ES2207775T3 - Microorganismos inactivados que contienen enzimas digestivas, procedimiento para su preparacion y su uso en el sector alimenticio. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN NUEVO PROCEDIMIENTO DE OBTENCION DE MICROORGANISMOS INACTIVADOS, QUE SE PUEDEN UTILIZAR VENTAJOSAMENTE COMO VEHICULOS DE ENZIMAS DIGESTIVAS EN ALIMENTOS Y, ADEMAS, PRESENTAN UNA ACTIVIDAD PROBIOTICA. SE DESCRIBE LA UTILIZACION DE DICHOS MICROORGANISMOS INACTIVADOS EN EL SECTOR ALIMENTARIO, TANTO COMO PARA CONSUMO HUMANO, COMO PARA USOS VETERINARIOS Y, EN ESPECIAL, COMO COMPONENTES DE PREMEZCLAS Y PIENSOS EN ZOOTECNIA.
Description
Microorganismos inactivados que contienen enzimas
digestivas, procedimiento para su preparación y su uso en el sector
alimenticio.
La presente invención trata de un nuevo
procedimiento para la obtención de microorganismos inactivados que
pueden ser convenientemente usados como vehículos de enzimas
digestivas y como agentes probióticos, tanto para consumo humano
como con propósitos veterinarios, y en especial como componente de
premezclas y alimento animal para la cría de ganado.
El procedimiento digestivo tiene la función de
transformar los productos alimenticios (proteínas, carbohidratos y
lípidos) en sustancias de estructura única que se pueden absorber
a través de la pared intestinal. Este procedimiento comprende
esencialmente enzimas que pueden ser producidas por órganos
internos, como las amilasas salivales y pancreáticas, pepsina,
proteasas, sacaridasas y lipasas intestinales. Además, pueden estar
involucradas en el procedimiento digestivo enzimas de la flora
intestinal como la celulasa. En realidad, solamente las especies
animales herbívoras son capaces de metabolizar la celulosa, y esto
es posible debido precisamente al tipo especial de flora intestinal
y ruminal.
Dado que la absorción tiene lugar solamente
después de la completa transformación de las sustancias
alimenticias en sus componentes de estructura simple, excepto en el
caso de los lípidos, es evidente la utilidad del suministro de
enzimas digestivas para garantizar las mejores condiciones de
catabolismo de las sustancias nutrientes. Esta necesidad se debe
tener en cuenta tanto en el caso de disfunción de órganos
secretores como en el caso de viabilidad reducida de la microflora
intestinal, que es la responsable de la biosíntesis enzimática. Este
último caso se puede encontrar frecuentemente en el sector de la
zootecnia, a menudo en relación con tratamientos antibióticos con
propósitos preventivos. Este tratamiento es la causa de
alteraciones del ecosistema microbiano intestinal, que inclusive
pueden ser considerables, con la consiguiente reducción de la
biosíntesis enzimática endógena.
En la cría de ganado, la optimización del uso de
la comida por parte de los animales mismos representa un papel
fundamental en el logro del máximo grado de competitividad,
teniendo un efecto considerable sobre la calidad del producto final
(por ejemplo carne y leche). En especial, en especies animales de
cría, en vista del origen predominantemente vegetal de su
alimentación de base, las enzimas producidas por la flora intestinal
asumen una importancia fundamental.
Además, en zootecnia, la optimización del
procedimiento digestivo tiene como resultado una mejoría del estado
general de salud del animal, en una significativa reducción de los
costes, así como en una reducción del impacto medioambiental
derivado de los desechos orgánicos. De hecho, en la cría de cerdos,
por ejemplo, debido a la falta de fitasas, se usan dietas
especialmente ricas en fosfatos, siendo estas sustancias una de
las mayores fuentes de polución del medio ambiente que se derivan
de estas actividades de cría.
Dada la importancia de un equilibrio enzimático
intestinal apropiado y la influencia que esto puede tener sobre la
cría de animales, se justifica la necesidad de un suministro
enzimático exógeno, especialmente en especies animales sometidas a
hiperalimentación y tratamiento farmacológico intensivo con
propósitos preventivos, como se ha mencionado anteriormente.
Este resultado se puede obtener asociando enzimas
apropiadas, como celulasas, fitasas, proteasas, lipasas, etc., al
alimento normal del ganado. La presencia de enzimas en cantidades
óptimas ocaciona, en realidad, un aumento del procedimiento
digestivo, facilitando la asimilación de las macro y micro
moléculas.
Sin embargo, los procedimientos para la
administración de enzimas conocidos a la fecha de acuerdo con el
estado actual de la técnica están limitados por problemas
relacionados a la fácil inactivación biológica de estas estructuras
de naturaleza proteica, que se caracterizan por una alta
inestabilidad estructural, siendo especialmente sensibles a
variaciones físico-químicas y químicas del medio
ambiente como pH, temperatura, luz, mezcla con otros componentes,
presencia de sustratos de reacción, presencia de enzimas
proteolíticas, etc. Por esta razón, su uso requiere de metodologías
y precauciones especiales con el objeto de conservar inalteradas
sus propiedades originales.
En el estado actual de la técnica, se conoce el
modo de administración de enzimas en forma protegida, por ejemplo,
en forma de gránulos protegidos de la acción gástrica o en forma de
extracto, en la medida que la presencia simultánea de inhibidores
específicos es capaz de reducir convenientemente la cinética de
degradación enzimática. Además se conoce el uso de enzimas que son
sometidas a inmovilización de fase inerte.
Sin embargo, las metodologías antes mencionadas
revelan diversas desventajas, tales como:
- los tratamientos requeridos pueden provocar la
inactivación de la enzima;
\newpage
- altos costes, que están lejos de ser
compatibles con aplicaciones extensivas, por ejemplo, en el sector
de la zootecnia;
- dificultad de uso en la industria de alimentos
animales debido a las condiciones de tensión
físico-químicas habitualmente presentes en los
procedimientos de preparación y mezcla de los alimentos.
Por lo tanto, se percibe la necesidad de un nuevo
procedimiento de administración de enzimas que sea conveniente y
económico, tanto en el campo humano como para propósitos
veterinarios, que pueda proponerse convenientemente a larga escala,
a costes industrialmente accesibles.
El objeto de la presente invención es un
procedimiento para producir microorganismos inactivados que
contienen enzimas digestivas, que comprende las siguientes
etapas:
1) extracción de la masa endocelular de las
células de un microorganismo apropiado, por medio de tratamiento
hiperosmótico, y separación de la masa endocelular extraída;
2) potencial inactivación del microorganismo
obtenido en la etapa (1) por medios químicos o físicos, manteniendo
inalterada la membrana externa del microorganismo;
3) inserción intracelular de una o más enzimas
digestivas en el microorganismo inactivado obtenido en la etapa (1)
o (2) por medio de tratamiento hipo-osmótico,
tratando a dicho microorganismo en una solución hipotónica que
contiene el material endógeno que fue extraído en la etapa (1), al
que potencialmente se añaden las enzimas digestivas de otra
naturaleza y otros nutrientes esenciales, o en una suspensión
acuosa hipotónica que contiene dichas enzimas digestivas y otros
nutrientes esenciales.
La presente invención, además, trata de
microorganismos que contienen enzimas digestivas, obtenidas con el
procedimiento descrito anteriormente, las composiciones que las
contienen, su posible asociación con alimentos, excipientes y/o
diluyentes apropiados, así como su uso en alimentos, tanto en el
campo humano como con propósitos veterinarios, y en especial en
zootecnia como componentes de alimentos animales y premezcias para
ganado.
Las características y ventajas del procedimiento
para la producción de microorganismos inactivados enriquecidos con
enzimas digestivas, de los microorganismos así obtenidos, de las
composiciones que los contienen, y su uso en el sector de
alimentación humana o veterinaria, de acuerdo con la presente
invención, serán ilustradas más ampliamente en el curso de la
descripción detallada que sigue.
La presente invención posibilita la
administración de enzimas digestivas incorporadas dentro de las
paredes celulares de microorganismos que han sido inactivados, es
decir, "muertos", capaces de proteger las características
estructurales y actividad de las mismas.
Los microorganismos pueden ser:
(i) microorganismos no productores de enzimas
digestivas específicas usadas, después de su inactivación, como
vehículos de una o más enzimas digestivas;
(ii) microorganismos productores de una o más
enzimas digestivas;
(iii) microorganismos no productores de enzimas
digestivas específicas, pero que pueden ser acondicionadas para
producir estas enzimas.
En los tres casos anteriores, los microorganismos
pueden ser usados para transportar enzimas producidas o no
producidas por los propios microorganismos.
En el caso (i), las cepas de microorganismos
usadas como transportadores de enzimas de origen animal o vegetal,
deben tener características apropiadas de resistencia, dado que
deben ser capaces de alcanzar el intestino estructuralmente
intactas.
Entre las cepas conocidas disponibles en el
mercado, se prefiere la Saccharomyces cerevisiae, que posee
características de resistencia estructural al ataque de agentes
químicos y físico-químicos, y es capaz de alcanzar
intacta el sitio en el que tiene lugar el procedimiento digestivo.
Dicho microorganismo además desempeña una conveniente actividad
probiótica, como se describe en la Patente Europea Nº
EP-O-111202.
Antes de la fase de vaciado, se pueden hacer
desarrollar los microorganismos en fermentadores apropiados, de
acuerdo con los procedimientos y condiciones conocidos en el estado
actual de la técnica, y se separa la masa de microorganismos del
medio de cultivo, al finalizar la fase de desarrollo, por medio de
filtración o centrifugación.
En el caso (ii), es posible usar microorganismos
conocidos por la producción de enzimas digestivas específicas, que
pertenecen normalmente a la microflora intestinal (por ejemplo,
Bacillus subtilis y Lactobacillus sp.) y son
fácilmente obtenibles en el mercado. La capacidad de dichos
microorganismos para producir enzimas, puede verificarse
previamente por medio de técnicas conocidas en el estado actual de
la técnica.
Además, dichos microorganismos pueden ser
acondicionados, de acuerdo con los procedimientos conocidos en el
estado actual de la técnica con el propósito de optimizar el
rendimiento industrial de la enzima producida.
Antes de la etapa de vaciado (1) del
procedimiento de la invención, se obtiene el desarrollo
fermentativo de los microorganismos, con la producción de enzimas
digestivas, de acuerdo con técnicas por partidas o continuas usadas
comúnmente en el estado actual de la técnica, por ejemplo en la
operación de condiciones referidas en Biochemical Engineering
and Biotechnology Handbook, B. Atkinson and F. Mavituna Eds.,
1991, MacMillan Publ., Capítulo 6.7.
Los microorganismos pueden ser separados del
medio de cultivo por filtración o centrifugación, recuperando el
sobrenadante en el caso de que las enzimas de interés sean
exo-enzimas (es decir, sean liberadas en el medio de
cultivo). El sobrenadante es entonces concentrado, y las enzimas de
interés pueden ser recuperadas por precipitación salina con sulfato
de amonio, como ha sido descrito por Robert K. Scopes en
Protein Purification, Principles and Practice, Cap. 3,
Páginas 39-52, Springer-Verlag Inc.,
Nueva York, 1982. El precipitado proteico puede entonces ser
separado por filtración, re-suspendido en agua y
sometido a diálisis con un tamaño molecular límite de 2.000/5.000
daltons contra agua durante 48 horas, realizando dichas operaciones
bajo enfriamiento. Este precipitado, cuya actividad enzimática
específica debe ser verificada usando procedimientos estándar (ver,
por ejemplo, A. J. Pesce y L. A. Kaplan, Methods in Clinical
Chemistry, The C. V. Mosby, Company, 1987, páginas
817-821 para amilasas; páginas
848-853 para lipasas, páginas
857-881 para tripsina), puede usarse seguidamente
en la etapa de reincorporación (3).
El grado de pureza de las proteínas obtenidas de
este modo se puede evaluar por medio del control de movilidad
electroforética, como describe Robert K. Scopes en Protein
Purification, Principles and Practice, Cap. 9, Páginas
245-254, Springer-Verlag Inc., Nueva York, 1982.
245-254, Springer-Verlag Inc., Nueva York, 1982.
Los microorganismos usados en el caso (iii) son
preferentemente cepas "vulgares", aisladas de materia fecal
humana y pertenecientes a la denominada flora intestinal
"buena", o de la flora intestinal "buena" de materia
fecal, intestinal o ruminal y de otras fuentes de las diferentes
especies de ganado. El aislamiento se realiza de acuerdo con
procedimientos conocidos en el estado actual de la técnica para el
desarrollo de microflora en cultivo nutritivo y la subsiguiente
selección de las colonias sobre la base de sus características
morfológicas y taxonómicas. La caracterización de las cepas
aisladas de acuerdo con las metodologías comúnmente usadas, por
ejemplo por el análisis de la tinción de Gram, comportamiento
metabólico, producción de productos químicos característicos, y
características nutritivas.
Las cepas antes mencionadas, que inicialmente no
son capaces de producir la enzima deseada, son sometidas a un
procedimiento de acondicionamiento para la producción de enzimas
específicas, usando procedimientos comúnmente empleados en el
estado actual de la técnica. El acondicionamiento se realiza por
enriquecimiento gradual del medio de cultivo del microorganismo con
el sustrato que metaboliza la enzima a ser producida, en
concentraciones que se aumentan de manera progresiva, y reduciendo
al mismo tiempo las otras fuentes de elementos presentes en el
cultivo nutritivo, hasta que dicho material represente la fuente
esencial de energía para el microorganismo. De esta manera, el
microorganismo es inducido a producir las enzimas involucradas en
la metabolización de este material, que constituye la fuente
predominante de nutrición para su crecimiento y desarrollo.
Con el aumento en el medio de cultivo del
material a ser metabolizado, se nota una reducción en el número de
microorganismos que son capaces de reproducirse en esas
condiciones, hasta que se obtiene la selección de las cepas
condicionadas que son apropiadas para la producción de sistemas
enzimáticos específicos, que se pueden caracterizar y posiblemente
aislar sobre la base de sus propiedades taxonómicas. En general, se
requieren al menos 36-72 ciclos de crecimiento para
obtener los resultados mencionados anteriormente.
Por ejemplo, en el caso de microorganismos que
producen celulasas, son acondicionados al uso de sustratos como
celulosa y fitatos como fuente principal de nutrientes
alimenticios esenciales (C, N y O).
El control de la producción de las enzimas
deseadas se realiza por medio de un análisis del contenido
proteico, por ejemplo de acuerdo con el método biuret (kit SIGMA,
Código 690-A, catálogo 1992), y de la actividad
enzimática específica del medio de cultivo, de acuerdo con los
procedimientos conocidos en el estado actual de la técnica, en el
caso en que las enzimas producidas sean exo-enzimas.
En el caso, en cambio, de endo-enzimas, las
determinaciones de actividad antes mencionadas deben ser precedidas
por un análisis del contenido endocelular de una parte de los
microorganismos, que se logra "exprimiéndolos" en un medio
hipertónico.
Después de la etapa de acondicionamiento, también
estos microorganismos son sometidos a un procedimiento de
fermentación para producir las enzimas deseadas, como se ha
descrito anteriormente, antes de proceder con la etapa de vaciado
(1).
Las enzimas digestivas vehiculizadas usando el
procedimiento de la invención pueden ser
endo-enzimas, que permanecen dentro del
microorganismo, o exo-enzimas, que son liberadas
hacia el medio de cultivo. Estas enzimas son preferentemente
seleccionadas del grupo formado por amilasas, sacaridasas, lipasas,
proteasas, pectinasas, celulasas, y peptidasas (carboxipeptidasas,
aminopeptidasas, dipeptidasas, y tripeptidasas).
Para la producción de amilasas y sacaridasas, las
cepas que las producen pertenecen preferentemente a las especies
Acinetobacter, Bacillus, Aspergillus, y Endomyces, y
en especial se eligen del grupo formado por Bacillus subtilis,
Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus
amyloliquefaciens, Bacillus polymyxa, Aspergillus niger,
Aspergillus oryzae, y Micrococcus halobius.
Para la producción de lipasas, se usan
preferentemente microorganismos de las especies Lactobacillus,
Micrococcus y Aspergillus, y en especial se eligen del
grupo formado por Aspergillus niger, Aspergillus oryzae y
Lactobacillus acidofilus.
Para la producción de proteasas, que se pueden
diferenciar de acuerdo con el sitio de enlace aminoácido de
interacción, se usan preferentemente microorganismos de las
especies Pseudomonas, Streptomyces y Bacillus, y en
especial se eligen del grupo formado por Bacillus subtilis,
Bacillus licheniformis, Bacillus thermoproteolyticus, Aspergillus
niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus melleus y Escherichia
cola.
Para la producción de pectinasas, se usan
preferentemente microorganismos de las especies Acrocylindrum,
Aspergillus y Penicillum, y en especial se eligen del
grupo formado por Aspergillus niger, Aspergillus alliaceus,
Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae, Fusarium oxysporum,
Clostridium multifermentans, Bacillus subtilis y
Pseudomonas fluorescens.
Otros microorganismos que pueden ser usados
convenientemente en el procedimiento de la invención, así como
algunas de sus fuentes, se informan en Biochemical Engineering
and Biotechnology Handbook, B. Atkinson y F. Mavitunas
Eds., 1991, MacMillan Publ., Capítulos 6.1, 6.7 y 9.5.
Además, se pueden usar convenientemente
microorganismos que producen celulasas, entre ellos endoglucanasas,
cellobiohidrolasas y betaglucosidasas.
Estos microorganismos pueden ser bacterias de las
especies Ruminococcus, Cellulomonas y Pseudomonas, y
en especial Pseudomonas fluorescens; hongos de las especies
Penicillium, Aspergillus y Trichoderma, y en especial
Penicillium funiculosum, Aspergillus niger, Trichoderma reesel,
Trichoderma viride y Trichoderma konlugir,
actinomycetes de las especies Streptomyces y
Thermoactinomyces.
En la etapa de vaciado (1), se provoca la salida
de la masa endocelular fuera de las paredes celulares del
microorganismo por medio del tratamiento hiperosmótico de
"exprimido" de los microorganismos obtenidos como se describe
anteriormente. En el caso de que los microorganismos sean
sometidos previamente a fermentación con el objetivo de producir las
enzimas digestivas deseadas, las últimas se obtienen en el máximo
pico de la curva de crecimiento celular, antes de empezar con la
fase de estasis.
La etapa (1) se realiza mediante la suspensión de
la masa de microorganismo en una solución acuosa hipertónica que
contiene:
- NaCl en concentraciones por encima de
0,2-0,3 M;
- citrato de sodio en concentraciones por encima
de 0,05 M;
- un agente antibacteriano apropiado,
preferentemente timerosal (en especial Merthiolate®, catálogo Sigma
1995), en concentraciones adecuadas.
La solución hipertónica antes mencionada contiene
preferentemente NaCl 1 M, citrato de sodio 0,1 M, y timerosal 0,1
mg/l.
La suspensión así obtenida se mantiene bajo
agitación a una temperatura en el intervalo entre 2 y 8°C,
preferentemente 4°C, durante un período de entre 2 horas y 4 días,
preferentemente 72 horas, logrando el exprimido de los
microorganismos a medida que el contenido endocelular es expulsado
hacia el medio hipertónico. La masa endocelular, cuya salida de las
células se provoca, puede comprender también las enzimas
digestivas producidas. En realidad, de este modo es posible
salvaguardar la estructura química de las enzimas, que podrían ser
irremediablemente dañadas en la etapa subsiguiente de inactivación
del microorganismo (etapa 2).
Los microorganismos así vaciados y reducidos a
sus paredes celulares solamente son más pequeñas de lo normal, y
los poros de la membrana están agrandados. Los microorganismos
pueden ser separados de la masa endocelular que ha salido hacia el
medio de suspensión usando técnicas conocidas en el estado actual
de la técnica, y preferentemente por medio de filtración o
centrifugación.
El control del vaciado de las paredes de los
microorganismos se puede realizar convenientemente por evaluación
microscópica de la morfología de las paredes mismas, que se
presentarán más pequeñas y arrugadas.
Una vez que la etapa de vaciado ha finalizado, el
medio de suspensión (es decir, la solución tampón hipertónica y el
contenido endocelular que ha sido extraído) pueden separarse de
los microorganismos vaciados por medio de centrifugación a
8000-15000 r.p.m., preferentemente a 10000 r.p.m. En
el caso de los microorganismos (ii) y (iii), el medio de suspensión
es tratado apropiadamente para la recuperación de las enzimas
contenidas en ellos y por la eliminación de la
hiper-concentración salina. En especial, este medio
puede dializarse con un límite molecular de 2000 daltons, y el
contenido enzimático puede aislarse por precipitación salina con
sulfato de amonio, como se ha descrito anteriormente. El precipitado
obtenido de este modo se puede entonces resuspender en agua,
dializar con el objeto de eliminar el sulfato de amonio, y
finalmente usarse para la preparación del medio hipotónico usado
en la etapa (3).
En la etapa (2), los microorganismos que se han
vaciado de sus masas endocelulares se pueden inactivar, es decir
matar, por medio de un tratamiento químico o físico apropiado. Este
tratamiento puede no ser necesario para ciertos microorganismos, en
la medida que el tratamiento hipertónico de la etapa (1) en muchos
casos demuestra ser suficiente para inactivar las células. Por lo
tanto, esta etapa (2) puede realizarse después que se ha
verificado el estado de inactivación de los microorganismos
obtenido por la etapa (1).
Entre los procedimientos químicos preferentemente
usados para los microorganismos que tienen paredes celulares que
son fácilmente degradables por el calor, se pueden emplear
tratamientos que usan sustancias desinfectantes (con
concentraciones de 0,05-0,2 mg/l), durante un
período de 2-12 horas, y preferentemente con
timerosal, a una concentración de 0,2 mg/l, durante un período de
6-8 horas.
Esta inactivación química se puede realizar
también durante la etapa previa de vaciado, añadiendo la sustancia
desinfectante antes mencionada a la solución hipertónica.
Los tratamientos físicos comprenden
preferentemente, la exposición a rayos UV e inactivación térmica,
mediante el calentamiento de la suspensión obtenida en la etapa
(1), a una temperatura que varía entre 55 y 65°C, preferentemente
60°C, y aislando finalmente los microorganismos inactivados por
concentración y filtración.
Este tratamiento se puede realizar también al
comienzo de la etapa (3) de re-integración
intracelular en medio hipotónico. En este caso, los microorganismos
vaciados obtenidos en la etapa (1) se suspenden en una parte del
medio hipotónico que contiene las enzimas a ser reincorporadas, y
la mezcla así obtenida es entonces calentada en las condiciones
referidas anteriormente. Después de enfriarla a
2-8ºC preferentemente a 4°C, se añade la parte
restante del medio hipotónico, y se procede con la etapa de
re-integración intracelular como se ha descrito en
la etapa (3).
Las condiciones de inactivación deben ser tales
que no provoquen alteraciones en la estructura parietal de los
microorganismos y, por lo tanto, deben seleccionarse de acuerdo
con las características de resistencia del microorganismo en sí
mismo. El control del grado de inactivación de las células del
microorganismo al final de la etapa (2) se puede realizar usando
pruebas de cultivo del modo siguiente: una pequeña parte de las
células de microorganismos tratadas se resuspenden en una parte de
la masa endocelular extraída previamente, después de la diálisis de
la misma para la eliminación de las sales y después de haber
restablecido su isotonicidad. Cuando las células han readquirido
su forma original, se inocula aproximadamente 1 g o 1 ml de sus
suspensión en un medio de cultivo selectivo (aproximadamente
15-25 ml de caldo nutritivo), y se dejan las
células en incubación ( a aproximadamente 37°C para bacterias; a
aproximadamente 25°C en el caso de Mycetos), durante un período de
36-48 horas.
Dado que esta primera fase puede no ser
suficiente para restablecer totalmente la viabilidad del
microorganismo, se puede repetir la siembra en otros transplantes
subsiguientes (preferentemente 3), usando el caldo obtenido en la
primera etapa. Los procedimientos de crecimiento se controlan
mediante el análisis de la concentración de colonias presentes por
medio de análisis turbidimétrico, o bajo el microscopio (sobre
portaobjetos después de ser teñidos), o también usando contadores
de colonias.
En la etapa (3), tiene lugar la integración
intracelular en las células de microorganismos inactivados, de una
o más enzimas digestivas a ser vehiculizadas, por medio del
tratamiento de dichas células inactivadas con una solución acuosa
hipotónica que contiene dichas enzimas, bajo una suave agitación,
durante un período suficientemente largo para posibilitar la
reincorporación del material a las células, es decir,
preferentemente entre 4 horas y 4 días, más preferentemente aún 72
horas, a una temperatura en el intervalo entre 2 y 8°C,
preferentemente de 4°C.
La solución hipertónica mencionada contiene
preferentemente:
- NaCl en concentraciones menores de 0,12 M;
- citrato de sodio en concentraciones menores de
0,025 M;
- un agente antibacteriano apropiado,
preferentemente timerosal (en especial Merthiolate®, catálogo Sigma
1995) en concentraciones apropiadas.
Preferentemente la mencionada solución
hipertónica contiene NaCl 0,05 M, citrato de sodio 0,005 M, y
timerosal 0,1 mg/l.
Durante la operación de reintegración
intracelular, la biomasa y el material ) enzimático contenido en la
suspensión hipotónica son absorbidos dentro de los microorganismos
inactivados, que recuperan su forma original. El control de la
reabsorción se puede realizar evaluando la cantidad de enzimas
todavía presente en la suspensión acuosa hipotónica, o por medio
de tisis de algunas de las células de microorganismos y
determinación de la actividad enzimática del lisado.
En el caso de células usadas solamente como
agentes vehiculizadores (caso (i)), los microorganismos inactivados
se pueden sumergir en un medio de suspensión hipotónico que
contiene una o más enzimas digestivas, de naturaleza animal o
vegetal, no producidas por los microorganismos usados (por lo tanto
no contenidas en la masa endocelular extraída), con la posible
adición de otros nutrientes esenciales como vitaminas y
glúcidos.
Por el contrario, en el caso de que se usen los
microorganismos (ii) y (iii), dicha suspensión acuosa puede
consistir en la masa endocelular extraída en la etapa (1) que
contiene las enzimas digestivas producidas previamente por el
microorganismo, con la posible adición de otras enzimas digestivas
de interés y nutrientes esenciales, como vitaminas y glúcidos. El
medio de suspensión que contiene la masa endocelular obtenida en
la etapa (1) se somete previamente a diálisis con el objeto de
eliminar la hiperconcentración salina provocada por el tratamiento
hiperosmótico previo y restablecer al medio de suspensión las
condiciones de isotonicidad.
En el caso de que las enzimas producidas por el
microorganismo sean exo-enzimas, el medio de
suspensión puede estar formado por enzimas recuperadas del caldo
de fermentación o de la fase de fermentación previa, como se
describe anteriormente, o de la masa endocelular exprimida en la
etapa (1). De manera diferente, en el caso de
endo-enzimas, solo se usa la masa endocelular
mencionada.
Los microorganismos obtenidos en la etapa (3) se
pueden finalmente concentrar, preferentemente por medio de
filtración, hasta obtener pequeños volúmenes de medio hipotónico, o
se pueden usar directamente en la preparación de composiciones
alimenticias. Estos microorganismos sirven como vehículos
excelentes, a nivel intracelular, de las enzimas digestivas mismas y
posibilita su administración en alimentos tanto para humanos como
para propósitos veterinarios. Estos microorganismos son
especialmente útiles en zoo-técnicas, en las que
trabajan de manera sinérgica con las enzimas endógenas en el
procedimiento digestivo de diversos nutrientes.
Después de la ingesta de los microorganismos de
la invención por humanos o animales por medio de los alimentos, a
nivel de la liberación en la fase de metabolización, la
fragmentación de las paredes celulares de los microorganismos
conduce a la liberación de las enzimas digestivas incorporadas en
los microorganismos enriquecidos. Dado que las enzimas protegidas
de esta manera no se ponen en contacto con factores inactivadores
externos, mantienen sus propiedades originales inalteradas.
Estos microorganismos no solo desempeñan un papel
como vehículos a nivel intestinal, sino también poseen una función
probiótica en la medida que conducen a una mejoría en el estado
general de salud del animal y, consecuentemente, en la calidad del
producto a ser consumido (leche, huevos, carne, etc.). En especial,
los microorganismos de la invención muestran los siguientes efectos
farmacológicos:
- función probiótica: los fragmentos no
poliméricos del microorganismo, obtenidos por la fragmentación que
ocurre en el animal a nivel intestinal, tienen un valor
nutritivo;
- mejoría de las condiciones de crecimiento de la
denominada microflora intestinal "buena", como bifidobacterias
y lactobacillus;
- efectos inmunoestimulantes: en realidad,
algunos componentes de la membrana del microorganismo, como
glucoproteínas y peptidoglicanos, son capaces de estimular las
reacciones inmunoprotectoras del animal mismo;
Los efectos antes mencionados permiten alcanzar
ventajas sorprendentes, que incluyen:
- mejoría del procedimiento digestivo, con mayor
absorción de nutrientes;
- mejoría de la respuesta inmunológica de los
animales a enfermedades infecciosas, con una reducción en la
cantidad de antibióticos que se necesita usar para prevenir
enfermedades;
- mejoría de las curvas de crecimiento de los
animales y consecuente reducción en los costes de crianza.
Finalmente, los microorganismos inactivados de
acuerdo con la presente invención ofrecen la ventaja de permitir
una dispersión homogénea de las enzimas digestivas en la comida,
evitando de este modo acumulación indeseada de estas sustancias y
permitiendo la administración de cantidades óptimas, controlables y
reproducibles de enzimas digestivas en los animales del ganando.
Por lo tanto, otro objeto de la presente
invención es el uso de los mencionados microorganismos inactivados
que contienen enzimas digestivas en el sector de la alimentación,
tanto para humanos como para propósitos veterinarios, y
preferentemente en zootecnia, en la cría de ganado.
Finalmente, otro objeto de la presente invención
está representado por composiciones alimenticias, utilizables en
alimentos destinados a humanos o para uso veterinario, que
comprenden uno o más microorganismos inactivados enriquecidos con
enzimas digestivas, como se ha descrito anteriormente, en asociación
con alimentos convencionales, y posiblemente en presencia de
excipientes y/o diluyentes apropiados. La cantidad de
microorganismos a ser administrada varía de acuerdo con la especie
animal tratada, la dieta seguida, el estado general de salud de los
animales y las condiciones de cría, y se encuentra preferentemente
entre 0,1 y 20 g por kg de alimento para ganado, y entre 0,1 y 5
g/día en alimentos para uso humano. En el caso de gallinas, los
microorganismos de la invención se administran preferentemente en
cantidades entre 30 y 70 mg/día.
Las composiciones mencionadas se usan
preferentemente en zootecnia en forma de premezcia o alimentos. En
realidad, las paredes celulares del microorganismo pueden proteger
las características estructurales y actividad de las enzimas
contenidas en ellas tanto en la fase de preparación de la mezcla
como durante su pasaje a través del sistema gastrointestinal.
Para proporcionar una ilustración de la presente
invención, se ofrecen los siguientes ejemplos que no son
limitantes.
Células de Saccharomyces cerevisiae
aisladas de subproductos del procesamiento del azúcar usando
técnicas de laboratorio habituales, se hicieron crecer por
fermentación en melaza de caña de azúcar en un fermentador de 75
m^{3}, con aireación de 2 mM de O_{2}/l/min, bajo agitación de
vvm, a una temperatura de 30°C, con un pH de
4,5-5,5, y una densidad de cultivo de
40-45 g/l. Las células fueron entonces separadas
por medio de centrifugación a 10.000 r.p.m. durante 15 minutos
para obtener 0,5 g de un producto seco (correspondiente a 15 x
10^{9} células) por 1 g de sustrato original.
1 kg de las células de Saccharomyces
cerevisiae obtenidas de este modo fueron suspendidas en 25 l de
una solución acuosa hipertónica que contenía NaCl 1 M, citrato de
sodio 1 M, y Merthiolate® 0,1 mg/l (catálogo Sigma 1995), y se dejó
la suspensión bajo agitación suave durante 72 horas, a una
temperatura de 4°C. La suspensión así obtenida se centrifugó
entonces a 10.000 r.p.m. durante 15 minutos, y se recuperaron las
células.
Se preparó una cantidad de 25 (EL ORIGINAL NO
DICE MEDIDA) de una solución acuosa hipotónica que contiene NaCl
0,05 M, citrato de sodio 0,005 M, y Merthiolate® 0,1 mg/I (catálogo
Sigma 1995).
Esta solución se enfrió hasta 4°C, y se añadieron
25,6 g de la enzima \alpha-quimiotripsina tipo
l-S, obtenida de páncreas bovino
(40-60 unidades/mg; Código C 7762; catálogo Sigma
1992), y se mantuvo la mezcla bajo agitación suave hasta su
completa disolución.
En esta solución hipotónica que contiene la
enzima que se ha de introducir dentro de los microorganismos
inactivados, se suspendieron las células de Saccharomyces
cerevisiae obtenidas como se describió anteriormente; la mezcla
se mantuvo bajo agitación suave durante un período de 72 horas, a
una temperatura de 4°C. La absorción de la enzima fue verificada
analizando el contenido proteico del medio hipotónico, aplicando
el método de Lowry (kit Sigma Código P5656, 1992) y por el
análisis del contenido endocelular de una pequeña parte de las
células de microorganismos tratadas, determinando la actividad
enzimática específica del lisado después de destruir dichas
células.
Al finalizar la introducción intracelular de la
enzima, se centrifugó la suspensión a 10.000 r.p.m. durante 15
minutos. Las células de microorganismos se recolectaron entonces y
se lavaron tres veces con una solución hipotónica estéril
(proporción de volumen 1:10), manteniendo la suspensión bajo
agitación suave en cada lavado durante 1-2 horas, y
centrifugando seguidamente en las condiciones indicadas
anteriormente. Finalmente se recolectaron las células en un pequeño
volumen de solución hipotónica estéril (aproximadamente
4-5 l).
Dos grupos de 30 conejos en fase de crecimiento,
y dos grupos de 30 ratas en fase de crecimiento, pertenecientes a
ambos sexos, fueron sometidos a tratamiento con alimento
enriquecido con células inactivadas de Saccharomyces
cerevisiae que contenían
\alpha-quimiotripsina, preparadas de acuerdo con
el Ejemplo 1, durante un período de 45 días para las ratas y 90
días para los conejos, de acuerdo con el siguiente esquema:
Grupo 1: 15 machos y 15 hembras, con acceso libre
al alimento que consistía en alimento corriente;
Grupo 2: 15 machos y 15 hembras, con acceso libre
al alimento que consistía en el alimento descrito anteriormente,
enriquecido con los microorganismos de acuerdo con el Ejemplo 1,
en cantidad de 5 g por kg de alimento.
El estado general de los animales sometidos a
estudio fue controlado cada día, y se evaluó cada 7 días la curva
de peso corporal y consumo de alimento.
\newpage
La Tabla 1 proporciona las diferencias
porcentuales, comparado con los controles, para las dos especies
animales probadas, al final del período de tratamiento.
| Animal | % de variación respecto a los controles | |
| Peso corporal | Consumo de alimento | |
| Rata macho | +24,5 | -7,3 |
| Rata hembra | +17,7 | -5,7 |
| Conejo macho | +21,9 | -6,5 |
| Conejo hembra | +18,5 | -6,0 |
Los resultados expuestos arriba muestran un
aumento significativo del peso corporal en los animales tratados
con los microorganismos inactivados que contenían enzimas
digestivas de acuerdo con la presente invención, respecto a los
animales de control, en presencia de una reducción simultánea del
consumo de alimento. Estos datos indican una mayor utilización del
alimento y una mejor biodisponibilidad de los nutrientes
horno-estructurales.
Al finalizar el tratamiento descrito
anteriormente, se sacrificaron los animales para el control
anatómico y patológico del estado de la mucosa gastrointestinal, no
encontrándose ninguna alteración significativa.
Con el objeto de verificar también el nivel de
absorción del alimento consumido, se recolectaron las heces de los
grupos de animales descritos anteriormente durante las 24 horas
anteriores al tratamiento, con el objetivo de examinar las
modalidades de eliminación de uno de los nutrientes esenciales (es
decir, proteínas), tomándolas como parámetro de referencia para una
evaluación de las diferencias entre los animales tratados y los
controles.
Por cada animal, se suspendieron 10 g de materia
fecal en 50 ml de solución salina tampón de PBS a un pH de 7,0. Se
homogeneizó finamente la mezcla y se mantuvo bajo agitación durante
aproximadamente 60 minutos, que fue suficiente para la liberación
del material proteico, peptídico y aminoácido hacia el medio
acuoso.
La mezcla fue centrifugada entonces a 10.000
r.p.m. durante 10 minutos; se recuperó el sobrenadante y se
concentró hasta un volumen de 10 ml en un evaporador rotatorio al
vacío a una temperatura de 37-45°C.
Se evaluó la presencia de grupos amino en una
primera porción de 1 ml del concentrado, como un índice del
contenido total de nitrógeno proteico.
Otras porciones de 1 ml del concentrado fueron,
en cambio, sometidas a análisis de cromatografía como un índice de
la evaluación de la magnitud del catabolismo proteico digestivo,
como se describirá posteriormente.
La determinación de los grupos amino se realizó
de acuerdo con el siguiente procedimiento: a 1 ml de concentrado se
añadió 0,5 ml de una solución de tetraborato de sodio 0,1 M en
NaOH 0,1 M. Después de la adición de 20 \mul de una solución de
ácido tetrahidrobencen sulfónico 1,1 M, se agitó la mezcla
minuciosamente y se dejó reaccionar durante 5 minutos. Al finalizar
este período, se interrumpió la reacción por la adición de 2 ml de
una solución de NaH_{2}PO_{4} 0,1 M que contenía sulfito de
sodio 1,5 mM.
La coloración fue detectada por análisis UV a 420
nm por comparación con el blanco.
La Tabla 2 presenta la diferencia porcentual de
la cantidad de aminas detectadas en las heces de los animales
tratados con los microorganismos inactivados enriquecidos con
enzimas digestivas de acuerdo con la presente invención, comparado
con las de los animales de control.
| Animal | % de variación de aminas con relación a los controles |
| Rata macho | -12,4 |
| Rata hembra | -10,6 |
| Conejo macho | -13,5 |
| Conejo hembra | -9,7 |
\newpage
Los datos tabulados arriba muestran que la
administración de los microorganismos de acuerdo con la presente
invención provoca una reducción de grupos amina en las heces.
En términos de porcentaje, esta reducción es
mayor que la reducción en la cantidad de alimento ingerido, lo que
da prueba de la mayor absorción de los nutrientes nitrogenados.
Además, como se mencionó previamente, porciones
de 1 ml del concentrado fueron sometidas a análisis cromatográficos
con el objeto de evaluar la distribución del peso molecular (PM)
del material proteico y, por lo tanto, obtener una evaluación
indirecta de su grado de degradación durante el procedimiento
digestivo.
Porciones de 1 ml de extracto fecal concentrado
de cada animal macho, se prepararon como se describió previamente,
y se sometieron a cromatografía por filtración en gel en Sephadex
G15, G25 y G200, de acuerdo con las instrucciones de operación
descritas en Gel-filtration, Theory and Practice
/Pharmacia, páginas 7-11,
1985-86) y en Protein Purification, Principles
and Practice (Robert K. Scopes; Cáp. 5. páginas
151-163, Springer-Verlag Inc., Nueva
York, 1982). Los eluídos obtenidos individualmente fueron entonces
recolectados y concentrados hasta un volumen de 1 ml usando un
evaporador rotatorio al vacío a una temperatura de
37-45°C. Para cada una de las muestras obtenidas,
se determinó el contenido peptídico/proteico usando el método de
Lowry (kit Sigma P-5656, 1992), que es
particularmente útil también para determinar fragmentos peptídicos
de bajo peso molecular.
La Tabla 3 presenta las variaciones porcentuales
de las cantidades de péptidos y proteínas, en intervalos de PM
precisos, contenidas en las heces de los animales examinados.
| Animal | Tipo de Sephadex | Intervalo de PM | % de variación del contenido |
| peptídico/proteico en las heces | |||
| Rata macho | G15 | 50-1.500 | +25,9 |
| Conejo macho | G15 | 50-1.500 | +23,7 |
| Rata macho | G25 | 1.000-5.000 | +16,2 |
| Conejo macho | G25 | 1.000-5.000 | 18,7 |
| Rata macho | G200 | 5.000-600.000 | -36,0 |
| Conejo macho | G200 | 5.000-600.000 | -35,4 |
El aumento en la concentración de fragmentos de
bajo peso molecular y la reducción simultánea de los fragmentos de
alto peso molecular, demuestran un incremento de la actividad
enzimática durante el procedimiento digestivo en los animales
tratados con los microorganismos de acuerdo con la presente
invención.
Se realizaron las pruebas siguientes en 4 grupos
de 20 ratones Swiss machos, que pesaban 20\pm2 g, que fueron
tratados en los 20 días previos a la inducción de la infección
experimental, con alimento corriente (controles) o con alimento
enriquecido con los microorganismos de la invención, y en especial
alimentados con el mismo alimento que los controles enriquecido con
5 g de microorganismos preparados por kg de alimento, como se
describió en el Ejemplo 1.
Los animales fueron entonces infectados, por vía
intranasal, con K. pneumaniae (cepa 52145 PITC) o con virus
influenza (cepa A/PR8/34) para provocar una infección leve, de
acuerdo con el procedimiento descrito por M.
Fatal-German y B. Bizzini (Develop. Biol..
Standard, 77:115-120 y 137-142,
1992). Después de la inoculación, los animales se alimentaron
nuevamente como se describió anteriormente, es decir con alimento
corriente o con alimento enriquecido con los microorganismos
inactivados de la invención. El porcentaje de supervivencia después
de intervalos de tiempo dados, se evaluó de acuerdo con el
siguiente esquema:
Grupo 1 (controles): después de 20 días de
alimentación corriente, se les inoculó por vía intranasal K.
pneumoniae, y se verificó la cantidad de animales que
sobrevivieron después de 7 días de infección;
Grupo 2 (controles): después de 20 días de
alimentación corriente, se les inoculó por vía intranasal virus
influenza, cepa A/PR8/34, y se verificó la cantidad de animales que
sobrevivieron después de 18 días de infección;
Grupo 3: después de 20 días de dieta enriquecida
con los microorganismos de la invención, como se describió
anteriormente, se les inoculó por vía intranasal K.
pneumoniae, y se verificó la cantidad de animales que
sobrevivieron después de 7 días de infección;
Grupo 4: después de 20 días de dieta enriquecida
con los microorganismos de la invención, como se describió
anteriormente, se les inoculó por vía intranasal virus influenza,
cepa NPR8/34, y se verificó la cantidad de animales que
sobrevivieron después de 18 días de infección.
La Tabla 4 muestra los índices porcentuales de
supervivencia de los animales pertenecientes a los grupos
mencionados anteriormente, después de intervalos de tiempo
especificados.
| Grupo | Dieta | Tipo de infección | % de animales sobrevivientes |
| 1 | normal | K. pneumoniae | 10 |
| 2 | normal | virus influenza | 30 |
| 3 | enriquecida | K. pneumoniae | 25 |
| 4 | enriquecida | virus influenza | 60 |
Los resultados informados arriba demuestran el
hecho de que existe un aumento de las defensas contra agentes
infecciosos en los animales tratados con los microorganismos de
acuerdo con la presente invención, comparados con los controles.
Este aumento puede estar relacionado con la mejoría del estado
general de salud de los animales y, sobre todo, al aumento de las
defensas inmunológicas respecto al ataque de agentes patógenos.
Las siguientes pruebas se realizaron en 2 grupos
de 20 ratones Swiss machos, con un peso de 20\pm2 g cada uno,
tratados, durante los 20 días en que se desarrolló la prueba, con
alimento normal (Grupo 1, controles) o con alimento enriquecido con
los microorganismos de la invención, y en especial alimentados con
el mismo alimento que los controles enriquecido cada vez que se
alimentaban con 5 g de microorganismos, preparados de acuerdo con
el Ejemplo 1, por kg de alimento (Grupo 2, grupo de prueba).
Se trataron entonces los animales, por vía
intravenosa, con 24 mg de partículas de carbono (tinta india) por
cada 100 g de peso del animal, de acuerdo con el procedimiento
descrito por B.N. Halpern y col. (Anna/es de I'Institu
Pasteur, 80(6):582-604, 1951). De esta
manera, se evaluó el índice de eliminación desde la circulación
sanguínea de las partículas de carbono inyectadas. El porcentaje de
reducción de las partículas circulantes se evaluó usando técnicas
turbidimétricas después de 30 minutos de la inyección intravenosa
de tinta.
Los animales del Grupo 2, es decir, los tratados
con los microorganismos de la presente invención, mostraron un
aumento en el porcentaje de eliminación de las partículas del 32,5%
en relación con los animales del Grupo 1, es decir, los que
recibieron una dieta normal. Esto proporciona una demostración
evidente del efecto inmunoestimulante producido por el régimen de
alimento enriquecido de acuerdo con la presente invención.
Claims (20)
1. Procedimiento para la producción de
microorganismos inactivados que contienen una o más enzimas
digestivas, que comprende las siguientes etapas:
- 1)
- extracción de la masa endocelular de las células de un microorganismo apropiado por medio de tratamiento hiperosmótico, y separación de la masa endocelular extraída;
- 2)
- inactivación posible del microorganismo obtenido en la etapa (1) por medios químicos o físicos, conservando inalterada la membrana externa del microorganismo;
- 3)
- inserción intracelular de una o más enzimas digestivas en el microorganismo inactivado obtenido en la etapa (1) o (2) por medio de tratamiento hipo-osmótico, mediante el tratamiento de dicho microorganismo en una suspensión hipotónica que contiene el material endógeno que ha sido extraído en la etapa (1), al que se añadieron enzimas digestivas de otra naturaleza y otros nutrientes esenciales, o una suspensión acuosa hipotónica adecuada que contiene dichas enzimas digestivas y otros nutrientes esenciales.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizado porque dicho microorganismo no es un
productor de enzimas digestivas, sino que actúa como vehículo de
dichas enzimas.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
2, caracterizado porque dichos microorganismos son
Saccharomyces cerevisiae.
4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizado porque dicho microorganismo es un
productor de una o más enzimas digestivas específicas seleccionadas
del grupo formado por amilasas, sacaridasas, lipasas, proteasas,
pectinasas, celulasas y peptidasas.
5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
4, caracterizado porque, cuando dichas enzimas digestivas
son amilasas o sacaridasas, dicho microorganismo pertenece a las
especies Acinetobacter, Bacillus, Aspergillus, Micrococcus o
Endomyces.
6. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4, caracterizado porque, cuando dichas
enzimas digestivas son lipasas, dicho microorganismo pertenece a
las especies Lactobacillus, Micrococcus, Aspergillus,
Pseudomonas o Penicillium.
7. Procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 4, caracterizado porque, cuando dichas
enzimas digestivas son proteasas, dicho microorganismo pertenece a
las especies Pseudomonas, Streptomyces, Bacillus o
Aspergillus.
8. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4, caracterizado porque, cuando dichas
enzimas digestivas son pectinasas, dicho microorganismo pertenece a
las especies Acrocylindrum, Aspergillus, Penicillum, Fusarium,
Clostridium, Bacillus o Pseudomonas.
9. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4, caracterizado porque, cuando dichas
enzimas digestivas son celulasas, dicho microorganismo es una
bacteria de las especies Ruminococcus, Cellulomonas o
Pseudomonas, o también un hongo de las especies
Penicillum, Aspergillus, o Trichoderma, o también un
actinomicete de las especies Streptomyces o
Thermoactinomyces.
10. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque dicho microorganismo
no es un productor de enzimas digestivas, se aísla de materia fecal
humana o de materia ruminal, intestinal y/o fecal de animales de
ganado, y se acondiciona apropiadamente para la producción de
dichas enzimas.
11. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque, antes de la etapa
(1), dichos microorganismos se hacen crecer por fermentación,
recuperando las enzimas digestivas producidas durante dicha
fermentación.
12. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque el tratamiento
hiperosmótico consiste en la suspensión de dicho microorganismo en
una solución hipertónica que contiene:
- NaCl en concentraciones superiores a 0,2 M;
- citrato de sodio en concentraciones superiores
a 0,05 M;
- un agente antibacteriano apropiado, en
concentraciones adecuadas; y el mantenimiento de dicha suspensión
bajo agitación a una temperatura que varía entre 2 y 8°C durante un
período que varía entre 2 y 4 días.
13. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa (2),
dicha inactivación química se obtiene por el tratamiento de los
microorganismos en una solución acuosa de una sustancia
desinfectante, a una concentración de 0,05-0,2
mg/l, durante un período de 2-12 horas.
14. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa (2),
dicha inactivación física se obtiene por exposición a rayos UV o por
calentamiento a 55-65°C.
15. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa (3), los
microorganismos obtenidos en la etapa (1) o (2) se suspenden en una
solución acuosa hipotónica que contiene las enzimas digestivas
mencionadas, durante un período de tiempo entre 4 horas y 4 días,
a una temperatura que varía entre 2 y 8°C.
16. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 15, caracterizado porque dicha solución
acuosa hipotónica además contiene:
- NaCl en concentraciones menores a 0,12 M;
- citrato de sodio en concentraciones menores a
0,025 M;
- un agente antibacteriano apropiado en
concentraciones adecuadas.
17. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa (3),
dichos nutrientes esenciales son vitaminas y/o glúcidos.
18. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa (3),
dicho material endógeno que se extrae en la etapa (1), primero se
dializa.
19. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque los microorganismos
obtenidos en la etapa (3) se concentran y/o desecan.
20. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1-19 que además comprenda una
etapa de formulación en una composición alimenticia para consumo
humano o con propósitos veterinarios.
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