根肿病也有较好的防控效果。但这些生防菌株大多处于试验阶段，应用于实际生产的很少，因此急需寻找新的拮抗微生物资源，以便更有效地控制根肿病的发生和流行。

贝莱斯芽孢杆菌是一种革兰氏阳性细菌，且具有繁殖速度快、营养简单、抗逆性较强等优势。目前关于贝莱斯芽孢杆菌在生物防治中研究和报道还很少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高十字花科根肿病生物防治效果。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)ZF481。

本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF481，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.20320。该菌株已于2020年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。下文简称贝莱斯芽孢杆菌ZF481。

贝莱斯芽孢杆菌ZF481菌体形状为杆状，菌体平均大小为0.4μm×4.0μm，该菌在LB固体培养基上培养24h，菌落呈白色，中间凸起，边缘整齐且光滑，在培养基生长一段时间以后，表皮褶皱，菌落中央呈火山口状。该菌为革兰氏阳性菌，NaCl含量1％～8％均可以生长，淀粉水解、V-P试验反应等为阳性，琥珀酸、D-葡萄糖醛酸测试反应为阴性。该菌可以利用蔗糖、D-果糖、D-山梨醇等，不能利用D-麦芽糖、L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、L-天(门)冬氨酸、L-组氨酸、L-焦谷氨酸、柠檬酸等。最适宜生长温度为28-30℃，生长pH值在6-8。贝莱斯芽孢杆菌ZF481具有序列表中序列1所示的16S rDNA，具有序列表中序列2所示的gyrB基因，具有序列表中序列3所示的atpD基因。

贝莱斯芽孢杆菌ZF481的代谢物和/或贝莱斯芽孢杆菌ZF481的培养物也属于本发明的保护范围。

上文中，所述贝莱斯芽孢杆菌ZF481的代谢物可为贝莱斯芽孢杆菌ZF481的发酵液。贝莱斯芽孢杆菌ZF481的发酵液可按照如下方法制备：在液体发酵培养基中培养贝莱斯芽孢杆菌ZF481，收集发酵液(含有贝莱斯芽孢杆菌ZF481和分泌到液体培养基内的物质)，该发酵液即为贝莱斯芽孢杆菌ZF481的代谢物。

上文中，所述贝莱斯芽孢杆菌ZF481的培养物是将贝莱斯芽孢杆菌ZF481在微生物培养基中培养得到的物质(如含有贝莱斯芽孢杆菌ZF481和分泌到液体培养基内的物质即发酵液，或如含有贝莱斯芽孢杆菌ZF481和分泌到固体培养基内的物质)。

上述贝莱斯芽孢杆菌ZF481的代谢物和/或所述贝莱斯芽孢杆菌ZF481的培养物具有抑制芸薹根肿菌的活性；

或者上述贝莱斯芽孢杆菌ZF481的代谢物和/或所述贝莱斯芽孢杆菌ZF481的培养物具有下述W1-W14的至少一种功能：

W1、抑制细菌的活性；

W2、抑制革兰氏阳性菌的活性；

W3、抑制革兰氏阴性菌的活性；

W4、抑制真菌的活性；

W5、抑制辣椒疫霉菌的活性；

W6、抑制茄匍柄霉的活性；

W7、抑制尖孢镰孢菌的活性；

W8、抑制茄链格孢菌的活性；

W9、抑制多主棒孢菌的活性。

W10、抑制灰葡萄孢菌的活性；

W11、抑制立枯丝核菌的活性；

W12、促进植物生长的活性；

W13、促进十字花科植物生长的活性；

W14、促进白菜生长的活性。

为了解决以上技术问题，本发明还提供了产品，本发明所提供的产品含有贝莱斯芽孢杆菌ZF481或/和贝莱斯芽孢杆菌ZF481的代谢物或/和贝莱斯芽孢杆菌ZF481的培养物。

所述产品可为菌剂或含有所述菌剂的微生态制剂。

所述产品具体可为下述任一种产品：

U1、预防和/或治疗植物根肿病的产品；

U2、抑制真菌的产品；

U3、抑制细菌的产品；

U4、提高植物产量的产品。

上述产品中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为十字花科植物。

上述产品的活性成分可为贝莱斯芽孢杆菌ZF481或/和贝莱斯芽孢杆菌ZF481的代谢物或/和贝莱斯芽孢杆菌ZF481的培养物，上述产品的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述产品的其他活性成分本领域技术人员可根据产品的效果确定。

上述产品可为液体菌剂或固体菌剂。

所述产品还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、生物材料；所述矿物材料可为草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述液体载体可为水；所述产品中，贝莱斯芽孢杆菌ZF481或/和贝莱斯芽孢杆菌ZF481的代谢物可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。

所述产品的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

根据需要，所述产品中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。

贝莱斯芽孢杆菌ZF481或/和贝莱斯芽孢杆菌ZF481的代谢物或/和贝莱斯芽孢杆菌ZF481的培养物或/和所述产品在预防和/或治疗植物根肿病中的应用属于本发明的保护范围。

贝莱斯芽孢杆菌ZF481或/和贝莱斯芽孢杆菌ZF481的代谢物或/和贝莱斯芽孢杆菌ZF481的培养物或/和所述产品的下述任一种应用也属于本发明的保护范围：

V1、在抑制真菌活性中的应用；

V2、在抑制细菌活性中的应用；

V3、在促进植物生长中的应用。

上述应用中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为十字花科植物。

培养所述的贝莱斯芽孢杆菌ZF481的方法也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的培养所述的贝莱斯芽孢杆菌ZF481的方法包括将所述贝莱斯芽孢杆菌ZF481在培养基中培养的步骤。

制备所述产品的方法也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的制备所述产品的方法，包括将所述贝莱斯芽孢杆菌ZF481或/和贝莱斯芽孢杆菌ZF481的培养物或/和贝莱斯芽孢杆菌ZF481的代谢物作为产品的成分，得到所述产品的步骤，所述产品为液体菌剂或固体菌剂。

上述方法中，所述产品可为液体菌剂。上述方法中，所述贝莱斯芽孢杆菌ZF481可在发酵培养基中培养，得到发酵液，将发酵液与载体混合，得到所述液体菌剂。所述发酵培养基的组成可为：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂15-20g，蒸馏水定容至1L，pH7.0。

实验证明，本发明的贝莱斯芽孢杆菌ZF481的具有较好的抑菌活性，不仅能抑制真菌的活性，也能抑制细菌的活性。本发明的贝莱斯芽孢杆菌ZF481根肿病有很好的生物防治效果，能促进十字花科植物的生长，提高产量。贝莱斯芽孢杆菌ZF481没有环境污染问题，培养条件简单，容易保存，方便加工，适合开发应用。

生物材料保藏说明

生物材料的的分类命名：贝莱斯芽孢杆菌

生物材料的的拉丁文学名：Bacillus velezensis

生物材料的菌株编号：ZF481

保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；邮编：100101

保藏日期：2020年07月08日

保藏编号：CGMCC No.20320

附图说明

图1为本发明实施例1中ZF481菌株对根肿菌休眠孢子的影响，其中A：ZF481；B：阴性对照；C：氟啶胺。

图2为本发明实施例2中菌株ZF481的基因序列系统发育树。

图3为为本发明实施例3中生防菌对白菜根肿病的盆栽防效，其中A：ZF481；B：氟啶胺；C：氰霜唑；D：百菌清；E：枯草芽孢杆菌；F：对照。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的定量试验，若无特殊说明，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。

下述实施例中所用到的病原菌如下：

尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)已在文献“石延霞、张晓慧、徐玉芳、谢学文、柴阿丽、李宝聚.吡唑并嘧啶衍生物BDO-1诱导黄瓜对枯萎病的抗性[J].园艺学报,2019,46(05):877-890.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)已在文献“程颖超、康华军、石延霞、柴阿丽、张红杰、谢学文、李宝聚.辣椒疫霉菌RT-PCR检测技术的建立及应用[J].园艺学报,2018,45(05):997-1006.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

茄匍柄霉(Stemphylium solani)已在文献“李宝聚、周艳芳、李金萍、谢学文、李宝聚.博士诊病手记(三十)番茄匍柄霉菌叶斑病(灰叶斑病)的诊断与防治.中国蔬菜,2010(23):24-26.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

茄链格孢菌(Alternaria solani)已在文献“柴阿丽、石延霞、谢学文、帕提古丽、李宝聚.加工番茄早疫病病原菌鉴定.华北农学报2015，30：316-320.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)已在文献“高苇、李宝聚、石延霞、谢学文.多主棒孢菌在黄瓜、番茄和茄子寄主上致病力的分化.园艺学报2011，38(3)：465-470.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)已在文献“石延霞、唐明、晋知文、谢学文、柴阿丽、李宝聚.蔬菜作物灰葡萄孢菌对不同类型杀菌剂的抗性评价.中国蔬菜，2016(03):60-65.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)已在文献“黄艺烁、谢学文、石延霞、柴阿丽、李磊、李宝聚.多粘类芽胞杆菌ZF197对白菜茎基腐病防治效果.园艺学报:1-13.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

贝莱斯芽胞杆菌ZF2(Bacillus velezensis Strain ZF2)已在文献“赵昱榕,李磊,谢学文,石延霞,柴阿丽,孙广玉,李宝聚.贝莱斯芽胞杆菌ZF2对多主棒孢病菌防治效果[J].中国生物防治学报,2019,35(02):217-225.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

下述实施例中供试白菜品种：白菜“菊心”已在文献“高青云.十字花科根肿病菌单孢分离体系的建立及生理小种鉴定.河北北方学院,2019.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

下述实施例中所用的培养基如下：胰蛋白胨培养基(LB)：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂15-20g，蒸馏水定容至1L，pH 7.0，用于活化、摇培生防细菌；蛋白胨牛肉粉液体培养基(NA)：牛肉粉3g，蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂15-20g，蒸馏水定容至1L；蛋白胨牛肉粉液体培养基(NB)：牛肉粉3g，蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水定容至1L，NA和NB用于活化、摇培病原细菌；马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，蒸馏水定容至1L，用于活化、培养真菌；水琼脂培养基(WA)：琼脂糖5g，蒸馏水定容至1L，用于细菌抑菌谱测定。

下述实施例中所用的药品如下：50％氟啶胺悬浮剂(Fluazinam)：日本石原产业株式会社；75％百菌清可湿性粉剂(Chlorothalonil)：江苏新河农用化工有限公司；10％氰霜唑可湿性粉剂(Cyazofamid)：山东省青岛东生药业有限公司；枯草芽孢杆菌(100亿个/g)：云南星耀生物制品公司。

实施例1十字花科根肿病生防菌的分离与筛选

1.菌株的分离与纯化

供试土样：从重庆武隆、湖北恩施、四川等十字花科蔬菜根肿病发生区采集根际土壤样品128份，使用无菌样品袋做好标记带回实验室及时保存处理。

采用稀释平板涂布法从上述128份土壤样品中分离获得细菌1198株。具体操作如下：分别将土壤样品10g加入装有90mL无菌蒸馏水的三角瓶中，将三角瓶置于28℃、200r/min摇床上振荡30min，使之充分悬浮，80℃水浴处理10min，获得10^-1的土壤稀释液，后梯度稀释至10^-6，将10^-4、10^-5和10^-6各吸取100μL液涂布于LB固体平板上，涂匀后正向静置晾干，每个梯度重复3次，28℃培养2d后，挑选形态、颜色等不同的单菌落平板划线纯化后，用25％的甘油保存于-80℃。

2.十字花科根肿病生防菌的筛选

采用平板对峙实验和菌株对根肿菌休眠孢子活性影响试验，从纯化的菌株中筛选十字花科根肿病生防菌。

2.1平板对峙实验

以尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)和辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)分别为靶标(即两种病原指示菌)，采用平板对峙法筛选具有拮抗作用的菌株。用打孔器在活化好的病原指示菌尖孢镰孢菌菌株和辣椒疫霉菌菌株菌落边缘打取菌饼(d＝5mm)，将菌饼接种到PDA平板中央位置，有菌丝的一面朝下，28℃培养24h后，在距离培养皿边缘15mm呈十字交叉的对称接种5μL步骤1分离获得的各株细菌的菌悬液，每株菌设3次重复；设置只接入病原指示菌的培养基的空白对照，28℃下培养；待空白对照长至生防菌接菌点时，测量靶标菌的对照生长量(菌落直径)和处理生长量(接种细菌后的生长直径)，按照公式(1)计算抑菌率：

采用平板对峙法从1198株细菌中筛选有强抑制作用的生防菌株，初步筛选到对尖孢镰孢菌抑菌率大于60％和对辣椒疫霉菌抑菌率大于40％的拮抗菌株115株。

2.2菌株对根肿菌休眠孢子活性影响试验

-20℃冰箱取出保存的白菜肿根，解冻后清洗并晾干，置于室温黑暗条件下腐烂5d。在组织破碎机中加适量蒸馏水充分打碎，孢子悬浮液通过8层纱布过滤，利用血球计数板将休眠孢子浓度调整到浓度为1×10⁸个·mL^-1，得到根肿菌休眠孢子悬浮液。

对步骤2.1筛选到的115株拮抗菌株分别进行如下试验：

挑取单菌落接种于LB液体培养基，28℃、180r/min摇床振荡培养24h(将浓度OD值调至1.0)，得到生防菌无菌发酵液；然后取浓度为1×10⁸个·mL^-1的根肿菌休眠孢子悬浮液0.5mL、生防菌无菌发酵液0.5mL置于无菌离心管中均匀混合；2d后，混合液分别与磷酸盐缓冲液(pH值为7.4)等体积(各500μL)混合均匀，然后加入总体积1/2(500μL)的2％伊文思蓝溶液摇晃均匀，在室温下放置30min后，取少量混合液，用蒸馏水稀释4倍，制片，在光学显微镜下观察休眠孢子的细胞质被染色的程度。休眠孢子细胞质染成深蓝色即为失去活性的孢子，未着色或着色较浅的为具活性的休眠孢子。每个重复观察200个休眠孢子。同时设化学药剂氟啶胺、氰霜唑、百菌清和枯草芽孢杆菌为阳性对照以等量无菌培养基代替生防菌无菌发酵液作为阴性对照。每处理设3个重复。

其中菌株ZF481发酵液处理根肿菌休眠孢子，孢子失活率达到47.63％，显著高于阳性对照，结果如图1和表1所示。

表1菌株ZF481对休眠孢子活性检测

处理	休眠孢子失活率(％)
		ZF481	47.63±5.54b
氟啶胺	55.53±3.87a
		氰霜唑	44.68±4.06bc
百菌清	25.69±6.48c
		枯草芽孢杆菌	40.82±5.59d
CK	11.09±2.84e

注：表中数据为平均值±标准差，不同小字母表示0.05水平上差异显著。

实施例2菌株ZF481的鉴定

取实施例1中分离、筛选得到的菌株ZF481进行下述鉴定。

1.形态特征

采用平板划线法观察菌株ZF481的形态学特征，其菌体形状为杆状，菌体平均大小为0.4μm×4.0μm，在LB固体培养基上划线接种菌株ZF481，置于28℃恒温培养箱，倒置培养24h，然后观察菌株单菌落的形态、颜色、边缘整齐度、质地等，具体如下：ZF481单菌落呈白色，中间凸起，边缘整齐且光滑，在培养基生长一段时间以后，表皮褶皱，菌落中央呈火山口状。

2.生理生化特征

参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠2001)进行革兰氏染色试验、硝酸盐还原、V-P试验、糖发酵、淀粉水解等进行菌株生理生化特性测定。生理生化测定显示，菌株ZF481为革兰氏阳性菌，NaCl含量1％～8％均可以生长，淀粉水解、V-P试验反应等为阳性，琥珀酸、D-葡萄糖醛酸测试反应为阴性(表2)。

表2菌株ZF481生理生化特征

测试项目	结果	测试项目	结果
				革兰氏染色	+	1％NaCl	+
淀粉水解	+	4％NaCl	+
				明胶液化	+	8％NaCl	+
硝酸盐还原	+	pH6	+
				葡萄糖	+	pH5	+
甘露醇	+	V-P试验	+
				琥珀酸	-	D-葡萄糖醛酸	-

注：“+”表示阳性；“－”表示阴性。

3.Biolog测定

BIOLOG GENⅢ试剂盒(按照试剂盒说明书操作)对菌株ZF481进行唯一碳源利用的测定，所有仪器耗材皆为Biolog公司产品。Biolog检测结果表明，菌株ZF481可以利用蔗糖、D-果糖、D-山梨醇等，不能利用D-麦芽糖、L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、L-天(门)冬氨酸、L-组氨酸、L-焦谷氨酸、柠檬酸等。初步鉴定菌株ZF481属于芽胞杆菌属。

4.分子鉴定

采用细菌DNA试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)提取菌株ZF481的基因组DNA，将其作为PCR反应的模板DNA，分别采用引物27F/1492R、UP1F/UP2R和atpD-F/atpD-R对16S rDNA基因、gyrB基因和atpD基因进行扩增(引物见表3)。

表3供试引物

注：字母Y代表C/T中的任一种核苷酸，字母N代表A/C/G中的任一种核苷酸，字母R代表A/G中的任一种核苷酸。

反应体系(50μL)：2×Rapid Taq MasterMix(诺唯赞生物科技有限公司)25μL、上下游引物各1μL(10μmol/L^-1)、DNA模板2μL(60ng·mL^-1)、ddH₂O补足。引物27F/1492r、UP1F/UP2R和atpD-F/atpD-R。反应程序如表4所示。

表4 PCR反应程序

PCR扩增产物均用1％琼脂糖凝胶电泳检测，以DNA Marker BM5000为对照检测产物分子量。电泳测定分析确认所需产物后，将样品送至北京博迈德生物技术有限公司进行测序，测序结果通过GenBank进行Blast序列同源性比对。采用MEGA 7.0、Sequence Matrix、Seaview4等软件按顺序连接，比对菌株的16S rDNA基因(如序列表的序列1所示)、gyrB基因(如序列表的序列2所示)和atpD基因(如序列表的序列3所示)，根据16S rDNA基因、gyrB基因和atpD基因的序列采用最大似然法构建系统发育树，分析其亲缘关系，构建菌株ZF481与其他相近菌株之间的进化树。

结果表明，菌株ZF481与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的16S rDNA的同源性高达100％，结合生物学特征观察以及生理生化特征分析及系统发育树(图2)比对分析，鉴定菌株ZF481为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。

菌株ZF481是贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，该菌株已于2020年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.20320。下文简称贝莱斯芽孢杆菌ZF481。

实施例3贝莱斯芽孢杆菌ZF481对根肿病的防治效果

采用盆栽试验检测贝莱斯芽孢杆菌ZF481对根肿病的防治效果，方法步骤如下：

1.根肿菌休眠孢子悬浮液的制备及接种

取大白菜品种‘菊心'的种子放在55℃的温水中浸泡30min，用无菌水冲洗2次。将浸泡后的白菜种子整齐放在铺有两层湿润灭菌滤纸的培养皿中，放置在16h光照8h黑暗的光照培养箱培养5天。然后，采用浸根法接种根肿病菌，将根系浸入上述根肿病菌悬液中，浸泡60min后得到带根肿病菌幼苗，准备移栽。实验设7个处理，每个处理6盆，每盆5株。7个处理分别如下：

(1)对照：将幼苗移栽在装有栽培土的栽培盆中，每个栽培盆装有800g栽培土，每个栽培盆移栽5个带菌幼苗。分别在移栽日、移栽后第7d和移栽后第14d均在植株根部浇灌一次无菌水，每次每盆浇200mL。

(2)氟啶胺处理：先将称好的50％氟啶胺悬浮剂加到少量水中，搅拌均匀，然后再与基质充分混匀，使其终浓度为0.20mL/L基质。每个栽培盆移栽5个带菌幼苗，3次重复。

(3)氰霜唑处理：先将称好的10％氰霜唑可湿性粉剂加到少量水中，搅拌均匀，然后再与基质充分混匀，使其终浓度为0.5mL/L基质。每个栽培盆移栽5个带菌幼苗，3次重复。

(4)百菌清处理：先将称好的75％百菌清可湿性粉剂加到少量水中，搅拌均匀，然后再与基质充分混匀，使其终浓度为0.5mL/L基质。每个栽培盆移栽5个带菌幼苗，3次重复。

(5)ZF481菌剂处理：将幼苗移栽在装有栽培土的栽培盆中，每个栽培盆装有800g栽培土(栽培土与对照组中的相同)，每个栽培盆移栽5个带菌幼苗。分别在播种期、播种后7d和播种后14d均在植株根部浇灌一次ZF481菌剂悬浮液(用对照组中的无菌水稀释ZF481菌剂至菌株ZF481的含量为10⁷cfu/mL得到的液体)，每次每盆浇200mL。

其中，ZF481菌剂按照如下方法制备：挑取菌株贝莱斯芽孢杆菌ZF481的菌落，接种在装有液体LB液体摇菌管中，在28℃，180r/min摇床振荡培养16h制备种子液；种子液以1％(体积百分含量)的接种量接种于LB培养液中，在28℃、180r/min条件下摇培48h，得到ZF481菌剂,调节浓度至1×10⁷cfu/mL。

(6)枯草芽孢杆菌菌剂处理：先将称好的枯草芽孢杆菌(100亿个/g)菌剂加到少量水中，搅拌均匀，然后再与基质充分混匀，使其终浓度为2g/L基质。每个栽培盆播种5个带菌幼苗，3次重复。分别在播种期、播种后7d和播种后14d均在植株根部浇灌一次枯草芽孢杆菌菌剂悬浮液。

(7)贝莱斯芽孢杆菌ZF2菌剂处理：将幼苗移栽在装有栽培土的栽培盆中，每个栽培盆装有800g栽培土(栽培土与对照组中的相同)，每个栽培盆移栽5个带菌幼苗。分别在播种期、播种后7d和播种后14d均在植株根部浇灌一次ZF2菌剂悬浮液(用对照组中的无菌水稀释ZF2菌剂至菌株ZF2的含量为10⁷cfu/mL得到的液体)，每次每盆浇200mL。

其中，ZF2菌剂按照如下方法制备：挑取菌株贝莱斯芽孢杆菌ZF2的菌落，接种在装有液体LB液体摇菌管中，在28℃，180r/min摇床振荡培养16h制备种子液；种子液以1％(体积百分含量)的接种量接种于LB培养液中，在28℃、180r/min条件下摇培48h，得到ZF2菌剂,调节浓度至1×10⁷cfu/mL。

移栽后所有幼苗置于日照时数16h，温度25-28℃环境条件下生长，保持土壤湿度。移栽后60天调查植株发病情况及自然株高(地面至盆栽白菜顶部的垂直高度)，参照Wallenhammar所用根肿病调查及分级标准：0级为根部无肿大；1级肿根只附着在侧根上，占全部根系1％至小于25％；2级主根上有肿根附着，侧根上肿根占25％至小于50％；3级主根上有肿根附着，肿根占根系50％至小于75％；4级主根上有根肿附着，肿根占根系75％以上。以如下公式(2)计算根肿病的发病率，以公式(3)计算病情指数，以公式(4)计算根肿病的防治效果，以公式(5)计算促生效果。

采用SPSS进行统计分析，结果如表5所示，表明ZF481菌剂处理对根肿病的防治效果达到71.23％，显著高于百菌清处理(65.31％)，株高也高于百菌清处理；枯草芽孢杆菌菌剂处理对根肿病的防治效果为55.24％显著低于ZF481菌剂处理；经过ZF481菌剂处理的植株较清水对照试验促生效果提高了17.34％，且株高明显高于氟啶胺、氰霜唑处理试验。说明菌株ZF481对根肿病的防治效果明显优于枯草芽孢杆菌且有显著的促生作用。各处理的照片如图3所示，图3中的A为ZF481菌剂处理，B氟啶胺处理，C为氰霜唑处理，D为百菌清处理，E为枯草芽孢杆菌菌剂处理，F为对照。

表5菌株ZF481对白菜根肿病的防治效果

注：表中数据为平均值±标准差，不同小字母表示0.05水平上差异显著，促生效果数字前有“-”表示有抑制作用。

实施例4贝莱斯芽孢杆菌ZF481抑菌谱测定

采用平板对峙法测定贝莱斯芽孢杆菌ZF481对7种真菌(分别为表6中的辣椒疫霉菌、茄匍柄霉、尖孢镰孢菌、茄链格孢菌、多主棒孢菌、灰葡萄孢菌和立枯丝核菌)的抑菌活性。在90mm PDA平板中心分别接种5mm所选取的真菌靶标菌饼，28℃下培养24h。将贝莱斯芽孢杆菌ZF481接种在液体LB培养基中，28℃下振荡培养16h，。在距离培养皿边缘15mm处十字交叉的4点接种5μL ZF481菌悬液，以接种液体LB培养基为空白对照，置于28℃下培养。待空白对照即将长至生防菌接种点时，测量靶标菌的对照生长量(菌落直径)和处理生长量(接种细菌后的生长直径)，以公式(6)计算抑菌率。

抑菌率(％)＝(对照生长量-处理生长量)/对照生长量×100％(6)

表6贝莱斯芽孢杆菌ZF481对病原菌拮抗试验

病原菌	抑菌直径(cm)	抑菌率(％)
			辣椒疫霉菌	4.35±0.1	41.21±1.41
茄匍柄霉	3.36±0.08	55.99±1.06
			尖孢镰孢菌	4.05±0.1	50.9±1.27
茄链格孢菌	4±0.06	44.44±0.87
			灰葡萄孢菌	3.78±0.07	57.96±0.83
多主棒孢菌	3.38±0.27	55.18±3.69
			立枯丝核菌	3.58±0.14	60.18±1.63

结果如表6所示，贝莱斯芽孢杆菌ZF481对7种病原真菌表现出明显的抑菌活性，抑制率达40％以上。贝莱斯芽孢杆菌ZF481对病原细菌也有不同程度的抑制效果，抑菌效果达到20％以上。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治十字花科根肿病中的应用

<130> GNCSY210031

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1402

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)

<400> 1

cttcggcggc tggctcctaa aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa actctcgtgg 60

tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga 120

ttactagcga ttccagcttc acgcagtcga gttgcagact gcgatccgaa ctgagaacag 180

atttgtggga ttggcttaac ctcgcggttt cgctgccctt tgttctgtcc attgtagcac 240

gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt 300

ttgtcaccgg cagtcacctt agagtgccca actgaatgct ggcaactaag atcaagggtt 360

gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc 420

acctgtcact ctgcccccga aggggacgtc ctatctctag gattgtcaga ggatgtcaag 480

acctggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg 540

cccccgtcaa ttcctttgag tttcagtctt gcgaccgtac tccccaggcg gagtgcttaa 600

tgcgttagct gcagcactaa ggggcggaaa ccccctaaca cttagcactc atcgtttacg 660

gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt cgctccccac gctttcgctc ctcagcgtca 720

gttacagacc agagagtcgc cttcgccact ggtgttcctc cacatctcta cgcatttcac 780

cgctacacgt ggaattccac tctcctcttc tgcactcaag ttccccagtt tccaatgacc 840

ctccccggtt gagccggggg ctttcacatc agacttaaga aaccgcctgc gagcccttta 900

cgcccaataa ttccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag 960

ttagccgtgg ctttctggtt aggtaccgtc aaggtgccgc cctatttgaa cggcacttgt 1020

tcttccctaa caacagagct ttacgatccg aaaaccttca tcactcacgc ggcgttgctc 1080

cgtcagactt tcgtccattg cggaagattc cctactgctg cctcccgtag gagtctgggc 1140

cgtgtctcag tcccagtgtg gccgatcacc ctctcaggtc ggctacgcat cgtcgccttg 1200

gtgagccgtt acctcaccaa ctagctaatg cgccgcgggt ccatctgtaa gtggtagccg 1260

aagccacctt ttatgtctga accatgcggt tcaaacaacc atccggtatt agccccggtt 1320

tcccggagtt atcccagtct tacaggcagg ttacccacgt gttactcacc cgtccgccgc 1380

taacatcagg gagcaagctc cc 1402

<210> 2

<211> 1126

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)

<400> 2

ttttcagant aaaatcttct ccgattcctg ttccgagggc cgtgatcatt gatctgacct 60

cattgtttga gagaatctta tcaagtctgg ctttctcaac gttcagaatc ttaccgcgca 120

gcggcagaat ggcttggaaa tgacggtccc gtccctgttt cgctgatccg cccgcagagt 180

caccctctac gatatacagc tcggaaatgc tcggatcttt agaagaacag tccgccagtt 240

tgcccggcag attggaaatc tcaagcgcac ttttgcggcg ggtcaattcc cgcgcttttt 300

tcgctgccat ccgcgctctt gcggccatta aacctttttc aacgattttg cgggctgagt 360

ccggattttc aagaaggaat gtttccagcg cagaagaaaa cagcgtatca gtgatcgttc 420

tcgcttcgga gttgccgagc ttcgttttcg tctgcccttc gaattgcgga tcagggtgct 480

taattgaaat aatggcagtc agcccttccc tcacatcatc cccgcttaaa ttcggatcat 540

tttctttgaa aatccctttt cttcttgcat agtcgtttat aacacgggtc agaccggttt 600

taaatccggc ttcgtgcgtg ccgccttcgt atgtgttgat attatttgtg aaagaataaa 660

tattgcttgt atagctgtcg ttgtattgca atgcaacttc aaccgttatg ccgtctttct 720

cgccttcgat ataaatcggc tcttcatgaa cgacttcttt ggaacggttt aagtactcaa 780

catagctttt gattccgcct tcgtagtggt actcgttttt ccgttcttgt ccttcacgtt 840

tgtcttcaat cgtgatgttt acaccttttg tcaggaaggc caattcccgg acacggtttg 900

aaagcaggtc atagtcgtat tcggttgttt ctttgaaaat ttccggatcc ggaacgaagt 960

gcgtaatcgt tccggtctta tcagtatcac cgatcacttc aagatcggcc acaggtacac 1020

cgcgctcgta cgcctgatag tggatttttc cgtcacgatg aaccgtaacg tcaagagtgg 1080

tcgacaaggc gtttacgaca gacgccccta caccgtgaag accgcc 1126

<210> 3

<211> 1011

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)

<400> 3

gtccgtacaa tcgcaatggc atctacagat ggtgttcagc gcggtatgga agctgtagat 60

acaggagcgc caatctcagt accggttggt gatgtaacac ttggacgtgt atttaacgtt 120

ctcggagaaa atattgattt gaatgagccg gttcctgcgg atgcgaaaaa ggatccgatt 180

cacagacagg cgccttcatt cgatcagctt tcaacagaag ttgaaattct tgaaacaggt 240

attaaggttg ttgatttgct tgctccttac attaagggcg gtaaaatcgg attgttcggt 300

ggtgccggtg taggtaaaac cgtattaatc caggaattaa tcaacaacat cgcgcaagag 360

cacggcggta tctctgtatt cgccggcgta ggagagcgta ctcgtgaagg gaacgacctt 420

ttctacgaaa tgagtgactc tggcgttatc aacaaaacag ccatggtatt cggacaaatg 480

aacgagccgc cgggcgcacg tatgcgtgtt gctttgacag gccttacaat ggctgagcac 540

ttccgtgatg tacaaggaca ggacgtactg ttctttatcg ataacatttt ccgtttcaca 600

caagcgggtt cagaggtttc agcccttctt ggccgtatgc cttcagcggt tggttatcag 660

ccgacgcttg caactgagat gggtcagctc caagagcgta tcacgtctac gaatgttgga 720

tcagttacat ctatccaggc gatctacgtg cctgccgatg actacactga cccggcgccg 780

gcaacaacgt tcgctcactt ggatgcgaca acaaaccttg agcgtaaatt aactgaaatg 840

ggtatttacc ctgcggttga tccgttggca tctacatcac gcgcccttgc tcctgaaatt 900

gtcggagaag agcactatgc ggttgcgcgt gaagtacagt caacgcttca gcgttacaaa 960

gagcttcaag atatcattgc gattctcggt atggatgaat taggcgagag a 1011

Claims

1.贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，其特征在于：其菌株号为ZF481，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.20320。

2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌ZF481在预防和/或治疗十字花科植物根肿病中的应用。

3.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌ZF481的下述任一种应用：

V1、在抑制植物病原真菌活性中的应用；

V2、在促进十字花科植物生长中的应用。

4.根据权利要求3的应用，其特征在于：所述抑制植物病原真菌的活性，为下述Q1-Q7中的至少一种：

Q1、抑制辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)的活性；

Q2、抑制茄匍柄霉(Stemphylium solani)的活性；

Q3、抑制尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)的活性；

Q4、抑制茄链格孢菌(Alternaria solani)的活性；

Q5、抑制多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)的活性；

Q6、抑制灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)的活性；

Q7、抑制立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的活性。

5.根据权利要求3的应用，其特征在于：所述十字花科植物为白菜。

6.一种液体菌剂或固体菌剂，其特征在于：含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌ZF481。

7.权利要求6所述的液体菌剂或固体菌剂的下述U1-U2中的至少一种应用：

U1、在预防和/或治疗十字花科植物根肿病中的应用；

U2、在抑制植物病原真菌中的应用。

8.权利要求6所述的液体菌剂或固体菌剂的在促进十字花科植物生长中的应用。

9.培养权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌ZF481的方法，其特征在于：包括将权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌ZF481在培养基中培养的步骤。

10.制备权利要求6所述的液体菌剂或固体菌剂的方法，其特征在于：包括将权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌ZF481作为产品的成分，得到所述产品的步骤，所述产品为液体菌剂或固体菌剂。