BR0207398B1 - Uso de bactérias e leveduras para a detoxificação biológica de micotoxinas ocratoxinas e zearalenons em produtos alimentícios e ração animal, bem como método de detoxificação das ditas micotoxinas. - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE BACTÉRIAS E LEVEDURAS PARA A DETOXIFICAÇÃO BIOLÓGICA DE MICOTOXINAS OCRATOXINAS E ZEARALENONS EM PRODUTOS ALIMENTÍCIOS E RAÇÃO ANIMAL, BEM COMO MÉTODO DE DETOXIFICA-ÇÃO DAS DITAS MICOTOXINAS". A presente invenção refere-se a um microorganismo para a de-toxificação biológica de micotoxinas, a saber, ocratoxinas e/ou zearalenons, assim como um método para biologicamente detoxificar micotoxinas, isto é, ocratoxinas e/ou zearalenons, dos produtos alimentícios e rações de animais pelo auxílio de pelo menos um microorganismo, assim como o uso de bactérias e/ou leveduras para detoxificar ocratoxinas e/ou zearalenons, dos produtos alimentícios e rações de animal.

As micotoxinas são metabólitos secundários de ocorrência natural de fungos de mofo que afetam os produtos agrícolas em todo o mundo e que causam efeitos tóxicos mesmo em quantidades pequenas. A infestação de produtos agrícolas com micotoxinas envolve danos extremamente elevados e também induz às micotoxicoses em seres humanos e animais, os quais parcialmente apresentam efeitos dramáticos. Devido às perdas econômicas elevadas e à cepa sobre o ser humano e animais causadas pelas micotoxinas e as assim induzidas micotoxicoses, esforços têm sido feitos por muito tempo para encontrar medidas de se combater às contaminações por micotoxina, com basicamente dois métodos tendo sido conhecidos da literatura. O primeiro caminho visa impedir o desenvolvimento dos fungos de mofo nos produtos alimentícios e rações de animal, assim simultaneamente impedindo a produção de micotoxinas. O segundo caminho é dirigido para subsequentemente destruir as micotoxinas, ou descontaminar os produtos alimentícios e/ou rações de animal.

Portanto, a WO 91/13555, por exemplo, descreve um suplemento alimentar assim como um método para tornar inativas as micotoxinas, em que as partículas de um mineral de filossilicato são adicionadas ao alimento de modo a tornar inativas ditas micotoxinas. Para intensificar o efeito destes filossilicatos, as partículas são revestidas com um sequestrante destinado para acelerar suas ações. Além disso, uma ração de animal tornou- se conhecido, por exemplo, a partir da WO 92/05706, de que a ração de animal contém argila de montmorilonita como um suplemento alimentar. Estes minerais de argila natural tendo grandes áreas superficiais internas são supostas de se ligarem às micotoxinas superficialmente devido à sua porosidade, assim, imobilizando as mesmas.

Além do mais, um suplemento alimentar é conhecido da Austrian Utility Model AT-U 504, em que o suplemento alimentar usa uma preparação de enzima capaz de formar epoxidases e lactonases e quimicamente degradar as micotoxinas tanto em rações de animais quanto no trato gastrointestinal dos animais. De acordo com a AT-U 504, a atividade desta preparação de enzima pode ser intensificada pela adição de zeólitos e similares. A adição de aglutinantes de micotoxina nas rações de animal, os quais se ligam às micotoxinas imediatamente no trato digestivo durante a digestão, é capaz de minimizar os efeitos das toxinas nos animais de criação. Além das opções acima mencionadas, as substâncias aplicadas incluem alfafa, bentonita, zeólito, argilas, carbono ativo, silicatos de alumínio de cálcio sódico hidrogenados, filossilicatos e divisões celulares de levedura ou bactéria (US 5.165.946; WO 99/57994; US 6.045.834; EP 9721741; US 5.165.946; US 5.935.623; WO 98/34503; WO 00/41806). A ligação de toxinas a tais materiais é uma função das características estruturais das toxinas. Assim, nenhum aglutinante de micotoxina efetivo foi até agora encontrado para tricotecenos. Uma outra desvantagem de aglutinantes de micotoxina é que eles são capazes de adsorver dos alimentos além de ditas toxinas, também nutrientes importantes como vitaminas ou antibióticos.

Foi recentemente observado que as micotoxinas podem ser degradadas e por esta razão parcialmente detoxificadas, por microorganismos. Um exemplo da detoxificação de micotoxinas e, em particular, de tricotene-nos, está contido na AT-B 406 166, em que uma cultura pura especial de um microorganismo que pertence ao gênero Eubacterium e depositada sob o número DSM 11798, assim como uma cultura misturada do gênero Eubacterium com um Enterococcus, que foi depositada sob o número 11799, detoxi-ficam os tricotecenos mediante a divagem do anel de epóxi presente nos tricotecenos. A detoxificação de ocratoxinas por hidrólise enzimática foi anteriormente descrita por M. J. Pitout: The hydrolysis of ochratoxin A by some proteolytic enzymes, Biochem. Pharmacol. 18, 495-491 (1969). A presente invenção visa a fornecer microorganismos especiais, assim como culturas misturadas ou puras e também combinações destas, que são capazes de bioquimicamente degradar as micotoxinas, a saber, ocratoxinas e/ou zearalenons, em uma maneira seletiva e converter as mesmas em substâncias fisiologicamente seguras e, em particular, substâncias seguras para as indústrias de rações e alimentos.

Para resolver estes objetivos, o microorganismo de acordo com a invenção, da espécie inicialmente definida é essencialmente caracterizado pelo fato de que um microorganismo e, em particular, bactérias ou leveduras aeróbicas ou anaeróbicas de detoxificação é/são usado(s), o(s) qual(is) cli-va(m) o grupo de fenilalanina das ocratoxinas e degradam os zearalenons, respectivamente, em que as bactérias de detoxificação da micotoxina são selecionadas das espécies Sphingomonas, Stenotrophomonas, Ochrabac-trum, Ralstonia e/ou Eubacterium, e/ou as leveduras de detoxificação são selecionadas das espécies Trichosporon, Crytococcus e/ou Rhodotorula. Mediante o uso de um microorganismo e, em particular, bactérias ou leveduras aeróbicas ou anaeróbicas de detoxificação que clivam o grupo de fenilalanina das ocratoxinas e degradam os zearalenons, respectivamente, é possível converter as ocratoxinas e, em particular, a ocratoxina A ou ocrato-xina B naqueles metabólitos que não possuem nenhum grupo de fenilalanina e, portanto, já não apresentam os efeitos tóxicos das ocratoxinas. Esta metabolização de ocratoxinas é efetuada por uma enzima similar à carboxi-peptidase A, que cliva a ligação de amida da ocratoxina diretamente ou através de um complexo de múltiplas enzimas pelo qual o anel da fenilalanina é hidroxilada e subsequentemente clivada e degradada. Finalmente, o aspartame remanescente é clivado, dessa maneira produzindo um outro metabólito de ocratoxina não-tóxico. Esta rota pode se demonstrada em uma maneira simples: Mediante o uso dos microorganismos da invenção, que são selecionados de bactérias ou leveduras, é possível detoxificar não apenas a ocratoxina A e ocratoxina B, mas também os metabólitos 4R-hidroxiocra-toxina A, 4S-hidroxiocratoxina A, ocratoxina C, éster metílico de ocratoxina A, éster metílico de ocratoxina B e éster etílico de ocratoxina B. Além disso, estes microorganismos permitem a degradação e em conseqüência a deto-xificação de zearalenons. O fato de acordo com a presente invenção, as bactérias de de-toxificação tanto aeróbicas quanto anaeróbicas, ou leveduras poderem ser usadas como microorganismos, é de importância particular, visto que, no caso do influxo de produtos alimentícios e/ou rações de animais contaminados com os respectivos microorganismos, a detoxificação pode ser obtida mesmo após o influxo de tais produtos alimentícios e/ou rações de animal. Esta detoxificação pode ocorrer em qualquer estágio, ou em qualquer fase, da passagem dos gêneros alimentícios ou ração dentro do trato gastrointestinal, desde que os respectivos microorganismos ou combinações destes possam ser seletivamente induzidos a entrar em funcionamento em cada caso. As condições dentro do trato gastrointestinal a partir do estômago até o cólon são conhecidas serem cada vez mais anaeróbicas, o que significa que o potencial de oxirredução é cada vez mais reduzido tal que, após a ingestão de um gênero alimentício e/ou rações contaminadas com as respectivas micotoxinas ou ocratoxinas e/ou zearalenons, a detoxificação a princípio pode ser iniciada com bactérias e/ou leveduras aeróbicas e continuada com as respectivas bactérias e/ou leveduras anaeróbicas no final de um processo digestivo, ou se o gênero alimentício ou ração já tivesse alcançado um segmento intestinal onde as condições anaeróbicas prevalecem.

Uma detoxificação particularmente completa de micotoxinas, isto é, ocratoxinas e/ou zearalenons, é possível se as bactérias de detoxificação selecionadas das espécies Sphingomonas, Stenotrophomonas, Ochrobac-trum, Ralstonia e/ou Eubacterium, e/ou as leveduras de detoxificação selecionadas das espécies Trichosporon, Cryptococcus e/ou Rhodotorula forem usadas como ditos microorganismos. Entre estas bactérias e/ou leveduras de detoxificação completa, as bactérias de detoxificação selecionadas de Sphingomonas sp; DSM 14170 e DSM 14167, Stenotrophomonas nitritredu-cens DSM 14168, Stenotrophomonas sp. DSM 14169, Ralstonia eutropha DSM 14171 e Eubacterium sp. DSM 14197, assim como as leveduras de detoxificação selecionadas de Trichosporon spec. nov. DSM 14153, Crypto-coccus sp. DSM 14154, Rhodotorula yarrowii DSM 14155, Trichosporon mu-coides DSM 14156 e Trichosporon dulcitum DSM 14162 têm provado serem particularmente eficientes, visto que elas não somente garantem a degradação completa das micotoxinas, mas podem adicionalmente ser seguramente usadas em produtos alimentícios e rações de animais, que não é necessariamente o caso com uma pluralidade de outras bactérias e leveduras de divagem e/ou degradação de micotoxina.

Entre ditas outras bactérias ou leveduras que são igualmente capazes de degradar os microorganismos, aquelas indicadas abaixo podem ser prosperamente aplicadas, sendo utilizáveis em um meio ou em um tampão, ou efetivas em ambas as substâncias.

Tem se comprovado particularmente vantajosos, quando em correlação com um outro desenvolvimento preferido desta invenção, que as bactérias e/ou leveduras são estabilizadas particularmente por liofilização, secagem por atomização ou microencapsulação. Mediante a estabilização de ditos microorganismos, sua viabilidade e duração de vida são melhoradas ou intensificadas, e, além disso, eles serão aplicáveis em uma escala mais universal, e portanto usáveis a qualquer hora em qualquer aplicação desejada, no estado estabilizado. A estabilização através da liofilização, secagem por atomização ou microencapsulação é conhecida per se, estes sendo métodos simples e rapidamente realizáveis que produzem microorganismos estáveis e viáveis.

De acordo com um outro desenvolvimento da invenção, as bactérias e leveduras são usadas como extratos livres de células ou extratos brutos. Assim procedendo, um outro desenvolvimento em uso de um extrato livre de células contempla que o último mencionado é usado em uma solução e, em particular, uma solução aquosa. As soluções aquosas de extratos livres de células oferecem a vantagem que, sendo pulverizadas sobre o alimento ou ração a ser tratado, elas entram em contato com as micotoxinas contaminantes diretamente nas superfícies das mesmas, a detoxificação assim sendo obtida logo imediatamente após a pulverização de dito extrato. O uso de um extrato bruto de bactérias ou leveduras, que é obtido pela aplicação de ultrassom, digestão enzimática, uma combinação de congelamento por impacto e descongelamento, um homogeneizador de fluxo, uma prensa Francesa, autólise em uma concentração de NaCI elevada, e/ou um moinho de contas, possui a vantagem que um tal extrato bruto pode ser obtido em uma maneira particularmente rápida em não problemática tal que, em particular, naqueles casos onde o uso rápido de substâncias de detoxificação ou degradação da micotoxina é requerido, o uso de um extrato bruto produz resultados rápidos e confiáveis. Além do mais, os extratos brutos podem ser diretamente usados na produção de ração animal tal que a ração suplementada com microorganismos será absorvida pelos animais, e os microorganismos e, em particular, as leveduras ou bactérias, entrarão em ação somente no trato digestivo do animal. Neste contexto, a invenção também contempla o uso de uma mistura contendo os extratos brutos de várias bactérias e/ou leveduras de detoxificação. O uso de microorganismos em uma solução não-tamponada ou tamponada contendo tampão de fosfato ou triscloridrato em um valor de pH entre 1 e 12 e, em particular, 2 e 8, quando em concordância com uma modalidade preferida, oferece a vantagem de que os microorganismos podem ser administrados diretamente com o gênero alimentício ou rações, assim entrando em ação no trato gastrointestinal naquelas regiões onde o potencial de oxirredução é adequado para a ação ideal dos microorganismos empregados. O uso de uma solução tamponada torna possível a adaptação imediata ao respectivo pH que prevalece no trato gastrointestinal tal que, o alimento ou a iguaria bem suplementada com a solução tamponanda de microorganismos não causará qualquer mudança ou distúrbio do pH prevale-cente no trato gastrointestinal, assim intensificando a fácil digestibilidade do alimento ou rações suplementadas por um lado e impedindo qualquer distúrbio digestivo no ambiente gastrointestinal.

Outro objetivo da presente invenção consiste em fornecer substâncias ou microorganismos que podem ser usados para detoxificar produtos alimentícios ou mercadorias de iguaria sem prejudicar ou afetar as criaturas vivas que ingerem as mesmas e sem prejudicar ou afetar ditos produtos alimentícios ou mercadorias de iguaria tratadas com eles, à parte da detoxificação das micotoxinas presentes em ditos produtos alimentícios ou mercadorias de iguaria.

Para resolver estes objetivos, foi observado de acordo com a invenção o uso de bactérias selecionadas de Sphingomonas sp. DSM 14170 e DSM 14167, Stenotrophomonas nitritreducens DSM 14168, Steno-trophomonas sp. DSM 14169, Ralstonia eutropha DSM 14171 e Eubacte-rium sp.DSM 14197, e/ou leveduras selecionadas de Trichosporon spec. nov. DSM 14153, Cryptococcus sp. DSM 14154, Rhodotorula yarrowii DSM 14155, Trichosporon mucoides DSM 14156 e Trichosporon dulcitum DSM 14162 permite que as micotoxinas, isto é, ocratoxinas, presentes nas super- fícies dos produtos alimentícios ou rações de animal sejam detoxificadas por divagem do grupo de fenilalanina e os zearalenons sejam clivados, sem afetar ou influenciar de qualquer maneira seja qual for os produtos alimentícios ou rações de animal tratadas com eles. O uso de Trichosporon spec. nov. DSM 14153, Eubacterium sp. DSM 14197 ou Stenotrophomonas nitritreducens DSM 14168 tem se provado particularmente adequado para este propósito, estes microorganismos garantem, em particular, a completa degradação das micotoxinas, a saber, ocratoxinas e/ou zearalenons, sem vincular qualquer risco.

De modo a permitir, em particular, a detoxificação econômica de micotoxinas, particularmente em produtos alimentícios ou rações de animal, culturas misturadas ou combinações de várias bactérias e/ou leveduras são usadas para a detoxificação de ocratoxinas e/ou zearalenons dos produtos alimentícios e/ou rações de animais.

Um outro objetivo da presente invenção consiste em fornecer um método para a detoxificação biológica por um microorganismo, micotoxinas, isto é, ocratoxinas e/ou zearalenons, dos produtos alimentícios e rações de animais, que permita as toxinas contaminantes serem completa e rapidamente descontaminadas diretamente após entrar em contato com os produtos alimentícios ou as rações de animal, ou dentro do trato digestivo das criaturas vivas que recebem ditos produtos alimentícios ou rações de animal.

Para solucionar estes objetivos, o método de acordo com a invenção é essencialmente caracterizado pelo fato de que um microorganismo de acordo com a invenção e, em particular, bactérias e/ou leveduras de acordo com a invenção, são misturadas com o produto alimentício ou rações de animais em quantidades que variam de 0,01% em peso a 1% em peso, e em particular , de 0,05% em peso a 0,5% em peso. Mediante a mistura na forma sólida do produto alimentício ou ração animal com o microorganismo de acordo com a invenção e, em particular, com as bactérias ou leveduras de acordo com a invenção, um produto alimentício ou ração animal suplementados com o microorganismo adequadamente estabilizado será obtido na forma estável. Se um tal produto alimentício ou ração animal suplementados com o microorganismo de acordo com a invenção for absorvido, uma suspensão se formará durante a insalivação, e a detoxificação do produto alimentício ou rações de animal e, em particular, a degradação de ocratoxi-nas, começará imediatamente após a entrada de dito produto alimentício ou rações de animal pelo homem ou animal, respectivamente. Desta maneira, a degradação completa das micotoxinas nocivas, a saber ocratoxinas e/ou zearalenons, no trato gastrointestinal do animal hospedeiro é garantida tal que o organismo não será prejudicado por micotoxinas nocivas em qualquer maneira seja qual for.

Se os produtos alimentícios ou rações de animal anteriormente detoxificados forem destinados a ser ingeridos, um outro desenvolvimento da invenção fornece a mistura de ditos produtos alimentícios ou rações de animal mediante agitação em uma suspensão aquosa de dito microorganismo contendo água em 20 a 99% em peso e, em particular, de 35 a 85% em peso, em temperaturas de 10 a 60°C e, em particular, de 15 a 45°C, por 2 minutos a 12 horas e, em particular de 5 minutos a 2 horas. Mediante o tratamento do produto alimentício ou rações de animal por agitação em uma suspensão aquosa do respectivo microorganismo, é possível, por um lado, fornecer um contato íntimo com os microorganismos de detoxificação, do produto alimentício ou rações de animal a serem tratados e, por outro lado, fornecer tratamento cuidadoso dos microorganismos, assim garantindo que estes não serão deteriorados ou destruídos quando misturados com o produto alimentício ou ração animal. Durante a mistura é, antes de mais nada, importante tomar o cuidado de que tanto as temperaturas da mistura não se tornarão muito elevadas ou muito baixas quanto a duração e a composição da pasta fluida ou suspensão plenamente se sujeitará com a presente invenção de modo a seguramente impedir a destruição ou exterminação dos microorganismos.

No que segue, a invenção será explicada com maiores detalhes por meio de exemplos em relação ao isolamento dos microorganismos e seu modo de ação. 1. Cultivo, produção e recuperação da levedura Trichosoorum spec. nov. (DSM 14153) 0 seguinte meio de cultura é usado para o crescimento da levedura: 10 g de extrato de levedura 20 g de extrato de malte 10 g de glicose 5 g de peptona 400 ppm de ocratoxina A 1 litro de água RO pH 5,5 É tratado por 25 minutos em 121°C em um autoclave. 30 ml de uma pré-cultura são preparados em um frasco Erlenmeyer de 100 ml (taxa de inoculação de 0,33%). A incubação é efetuada por 72 horas em 25°C no agitador. A contagem bacteriana obtida é de cerca de 5 x 107/ml.

Estes 30 ml subsequentemente fornecem a pré-cultura como um inóculo para a fermentação em um fermentador de 75 litros. O seguinte meio de cultivo é usado para a fermentação: Extrato de malte 4 g/l Extrato de levedura 10 g/l Peptona 5 g/l Glicose 10 g/l Agente antiespumante 0,1% pH 5,5 Um p02 de 40% e uma taxa de aeração máxima de 3 m3/h são ajustados como parâmetros adicionais. O pH é 5,00 no começo, porém muda no curso do processo de crescimento (se elevando até 8,5). Após cerca de 40 a 44 horas, os conteúdos podem ser usados como um inóculo para a produção de 3,6 m3 no fermentador. O seguinte meio é usado para isto: Extrato de malte 17 g/l Extrato de levedura 5 g/l Peptona 2 g/l Agente antiespumante 0,1% A taxa de aeração é de 15 m3 de ar por hora. Após 40 a 48 horas, as células são concentradas por meio de um separador de fluxo. O caldo de fermentação pode ser concentrado em cerca de 1:10 por meio de um separador com uma contagem bacteriana de cerca de 3 x 109/ml sendo obtida. A subsequente estabilização é efetuada por secagem por congelamento ou secagem por atomização. Pó de soro de leite serve como um protetor criogênico na secagem por congelamento. 10% é adicionado, com base no volume de concentrado. Após isto, o concentrado é congelado em -80°C. A secagem por congelamento é realizada em uma pressão de 0,400 mbar, em uma temperatura da área de armazenagem de 20°C. A duração em uma espessura de camada de 1,5 cm é de cerca de 30 horas.

Parâmetros de secagem por atomização - Temperatura de entrada do meio de secagem (ar): 160°C

- Temperatura de saída: 80°C - Pressão: 3 bar 2. Cultivo, produção e recuperação da bactéria Stenotrophomonas nitritre-ducens ÍDSM 141681 O cultivo desta bactéria ocorre em um caldo de nutrientes, uma vez em Oxoid CM 001 B e uma vez em CM 067 B com 400 ppb de ocratoxi-na A. 30 ml do meio são submetidos a autoclave em um frasco Erlenmeyer de 100 ml por 25 minutos em 121°C. 1,5 ml de um tubo do banco de células de trabalho serve como um inóculo. A incubação ocorre em 30°C por 72 horas no agitador.

Estes 30 ml subsequentemente servem a pré-cultura como um inóculo para fermentação em um fermentador de 75 litros. O seguinte meio de cultivo é usado para a fermentação: Peptona de carne 5 g/l Extrato de carne 3 g/l Agente antiespumante 0,1% Um p02 de 40% e uma taxa de tratamento com gás máxima de 3 m3/h são ajustados como parâmetros adicionais. A taxa de agitação é de 200 rpm. O pH é de cerca de 6,8 a 6,9 no começo, porém muda no curso do processo de crescimento, se elevando até 8,3. Após cerca de 40 a 44 horas, os conteúdos podem ser usados como um inóculo para a produção de 3,6 m3 no fermentador. O seguinte meio foi usado para isto: Farinha de soja 17 g/l Extrato de levedura 5 g/l Peptona 2 g/l Agente antiespumante 0,1 % A taxa de aeração é ajustada para 15 m3 de ar por hora. A velocidade de agitação é de 250 rpm.

Após 40 a 48 horas, as células podem ser concentradas por meio de um separador de fluxo. A relação de concentração é de cerca de 1:10. A subsequente estabilização é efetuada por secagem por congelamento ou secagem por atomização. Pó de soro de leite serve como um protetor criogênico na secagem por congelamento. 10% é adicionado na maioria dos casos, com base no volume de concentrado. Após isto, o concentrado é congelado em -80°C (10 h) ou pelo auxílio de nitrogênio líquido (2 h). A secagem por congelamento é efetuada em uma pressão de 0,400 mbar, em uma temperatura da área de armazenagem de 20°C. A duração em uma espessura de camada de 1,5 cm é de cerca de 30 horas.

Parâmetros de secagem por atomização - Temperatura de entrada do meio de secagem (ar): 160°C

- Temperatura de saída: 80°C - Pressão: 3 bar 3. Cultivo, produção e recuperação da bactéria Eubacterium sd. (DSM 14197) O seguinte meio é usado para cultivar esta bactéria anaeróbica: D (+) -glicose 4 g/l Peptona de caseína 2 g/l Extrato de levedura 2 g/l Solução mineral I 75 ml/l [KH2P04 6 g/l] Solução mineral II 75 ml/l [K2HP04 6 g/l; (NH4)S04 6 g/l;

NaCI 12 g/l; MgS04 x 7 H20 2,5 g/l;

CaCI2 x 2 H20 3 g/l] Hemina 1 mg/l Mistura de ácido graxo 3,1 ml/l Custeína-HCI 0,5 g/l Resazurin 1 mg/l Ocratoxina A 400 ppb pH 6,9 O cultivo ocorre em um frasco Pyrex de 100 ml com um septo de silicona. 80 ml do meio submetido a autoclave são decantados e misturados com tampão de KH2P04/Na2HP04 (pH 7). Após a adição dos conteúdos de um frasco criogênico do banco de células de trabalho, o topo livre do frasco é tratado com gás com N2 (1 min). Após o fechamento do frasco, este é incubado em 37°C por 72 horas.

Após isto, 4,5 litros da solução de cultura acima mencionada são submetidos a autoclave em um frasco Schott de 5 litros. Este compreende uma conexão de drenagem e dois tubos com filtros estéreis (para tratar com gás o inóculo). Após o esfriamento do meio para 37°C, a solução tampão (1% do tampão de fosfato) e subsequentemente 80 ml de inóculo são adicionados. Após 0 tratamento com gás do topo livre com nitrogênio (por 5 min), as aberturas são fechadas por meio de grampos de tubo e o inóculo é incubado em 37°C por cerca de 64 horas. Após um teste de pure- za, pode ser usado como um inóculo para um fermentador de 1 m3 (capacidade de 700 litros). O seguinte meio é usado para a produção: Glicose 10 g/l Extrato de levedura 5 g/l Peptona 2 g/l Cisteína HCI 0,5 g/l pH 7,00 O inóculo é adicionado após a esterilização do meio em um tanque de fermentação (40 min, 121 °C, 1,21 bar) e rerrefrigeração para 37°C. O topo livre do fermentador é excitado com N2. A taxa de agitação é de 100 rpm, lixíria de soda (8 mol/l) é usada para o ajuste do pH. O potencial de oxirredução é de cerca de -240 mV no começo, diminuindo para mais do que -500 mV durante o desenvolvimento. O tempo de fermentação é de cerca de 48 horas. A concentração é efetuada por meio de um separador de fluxo. A estabilização subsequente é efetuada por secagem por congelamento, microencapsulação ou secagem por atomização. O pó de soro de leite serve como um protetor criogênico na secagem por congelamento. 10% é adicionado, com base no volume de concentrado. Após isto, o concentrado é congelado em -80°C (10 h) ou pelo auxílio de nitrogênio líquido (2 h). A secagem por congelamento é efetuada em uma pressão de 0,400 mbar, em uma temperatura da área de armazenagem de 20°C. A duração em uma espessura de camada de 1,5 cm é de cerca de 30 horas. O microorganismo é protegido das condições de vida desfavoráveis durante a armazenagem mediante a granulação de leito fluidificado usando gordura vegetal (processo Holtmelt, pulverização de topo).

Taxa de pulverização: ca. 80- 150 g/min Temperatura do ar que entra: 50°C

Pressão de pulverização: 3 bar Quantidade de ar: 750 a 1500 m3/h Temperatura do produto: < 47°C

Parâmetros de secagem por atomização - Temperatura de entrada do meio de secagem (gás inerte): 160°C

- Temperatura de saída: 80°C - Pressão: 3 bar 4. Detoxificação de ocratoxina A (OTA1 pelos produtos bacterianos e de levedura de acordo com os Exemplos de 1 a 3 Uma série de diluição logarítmica para representar 10‘4 é preparada em solução salina fisiológica a partir dos produtos obtidos nos Exemplos de 1 a 3. Dos estágios de 10'1 a 10'4, 2 ml são cada um colocado em pipeta em 18 ml do respectivo meio (meio mínimo (Na2HP04 2,44 g/l; KH2P04 1,52 g/l; (NH3)2S04 0,50 g/l; MgS04 x 7 H20 0,20 g/l, CaCI2 x 2 H20 0,05 g/l), meio de levedura ou caldo de nutrientes (Oxoid CM001B), suplementado com 200 ppb de OTA. Os frascos usados são incubados em um agitador horizontal sob condições adequadas. Após 2,5, 5 e 24 horas, as amostras são tomadas e examinadas para divagem da OTA por meio de cromatografia líquida de pressão elevada. Em um estágio de diluição de 10'3 (correspondendo às contagens bacterianas do produto de 105), as leveduras em meio mínimo tiveram clivadas 90% de ocratoxina A após 5 horas e 100% após 24 horas.

Se o meio de levedura complexo for usado como uma matriz de teste, os produtos apresentam uma taxa de divagem de 90% após 6 horas em um estágio de diluição de 10'2. Após 24 horas, toda a OTA é detoxifica-da.

Os produtos bacterianos em meio mínimo em um estágio de diluição de 10'3 (contagem bacteriana de 106 a 109) detoxificaram 40 a 100% de ocratoxina A após 2,5 horas, e 100% após 24 horas. No caldo de nutrientes, a detoxificação procede um pouco mais lenta - no estágio de 3, 40 a 50% é detoxificada após 2,5 h e 80 a 100% após 24 horas. Estes testes demonstram que os microorganismos podem ser convertidos em produtos estáveis apresentando atividades de detoxificação tanto em meio mínimo quanto em complexo. 5. Degradação de ocratoxina (OTA) por liofilisatos no ambiente intestinal estimulado.

Modelo de Teste A

Este modelo serve para investigar os liofilisatos das cepas de levedura DSM 14153, DSM 14154, DSM 15155, DSM 14156 e DSM 14162, assim como as cepas bacterianas aeróbicas (DSM 14170, DSM 14167, DSM 14168 e DSM 14169) e anaeróbicas (DSM 14197). O intestino curto de um porco recentemente abatido é cortado em pedaços de cerca de 15 cm de comprimento, que são cada um adicionados a 100 ml de meio mínimo contendo OTA [200 ppb]. As bateladas foram finalmente inoculadas diretamente com 1 g de liofilisato e incubadas em 35°C. Após 0, 6, 24 e 48 horas, as amostras foram retiradas para uma análise de OTA subsequente por meio de HPLC e armazenadas em um estado de congelamento muito baixo (-20°C) até dita análise.

Entre as leveduras, os germes DSM 14153, DSM 14156 e DSM 14162 provaram ser os mais ativos. Logo após as primeiras seis horas de incubação, de 70 a 90%, de 50 a 90% e de 80 a 90%, respectivamente, da toxina presente foi transformada (após 24 h: de 90 a 95%). As duas outras leveduras testadas (DSM 14154, DSM 14155) ficaram para trás das três cepas acima mencionadas em termos de atividade (0 a 20% de degradação após 6 h; de 30 a 50% após 24 h; 80% após 48 h).

Entre as bactérias aeróbicas, o germe DSM 14168 foi o melhor; após 6 horas, 50 a 100% da toxina presente foi logo reagida, após 24 horas de 80 a 100%. O DSM 14169 também se mostrou ser absolutamente "aceitável": após 6 horas, de 0 a 90% de OTA tinha sido detoxificada, após 24 horas de 70 a 95%. Os dois germes remanescentes claramente execuraram bem menos (0 a 40% após 6 h; de 50 a 60% após 24 h; de 60 a 80% após 48 h). O DSM 14197 isolado do intestino curto anaeróbico degradou a micotoxina presente após 6 horas de incubação em uma relação de 0 a 60%; após 24 horas, entre 50 e 100% da OTA tinha sido reagido.

Testes análogos foram realizados com os seguintes germes: F6 isolado do intestino curto 90 a 95% após 24 h Di 1 -8 isolado do cólon 80 a 95% após 24 h Trichosporon ovoides 40 a 50% após 24 h Triosporon dulcitunr. 50 a 90% após 24 h Cryptococcus curvatus: 40 a 50% após 24 h Trichosporon laibachii: 50% após 24 h Stenotrophomonas nitrítreducens: 60 a 95% após 24 h Stenotrophomonas sp.: 50 a 70% após 24 h Este modelo demonstrou que a OTA pode ser desativada pelos produtos produzidos no meio tamponante contendo uma seção intestinal com o ambiente apropriado (nutrientes e flora intestinal).

Modelo de Teste B

Este modelo serviu para examinar os liofilisatos das cepas de levedura DSM 14153, DSM 14156 e DSM 14162, assim como as cepas bacterianas DSM 14168 (aeróbica), DSM 14169 (aeróbica) e DSM 14197 (anaeróbica). O intestino curto de um porco recentemente abatido é cortado em pedaços de cerca de 25 cm de comprimento, que foram fechados em suas extremidades por meio de fios. 1 g do produto a ser examinado foi pesado em um tubo de centrifugação de 50 ml e colocado novamente em suspensão em 20 ml do meio de teste contendo OTA [200 ppb] (germes e leveduras aeróbicas —> meio mínimo; germes anaeróbicos tampão enaeróbi-co). Divergindo da suspensão cuidadosamente misturada, também diluições dez vezes mais foram opcionalmente preparadas. A(s) suspensão(ões) misturada(s) foi/foram depois cada uma injetada diretamente em um pedaço de intestino. Após ter se retirado uma amostra zero diretamente da peça de intestino, esta foi incubada em 35°C, colocada em suspensão em um frasco Pyrex de 250 ml (isto é, o fio de uma extremidade foi fixado pela tampa com rosca da frasco). Após 6, 24 e 48 horas, outras amostras foram retiradas para uma análise subsequente de transformação de OTA por meio de HPLC.

No caso de leveduras (cerca de 107 KBU/ml), uma degradação de OTA até 90% (DSM 14153 foi registrada após 6 horas. Após 24 horas no máximo, atividades comparavelmente elevadas (de 80 a 100%) podem ser detectadas para todas as amostras.

Resultados comparáveis foram obtidos também com diluições de dez vezes mais e cem vezes mais dos liofilisatos. Resultados similares foram obtidos com as duas bactérias aeróbicas DSM 14168 e DSM 14169. Após 6 horas, foi transformada de 20 a 60% de OTA, após 24 horas de 80 a 95%. O germe anaeróbico DSM 14197 mostrou um desempenho de degradação entre 40 e 50% após 6 horas, que elevado para 90% após 24 horas. As seções de intestino incubadas com OTA, mesmo sem quaisquer produtos não apresentaram nenhuma atividade de detoxificação sob qualquer condição.

Estes testes mostraram que os microorganismos de detoxificação de ocratoxina foram capazes de degradar esta toxina também em um ambiente correspondendo ao intestino. Assim, a aplicação dos microorganismos como suplementos de alimento ou ração particularmente para a detoxificação de ocratoxinas foi claramente demonstrada. 6. Detoxificação de produtos alimentícios e rações de animais Os microorganismos de detoxificação da ocratoxina foram cultivados por cerca de 66 horas de acordo com os Exemplos de 1 a 3 sob as condições apropriadas. 25 ml da suspensão foram centrifugados por 15 min em 3210 x g e absorvidos em um volume adequado de meio mínimo suplementado com 200 ppb de OTA. A suspensão que se forma foi usada para inocular 25 g ou 25 ml de gênero alimentício, pó de café, grãos de milho, semolina, cerveja e vinho. Após mistura cuidadosa do gênero alimentício com a suspensão de microorganismo, uma amostra (= amostra zero) foi retirada. A incubação das bateladas ocorreram em 25°C por 9 dias. Após este tempo, 5 g da amostra foram analisadas em comparação com a amostra zero. Além disso, espaços vazios foram co-incubados. Estes foram fornecidos com OTA, mesmo sem microorganismos. Para analisar a ocratoxina contida nos alimentos líquidos, precisamente 1 ml de cada alimento livre dos microorganismos foi acidificado com 0,5 ml de ácido fosfórico 1 M e extraído com 5 ml de cloreto de metileno. 5 ml do extrato foram secados sob nitrogênio. Cada amostra foi processada duas vezes, o resíduo após secagem foi absorvido uma vez em acetonitrila/água ácido acético (45:54:1) e uma vez em tolueno/ácido acético (99:1). As análises das amostras foram realizadas tanto por meio de HPLC quanto por meio de TLC. Quando se analisa a semolina, 5 g da amostra foram pesados em um frasco Schott de 100 ml e agitados por uma hora com 20 ml de acetonitrila/água (60:40) em 170 rpm. Após filtração, este extrato foi diretamente analisado por meio de HPLC. O processamento dos grãos de milho e café para as análises de OTA foi um pouco mais enfadonho. Nestes casos, 5 g das amostras foram pesadas em um frasco Schott de 100 ml e agitadas com 20 ml de acetonitrila:água (60:40) por uma hora. Após filtração, 4 ml do extrato foram misturados com 44 ml de tampão PBS (Tween 20 a 0,1%) e acondicionados em uma coluna de imunoaffinidade. Subsequentemente, a análise de HPLC foi feita. Tanto a diminuição de OTA quanto a emersão do metabólito OTa foram determinadas. Nenhuma OTa pode ser detectada nas amostras de café e milho devido à purificação da coluna aplicada. As taxas de degradação que seguem podem ser obtidas: 7. Degradação das micotoxinas Os microorganismos foram cultivados por cerca de 66 horas. Após este tempo, eles foram centrifugados (3210 x g, 15 min, temperatura ambiente) e os péletes obtidos foram ressuspensos em meio mínimo. Ao meio mínimo foram adicionados 1 ppm de desoxinivalenol, 1 ppm de fumo-nisin Bi, 1 ppm de zearalenon, 200 ppb de aflatoxin Bi e 2 ppm de citrinina. Antes da incubação das bateladas em 30°C, uma amostra foi tomada ("amostra zero"). O tempo de incubação foi de 96 horas. As bateladas foram determinadas em duplicata por examinar pela análise de HPLC uma vez o sobrenadante (após a centrifugação) e uma vez a batelada toda. Para purificação, 3 ml dos sobrenadantes e 2 ml da amostra toda, respectivamente, foram acondicionados em 15 g de material Extrelut. Após 15 minutos, as amostras foram diluídas com 40 ml de acetato de etila. 7 ml do acetato de etila foram secados e absorvidos no solvente apropriado. A análise de aflatoxin Bi e fumonisin Bi foi realizada após uma derivação.

As amostras após 96 horas foram examinadas com relação à degradação das respectivas toxinas em comparação com as amostras no começo. Para esta finalidade, tanto os sobrenadantes (separação da bio-massa por centrifugação) quanto as amostras totais (com biomassa) foram analisadas com relação a DON, ZON e AFBi. Os resultados são ilustrados na Tabela 2. TABELA 2 Fica claramente evidente dos ensaios precedentes que algumas micotoxinas tais como zearalenon (ZON), aflatoxin Bi (AFBi), fumonisin Bi (FBi), podem parcialmente ser degradadas extremamente bem com os microorganismos de acordo com a invenção. A citrinin (CIT) pode ser degradada 100% simplesmente pela bactéria Sphingomonas sp. (DSM 14170).

Para recapitular, é observado que os microorganismos de acordo com a invenção facilmente permitem, em particular, a degradação de ocratoxinas nos produtos alimentícios e rações de animais e também no ambiente intestinal, com a degradação de zearalenon, citrinin e similares, mesmo parcialmente produzindo bons resultados.

Claims (8)

1. Uso de bactérias selecionadas de: Sphingomonas sp; DSM 14170 e DSM 14167, Stenotrophomonas nitritreducens DSM 14168, Steno-trophomonas sp. DSM 14169, Ralstonia eutropha DSM 14171 e Eubacterium sp. DSM 14197, e/ou leveduras selecionadas de: Trichosporon spec. nov. DSM 14153, Cryptococcus sp. DSM 14154, Rhodotorula yarrowii DSM 14155, Trichosporon mucoides DSM 14156 e Trichosporon dulcitum DSM 14162, caracterizado pelo fato de que é para a detoxificação de micotoxinas, a saber, ocratoxinas e/ou zearalenons, nos produtos alimentícios e/ou rações de animais mediante a divagem do grupo de fenilalanina da ocratoxina ou degradação do zearalenon.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os Trichosporon spec. nov. DSM 14153, Eubacterium sp. DSM 14197 ou Stenotrophomonas nitritreducens DSM 14168 são usados para a detoxificação de micotoxinas, a saber, ocratoxinas e/ou zearalenons, nos produtos alimentícios e/ou rações de animais.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as culturas misturadas das ditas bactérias e/ou leveduras são usadas para a detoxificação de micotoxinas, isto é, ocratoxinas e/ou zearalenons, nos produtos alimentícios e/ou rações de animal.

4. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é as bactérias ou leveduras são usadas como extratos livres de células ou extratos brutos, preferencial mente em que as bactérias ou leveduras são usadas como extratos livres em uma solução e, mais preferencialmente, em uma solução aquosa.

5. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que os ditos extratos brutos são obtidos das ditas bactérias e leveduras mediante a aplicação de ultrassom, digestão enzimática, uma combinação de congelamento por impacto e descongelamento, um homogeneizador de fluxo, uma prensa Francesa, autólise em uma concentração de NaCI elevada, e/ou um moinho de contas.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que as ditas bactérias e leveduras são usadas em uma solução tamponada contendo tampão de acetato, citrato, fosfato ou clo-ridrato em um pH entre 1 e 12 e, em particular, 2 e 8.

7. Método para biologicamente detoxificar micotoxinas, a saber, ocratoxinas e/ou zearalenons, dos produtos alimentícios e/ou rações de a-nimal pelo auxílio de um microrganismo selecionado do grupo consistindo em bactérias selecionadas de: Sphingomonas sp; DSM 14170 e DSM 14167, Stenotrophomonas nitritreducens DSM 14168, Stenotrophomonas sp. DSM 14169, Ralstonia eutropha DSM 14171 e Eubacterium sp. DSM 14197, e/ou leveduras selecionadas de: Trichosporon spec. nov. DSM 14153, Cryp-tococcus sp. DSM 14154, Rhodotorula yarrowii DSM 14155, Trichosporon mucoides DSM 14156 e Trichosporon dulcitum DSM 14162, caracterizado pelo fato de que o dito microrganismo é misturado com os produtos alimentícios ou rações de animal em quantidades que variam de 0,01% em peso a 1 % em peso e, em particular, de 0,05% em peso a 0,5% em peso.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que os ditos produtos alimentícios ou rações de animal são tratados pela agitação em uma suspensão aquosa do dito microrganismo contendo água em 20 a 99% em peso e, em particular, de 35 a 85% em peso, em temperaturas de 10 a 60Ό e, em particular, 15 a 45 Ό, por 2 minutos a 12 horas e, em particular, de 5 minutos a 2 horas.