CN116987613B - 一种芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌yz-375及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)YZ‑375及其应用，涉及功能微生物筛选及应用领域，该菌株YZ‑375于2023年2月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCCNo:63179。该菌株YZ‑375对刺五加黑斑病及灰霉病病原菌具有较好的拮抗效果，对细极链格孢的抑菌率为75.3％，对灰葡萄孢的抑菌率为88.01％。该菌株YZ‑375对立枯丝核菌、茄腐皮镰孢菌、核盘菌、链格孢菌、毁灭柱孢菌、尖镰孢菌均具有良好的抑制作用，具有广谱抑菌特性。该菌株YZ‑375还具有良好的刺五加叶面定殖能力，对刺五加黑斑病和灰霉病具有较好的防治效果。
Description
技术领域
本发明涉及功能微生物筛选及应用技术领域，具体涉及一种芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YZ-375及其应用。
背景技术
目前，化学途径仍旧是防治真菌性病害的首选措施，但长期施用化学药剂将面临病害严重、加大药量的无限循环，使病原菌产生耐药性，会造成中药材农残超标，破坏绿色生态环境。生物防治由于安全、绿色且对病原菌特性好等特点受到人们的广泛关注，生防微生物通过拮抗作用、竞争作用等方式防控植株病害发生及发展，该类生防微生物在植物病害防治方面发挥着多种有益作用。
目前利用贝莱斯芽孢杆菌防治刺五加黑斑病以及刺五加灰霉病等病害的研究还未见相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YZ-375及其应用，以弥补贝莱斯芽孢杆菌在防治刺五加黑斑病以及刺五加灰霉病领域中的空白。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明提供一种芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YZ-375，该芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YZ-375已于2023年2月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No:63179。
本发明提供一种芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YZ-375在防治刺五加黑斑病中的应用。
本发明提供一种芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YZ-375在防治刺五加灰霉病中的应用。
本发明提供一种芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YZ-375在制备植物病原菌抑制剂中的应用。
作为优选的实施方式，所述植物为刺五加、人参或五味子。
作为优选的实施方式，所述植物病原菌为细极链格孢、灰葡萄孢、立枯丝核菌、茄腐皮镰孢菌、核盘菌、链格孢菌、毁灭柱孢菌或尖镰孢菌。
作为优选的实施方式，所述植物病原菌抑制剂为细极链格孢抑制剂、灰葡萄孢抑制剂、立枯丝核菌抑制剂、茄腐皮镰孢菌抑制剂、核盘菌抑制剂、链格孢菌抑制剂、毁灭柱孢菌抑制剂或尖镰孢菌抑制剂。
作为优选的实施方式，所述植物病原菌抑制剂的活性成分为芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YZ-375的菌悬液或无菌滤液。
本发明的有益效果是：
本发明所筛选的一种芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YZ-375，对刺五加黑斑病病原菌以及刺五加灰霉病病原菌具有较好的拮抗效果，并且对细极链格孢(A.tenuissima)的抑菌率为75.30％，对灰葡萄孢(B.cinerea)的抑菌率为88.01％，芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YZ-375的无菌滤液对细极链格孢(A.tenuissima)和灰葡萄孢(B.cinerea)的抑菌率分别为65.85％和78.46％。同时，芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YZ-375对立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、茄腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、核盘菌(Sclerotinia ginseng)、链格孢菌(Alternariapanax)、毁灭柱孢菌(Cylindrocarpon destructans(Zinss.)Scholtan)、尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)这6种病原真菌均具有不同程度的抑制作用，表现出广谱抑菌特性。通过叶面定殖试验可知芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YZ-375具有良好的刺五加叶面定殖能力；通过盆栽试验可知芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YZ-375对刺五加黑斑病和刺五加灰霉病具有良好的防治效果。本发明为刺五加黑斑病和刺五加灰霉病的绿色防治提供了理论依据，为刺五加生防菌资源的开发与应用提供科学基础。
附图说明
图1为菌株YZ-375对刺五加黑斑病病原菌和刺五加灰霉病病原菌的拮抗效果。图中，1：菌株YZ-375对峙刺五加黑斑病病原菌(细极链格孢(A.tenuissima))；2：菌株YZ-375对峙刺五加灰霉病病原菌(灰葡萄孢(B.cinerea))。
图2为基于菌株YZ-375的16S rDNA部分序列构建的系统发育树。
图3为基于gyrB基因保守序列构建菌株YZ-375的系统进化树。
图4为菌株YZ-375对6种病原真菌的拮抗效果。图中，1：菌株YZ-375对峙立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；2：菌株YZ-375对峙茄腐皮镰孢菌(Fusarium solani)；3：菌株YZ-375对峙核盘菌(Sclerotiniaginseng)；4：菌株YZ-375对峙链格孢菌(Alternariapanax)；5：菌株YZ-375对峙毁灭柱孢菌(Cylindrocarpon destructans(Zinss.)Scholtan)；6：菌株YZ-375对峙尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)。
图5为菌株YZ-375对刺五加黑斑病的防控效果。图中，A：菌株YZ-375；B：苯醚甲环唑；C：枯草芽孢杆菌；CK：清水处理。
图6为菌株YZ-375对刺五加灰霉病的防控效果。图中，A：菌株YZ-375；B：腐霉利；C：枯草芽孢杆菌；CK：清水处理。
具体实施方式
本发明所筛选的一种芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YZ-375，已于2023年2月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼(广东省科学院微生物研究所)，保藏编号为：GDMCC No:63179。
本发明提供一种芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YZ-375在防治刺五加黑斑病中的应用。
本发明提供一种芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YZ-375在防治刺五加灰霉病中的应用。
本发明提供一种芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YZ-375在制备植物病原菌抑制剂中的应用。
作为优选的实施方式，所述植物为刺五加、人参或五味子。
作为优选的实施方式，所述植物病原菌为细极链格孢、灰葡萄孢、立枯丝核菌、茄腐皮镰孢菌、核盘菌、链格孢菌、毁灭柱孢菌或尖镰孢菌。
作为优选的实施方式，所述植物病原菌抑制剂为细极链格孢抑制剂、灰葡萄孢抑制剂、立枯丝核菌抑制剂、茄腐皮镰孢菌抑制剂、核盘菌抑制剂、链格孢菌抑制剂、毁灭柱孢菌抑制剂或尖镰孢菌抑制剂。
作为优选的实施方式，所述植物病原菌抑制剂的活性成分为芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YZ-375的菌悬液或无菌滤液。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
试验材料：
供试土壤刺五加根际土：收集于吉林农业大学药用植物园(43°48′23″N，125°24′57″W)。
供试病原菌：细极链格孢(Alternaria tenuissima(Fr)Wiltshire)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、茄腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)、核盘菌(Sclerotinia ginseng)、链格孢菌(Alternariapanax)、毁灭柱孢菌(Cylindrocarpon destructans(Zinss.)Scholtan)、尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)均由吉林农业大学植物病害综合治理实验室提供。
实施例1菌株YZ-375的筛选、鉴定及保藏
1、培养基的配制；
(1)牛肉膏蛋白胨培养基(beef-protein medium，NA)(以下简称NA培养基)：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂20g/L、pH 7.0～7.2、121℃湿热灭菌30min。
(2)牛肉膏蛋白胨肉汤培养基(beef-protein medium，NB)(以下简称NB培养基)：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、pH 7.0～7.2、121℃湿热灭菌30min。
(3)牛肉膏蛋白胨酵母膏培养基发酵液(beefextract-prptone-yeast extractmedium，BPY)(以下简称BPY培养基发酵液)：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、葡萄糖5g/L、氯化钠5g/L、pH 6.8～7.0、115℃湿热灭菌20min。
(4)马铃薯葡萄糖培养基(potato dextrose agarmedium，PDA)(以下简称PDA培养基)：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L、pH 7.0～7.2、121℃湿热灭菌30min。
(5)马铃薯葡萄糖培养基(PDB)(以下简称PDB培养基)：马铃薯200g、葡萄糖20g、蒸馏水1L。
2、筛选；
(1)收集若干健康刺五加根际土壤样品，风干土壤样品后过20目筛。称取样品10g后放入装有玻璃珠与90mL无菌水的三角瓶中，充分振荡10-30min，混匀后静置5min。无菌条件下梯度稀释至10-4备用，以200μL各稀释液涂布于NA培养基上。每个处理重复3次，平板倒置于恒温培养箱内，30℃纯化培养24-48h，分离出多株纯菌落，进行编号后4℃保存备用。
(2)无菌条件下，挑取细菌各单菌落分别划线接种于NA培养基，于恒温培养箱内30℃倒置培养24h，挑取3块直径约1cm的菌饼接入含50mLNB培养基的100mL三角瓶中，32℃、180r/min震荡培养24h后即得NB细菌培养液；以培养12h的NB细菌培养液1％接入含50mLBPY培养基发酵液的100mL三角瓶中，34℃、180r/min震荡培养24h，即得BPY菌株发酵液。
(3)采用滤纸片法初筛：将活化好的刺五加黑斑病病原菌(细极链格孢(A.tenuissima))和刺五加灰霉病病原菌(灰葡萄孢(B.cinerea))分别制成直径8mm的菌饼，在无菌条件下接种于PDA培养基的平板中心，平板直径为90mm，同时将灭菌的滤纸片浸泡在NB细菌培养液中1min进行阴干，之后将滤纸片粘于距上述平板中心约25mm处的4个对称角点，以单独只接种病原菌为对照，每个处理重复3次，置于25℃恒温培养箱中暗箱培养。待对照组长满平板，对病原菌生长情况进行测量，观察有无抑菌带产生。
(4)采用牛津杯法复筛：将BPY菌株发酵液于4℃、12000r/min离心20min，收集上清液，经0.22μm滤膜进行去菌体，收集无菌滤液。在含PDA培养基的平板中心接种直径为8mm的菌饼，将4个无菌牛津杯放入距上述平板中心约25mm处的4个对称角点，每个无菌牛津杯内加入200μL无菌滤液，以单独接种病原菌为对照，每个处理重复3次，置于25℃恒温培养箱中暗箱培养，待对照组长满平板后，计算抑菌率。抑菌率计算公式为：抑菌率(％)＝(对照菌落半径-对峙培养菌落半径)/(对照菌落半径-4)×100％。
通过分析，将抑菌率最高的一株菌株命名为YZ-375，其中，菌株YZ-375对刺五加黑斑病病原菌(细极链格孢(A.tenuissima))和刺五加灰霉病病原菌(灰葡萄孢(B.cinerea))的抑菌率均达到75％以上，结果如表1所示；菌株YZ-375的无菌滤液对刺五加黑斑病病原菌(细极链格孢(A.tenuissima))和刺五加灰霉病病原菌(灰葡萄孢(B.cinerea))的抑菌率分别为65.85％和78.46％，结果如表2所示。
表1
| 病原菌 | 细极链格孢 | 灰葡萄孢 |
| 抑菌率％ | 75.30±1.29 | 88.01±0.35 |
表2
| 病原菌 | 细极链格孢 | 灰葡萄孢 |
| 抑菌率％ | 65.85±0.86 | 78.46±0.35 |
3、鉴定；
(1)形态学特性以及生理生化特征鉴定
参照资料《微生物学试验手册》、《常见细菌系统鉴定手册》、《伯杰氏细菌鉴定手册》，将菌株YZ-375划线接种于NA培养基中，置于30℃恒温培养箱中培养2-3天，观察单菌落形态特征，并进行革兰氏染色和芽孢染色观察，采用细菌微量生化反应管对碳水化合物代谢试验、酶类试验、柠檬酸盐利用试验及耐盐性等生理生化指标进行测定。
形态学特性鉴定结果：在NA培养基上，YZ-375菌落呈乳白色，表面干燥，边缘褶皱，不透明，革兰氏呈阳性，具有芽孢。
生理生化特征鉴定结果：菌株YZ-375不能利用葡萄糖、蔗糖、木糖、L-阿拉伯糖，可以利用甘露醇，VP测试、OF试验均呈阳性，硫化氢试验结果为阴，明胶水解、淀粉水解均为阳性，能够利用柠檬酸盐，酒石酸盐呈阴性，酪蛋白水解、接触酶、氧化酶、硝酸盐还原均为阳性，最高耐盐浓度为10％。
(2)16S rDNA鉴定：将菌株YZ-375的单菌落接种于NB培养基中，于32℃、180r/min培养24h，离心收集菌体，采用细菌提取试剂盒对细菌DNA进行提取。16S rDNA选择通用引物27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和1492R(5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3)；gyrB选择扩增引物UP-1(GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA)和UP-2r(AG CAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT)，测序引物为UP-1S(GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA)和UP-2Sr(AGCAGGGTACGGA TGTGCGAGCC)。PCR反应体系见表3。16S rDNA基因PCR扩增条件为：94℃、5min；94℃1min；58℃30s；70℃90s；35个循环，72℃10min。gyrB扩增条件：95℃4min；98℃10s；62℃1min；72℃2min；30个循环，72℃8min。上述扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后送至生工生物工程(上海)股份有限公司武汉分公司进行测序。
表3
| 试剂 | 50μL反应体系组成(μL) |
| 基因组DNA | 2 |
| dNTP(10mmoL/L) | 2 |
| 10×Buffer | 5 |
| 27F/UP-1 | 2 |
| 1492R/UP-2r | 2 |
| Taq酶(2.5U/μL) | 2 |
| ddH2O | 35 |
| Total | 50 |
分子鉴定结果：经过测序获得16S rDNA有效序列长度为1424bp(SEQ ID NO：1)(对应GenBank登录号为OK474780)，gyrB有效序列长度为1110bp(SEQ ID NO：2)(对应GenBank登录号为OP731351)。在NCBI通过BLA ST序列比对，并采用MEGA X64软件，通过N-J法构建系统发育树，结果图2和图3显示，菌株YZ-375的16S rDNA有效序列与贝莱斯芽孢杆菌Bacillus ve lezensis聚为一支。因此，结合形态学、生理生化特征、16S rDNA及gyrB综合分析，鉴定菌株YZ-375为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis。
4、保藏；
本发明所筛选的一种芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YZ-375，已于2023年2月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼(广东省科学院微生物研究所)，保藏编号为：GDMCC No:63179。
实施例2菌株YZ-375的广谱抑菌试验
以立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、茄腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、核盘菌(Sclerotiniaginseng)、链格孢菌(Alternariapanax)、毁灭柱孢菌(Cylindrocarpondestructans(Zinss.)Scholtan)、尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)为靶标，利用平板对峙法对菌株YZ-375进行抗菌谱试验。具体操作步骤如下：
用打孔器取直径为8mm的供试病原菌菌饼接种于含有PDA培养基的平板(直径90mm)中心，同时将灭菌的滤纸片浸泡在NB细菌培养液中1min，进行阴干，之后将滤纸片粘于距含有PDA培养基的平板中心约25mm处的4个对称角点，以单独接种供试病原菌为对照，每个处理重复3次，置于25℃恒温培养箱中暗箱培养。待对照组长满平板，计算抑菌率。抑菌率计算公式为：抑菌率(％)＝(对照菌落半径-对峙培养菌落半径)/(对照菌落半径-4)×100％。
结果如表4和图4所示，菌株YZ-375对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、茄腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、核盘菌(Sclerotinia ginseng)、链格孢菌(Alternariapanax)、毁灭柱孢菌(Cylindrocarpon destructans(Zinss.)Scholtan)、尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)均具有明显的拮抗作用，其中对茄腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)和链格孢菌(Alternariapanax)拮抗效果最好，分别为77.44％和75.20％，对尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)的抑制效果较弱，抑菌率为69.21％；菌株YZ-375对其他几种病原菌的抑菌率在69.72％-73.58％之间，由此表明菌株YZ-375的抗菌谱较广。
表4
实施例3菌株YZ-375的抗利福平筛选及在刺五加叶面定殖试验
将菌株YZ-375依次在含有浓度为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL……200μg/mL的利福平NB培养液中培养，逐级诱导利福平的抗性突变，获得突变菌株YZRif-375；以原始菌株YZ-375为对照，观察突变菌株YZRif-375对刺五加黑斑病病原菌(细极链格孢(A.tenuissima))和刺五加灰霉病病原菌(灰葡萄孢(B.cinerea))的抑菌活性是否存在差异性。将突变菌株YZRif-375接种于含500mLBPY培养基发酵液的1000mL三角瓶中，34℃、180r/min培养48h，使用无菌BPY培养基发酵液制成含菌量为107的菌悬液；将10mL菌悬液均匀喷施于刺五加叶面，分别于1d、3d、7d、11d、17d、25d、35d取样回收，每个处理均设置3个盆，每盆1株，每盆随机取刺五加叶组织，将刺五加叶组织表面使用75％乙醇溶液消毒15s，无菌水冲洗数次，称取若干刺五加叶片组织于无菌研钵中研磨成匀浆，溶于10mL无菌水，静置30min，分别稀释至10-3备用，采用平板梯度稀释法测定菌数，取200μL稀释液涂布于含有200μg/mL利福平的NA培养基上，每个处理重复3次，30℃培养3d后，计数培养基表面的菌落数。计算每克鲜重叶片组织中的菌落数(cfu·g-1)。含菌量计算公式为：含菌量＝菌落数×稀释倍数×分离用水量/涂板用水量×分离组织质量(g)。
菌株YZ-375经抗利福平诱导后能在200μg/mL Rif的NA培养基上稳定生长，在不含利福平的NA培养基上连续培养3代后，仍能在200μg/mL RifNA培养基上正常生长，其突变菌株YZRif-375发酵液对刺五加黑斑病病原菌(细极链格孢(A.tenuissima))和刺五加灰霉病病原菌(灰葡萄孢(B.cinerea))仍具有拮抗作用，拮抗效果同原始菌株YZ-375无明显差异，这表明，菌株YZ-375具有遗传稳定性且对刺五加黑斑病病原菌(细极链格孢(A.tenuissima))和刺五加灰霉病病原菌(灰葡萄孢(B.cinerea))仍能保持良好的抑菌活性。
刺五加叶面喷施抗利福平标记菌株YZ-375的菌液，在0-35d内，呈“先减后增再减”的趋势，且不同时期定殖菌量不同，突变菌株YZRif-375定殖菌量不同，突变菌株YZRif-375的叶面定殖菌量如表5所示，突变菌株YZRif-375于第1天时达到最低值，第3天缓慢上升，于第7天达到峰值，定殖菌量达1.43×106。突变菌株YZRif-375在0-35d内，定殖菌量仍能保持103CFU/g鲜叶以上，这说明菌株YZ-375具有良好的叶面定殖能力，可将其用于盆栽防病试验。
表5
实施例4菌株YZ-375的盆栽生防试验
(1)病原菌悬液的制备
将保存的刺五加黑斑病病原菌(细极链格孢(A.tenuissima))和刺五加灰霉病病原菌(灰葡萄孢(B.cinerea))分别接种于PDA培养基中，25℃倒置培养至长满整个平板，之后挑取菌饼接入PDB培养基中制成菌丝悬浮液，过滤，吸干水分后称量菌丝的重量，然后使用无菌水进行稀释，最终将细极链格孢(A.tenuissima)制成菌丝浓度为8.76g/L的菌丝悬浮液，将灰葡萄孢(B.cinerea)制成菌丝浓度为4.68g/L的菌丝悬浮液，菌丝悬浮液于4℃保存备用。
(2)拮抗菌悬液的制备
将菌株YZ-375接种至NA培养基中，30℃培养48h，挑取2-3块直径约1cm的菌落接种于NB培养基中，32℃、180r/min培养12h，再以接种量1％接种于BPY培养基发酵液中，34℃、180r/min培养24h，获得菌株YZ-375菌悬液，使用BPY培养基发酵液将菌株YZ-375菌悬液浓度调至107cfu/mL。
(3)刺五加黑斑病盆栽试验
选取3年生刺五加进行盆栽试验，采用针刺法，将刺五加叶片针刺5-6个伤口，每株针刺的叶片上均涂抹10mL细极链格孢(A.tenuissima)的菌丝悬浮液，并设置4种处理，每个处理5盆，每盆1株。A：菌株YZ-375(菌株YZ-375菌悬液浓度为107cfu/ml)；B：10％苯醚甲环唑(800倍液)；C：1000亿/g枯草芽孢杆菌(1000倍液)；CK：清水处理。
刺五加黑斑病分级标准：0级：叶片完整，无病斑：1级：有少量病斑(占叶片面积的1％-5％)；3级：病斑形成中等数量(占叶片面积的6％-10％)；5级：病斑数量较多(占叶片面积的11％-20％)；7级：病斑很多且较大(占叶片面积的21％-50％)；9级：病斑很多且较大(占叶片面积的51％-100％)。
病情指数＝{∑[(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×9)]}×100。
防治效果＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％。
(4)刺五加灰霉病盆栽试验
选取3年生刺五加进行盆栽试验，采用针刺法，将刺五加叶片针刺5-6个伤口，每株针刺的叶片上均涂抹10mL灰葡萄孢(B.cinerea)的菌丝悬浮液，并设置4种处理，每个处理5盆，每盆1株。A：菌株YZ-375(菌株YZ-375菌悬液浓度为107cfu/ml)；B：50％腐霉利可湿性粉剂(1000倍液)；C：1000亿/g枯草芽孢杆菌(1000倍液)；CK：清水处理。
刺五加灰霉病分级标准：0级：叶片完整，无病斑：1级：有少量病斑(占叶片面积的1％-5％)；3级：病斑形成中等数量(占叶片面积的6％-10％)；5级：病斑数量较多(占叶片面积的11％-20％)；7级：病斑很多且较大(占叶片面积的21％-50％)；9级：病斑很多且较大(占叶片面积的51％-100％)。
病情指数＝{∑[(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×9)]}×100。
防治效果＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％。
(5)刺五加黑斑病盆栽试验为期35天，于接种35天后对刺五加感病情况进行调查。从表6可以看出，在菌株YZ-375接种35d后，对照组刺五加黑斑病的病情指数为45.48，而经过枯草芽孢杆菌、苯醚甲环唑及菌株YZ-375发酵液处理后的刺五加黑斑病病情指数均有所降低。各处理防治效果在68.73％-72.31％之间，处理间无差异，其中菌株YZ-375对刺五加黑斑病的防效达72.31％(图5)，与枯草芽孢杆菌和农药苯醚甲环唑防效相当。
表6菌株YZ-375对刺五加黑斑病的防治效果
| 处理 | 病情指数 | 防治效果％ |
| 菌株YZ-375 | 12.59±2.46b | 72.31±5.4a |
| 1000亿/g枯草芽孢杆菌 | 12.59±1.74b | 72.31±3.82a |
| 10％苯醚甲环唑 | 14.22±0.81b | 68.73±1.78a |
| CK(清水对照) | 45.48±2.20a | — |
刺五加灰霉病盆栽试验为期35天，于接种35天后对刺五加感病情况进行调查。从表7可以看出，菌株YZ-375在接种35天后，对照组刺五加灰霉病的病情指数为24.15，而经过枯草芽孢杆菌、腐霉利、YZ-375发酵液处理后的刺五加灰霉病的病情指数均有所降低。各处理防效在38.04％-51.53％之间，处理间存在差异，其中菌株YZ-375对刺五加灰霉病的防效为38.04％(图6)，不如枯草芽孢杆菌的防效，但与腐霉利防效相当。
表7菌株YZ-375对刺五加灰霉病的防治效果
| 处理 | 病情指数 | 防治效果％ |
| 菌株YZ-375 | 14.96±0.33b | 38.04±1.37b |
| 1000亿/g枯草芽孢杆菌 | 11.70±1.77c | 51.53±7.32a |
| 50％腐霉利 | 13.63±1.78b | 43.56±7.39ab |
| CK(清水对照) | 24.15±1.24a | — |
本发明从健康刺五加根际土中分离筛选出一株对刺五加黑斑病菌和刺五加灰霉病菌均具有拮抗作用的生防细菌YZ-375，菌株YZ-375对刺五加黑斑病病原菌和刺五加灰霉病病原菌的抑菌率分别为75.30％和88.01％，其无菌滤液对刺五加黑斑病病原菌和刺五加灰霉病病原菌的抑菌率分别为65.85％和78.46％；菌株YZ-375对立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、茄腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、核盘菌(Sclerotinia ginseng)、链格孢菌(Alternaria panax)、毁灭柱孢菌(Cylindrocarpon destructans(Zinss.)Scholtan)、尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)6种病原真菌均具有不同程度的抑制作用，表现出广谱抑菌特性。同时，菌株YZ-375具有良好的刺五加叶面定殖能力，且盆栽试验中表明该菌株YZ-375对刺五加黑斑病和刺五加灰霉病具有良好的防治效果。
本发明贝莱斯芽孢杆菌YZ-375对刺五加黑斑病病原菌和刺五加灰霉病病原菌均具有拮抗效果，其对药用植物常见病害表现出广谱抑菌特性，本发明菌株YZ-375在刺五加叶片上具有良好的定殖能力，其对刺五加黑斑病和灰霉病具有一定的防控效果。
本发明公开了一种芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌YZ-375及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
Claims (3)
1.一种芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YZ-375，其特征在于，该芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YZ-375已于2023年2月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No:63179。
2.如权利要求1所述的一种芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YZ-375在防治刺五加黑斑病中的应用。
3.如权利要求1所述的一种芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YZ-375在防治刺五加灰霉病中的应用。
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