TW202328441A - 赭麯黴毒素a的解毒手段和方法 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及能夠使赭麯黴毒素A(OTA)解毒的多肽和所述多肽的新變體的新用途以及基於其的方法(例如用於使黴菌毒素解毒)。本發明還涉及組合物、試劑盒、轉基因植物、轉基因種子、轉基因花粉粒、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑、益生元、中間益生元和/或它們的混合物,其包含能夠使赭麯黴毒素A(OTA)解毒的多肽和/或變體中的一種或多種。
Description
本申請包含計算機可讀形式的序列表,其通過引用併入本文。本發明涉及能夠使黴菌毒素(例如赭麴黴毒素A(OTA))解毒的多肽及其變體以及基於它們的方法(例如用於使黴菌毒素例如OTA解毒)。本發明進一步涉及包含能夠使黴菌毒素(例如赭麴黴毒素A(OTA))解毒的一種或多種本發明的多肽及其變體的組合物、試劑盒、轉基因植物、轉基因種子、轉基因花粉粒、轉基因宿主細胞、轉基因孢子、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑、益生元、中間益生元和/或它們的混合物。
黴菌毒素是由主要屬於麴黴屬(Aspergillus)和青黴屬(Penicillium)的真菌物種產生的次級低分子量代謝物。黴菌毒素赭麴黴毒素A(OTA;也稱為例如N-{[(3R)-5-氯-8-羥基-3-甲基-1-氧代-3,4-二氫-1H-2-苯並吡喃-7-基]羰基}-L-苯丙氨酸,(-)-N-((5-氯-8-羥基-3-甲基-1-氧代-7-異色滿基)羰基)-3-苯丙氨酸,(2S)-2-{[(3R)-5-氯-8-羥基-3-甲基-1-氧代-3,4-二氫-1H-2-苯並吡喃-7-羰基]氨基}-3-苯基丙酸,(R)-N-((5-氯-3,4-二氫-8-羥基-3-甲基-1-氧代-1H-2-苯並吡喃-7-基)羰基)苯丙氨酸,N-(((3R)-5-氯-8-羥基-3-甲基-1-氧代-7-異色滿基)羰基)-3-苯基-L-丙氨酸,N-[(3R)-5-氯-8-羥基-3-甲基-1-氧代-3,4-二氫-1H-2-苯並吡喃-7-羰基]-L-苯丙氨酸,N-{[(3R)-5-氯-8-羥基-3-甲基-1-氧代-3,4-二氫-1H-異色烯-7-基]羰基}-L-苯丙氨酸),CAS No. 303-47-9,由真菌大量產生並且是赭麴黴毒素組中毒性最大的成員,所述赭麴黴毒素組尤其包括赭麴黴毒素B、赭麴黴毒素C等。特別地,由於對人類和動物的嚴重副作用,包括腎毒性、免疫毒性和致癌性(Carballo等人,2019;Malier等人,2016),OTA對食品和飼料安全性產生了嚴重的關注。在這方面,OTA已被國際癌症研究機構(IARC)在2B組中分類為可能的人類致癌物(IARC,2012)。
可食用作物、植物和相關產品的收穫前和收穫後階段的環境條件影響產OTA真菌的繁殖,這導致食品和飼料材料中OTA和可能的其它黴菌毒素的污染。值得注意的是,由於動物被餵被污染飼料時的遺留現象,在基於穀物的食品和飼料以及蛋、肉、奶和由其衍生的產品中也已經報導了OTA的存在。此外,報導了OTA存在於各種食品中,例如咖啡、葡萄酒、啤酒、葡萄、豆類、可可等。由於OTA給人類和動物健康和幸福造成的相關風險,歐洲委員會已經提供了指導方針來控制其在食品(EC 1881/2006)和飼料(EC 2016/1319)中的存在。其中,報導了每kg體重120ng OTA的可耐受每週攝入量。特別是就動物飼料而言,穀物/穀物產品的指導值是0.25mg OTA/kg飼料,豬、家禽和貓/狗用的配合飼料的指導值分別是0.05mg/kg、0.1mg/kg和0.01mg/kg。
通常,食品和飼料材料中黴菌毒素含量、特別是OTA含量的降低是食品和飼料工業努力確保安全供應鏈的未滿足的需要。已有報導利用不動苯基桿菌(Phenylobacterium immobile)或解毒毛孢酵母(Trichosporon mycotoxinivorans)的全細胞進行OTA水解,對OTA進行微生物解毒(Wegst和Lingens 1983;US 2009/0098244 A1)。然而,由於法規和安全要求,微生物在食品和飼料應用中用於OTA水解的適用性是具有挑戰性的。此外,全細胞微生物的使用與以確保所述微生物包含的酶的足夠活性的方式來培養和配製微生物的複雜和昂貴要求相關。
作為OTA的微生物解毒的替代方式,需要開發一種基於酶的策略用於生物化學OTA降解。在這方面,以前報導了來自黑麴黴(Aspergillus niger)的稱為赭麴黴毒素酶(ochratoxinase)的酶具有OTA水解活性(例如Dobrtzsch等,2014, Biochem J. 15;462(3):441-52)。然而,尚未證明在食品和飼料生產線中所需的真實條件下應用這種酶,並且認為這是不可能的。 Delafioria等(Toxins 2020, 12, 258)報導了豬羧肽酶B作為OTA水解酶。 EP 2 613 647 B1公開了一種能夠降解OTA的酰胺酶。儘管如此,由於活性、穩定性和/或重組還原能力不足,迄今為止報導的OTA水解酶不能期望在應用條件下有效地發揮作用。
因此,需要提供具有改善的功能性(例如酶動力學和/或效率)和/或穩定性(例如熱穩定性)的進一步改善的OTA水解酶及其變體。
本發明涉及一種用於使具有式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素)(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾和/或水解)的方法(例如體外、離體、體內和/或製造方法,例如工業應用):
,其中R1選自H和OH,R2選自H和CH2-CH3,
R3選自H和Cl;所述方法包括:(a) 提供:(i) 一種或多種多肽,所述一種或多種多肽與選自以下的氨基酸序列具有至少70%序列同一性(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%):SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 318、SEQ ID NO: 336、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NOs: 16-359、368-370;優選地,所述一種或多種多肽能夠使至少一種具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素)解毒(例如修飾或水解);進一步優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;最優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;進一步最優選地,所述一種或多種多肽包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個:如本文所定義的(i’)-(xxi’)(例如SEQ ID NOs: 3-15、360-367);(ii) 親本多肽的一種或多種變體,其中所述變體在一個或多個位置處包含改變(例如置換、缺失和/或插入),其中所述變體與選自以下的氨基酸序列具有至少70%(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)但小於100%序列同一性:SEQ ID NOs: 1、2、16-21、22、23-34、317-318、326-335、336-337、348-349、368-370,優選地,所述變體能夠使至少一種具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素)(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解);進一步優選地,所述變體具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;最優選地,所述變體具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;進一步最優選地,所述變體包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個:根據(i)的(i’)-(xiii’);進一步最優選地,所述親本多肽選自以下:SEQ ID NOs: 1、2、16-21、22、23-34、317-318、326-335、336-337、348-349、368-370;(iii) 編碼和/或能夠表達根據(i)-(ii)的一種或多種多肽和/或一種或多種變體的一種或多種多核苷酸、核酸構建體和/或表達載體;(iv) 包含(i)、(ii)和/或(iii)的一種或多種重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子和/或轉基因花粉粒;和/或(v) 包含(i)、(ii)、(iii)和/或(iv)的食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑,中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物;(b) 將(a)應用於所述黴菌毒素。
本發明進一步涉及包含以下中的一種或多種的食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑,中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物:(i) 一種或多種多肽,所述一種或多種多肽與選自以下的氨基酸序列具有至少70%序列同一性(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%):SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 318、SEQ ID NO: 336、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NOs: 16-359、368-370;優選地,所述多肽能夠使至少一種具有如本文所公開的所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素)(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解);進一步優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;最優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;進一步最優選地,所述多肽包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個:如本文所定義的(i’)-(xxi’)(例如SEQ ID NOs: 3-15、360-367);(ii) 親本多肽的一種或多種變體,其中所述變體在一個或多個位置處包含改變(例如置換、缺失和/或插入),其中所述變體與選自以下的氨基酸序列具有至少70%(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)但小於100%序列同一性:SEQ ID NOs: 1、2、16-21、22、23-34、317-318、326-335、336-337、348-349、368-370,優選地,所述變體能夠使至少一種具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素)(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解);進一步優選地,所述變體具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;最優選地,所述變體具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;進一步最優選地,所述變體包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個:根據(i)的(i’)-(xxi’);進一步最優選地,所述親本多肽選自以下:(iii) 編碼和/或能夠表達根據(i)-(ii)的一種或多種多肽和/或一種或多種變體的一種或多種多核苷酸、核酸構建體和/或表達載體;和/或(iv) 包含(i)、(ii)和/或(iii)的一種或多種重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子和/或轉基因花粉粒。
本發明進一步涉及親本多肽(例如具有EC 3.4.13.X的親本肽酶,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;例如所述親本肽酶具有EC 3.4.13.9和/或選自以下:SEQ ID NOs: 1-2、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 318、SEQ ID NO: 336、SEQ ID NO: 348)的變體,所述變體能夠使至少一種具有如本文所定義的所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素)(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解),其中所述變體在一個或多個位置處包含改變(例如置換、缺失和/或插入),其中所述變體與選自以下的氨基酸序列具有至少70%(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)但小於100%序列同一性:SEQ ID NOs: 1、2、16-21、22、23-34、317-318、326-335、336-337、348-349、368-370;優選地,所述變體具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;進一步優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;最優選地,所述變體包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個:如本文所定義的(i’)-(xxi’)(例如SEQ ID NOs: 3-15、360-367)。
本申請通過提供本文下文描述的多肽滿足了這種需要,所述多肽在申請專利範圍中表徵並通過所附實施例和附圖說明。
序列表概述
如本文所述,可以參考UniProtKB登錄號(http://www.uniprot.org/,例如如在2021年2月10日發布的UniProt release 2021_01中可得到)。
如本文所述,可以參考GenBank登記號(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/,例如如在2021年2月15日出版的Release 242.0中可得到。
SEQ ID NO: 1是屬於酰胺水解酶蛋白家族的本發明的示例性OTA水解多肽1的成熟種類的氨基酸序列。 SEQ ID NO: 1可用作本發明的示例性親本多肽。
SEQ ID NO: 2是屬於酰胺水解酶蛋白家族的本發明的示例性OTA水解多肽2的氨基酸序列。 SEQ ID NO: 2可用作本發明的示例性親本多肽。
SEQ ID NOs: 3-15是本發明的示例性氨基酸基序(例如保守基序)。
SEQ ID NO: 16是本發明的示例性OTA水解多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 17是屬於酰胺水解酶蛋白家族的本發明的示例性OTA水解多肽3的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 18是屬於酰胺水解酶蛋白家族的本發明的示例性OTA水解多肽4的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 19是屬於酰胺水解酶蛋白家族的本發明的示例性OTA水解多肽5的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 20是屬於酰胺水解酶蛋白家族的本發明的示例性OTA水解多肽6的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 21是示例性OTA水解多肽7的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 22是屬於酰胺水解酶蛋白家族的本發明的示例性OTA水解多肽8的氨基酸序列。 SEQ ID NO: 22可用作本發明的示例性親本多肽。
SEQ ID NOs: 23-34是屬於酰胺水解酶蛋白家族的本發明的其它示例性OTA水解多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NOs: 35-47是屬於酰胺水解酶蛋白家族的本發明的其它示例性OTA水解多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NOs: 48-316是屬於酰胺水解酶蛋白家族的本發明的其它示例性OTA水解多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NOs: 317和318分別是屬於酰胺水解酶蛋白家族的本發明的具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的示例性OTA水解多肽的另一成熟種類和天然未成熟種類的氨基酸序列。
SEQ ID NOs: 319-325是具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列並進一步包含可選的N端前導肽的OTA水解多肽的其它示例性變體的氨基酸序列。
SEQ ID NOs: 326-335是SEQ ID NOs: 17-21的示例性OTA水解多肽中任一個的成熟種類的氨基酸序列。
SEQ ID NOs: 336-337是屬於酰胺水解酶蛋白家族的本發明的另一示例性OTA水解多肽的氨基酸序列。 SEQ ID NO: 336可用作本發明的示例性親本多肽。
SEQ ID NOs: 338-347是具有SEQ ID NO: 336的氨基酸序列的OTA水解多肽的示例性變體的氨基酸序列。
SEQ ID NOs: 348-349是屬於酰胺水解酶蛋白家族的本發明的另一示例性OTA水解多肽的氨基酸序列。 SEQ ID NO: 348可用作本發明的示例性親本多肽。
SEQ ID NOs: 350-359是具有SEQ ID NO: 348的氨基酸序列的OTA水解多肽的示例性變體的氨基酸序列。
SEQ ID NOs: 360-367是本發明的其它示例性氨基酸基序(例如保守基序)。
SEQ ID NOs: 368-370是屬於酰胺水解酶蛋白家族的本發明的其它示例性OTA水解多肽的氨基酸序列。
定義
如本文所述,根據2020年2月26日公佈的酶命名數據庫(例如可在https://enzyme.expasy.org/獲得),「EC編號」(酶學委員會編號)可用於指酶活性。 EC編號是指來自NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, Calif.的酶命名法1992,包括分別在Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5;Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6;Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5;Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1-6;和Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650中發表的增刊1-5。
術語「多肽」在本文中與術語「蛋白質」等同地使用。蛋白質(包括其片段、優選生物活性片段,和肽,其通常具有小於30個氨基酸)包含一個或多個彼此通過共價肽鍵偶聯的氨基酸(產生氨基酸鏈)。如本文所用,術語「多肽」描述一類分子,其例如由大於30個氨基酸組成。多肽還可以形成多聚體,例如二聚體、三聚體和更高的低聚體,即,由大於1個多肽分子組成。形成此類二聚體、三聚體等的多肽分子可以是相同的或不同的。相應的這些多聚體更高級的結構因此稱作同-或異二聚體、同-或異三聚體等。一種異多聚體的實例是以其天然存在形式由兩個相同的輕多肽鍊和兩個相同的重多肽鏈組成的抗體分子。術語「多肽」和「蛋白質」也指天然修飾的多肽/蛋白質,其中所述修飾受例如翻譯後修飾(如糖基化、酰基化、磷酸化等)的影響。此類修飾是本領域熟知的。
氨基酸基序:如本文所用的術語「氨基酸基序」或「基序」可以指多肽的特別定義的氨基酸區段。因此,本發明的氨基酸基序(例如如SEQ ID NOs: 3-15所示)可涉及多肽內(例如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2內)的短氨基酸序列。
序列同一性:兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性由參數「序列同一性」描述。出於本發明的目的,使用在EMBOSS軟件包(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice等人,2000, Trends Genet. 16: 276-277)的Needle程序、優選5.0.0版或更新版本中執行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)來確定兩個氨基酸序列之間的序列同一性。所使用的參數可以是空位開放罰分10,空位延伸罰分0.5,以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩陣。將標記為「最長同一性」(使用非簡化(no-brief)選項獲得)或標記為「同一性」的Needle輸出用作同一性百分比並且是如下計算的:
(相同的殘基×100)/(比對長度-比對中的空位總數)。
替代地,所使用的參數可以是空位開放罰分10,空位延伸罰分0.5,以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩陣。將標記為「最長同一性」的Needle輸出(使用非簡化(no-brief)選項獲得)用作同一性百分比並且是如下計算的:
(相同的脫氧核糖核苷酸×100)/(比對長度-比對中的空位總數)。
表達:術語「表達」包括涉及於變體(多肽)產生的任何步驟,其包括、但不限於轉錄、轉錄後修飾、翻譯、翻譯後修飾和分泌。
表達載體:術語「表達載體」可以指線性或環狀DNA分子,其包含編碼變體(多肽)的多核苷酸並可操作地連接至控制序列以提供其表達,特別是提供其轉錄。
片段:術語「片段」可以指一種自成熟多肽的氨基和/或羧基端缺失一個或多個(例如若干個)氨基酸的多肽;其中所述片段具有如本文其它地方所述的活性。
宿主細胞:術語「宿主細胞」可以指易於用包含本發明的多核苷酸的核酸構建體或表達載體進行轉化、轉染、轉導等的任何細胞類型。術語「宿主細胞」涵蓋由於復制期間出現的突變而與親本細胞不相同的親本細胞的任何子代,例如重組或轉基因宿主細胞。
核酸構建體:術語「核酸構建體」可以指單鍊或雙鏈的核酸分子,該核酸分子是從天然存在的基因中分離的,或者以一種本來不存在於自然界中的方式被修飾成含有核酸區段,或者是合成的,該核酸分子包含一個或多個控制序列。
可操作地連接:術語「可操作地連接」可以指這樣一種構造,在該構造中,將控制序列相對於多核苷酸的編碼序列安置在適當位置處,使得該控制序列指導該編碼序列的表達。
控制序列:如本文所用的術語「控制序列」可以指對於表達編碼本發明的變體(多核苷酸)的多核苷酸所必需的核酸序列。每個控制序列對於編碼該變體的多核苷酸來說可以是同源(native)的(即,來自相同基因)或外源的(即,來自不同基因),或相對於彼此是同源(native)的或外源的。此類控制序列包括、但不限於前導子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列以及轉錄終止子。至少,控制序列包括啟動子,以及轉錄和翻譯終止信號。出於引入有利於將這些控制序列與本發明的多核苷酸的編碼區連接的特異性限制位點的目的,可以提供具有接頭的控制序列。
如本文所用,術語「對應於」可以是指確定序列中的特定氨基酸(其中參考了特定氨基酸序列(如US2020071638))的方式。例如出於本發明的目的,當參考特定氨基酸位置時,技術人員將能夠將另一氨基酸序列與所述已經被參考的氨基酸序列進行比對,從而確定哪一個特定氨基酸可能是在所述另一個氨基酸序列中所關注的。已經在本文其它地方描述了另一氨基酸序列與例如如在SEQ ID NOs: 1或2或22或318所示的序列或本文列出的任何其它序列(例如SEQ ID NO: 336、SEQ ID NO: 348)的比對。可使用替代性比對方法,並且這些比對方法是本領域技術人員熟知的。
當根據本發明使用時,術語「位置」可以是指本文所描繪的氨基酸序列中氨基酸的位置。在本上下文中術語「對應於」可包括位置不僅由前面的核苷酸/氨基酸的數量決定的情況。
如本文所用,「沉默」突變意指核酸序列中的鹼基置換,該置換不會改變由該核酸序列編碼的氨基酸序列。 「保守性或等價」置換(或突變)意指如下表1中作為「示例性置換」列出的置換。如本文所用的「高度保守性」置換意指如下文表1中標題「優選置換」下示出的置換。
表1.胺基酸置換
原始 | 示例性置换 | 優選置换 |
Ala (A) | val;leu;ile | val |
Arg (R) | lys;gln;asn | lys |
Asn (N) | gln;his;asp、lys;arg | gln |
Asp (D) | glu;asn | glu |
Cys (C) | ser;ala | ser |
Gln (Q) | asn;glu | asn |
Glu (E) | asp;gln | asp |
Gly (G) | ala | ala |
His (H) | asn;gln;lys;arg | arg |
Ile (I) | leu;val;met;ala;phe; | leu |
Leu (L) | norleucine;ile;val;met;ala; | ile |
Lys (K) | arg;gln;asn | arg |
Met (M) | leu;phe;ile | leu |
Phe (F) | leu;val;ile;ala;tyr | tyr |
Pro (P) | ala | ala |
Ser (S) | thr | thr |
Thr (T) | ser | ser |
Trp (W) | tyr;phe | tyr |
Tyr (Y) | trp;phe;thr;ser | phe |
Val (V) | ile;leu;met;phe;ala; | leu |
變體:術語「變體」可以指在一個或多個(例如若干個)位置處包含改變(即,置換、插入和/或缺失)的如本文所述的具有特異性活性的多肽。置換意指用一個不同氨基酸替換佔據一個位置的氨基酸;缺失意指移除佔據一個位置的氨基酸;插入意指在鄰接和緊隨佔據一個位置的氨基酸之後添加一個氨基酸。
在描述本發明的變體時,為了易於參考,採用了下文描述的命名法。採用公認的lUPAC單字母或三字母氨基酸縮寫。
置換。對於氨基酸置換,使用以下命名法:原始氨基酸、位置、置換的氨基酸。因此,將位置167處的Asn(N)用Thr(T)置換指定為「N167T」或「Asn167Thr」。多個突變可通過加號(「+」)或(「,」或「、」)或(「/」)分開,例如「N167T+F168Y+S174C+F218Y;」或「N167T、F168Y、S174C、F218Y;」或「N167T/F168Y/S174C/F218Y;」,代表在給定位置處的多個置換。在本申請的實施例中,多個突變可被逗號或頓號分隔,例如N167T,F168Y,S174C,F218Y。此外,如本文所用的「X」或「Xaa」可以表示任何氨基酸(例如如上文表1中所示)。因此,如本文所用的「X167T」可以表示在位置167的任何氨基酸用T(Thr)置換。在原始氨基酸殘基可以是任何氨基酸殘基的情況下,也可以使用僅指示位置和置換的氨基酸的簡化符號。因此,「X」或「Xaa」在指定置換時可以省略,例如,「167T」指定可用於表示在位置167的任何氨基酸用T(Thr)置換。此外,如本文所用的「X167G、A、S、C、U、I、L、V、T」可以表示在位置167的任何氨基酸用G、A、S、C、U、I、L、V或T中的任何一個置換。在置換的氨基酸殘基可以是任何氨基酸殘基的情況下,也可以使用僅指示原始氨基酸及其位置的簡化符號,例如「N167」。
如本文所用,術語「轉基因(的)」可以指一種例如通過轉化或重組引入異源基因材料或同源基因材料的另外拷貝而使其基因組得到改變的生物體(例如US7410800B2)。轉基因生物體可以是植物、哺乳動物、真菌、細菌或病毒。如本文所用,「轉基因植物、種子或花粉粒」可以指植物、種子或花粉粒或衍生自它們的任何後代的子代植物、種子或花粉粒,其中所述植物、種子或花粉粒或其子代的DNA包含相同植株的非轉基因植物、種子或花粉粒中初始不存在的引入的外源DNA。轉基因植物、種子或花粉粒可另外地包含對被轉化的植物而言為天然的序列,但是其中為了改變編碼序列的表達水平或模式已改變了外源DNA。
術語「食物」可以指具有食用價值的物質。
術語「草料」可以指餵養家畜的物質。
術語「飼料」可以指用作牲畜食物的物質。
術語「添加劑」可以指例如以少量添加至另一產品或物質中以實現期望的性質和/或特性的化合物或物質。
術語「益生元」可以指能夠誘導有益微生物的生長和/或活性的化合物或物質。
術語「解毒劑」可以指能夠降低和/或抑制毒性(例如以合適的形式(例如溶解的或成顆粒的(granulated)或成團粒的(pelleted))和/或在合適的溶液中(例如在緩衝溶液中,例如在磷酸鈉緩衝溶液中)和/或在合適的條件下,例如如本文實施例3中公開的(例如在pH 7.5和/或在37℃下)的化合物或物質。
術語「營養補充劑」可以指能夠支持膳食中營養含量的化合物或物質,例如維生素和礦物質。
術語「藻植酸物質(phycophytic substance)」可以指來源於海草或藻類物種的物質。
氨基酸基序:如本文所用的術語「氨基酸基序」或「基序」可以指多肽的特別定義的氨基酸區段。因此,本發明的氨基酸基序可涉及給定多肽內的短氨基酸序列。
術語「中間(體)(intermediate)」可以指在獲得本發明的終產物的過程(例如在該過程的中間階段)中產生的化合物或物質,所述終產物例如本發明的食物、草料、草料;飼料、添加劑(如食物、草料或飼料添加劑)、解毒劑、營養補充劑或益生元。
術語「赭麴黴毒素」可以指具有式I的化合物(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C):
,其中R1選自H和OH,R2選自H和CH2-CH3,R3選自H和Cl。
應注意如本文所用,單數形式「一個/一種」和「所述/該」包括複數指代,除非上下文另有明確指示。因此,例如提及「試劑」包括一種或多種這樣的不同試劑,提及「方法」包括提及本領域普通技術人員已知的等同步驟和方法,其可以被修飾或替代本文所述的方法。
除非另有說明,在一系列要素之前的術語「至少」應理解為是指該系列中的每個要素。本領域技術人員將認識到或能夠使用不超過常規實驗確定本文所述的本發明的具體實施方案的許多等同方案。這些等同方案也意在被本發明涵蓋。
術語「和/或」無論在本文何處使用都包括「和」、「或」和「由所述術語連接的要素的全部或任何其它組合」的含義。
當在本文使用時,術語「約」或「大約」意指在給定值或範圍的20%內,優選地在10%內和更優選地在5%內。
在整個說明書和隨後的權利要求書中,除非上下文另有要求,詞語「包含(comprise)」及其諸如「包含(comprises)」和「包含(comprising)」的變形應理解為暗示包括所述的整數或步驟或者整數或步驟的組,但不排除任何其它整數或步驟或者整數或步驟的組。當在本文使用時,術語「包含」可以用術語「含有」或「包括」代替,或者有時當在本文使用時用術語「具有」代替。
當在本文使用時,「由…組成」排除未在請求保護的要素中指定的任何要素、步驟或成分。當在本文使用時,「基本上由…組成」不排除對請求保護的基本特徵和新特徵沒有實質性影響的材料或步驟。
在本文的每個實例中,術語「包括(包含)」、「基本上由…組成」和「由…組成」中的任何一個都可以被其他兩個術語中的任何一個代替。
本發明的目的已經通過提供本文所述的手段和方法實現,例如通過提供能夠使黴菌毒素(例如赭麴黴毒素,例如赭麴黴毒素A(OTA))解毒的進一步改進的多肽及其新變體,特別是例如在製粒前和/或製粒後例如具有改進的熱穩定性和/或改進的OTA降解能力的多肽/變體(例如如本文表6-18中所公開的)。
如下文實施例部分中所示,本發明的多肽和變體證明了OTA解毒在食品/飼料工業應用中的適用性。
在一些實施方案/方面,本發明涉及能夠使至少一種具有式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素)(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解)的多肽:
,其中R1選自H和OH,R2選自H和CH2-CH3,R3選自H和Cl。
在一些實施方案/方面,所述多肽具有肽酶活性EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;其中所述多肽是以下中的一種或多種:a) 與選自以下的氨基酸序列具有至少58%序列同一性(例如至少59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)的多肽:SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 318、SEQ ID NO: 336、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NOs: 16-359、368-370;b) (a)的多肽的變體,其中所述變體在一個或多個位置處包含置換、缺失和/或插入(例如所述變體具有一個或多個保守或等價置換;c) (a)或(b)的多肽的片段,其中所述片段能夠使具有所述式I的黴菌毒素解毒。
在一些實施方案/方面,本發明涉及一種用於使具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素)(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解)的方法(例如體外、離體、體內方法和/或製造方法);所述方法包括:(a) 提供:(i) 一種或多種多肽,所述一種或多種多肽與選自以下的氨基酸序列具有至少70%序列同一性(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%):SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 318、SEQ ID NO: 336、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NOs: 16-359、368-370;其中所述一種或多種多肽能夠使至少一種具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素)解毒(例如修飾或水解);優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;進一步優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;最優選地,所述一種或多種多肽包含以下氨基酸序列(例如保守基序)的一個或多個:PGFIDAHVH(SEQ ID NO: 3),優選地,所述SEQ ID NO: 3被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置87-95的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;PAEQA(SEQ ID NO: 4),優選地,所述SEQ ID NO: 4被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置116-120的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;GVCNG(SEQ ID NO: 5),優選地,所述SEQ ID NO: 5被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置197-201的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;CRAAVR(SEQ ID NO: 6),優選地,所述SEQ ID NO: 6被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置205-210的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;IKFMPSGGVLSL (SEQ ID NO: 7),優選地,所述SEQ ID NO: 7被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置220-231的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;RKVAAH(SEQ ID NO: 8),優選地,所述SEQ ID NO: 8被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置257-262的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;AGVDSIEHG(SEQ ID NO: 9),優選地,所述SEQ ID NO: 9被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置275-283的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;VMPGLIDAH(SEQ ID NO: 10),優選地,所述SEQ ID NO: 10被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置51-59的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;AGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 11),優選地,所述SEQ ID NO: 11被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置96-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;QTFGH(SEQ ID NO: 12),優選地,所述SEQ ID NO: 12被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置135-139的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;ATGGVLS(SEQ ID NO: 13),優選地,所述SEQ ID NO: 13被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置185-191的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;YVAAHAHGD(SEQ ID NO: 14),優選地,所述SEQ ID NO: 14被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置219-227的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;LTPTL(SEQ ID NO: 15),優選地,所述SEQ ID NO: 15被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置262-266的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;VMPGLID(SEQ ID NO: 360),優選地,所述SEQ ID NO: 360被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置52-58的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;KGGSL(SEQ ID NO: 361),優選地,所述SEQ ID NO: 361被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置67-71的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;LLLAGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 362),優選地,所述SEQ ID NO: 362被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置93-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;QTFGHGE(SEQ ID NO: 363),優選地,所述SEQ ID NO: 363被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置135-141的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;FATGGVLSQRD(SEQ ID NO: 364),優選地,所述SEQ ID NO: 364被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置184-194的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;IVNEA(SEQ ID NO: 365),優選地,所述SEQ ID NO: 365被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置209-213的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;IGVDEWGL(SEQ ID NO: 366),優選地,所述SEQ ID NO: 366被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置279-286的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;GFETGL(SEQ ID NO: 367),優選地,所述SEQ ID NO: 367被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置317-322的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;(b) 將(a)應用於所述具有式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素)。
在一些實施方案/方面,本發明涉及一種用於使具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素)(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解)的方法(例如體外、離體、體內和/或製造方法);所述方法包括:(a) 提供:ii) 親本多肽的一種或多種變體,其中所述變體在對應於親本多肽的位置的一個或多個位置處包含改變(例如置換、缺失和/或插入),其中所述變體與選自以下的親本氨基酸序列具有至少70%(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)但小於100%序列同一性:SEQ ID NO: 1、2、16-21、22、23-34、317-318、326-335、336-337、348-349、368-370;其中所述變體能夠使至少一種具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素)(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解);優選地,所述變體具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;進一步優選地,所述變體具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;最優選地,所述變體包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個:如本文所定義的(i’)-(xiii’);進一步最優選地,所述親本多肽選自:SEQ ID NOs: 1、2、16-21、22、23-34、317-318、326-335、336-337、348-349、368-370;(b) 將(a)應用於所述具有式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素)。
在一些實施方案/方面,本發明涉及一種使具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解)的方法(例如體外、離體、體內和/或製造方法);所述方法包括:(a) 提供:(iii) 編碼和/或能夠表達根據如上文的(i)-(ii)的一種或多種多肽和/或一種或多種變體的一種或多種多核苷酸、核酸構建體和/或表達載體;(b) 將(a)應用於所述具有式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素)。
在一些實施方案/方面,本發明涉及一種用於使具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素)(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解)的方法(例如體外、離體、體內和/或製造方法);所述方法包括:(a) 提供:(iv) 包含如上文的(i)、(ii)和/或(iii)的一種或多種重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子和/或轉基因花粉粒;(b) 將(a)應用於所述具有式I的黴菌毒素。
在一些實施方案/方面,本發明涉及一種用於使具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素)(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解)的方法(例如體外、離體、體內和/或製造方法);所述方法包括:(a) 提供:(v) 包含如上文的(i)、(ii)、(iii)和/或(iv)的食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑,中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物;(b) 將(a)應用於所述具有式I的黴菌毒素。
在本發明的一些實施方案/方面,所述多肽和/或變體具有TIM桶結構,所述TIM桶結構包含沿多肽主鏈交替的8個α-螺旋和8個平行β-鏈,其中優選地,所述TIM桶還包含磷酸結合位點(phosphate binding site)。
在本發明的一些實施方案/方面,所述多肽和/或變體在pH7.5具有至少2.9U/g的比活性;
在本發明的一些實施方案/方面,所述多肽和/或變體在pH6.0具有至少0.9U/g的比活性。
在本發明的一些實施方案/方面,所述多肽和/或變體具有大於80℃(例如大於85℃)的T50值。
在本發明的一些實施方案/方面,所述多肽選自以下:SEQ ID NOs: 1、2、16-21、22、23-34、317-318、326-335、336-337、348-349、368-370。
在本發明的一些實施方案/方面,本發明的變體選自以下:SEQ ID NOs: 35-316、319-325、338-347、350-359。
在本發明的一些實施方案/方面,所述變體在對應於SEQ ID NO: 2的位置65、106、132、268、269、272、275和/或318的一個或多個位置處包含改變(例如置換、缺失和/或插入),優選地,使用SEQ ID NO: 2的編號,例如,所述變體包含以下置換或置換組合中的一個或多個:I65G,I65A,E106G,E106S,P132A,I268A,Q269I,I272V,Y275V;F318V;I272V;Y275F;Y275H;和/或F318V,或其等價氨基酸置換。
在本發明的一些實施方案/方面,所述變體在對應於SEQ ID NO: 318或SEQ ID NO: 1的位置30、36、50、85、97、98、99、100、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、119、122、126、130、142、143、144、170、171、176、178、179、181、183、184、187、188、192、198、223、226、228、229、230、231、233、235、239、242、253、264、284、287、307、308、310、311、314、315、317、318、322、329、330、332、333、339、353、354、355、356、357、358或361的一個或多個位置處包含改變(例如置換、缺失和/或插入),優選地,使用SEQ ID NO: 318的編號,例如,變體包含以下置換或置換組合中的一個或多個:Y300C+L389C;I308V;A171P;T144A;V355L;I308A;G354A;S143E;M223C;A171G;H187N;I184V;H187Q;E239Q;V311I;K314Q;F109A;Y122R;F318Y;A36C+L85C;A375P;M223C;M223A;H264Q;A307G;H178Q;A307G+V355T;T144A;A171P;A171G;M223C;V228A;L229V;L229M;A307S;A307G;I308V;V311T;V355T;V311A;V355A;H264Q;M223C;M223A;A171L;A171G;H178Q;H178L;A307G+V311A;A307G+V311T;A307G+V355T;A307G+A355A;H178S;V228L;V228I;L229I;H264N;H264L;A307V;A307T;I308A;V311L;V311I;G354A;S97D;S97N;S97P;S97T;S97V;G142A;G142P;T144D;T144E;T144P;T144R;A179P;A179S;A179T;A171P+I184V;A171P+I308A;A171P+I308V;A171P+F318Y;A171P+G354A;I184V+I308A;I184V+I308V;I184V+F318Y;I184V+G354A;I308A+F318Y;I308V+F318Y;I308A+G354A;I308V+G354A;F318Y+G354A;A171P+I184V+I308A;A171P+I184V+I308V;A171P+I184V+F318Y;A171P+I184V+G354A;A171P+I308A+F318Y;A171P+I308V+F318Y;A171P+I308A+G354A;A171P+I308V+G354A;A171P+F318Y+G354A;I184V+I308A+F318Y;I184V+I308V+F318Y;I184V+I308A+G354A;I184V+I308V+G354A;I184V+F318Y+G354A;I308A+F318Y+G354A;I308V+F318Y+G354A;Q181M;Q181L;F318L;F318M;A329G;A329V;V355L;V355I;Y170E;Y170F;Y170R;A330L;A330M;A330V;L333I;L333M;L333V;G354L;G354S;G354T;G354V;G356A;G356F;G356P;G356V;G356Y;F109A;P183G;P183S;F108V;F108L;F109V;F109L;M112I;M112W;I184V;I184F;W104F;W104L;W104P;W104Y;I322L;I322M;I322Q;I322S;H187Q;H187N;H310Q;H310N;K314Q;K314E;H332Q;H332V;E287Q;H358Q;H358Y;Q99D;H30E;H30K;H30P;H30R;H50D;H50N;H50P;S100D;N103D;N103L;N103Q;T130E;H187D;H187E;H187G;H187P;K188D;K188E;K188R;G226A;G226P;G226S;S230D;S230P;S230T;D233N;D233Q;D233S;H253A;H253N;S284D;S284H;S284T;H310D;H310E;H332E;H332R;H332S;H339E;H339K;H339N;H339S;A353S;H358A;H358K;H358N;N361E;N361Q;D110K+K188D;D110K+K188E;H187N+K188R;S284D+A329S;S284D+A329T;H310D+E313A;H310E+E313A;V235P;E239Q;A357P;F108Y;N111D;M113Q;Y122R;Y126W;F109Y;Q242P;I315P;T317Y;F318Y;G98S;G98V;Y105N;Y105R;G106P;D107R;D107Y;M112F;M112K;M113D;M113R;Q119E;Q119H;Q119K;Q119M;G176S;A192L;A192M;A192V;V198T;L231F;V235A;V235D;V235F;V235L;L231E+V321T;L229I+I308A;I308A+A329V;I308A+G356F;I308A+G356P;I308A+G356Y;L229I+I308V;I308V+A329V;I308V+G356F;I308V+G356P;I308V+G356Y;G354A+G356V;G354A+G356Y;H310D+V355L;H310E+V355L;V311A+V355L;G354P+V355L;V355L+G356P;I184V+A192L;I184V+A192M;S143E;N361W;I308A+A330L;I308A+A330M;I308A+A330V;I308A+L333I;I308A+L333M;I308V+A330L;I308V+A330M;I308V+A330V;I308V+L333I;I308V+L333M;I308V+V355L;F318Y+V355L;H253E+D278R;K258Y+G391R;A36C+L85C;S100C+T317C;A179C+M223C;Y300C+L389C;A309C+A330C或其等價氨基酸置換。
在一些實施方案/方面,本發明涉及編碼和/或能夠表達本發明的一種或多種變體和/或多肽的多核苷酸、核酸構建體或表達載體。
在一些實施方案/方面,本發明涉及一種重組宿主細胞(例如分離的重組宿主細胞)、孢子、轉基因植物、轉基因種子或轉基因花粉粒,其包含以下中的一種或多種:(i) 本發明的一種或多種變體和/或多肽;(ii) 本發明的一種或多種多核苷酸;和/或(iii) 本發明的一種或多種核酸構建體和/或表達載體。
在一些實施方案/方面,本發明涉及一種包含以下中的一種或多種的組合物或試劑盒:本發明的變體、多肽、核酸構建體、表達載體、重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子和/或轉基因花粉粒、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑、益生元、中間益生元和/或它們的混合物和/或一種或多種多肽,所述一種或多種多肽與選自以下的氨基酸序列具有至少70%序列同一性(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%):SEQ ID NOs: 1、2、16-21、22、23-34、317-318、326-335、336-337、348-349、368-370;其中所述多肽能夠使至少一種具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素)解毒(例如修飾或水解),優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;進一步優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;最優選地,所述多肽包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個:如本文所定義的(i’)-(xxi’)。
在一些另外的實施方案/方面,本發明的組合物或試劑盒進一步包含以下中的一種或多種:(i) 一種或多種其它多肽,所述一種或多種其它多肽能夠使所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素)解毒,進一步優選地,所述一種或多種其它多肽屬於M20肽酶氨基酰化酶1-樣蛋白2-樣酰胺水解酶亞家族(例如M20肽酶ACY1L2酰胺水解酶亞家族,例如具有根據保守結構域數據庫(Conserved Domain Database)的標識符cd05672(例如https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cddsrv.cgi?uid=cd05672),和/或具有氨基肽酶活性(例如EC 3.4.11.10),和/或包含羧基肽酶活性(例如羧基肽酶A和/或B活性,例如分別具有EC 3.4.17.1和/或EC 3.4.17.2)和/或嗜熱菌蛋白酶活性(例如具有EC 3.4.24.27);(ii) 一種或多種其它多肽,所述一種或多種其它多肽能夠使一種或多種黴菌毒素(例如ZEN和/或單端孢黴烯黴菌毒素,諸如例如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、雪腐鐮刀菌烯醇、新茄鐮孢菌醇、trichotecin、扁蟲菌素(crotocin)、桿孢菌素(roridin) A、葡萄穗黴毒素H、二乙酰藨草鐮刀烯醇、HT-2毒素或T-2毒素;黃麴黴毒素,諸如例如黃麴黴毒素B1、B2、G1或G2;煙麴黴毒素,諸如例如煙麴黴毒素B1、B2、B3或B4;多肽黴菌毒素,諸如例如白殭菌毒素或恩鐮孢菌素;玉米赤黴烯酮;桔黴素;棒麴黴素;麥角生物鹼,諸如例如麥角胺)和/或一種或多種植物和/或細菌衍生的毒素(例如內毒素等)解毒,特別是所述一種或多種其它多肽能夠使一種或多種其它黴菌毒素和/或一種或多種植物和/或細菌衍生的毒素解毒,例如伏馬菌素酯酶(例如如WO 2016/134387 A1中公開)和/或玉米赤黴烯酮內酯酶(例如如WO 2020/025580 A1中公開)和/或ergopeptine水解酶(例如如WO 2014/056006 A1中公開);(iii) 一種或多種有機吸收劑(例如活的、失活的、凍乾的、休眠的和/或死的全酵母或酵母衍生的產物,諸如例如酵母細胞壁,或酵母寡糖,諸如例如甘露聚醣)和/或一種或多種無機吸收劑(例如矽藻土和/或粘土礦物,諸如例如高嶺土或高嶺石,綠土,諸如例如蒙脫石、伊利石或綠泥石;特別是膨潤土);( iv) 一種或多種活的、滅活的、凍乾的和/或休眠的微生物,所述一種或多種活的、滅活的、凍乾的和/或休眠的微生物能夠使一種或多種其它黴菌毒素(例如單端孢黴烯黴菌毒素,諸如例如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、雪腐鐮刀菌烯醇、新茄鐮孢菌醇、trichotecin、扁蟲菌素(crotocin)、桿孢菌素(roridin) A、葡萄穗黴毒素H、二乙酰藨草鐮刀烯醇、HT-2毒素或T-2毒素;黃麴黴毒素,諸如例如黃麴黴毒素B1、B2、G1或G2;煙麴黴毒素,諸如例如煙麴黴毒素B1、B2、B3或B4;多肽黴菌毒素,諸如例如白殭菌毒素或恩鐮孢菌素;玉米赤黴烯酮;桔黴素;棒麴黴素;麥角生物鹼,諸如例如麥角胺)和/或一種或多種植物或細菌衍生的毒素(例如內毒素等)解毒,特別地所述微生物選自以下:毛孢子菌屬(Trichosporon)和Apriotrichum屬(例如如WO 03/053161 A1中公開)和紅蝽菌(Coriobacteriaceae)科(例如如EP 3 501 526 A1中公開);(v) 一種或多種植物產品(例如海草,優選海草粉;和/或藻類,優選藻粉;和/或薊,優選薊種子;和/或甘草屬(glycyrrhiza)植物製劑,優選甘草粉和/或甘草提取物,例如如WO 2018/121881 A1中公開);(vi) 一種或多種調味化合物(例如植物提取物,例如來自牛至、百里香、冬青、香菜、墨角蘭、薄荷、胡椒薄荷、茴芹、橙、檸檬、茴香、八角、丁香、肉桂和/或大蒜;和/或精油,諸如例如D-檸檬烯、γ-萜品烯、對-繖花烴、2-蒈烯、芳樟醇氧化物、異薄荷酮、樟腦、芳樟醇、萜品烯-4-醇、2-異丙基-1-甲氧基-4-甲基苯、L-薄荷醇、乙胺、α-萜品醇、β-石竹烯、D-香芹酮、水楊酸甲酯、α-石竹烯、乙酸薰衣草酯、氧化石竹烯、丁子香酚、百里酚和/或香芹酚);(vii) 一種或多種維生素(例如維生素A、D、E、K、C、B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9和/或B12;特別是維生素E)。
在特別的實施方案/方面,本發明的組合物或試劑盒進一步包含以下中的一種或多種:膨潤土、伏馬菌素酯酶和/或玉米赤黴烯酮內酯酶、能夠使一種或多種黴菌毒素解毒的紅蝽菌科微生物(例如選自紅蝽菌科的微生物,例如https://lpsn.dsmz.de/family/coriobacteriaceae)、矽藻土、酵母(特別是滅活的酵母)、海草粉、薊種子和一種或多種調味化合物。
在一些其他實施方案中,本發明的它組合物(例如下文表2所示的示例性組合物1-24)或試劑盒(對應於下文表2所示的示例性組合物1-24)包含一種或多種其它組分(例如除了根據本發明的至少一種多肽)。這些進一步的示例性組合物或試劑盒明確公開於本文下文的表2中,其描述了本發明的實施方案。
表2. 包含一種或多種其他組分的本發明的示例性組合物或試劑盒。
組合物編號 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
根據本發明的任何變體或多肽(例如SEQ ID NOs: 1-2、16-359、368-370) | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 |
能夠使一種或多種其它霉菌/植物/细菌毒素解毒的任何合適的多肽 | 例如優馬菌素酯酶,例如具有EC:3.1.1.87酶活性, 例如UniProtKB - D2D3B6和/或其變體 | 例如優馬菌素酯酶,例如具有EC: 3.1.1.87酶活性,例如UniProtKB - D2D3B6和/或其變體 | ||||
任何合適的有機吸收劑 | 例如失活的酵母 | 例如乾的酵母 | 例如酵母 | |||
任何合適的無機吸收劑 | 例如膨潤土 | 例如沸石 | 例如膨潤土-蒙脫石 | 例如膨潤土 | 例如膨潤土 | 例如膨潤土 |
能夠使一種或多種其它霉菌毒素解毒的任何合適的微生物 | 例如 红蝽菌科 | 例如红蝽菌科 | 例如红蝽菌科 | |||
任何合適的植物產品 | 例如藻粉 | 例如薊種子 | ||||
任何合適的維生素 | 例如維生素E | |||||
任何合适的調味化合物 | 是 | |||||
組合物編號 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
根據本發明的任何變體或多肽(例如SEQ ID NOs: 1-2和/或16-359、368-370) | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 |
能夠使一種或多種其它霉菌/植物/细菌毒素解毒的任何多肽 | 例如優馬菌素酯酶,例如具有EC:3.1.1.87酶活性,例如UniProtKB - D2D3B6和/或其變體 | 例如優馬菌素酯酶,例如具有EC:3.1.1.87酶活性,例如UniProtKB - D2D3B6和/或其變體 | 例如優馬菌素酯酶,例如具有EC:3.1.1.87酶活性,例如UniProtKB - D2D3B6和/或其變體 | 例如優馬菌素酯酶,例如具有EC:3.1.1.87酶活性,例如UniProtKB - D2D3B6和/或其變體 | ||
任何合適的有機吸收劑 | 例如失活的酵母 | 例如釀酒酵母 | ||||
任何合適的無機吸收劑 | 例如膨潤土 | 例如膨潤土 | 例如膨潤土 | 例如膨潤土 | 例如膨潤土 | 例如膨潤土 |
能夠使一種或多種其它霉菌毒素解毒的任何合適的微生物 | 例如真细菌sp. | 例如红蝽菌科 | 例如真细菌sp. | 例如红蝽菌科 | ||
任何合適的植物產品 | 例如藻類提取物 | 例如海草粉,奶薊 | 例如藻植酸物質 | |||
任何合適的維生素 | ||||||
任何合適的調味化合物 | ||||||
組合物編號 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 |
根據本發明的任何變體或多肽(例如SEQ ID NOs: 1-2和/或16-359、368-370) | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 |
能夠使一種或多種其它霉菌/植物/细菌毒素解毒的任何合適的多肽 | 例如優馬菌素酯酶,例如具有EC:3.1.1.87酶活性,例如UniProtKB - D2D3B6和/或其變體,玉米赤霉烯酮内酯酶,例如UniProtKB - Q8NKB0和/或其變體 | 例如優馬菌素酯酶,例如具有EC:3.1.1.87酶活性,例如UniProtKB - D2D3B6和/或其變體,玉米赤霉烯酮内酯酶,例如UniProtKB - Q8NKB0和/或其變體 | ||||
任何合適的有機吸收劑 | 例如失活的酵母 | 例如乾的酵母 | 例如酵母 | |||
任何合適的無機吸收劑 | 例如膨潤土 | 例如沸石 | 例如膨潤土-蒙脫石 | 例如膨潤土 | 例如膨潤土 | 例如膨潤土 |
能夠使一種或多種其它霉菌毒素解毒的任何合適的微生物 | 例如红蝽菌科 | 例如红蝽菌科 | 例如红蝽菌科 | |||
任何合適的植物產品 | 例如藻粉 | |||||
任何合適的維生素 | 例如維生素E | |||||
任何合適的調味化合物 | 是 | |||||
組合物編號 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 |
根據本發明的任何變體或多肽(例如SEQ ID NOs: 1-2和/或16-359、368-370) | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 |
能夠使一種或多種其它霉菌/植物/细菌毒素解毒的任何多肽 | 優馬菌素酯酶,例如具有EC:3.1.1.87酶活性,例如UniProtKB - D2D3B6和/或其變體,玉米赤霉烯酮内酯酶,例如UniProtKB - Q8NKB0和/或其變體 | 優馬菌素酯酶,例如具有EC:3.1.1.87酶活性,例如UniProtKB - D2D3B6和/或其變體,玉米赤霉烯酮内酯酶,例如UniProtKB - Q8NKB0和/或其變體 | 優馬菌素酯酶,例如具有EC:3.1.1.87酶活性,例如UniProtKB - D2D3B6和/或其變體,玉米赤霉烯酮内酯酶,例如UniProtKB - Q8NKB0和/或其變體 | 優馬菌素酯酶,例如具有EC:3.1.1.87酶活性,例如UniProtKB - D2D3B6和/或其變體,玉米赤霉烯酮内酯酶,例如UniProtKB - Q8NKB0和/或其變體 | ||
任何合適的有機吸收劑 | 例如失活的酵母 | 例如釀酒酵母 | ||||
任何合適的無機吸收劑 | 例如膨潤土 | 例如膨潤土 | 例如膨潤土 | 例如膨潤土 | 例如膨潤土 | 例如膨潤土 |
能夠使一種或多種其它霉菌毒素解毒的任何合適的微生物 | 例如真细菌sp. | 例如红蝽菌科 | 例如真细菌sp. | 例如红蝽菌科 | ||
任何合適的植物產品 | 例如藻類提取物 | 例如海草粉,奶薊 | 例如藻植酸物質 | |||
任何合適的維生素 | ||||||
任何合適的調味化合物 |
在一些實施方案/方面,本發明涉及一種用於生產食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物的方法,所述方法包括:a) 提供:(i) 一種或多種多肽,所述一種或多種多肽與選自以下的氨基酸序列具有至少70%序列同一性(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%):SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 318、SEQ ID NO: 336、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NOs: 17-21、23-34、16-359、368-370;其中所述多肽能夠使至少一種具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素)解毒(例如修飾或水解);優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;進一步優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;最優選地,所述多肽包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個:如本文所定義的(i’)-(xxi’);(ii) 根據本發明的變體;(iii) 本發明的一種或多種多核苷酸;(iv) 本發明的一種或多種核酸構建體和/或表達載體;和/或(v) 本發明的一種或多種重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子和/或轉基因花粉粒;優選地,所述一種或多種多肽是一種或多種重組和/或分離多肽;b) 將(a)應用於適用於生產食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物的營養源或材料。
在一些實施方案/方面,本發明涉及一種通過本發明的方法生產的食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物。
在一些實施方案/方面,本發明涉及本發明的變體、多肽、多核苷酸、核酸構建體、表達載體、重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子、轉基因花粉粒、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元或它們的混合物、組合物或試劑盒,其用於用作藥物(例如用於獸醫用途)和/或用於疾病的治療和/或預防。
在一些實施方案/方面,本發明涉及本發明的變體、多肽、多核苷酸、核酸構建體、表達載體、重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子、轉基因花粉粒、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元或它們的混合物、組合物或試劑盒,其用於以下方法中的一種或多種中:用於治療、改善、預防和/或診斷黴菌毒素中毒、優選OTA黴菌毒素中毒的方法;用於監測黴菌毒素中毒的發展和/或評估黴菌毒素中毒預防和/或治療、優選OTA黴菌毒素中毒預防和/或治療的功效的方法;用於使具有式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素)解毒和/或改變毒性的方法;生產以下中的一種或多種的方法:食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元;藥物、獸醫、診斷、解毒、監測和/或篩選組合物或試劑盒;根據前述項目中任一項所述的方法;如上文的方法的任何組合;如本文所定義的任何方法,其中所述方法是體外、離體、體內和/或製造方法。
在一些實施方案/方面,本發明涉及本發明的變體、多肽、多核苷酸、核酸構建體、表達載體、重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子、轉基因花粉粒、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元或它們的混合物、組合物或試劑盒中的一種或多種用於以下中的一項或多項或在以下中的一項或多項中的用途:黴菌毒素中毒、優選OTA黴菌毒素中毒的治療、改善、預防和/或診斷;監測黴菌毒素中毒的發展和/或評估黴菌毒素中毒預防和/或治療、優選OTA黴菌毒素中毒預防和/或治療的功效;使具有式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素)解毒和/或改變毒性;生產以下中的一種或多種:食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元;藥物、獸醫、診斷、解毒、監測和/或篩選組合物或試劑盒;根據本發明的方法;上文的任何組合;如本文所定義的用途,其中所述用途是體外、離體、體內和/或製造用途。
在一些實施方案/方面,本發明涉及根據本發明的變體、多核苷酸、核酸構建體、表達載體、重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子、轉基因花粉粒、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元或它們的混合物、組合物或試劑盒用於製備用於治療或預防黴菌毒素中毒的藥物的用途。
在一些實施方案/方面,本發明涉及SEQ ID NO: 318的酶的特定變體,所述特定變體具有以下突變組合中的任一種:I308V/V355L;F318Y/V355L;S97V/A171P/I184V/S284T/I308V/V355L;S143E/T144A/A171P/I308V/G354A/V355L;H30E/H50N/S97V/G98V/N103D/W104Y/Q119H/T130E/G142A/T144R/Y170F/A171P/I184V/H187N/K188R/M223C/S230T/E239Q/S284T/I308V/V311I/L333I/H339E/A353S/V355L/G356P;I308V/F318Y/V355L;I184V/I308V/V355L;I184V/I308V/F318Y/V355L;H30E/A36C/H50N/L85C/S97V/G98V/S100D/N103Q/W104Y/Y105R/G106P/D107R/F108A/F109Y/D110K/N111D/M112W/M113Q/Q119H/Y122R/Y126W/T130E/G142A/S143E/T144R/Y170F/A171P/G176S/A179C/Q181M/P183S/I184V/H187N/K188R/A192V/V198T/M223C/G226S/V228A/L229I/S230T/L231F/D233N/V235A/E239Q/Q242P/H253E/K258Y/H264Q/D278R/S284T/E287Q/Y300C/A307G/I308V/A309C/H310E/V311A/E313A/K314Q/T317C/F318Y/I322M/A329G/A330M/H332S/L333M/H339E/A353S/G354A/V355L/G356P/A357P/H358N/N361Q/L389C/G391R;H30E/V32I/A36C/A37G/H50N/D76D/A83S/L85C/S97V/G98V/S100D/N103Q/W104Y/Y105R/G106P/D107R/F108A/F109Y/D110K/N111D/M112W/M113Q/A117G/Q119H/Y122R/Y126W/T130E/V141L/G142A/S143E/T144R/V147I/Y170F/A171P/G176S/A179C/Q181M/P183S/I184V/H187N/K188R/A192V/V198T/E203D/M223C/G226S/V228A/L229I/S230T/L231F/D233N/V235A/E239Q/Q242P/D243E/I249V/H253E/K258Y/H264Q/D278R/S284T/E287Q/Y300C/A307G/I308V/A309C/H310E/V311A/E313A/K314Q/T317C/F318Y/I322M/A329G/A330M/H332S/L333M/H339E/A353S/G354A/V355L/G356P/A357P/H358N/S360T/N361Q/L389C/G391R/L425V;H30E/V32I/A36C/A37G/H50N/D76D/A83S/L85C/S97V/G98V/S100D/N103Q/A117G/Q119H/Y122R/Y126W/T130E/V141L/G142A/S143E/T144R/V147I/Y170F/A171P/G176S/A179C/Q181M/P183S/I184V/H187N/K188R/A192V/V198T/E203D/M223C/G226S/V228A/L229I/S230T/L231F/D233N/V235A/E239Q/Q242P/D243E/I249V/H253E/K258Y/H264Q/D278R/S284T/E287Q/Y300C/A307G/I308V/A309C/H310E/V311A/E313A/K314Q/T317C/F318Y/I322M/A329G/A330M/H332S/L333M/H339E/A353S/G354A/V355L/G356P/A357P/H358N/S360T/N361Q/L389C/G391R/L425V;Y170F/A171P/G176S/A179C/Q181M/P183S/I184V/H187N/K188R/A192V/V198T/M223C/G226S/V228A/L229I/S230T/L231F/D233N/V235A/E239Q/Q242P/H253E/K258Y/H264Q/D278R/S284T/E287Q/Y300C/A307G/I308V/A309C/H310E/V311A/E313A/K314Q/T317C/F318Y/I322M/A329G/A330M/H332S/L333M;或Y170F/A171P/G176S/A179C/Q181M/P183S/I184V/H187N/K188R/A192V/V198T/M223C/G226S/V228A/L229I/S230T/L231F/D233N/V235A/E239Q/Q242P,例如使用SEQ ID NO: 318的編號。
在一些實施方案/方面,本發明涉及SEQ ID NO: 318的酶的變體,所述變體具有突變組合I308V/V355L(使用SEQ ID NO: 318的編號),例如發現其在pH 7.5和pH 6分別顯示SEQ ID NO: 318的未突變酶的活性的189%和209%。
在一些實施方案/方面,本發明涉及SEQ ID NO: 318的酶的變體,所述變體具有突變組合F318Y/V355L,例如發現其在pH 7.5和pH 6分別顯示SEQ ID NO: 318的未突變酶的活性的138%和197%。
在一些實施方案/方面,本發明涉及SEQ ID NO: 318的酶的變體,所述變體具有H30E/V32I/A36C/A37G/H50N/D76D/A83S/L85C/S97V/G98V/S100D/N103Q/W104Y/Y105R/G106P/D107R/F108A/F109Y/D110K/N111D/M112W/M113Q/A117G/Q119H/Y122R/Y126W/T130E/V141L/G142A/S143E/T144R/V147I/Y170F/A171P/G176S/A179C/Q181M/P183S/I184V/H187N/K188R/A192V/V198T/E203D/M223C/G226S/V228A/L229I/S230T/L231F/D233N/V235A/E239Q/Q242P/D243E/I249V/H253E/K258Y/H264Q/D278R/S284T/E287Q/Y300C/A307G/I308V/A309C/H310E/V311A/E313A/K314Q/T317C/F318Y/I322M/A329G/A330M/H332S/L333M/H339E/A353S/G354A/V355L/G356P/A357P/H358N/S360T/N361Q/L389C/G391R/L425V;H30E/V32I/A36C/A37G/H50N/D76D/A83S/L85C/S97V/G98V/S100D/N103Q/A117G/Q119H/Y122R/Y126W/T130E/V141L/G142A/S143E/T144R/V147I/Y170F/A171P/G176S/A179C/Q181M/P183S/I184V/H187N/K188R/A192V/V198T/E203D/M223C/G226S/V228A/L229I/S230T/L231F/D233N/V235A/E239Q/Q242P/D243E/I249V/H253E/K258Y/H264Q/D278R/S284T/E287Q/Y300C/A307G/I308V/A309C/H310E/V311A/E313A/K314Q/T317C/F318Y/I322M/A329G/A330M/H332S/L333M/H339E/A353S/G354A/V355L/G356P/A357P/H358N/S360T/N361Q/L389C/G391R/L425V;Y170F/A171P/G176S/A179C/Q181M/P183S/I184V/H187N/K188R/A192V/V198T/M223C/G226S/V228A/L229I/S230T/L231F/D233N/V235A/E239Q/Q242P/H253E/K258Y/H264Q/D278R/S284T/E287Q/Y300C/A307G/I308V/A309C/H310E/V311A/E313A/K314Q/T317C/F318Y/I322M/A329G/A330M/H332S/L333M;或Y170F/A171P/G176S/A179C/Q181M/P183S/I184V/H187N/K188R/A192V/V198T/M223C/G226S/V228A/L229I/S230T/L231F/D233N/V235A/E239Q/Q242P(例如使用SEQ ID NO: 318的編號)的突變組合中的任一種,其例如在使用如國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)提供的使用默認設置的Needleman-Wunsch算法(“Needleman-Wunsch Global Align Protein Sequences”)的全局序列比對(即不省略N和/或C端氨基酸)中與SEQ ID NO: 1的氨基酸序列分別為75%、80%、85%或90%相同。
在一些實施方案/方面,本發明涉及SEQ ID NO: 2的酶的變體,所述變體具有以下產生的突變組合中的任一種:I065A/E106G/I272V/Y275V/F318V;I065A/E106G/Y275V/F318V;I065A/Y275V/F318V;R7K/I18L/D26N/I33V/T34S/A40V/K41R/V44I/N45D/L60I/L62I/T63S/I65A/R66K/D77E/L84I/S87S/E106G/I110L/A115G/I116L/N117Q/E118D/I120L/I126V/P132A/A140G/L142I/L146I/G157S/D164E/V173I/A178S/V183I/E192Q/E197D/T202S/E204D/R231K/R239K/I268A/Q269I/I272V/Y275V/V296L/I300L/K301R/R304K/V308I/L311I/A312T/F318V/D323E/S343T/A355S/S356A/L359I/L361I/T363S/I365L/A372G/I374L/V375I/L376I/N378D/N384D/I385V/D387E/I388V/A389S/R390K/V391I/I395L/V400L/N405D/L408I;或V44I/N45D/L60I/L62I/T63S/I65A/R66K/D77E/L84I/S87S/E106G/I110L/A115G/I116L/N117Q/E118D/I120L/I126V/P132A/A140G/L142I/L146I/G157S/D164E/V173I/A178S/V183I/E192Q/E197D/T202S/E204D/R231K/R239K/I268A/Q269I/I272V/Y275V/V296L/I300L/K301R/R304K/V308I/L311I/A312T/F318V/D323E/S343T/A355S/S356A/L359I/L361I/T363S/I365L/A372G/I374L/V375I/L376I/N378D/N384D/I385V/D387E(例如使用SEQ ID NO: 2的編號),其與SEQ ID NO: 2的酶分别为98.8%、99.0%、99.3%、81.4%或85.0%相同。
在一些實施方案/方面,本發明涉及SEQ ID NO: 22的酶的變體,所述變體具有由本發明人產稱的以下突變組合中的任一種:V5I/D38E/N40D/L66I/I74L/A83T/K131R/S153T/D176E/R195K/S202T/A208V/S245T/S261T/T267S/K274R/E305D/L335V/L360I/D379N;或Q2A/Y3F/V5I/I7L/V12I/T14N/S27N/S32T/D38E/N40D/L51F/L66I/G69A/I74L/K78R/A83T/L84I/E91D/E106D/K113A/R114K/N117K/K125R/I126V/A129G/K131R/F142L/S143T/S153T/G162A/D176E/S178T/D179E/I183L/R195K/D197E/S202T/F203Y/R207K/A208V/I209L/A216V/E235D/A236G/S245T/K248Q/E249D/D250E/L256I/I260L/S261T/L262I/T267S/I271V/K274R/E294D/N295Q/L296I/L300V/R301K/E305D/G313A/T320S/I327L/G328A/L335V/S344T/A357S/L360I/L362I/L366I/I367L/D372E/I375L/V377I/D379N/N385D/V389I/Q398D/L401I/D405E/G406A(例如使用SEQ ID NO: 22的編號),其中例如所述變體與SEQ ID NO: 22的酶分别为95.15%或80.10%相同。
在一些實施方案/方面,本發明涉及如本文所述的新多肽及其變體,所述多肽及其變體表現出如本文所公開的改變的性質,特別是改變的熱穩定性模式(相對於親本和/或其他已知OTA水解酶)和/或增強的水解活性,這對於多肽及其變體的應用是有利的,特別是在如本文所公開的工業和/或製造方法中。
應當理解,本發明不限於本文所述的特定方法、方案和試劑等,因此可以變化。本文所用的術語僅用於描述特定實施方案的目的,而非旨在限製本發明的範圍,本發明的範圍僅由權利要求書限定。
本說明書全文中引用的所有出版物和專利(包括所有專利、專利申請、科學出版物、製造商的說明書、指導書等),無論在上文還是下文,均以其全文通過引用併入本文。本文中沒有任何內容被解釋為承認本發明無權憑藉在先發明而早於這種公開。在通過引用併入的材料與本說明書矛盾或不一致的程度上,本說明書將取代任何這樣的材料。
本發明的特徵還在於以下項目:
1. 一種多肽,其能夠使至少一種具有式I的黴菌毒素、優選赭麴黴毒素(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒:
,其中R1選自H和OH,R2選自H和CH2-CH3,R3選自H和Cl;優選地,其中所述多肽具有肽酶活性EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;其中所述多肽是以下中的一種或多種:
a) 與選自以下的氨基酸序列具有至少58%序列同一性(例如至少59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)的多肽:SEQ ID NOs: 1、2、16-21、22、23-34、317-318、326-335、336-337、348-349、368-370;
b) (a)的多肽的變體,其中所述變體在一個或多個位置處包含置換、缺失和/或插入(例如所述變體具有一個或多個保守或等價置換(例如SEQ ID NOs: 35-316、319-325、338-347、350-359);
c) (a)或(b)的多肽的片段,其中所述片段能夠使具有所述式I的黴菌毒素解毒。
2. 一種用於使具有式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解)的方法(例如體外、離體、體內或製造方法):
,其中R1選自H和OH,R2選自H和CH2-CH3,R3選自H和Cl;所述方法包括:(a) 提供:
(i) 一種或多種多肽,所述一種或多種多肽與選自以下的氨基酸序列具有至少70%序列同一性(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%):SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 318、SEQ ID NO: 336、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NOs: 16-359、368-370;其中所述一種或多種多肽能夠使至少一種具有所述式I的黴菌毒素解毒(例如修飾或水解);
優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;進一步優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;最優選地,所述一種或多種多肽包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個:
i’) PGFIDAHVH(SEQ ID NO: 3),優選地,所述SEQ ID NO: 3被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置87-95的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
ii’) PAEQA(SEQ ID NO: 4),優選地,所述SEQ ID NO: 4被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置116-120的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
iii’) GVCNG(SEQ ID NO: 5),優選地,所述SEQ ID NO: 5被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置197-201的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
iv’) CRAAVR(SEQ ID NO: 6),優選地,所述SEQ ID NO: 6被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置205-210的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
v’) IKFMPSGGVLSL(SEQ ID NO: 7),優選地,所述SEQ ID NO: 7被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置220-231的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
vi’) RKVAAH(SEQ ID NO: 8),優選地,所述SEQ ID NO: 8被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置257-262的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
vii’) AGVDSIEHG(SEQ ID NO: 9),優選地,所述SEQ ID NO: 9被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置275-283的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
viii’) VMPGLIDAH(SEQ ID NO: 10),優選地,所述SEQ ID NO: 10被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置51-59的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
ix’) AGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 11),優選地,所述SEQ ID NO: 11被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置96-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
x’) QTFGH(SEQ ID NO: 12),優選地,所述SEQ ID NO: 12被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置135-139的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xi’) ATGGVLS(SEQ ID NO: 13),優選地,所述SEQ ID NO: 13被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置185-191的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xii’) YVAAHAHGD(SEQ ID NO: 14),優選地,所述SEQ ID NO: 14被包含在對應於SEQ ID NO: 2或22的位置219-227的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2或22的編號)處;
xiii’) LTPTL(SEQ ID NO: 15),優選地,所述SEQ ID NO: 15被包含在對應於SEQ ID NO: 2或22的位置262-266的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2或22的編號)處;
xiv’) VMPGLID(SEQ ID NO: 360),優選地,所述SEQ ID NO: 360被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置52-58的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xv’) KGGSL(SEQ ID NO: 361),優選地,所述SEQ ID NO: 361被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置67-71的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xvi’) LLLAGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 362),優選地,所述SEQ ID NO: 362被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置93-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xvii’) QTFGHGE(SEQ ID NO: 363),優選地,所述SEQ ID NO: 363被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置135-141的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xviii’) FATGGVLSQRD(SEQ ID NO: 364),優選地,所述SEQ ID NO: 364被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置184-194的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xix’) IVNEA(SEQ ID NO: 365),優選地,所述SEQ ID NO: 365被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置209-213的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xx’) IGVDEWGL(SEQ ID NO: 366),優選地,所述SEQ ID NO: 366被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置279-286的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xxi’) GFETGL(SEQ ID NO: 367),優選地,所述SEQ ID NO: 367被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置317-322的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處。
ii) 親本多肽的一種或多種變體,其中所述變體在對應於所述親本多肽的位置的一個或多個位置處包含改變(例如置換、缺失和/或插入),其中所述變體與選自以下的親本氨基酸序列具有至少70%(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)但小於100%序列同一性:SEQ ID NOs: 1、2、16-21、22、23-34、317-318、326-335、336-337、348-349、368-370;其中所述變體能夠使至少一種具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解);
優選地,所述變體具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;進一步優選地,所述變體具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;最優選地,所述變體包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個:根據(i)的(i’)-(xxi’);進一步最優選地,所述親本多肽選自以下:SEQ ID NOs: 1、2、16-21、22、23-34、317-318、326-335、336-337、348-349、368-370;
(iii) 編碼和/或能夠表達根據(i)-(ii)的一種或多種多肽和/或一種或多種變體的一種或多種多核苷酸、核酸構建體和/或表達載體;
(iv) 包含(i)、(ii)和/或(iii)的一種或多種重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子和/或轉基因花粉粒;和/或
(v) 包含(i)、(ii)、(iii)和/或(iv)的食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑(例如溶解的或成顆粒的(granulated)或成團粒的(pelleted))、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物;
(b) 將(a)應用於所述具有式I的黴菌毒素。
3. 一種食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑(例如溶解的或成顆粒的或成團粒的)、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物,其包含以下中的一種或多種:
(i) 一種或多種多肽,所述一種或多種多肽與選自以下的氨基酸序列具有至少70%序列同一性(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%):SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 318、SEQ ID NO: 336、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NOs: 16-359、368-370;其中所述一種或多種多肽能夠使至少一種具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解):
,其中R1選自H和OH,R2選自H和CH2-CH3,R3選自H和Cl;
優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;進一步優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;最優選地,所述多肽包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個:
i’) PGFIDAHVH(SEQ ID NO: 3),優選地,所述SEQ ID NO: 3被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置87-95的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
ii’) PAEQA(SEQ ID NO: 4),優選地,所述SEQ ID NO: 4被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置116-120的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
iii’) GVCNG(SEQ ID NO: 5),優選地,所述SEQ ID NO: 5被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置197-201的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
iv’) CRAAVR(SEQ ID NO: 6),優選地,所述SEQ ID NO: 6被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置205-210的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
v’) IKFMPSGGVLSL(SEQ ID NO: 7),優選地,所述SEQ ID NO: 7被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置220-231的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
vi’) RKVAAH(SEQ ID NO: 8),優選地,所述SEQ ID NO: 8被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置257-262的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
vii’) AGVDSIEHG(SEQ ID NO: 9),優選地,所述SEQ ID NO: 9被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置275-283的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
viii’) VMPGLIDAH(SEQ ID NO: 10),優選地,所述SEQ ID NO: 10被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置51-59的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
ix’) AGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 11),優選地,所述SEQ ID NO: 11被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置96-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
x’) QTFGH(SEQ ID NO: 12),優選地,所述SEQ ID NO: 12被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置135-139的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xi’) ATGGVLS(SEQ ID NO: 13),優選地,所述SEQ ID NO: 13被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置185-191的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xii’) YVAAHAHGD(SEQ ID NO: 14),優選地,所述SEQ ID NO: 14被包含在對應於SEQ ID NO: 2或22的位置219-227的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2或22的編號)處;
xiii’) LTPTL(SEQ ID NO: 15),優選地,所述SEQ ID NO: 15被包含在對應於SEQ ID NO: 2或22的位置262-266的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2或22的編號)處;
xiv’) VMPGLID(SEQ ID NO: 360),優選地,所述SEQ ID NO: 360被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置52-58的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xv’) KGGSL(SEQ ID NO: 361),優選地,所述SEQ ID NO: 361被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置67-71的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xvi’) LLLAGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 362),優選地,所述SEQ ID NO: 362被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置93-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xvii’) QTFGHGE(SEQ ID NO: 363),優選地,所述SEQ ID NO: 363被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置135-141的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xviii’) FATGGVLSQRD(SEQ ID NO: 364),優選地,所述SEQ ID NO: 364被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置184-194的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xix’) IVNEA(SEQ ID NO: 365),優選地,所述SEQ ID NO: 365被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置209-213的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xx’) IGVDEWGL(SEQ ID NO: 366),優選地,所述SEQ ID NO: 366被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置279-286的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xxi’) GFETGL(SEQ ID NO: 367),優選地,所述SEQ ID NO: 367被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置317-322的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處。
ii) 親本多肽的一種或多種變體,其中所述變體在對應於所述親本多肽的位置的一個或多個位置處包含改變(例如置換、缺失和/或插入),其中所述變體與選自以下的親本氨基酸序列具有至少70%(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)但小於100%序列同一性:SEQ ID NOs: 1、2、16-21、22、23-34、317-318、326-335、336-337、348-349、368-370;其中所述變體能夠使至少一種具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解);
優選地,所述變體具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;進一步優選地,所述變體具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;最優選地,所述變體包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個:根據(i)的(i’)-(xxi’);
(iii) 編碼和/或能夠表達根據(i)-(ii)的一種或多種多肽和/或一種或多種變體的一種或多種多核苷酸、核酸構建體和/或表達載體;和/或
(iv) 包含(i)、(ii)和/或(iii)的一種或多種重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子和/或轉基因花粉粒。
4. 一種親本多肽的變體,所述變體能夠使至少一種具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解):
,其中R1選自H和OH,R2選自H和CH2-CH3,R3選自H和Cl;其中所述變體在對應於所述親本多肽的位置的一個或多個位置處包含改變(例如置換、缺失和/或插入),其中所述變體與選自以下的親本氨基酸序列具有至少70%(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)但小於100%序列同一性:SEQ ID NOs: 1、2、16-21、22、23-34、317-318、326-335、336-337、348-349、368-370;
優選地,所述變體具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;進一步優選地,所述變體具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;最優選地,所述變體包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個:
i’) PGFIDAHVH(SEQ ID NO: 3),優選地,所述SEQ ID NO: 3被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置87-95的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
ii’) PAEQA(SEQ ID NO: 4),優選地,所述SEQ ID NO: 4被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置116-120的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
iii’) GVCNG(SEQ ID NO: 5),優選地,所述SEQ ID NO: 5被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置197-201的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
iv’) CRAAVR(SEQ ID NO: 6),優選地,所述SEQ ID NO: 6被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置205-210的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
v’) IKFMPSGGVLSL(SEQ ID NO: 7),優選地,所述SEQ ID NO: 7被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置220-231的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
vi’) RKVAAH(SEQ ID NO: 8),優選地,所述SEQ ID NO: 8被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置257-262的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
vii’) AGVDSIEHG(SEQ ID NO: 9),優選地,所述SEQ ID NO: 9被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置275-283的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
viii’) VMPGLIDAH(SEQ ID NO: 10),優選地,所述SEQ ID NO: 10被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置51-59的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
ix’) AGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 11),優選地,所述SEQ ID NO: 11被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置96-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
x’) QTFGH(SEQ ID NO: 12),優選地,所述SEQ ID NO: 12被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置135-139的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xi’) ATGGVLS(SEQ ID NO: 13),優選地,所述SEQ ID NO: 13被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置185-191的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xii’) YVAAHAHGD(SEQ ID NO: 14),優選地,所述SEQ ID NO: 14被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置219-227的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xiii’) LTPTL(SEQ ID NO: 15),優選地,所述SEQ ID NO: 15被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置262-266的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xiv’) VMPGLID(SEQ ID NO: 360),優選地,所述SEQ ID NO: 360被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置52-58的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xv’) KGGSL(SEQ ID NO: 361),優選地,所述SEQ ID NO: 361被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置67-71的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xvi’) LLLAGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 362),優選地,所述SEQ ID NO: 362被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置93-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xvii’) QTFGHGE(SEQ ID NO: 363),優選地,所述SEQ ID NO: 363被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置135-141的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xviii’) FATGGVLSQRD(SEQ ID NO: 364),優選地,所述SEQ ID NO: 364被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置184-194的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xix’) IVNEA(SEQ ID NO: 365),優選地,所述SEQ ID NO: 365被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置209-213的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xx’) IGVDEWGL(SEQ ID NO: 366),優選地,所述SEQ ID NO: 366被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置279-286的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xxi’) GFETGL(SEQ ID NO: 367),優選地,所述SEQ ID NO: 367被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置317-322的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
進一步最優選地,置換的數目是1-30,優選1-20和1-10,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個置換。
5. 根據前述項目中任一項所述的方法、變體、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑(例如溶解的或成顆粒的或成團粒的)、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物,其中所述多肽和/或變體具有以下中的一個或多個:
i) 所述肽酶活性為Xaa-Pro二肽酶EC 3.4.13.9;
ii) 所述多肽和/或變體具有TIM桶結構,所述TIM桶結構包含沿多肽主鏈交替的8個α-螺旋和8個平行β-鏈,其中優選地,所述TIM桶還包含磷酸結合位點(phosphate binding site);
iii) 所述多肽和/或變體在pH7.5具有至少2.9U/g的比活性;
iv) 所述多肽和/或變體在pH6.0具有至少0.9U/g的比活性;
v) 所述多肽和/或變體具有大於80℃(例如大於85℃)的T50值;
vi) 所述多肽選自以下:SEQ ID NOs: 1、2、16-21、22、23-34、317-318、326-335、336-337、348-349、368-370;和/或
vii) 所述變體選自以下:SEQ ID NOs: 35-316、319-325、338-347、350-359。
6. 根據前述項目中任一項所述的方法、變體、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑(例如溶解的或成顆粒的或成團粒的)、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物,其中所述變體在對應於SEQ ID NO: 2的位置65、106、132、268、269、272、275和/或318的一個或多個位置處包含改變(例如置換、缺失和/或插入),優選地,使用SEQ ID NO: 2的編號。
7. 根據項目6所述的方法、變體、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑(例如溶解的或成顆粒的或成團粒的)、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物,其中所述變體包含以下置換或置換組合中的一個或多個:I65G,I65A,E106G,E106S,P132A,I268A,Q269I,I272V,Y275V;F318V;I272V;Y275F;Y275H;和/或F318V,或其等價氨基酸置換。
8. 根據前述項目中任一項所述的方法、變體、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑(例如溶解的或成顆粒的或成團粒的)、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物,其中所述變體在對應於SEQ ID NO: 1或318的位置30、36、50、85、97、98、99、100、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、119、122、126、130、142、143、144、170、171、176、178、179、181、183、184、187、188、192、198、223、226、228、229、230、231、233、235、239、242、253、264、284、287、307、308、310、311、314、315、317、318、322、329、330、332、333、339、353、354、355、356、357、358或361的一個或多個位置處包含改變(例如置換、缺失和/或插入),優選地,使用SEQ ID NO: 1或318的編號,進一步優選地,使用SEQ ID NO: 318的編號。
9. 根據項目8所述的方法、變體、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑(例如溶解的或成顆粒的或成團粒的)、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物,其中所述變體包含以下置換或置換組合中的一個或多個:Y300C+L389C;I308V;A171P;T144A;V355L;I308A;G354A;S143E;M223C;A171G;H187N;I184V;H187Q;E239Q;V311I;K314Q;F109A;Y122R;F318Y;A36C+L85C;A375P;M223C;M223A;H264Q;A307G;H178Q;A307G+V355T;T144A;A171P;A171G;M223C;V228A;L229V;L229M;A307S;A307G;I308V;V311T;V355T;V311A;V355A;H264Q;M223C;M223A;A171L;A171G;H178Q;H178L;A307G+V311A;A307G+V311T;A307G+V355T;A307G+A355A;H178S;V228L;V228I;L229I;H264N;H264L;A307V;A307T;I308A;V311L;V311I;G354A;S97D;S97N;S97P;S97T;S97V;G142A;G142P;T144D;T144E;T144P;T144R;A179P;A179S;A179T;A171P+I184V;A171P+I308A;A171P+I308V;A171P+F318Y;A171P+G354A;I184V+I308A;I184V+I308V;I184V+F318Y;I184V+G354A;I308A+F318Y;I308V+F318Y;I308A+G354A;I308V+G354A;F318Y+G354A;A171P+I184V+I308A;A171P+I184V+I308V;A171P+I184V+F318Y;A171P+I184V+G354A;A171P+I308A+F318Y;A171P+I308V+F318Y;A171P+I308A+G354A;A171P+I308V+G354A;A171P+F318Y+G354A;I184V+I308A+F318Y;I184V+I308V+F318Y;I184V+I308A+G354A;I184V+I308V+G354A;I184V+F318Y+G354A;I308A+F318Y+G354A;I308V+F318Y+G354A;Q181M;Q181L;F318L;F318M;A329G;A329V;V355L;V355I;Y170E;Y170F;Y170R;A330L;A330M;A330V;L333I;L333M;L333V;G354L;G354S;G354T;G354V;G356A;G356F;G356P;G356V;G356Y;F109A;P183G;P183S;F108V;F108L;F109V;F109L;M112I;M112W;I184V;I184F;W104F;W104L;W104P;W104Y;I322L;I322M;I322Q;I322S;H187Q;H187N;H310Q;H310N;K314Q;K314E;H332Q;H332V;E287Q;H358Q;H358Y;Q99D;H30E;H30K;H30P;H30R;H50D;H50N;H50P;S100D;N103D;N103L;N103Q;T130E;H187D;H187E;H187G;H187P;K188D;K188E;K188R;G226A;G226P;G226S;S230D;S230P;S230T;D233N;D233Q;D233S;H253A;H253N;S284D;S284H;S284T;H310D;H310E;H332E;H332R;H332S;H339E;H339K;H339N;H339S;A353S;H358A;H358K;H358N;N361E;N361Q;D110K+K188D;D110K+K188E;H187N+K188R;S284D+A329S;S284D+A329T;H310D+E313A;H310E+E313A;V235P;E239Q;A357P;F108Y;N111D;M113Q;Y122R;Y126W;F109Y;Q242P;I315P;T317Y;F318Y;G98S;G98V;Y105N;Y105R;G106P;D107R;D107Y;M112F;M112K;M113D;M113R;Q119E;Q119H;Q119K;Q119M;G176S;A192L;A192M;A192V;V198T;L231F;V235A;V235D;V235F;V235L;L231E+V321T;L229I+I308A;I308A+A329V;I308A+G356F;I308A+G356P;I308A+G356Y;L229I+I308V;I308V+A329V;I308V+G356F;I308V+G356P;I308V+G356Y;G354A+G356V;G354A+G356Y;H310D+V355L;H310E+V355L;V311A+V355L;G354P+V355L;V355L+G356P;I184V+A192L;I184V+A192M;S143E;N361W;I308A+A330L;I308A+A330M;I308A+A330V;I308A+L333I;I308A+L333M;I308V+A330L;I308V+A330M;I308V+A330V;I308V+L333I;I308V+L333M;I308V+V355L;F318Y+V355L;H253E+D278R;K258Y+G391R;A36C+L85C;S100C+T317C;A179C+M223C;Y300C+L389C;A309C+A330C或其等價氨基酸置換。
10. 根據前述項目中任一項所述的方法、變體、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑(例如溶解的或成顆粒的或成團粒的)、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物,其中所述變體在對應於如表13中所定義的SEQ ID NO: 336或337的位置或對應於如表14中所定義的SEQ ID NO: 348或349的位置的一個或多個位置處包含改變(例如置換、缺失和/或插入)。
11. 根據項目8所述的方法、變體、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑(例如溶解的或成顆粒的或成團粒的)、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物,其中所述變體包含如本文表13-14中任一個中所定義的置換或置換組合中的一個或多個。
12. 一種編碼和/或能夠表達根據前述項目中任一項所述的一種或多種變體和/或多肽的多核苷酸、核酸構建體或表達載體。
13. 包含以下中的一種或多種的重組宿主細胞(例如分離的重組宿主細胞)、孢子、轉基因植物、轉基因種子或轉基因花粉粒:(i) 根據前述項目中任一項所述的一種或多種變體和/或多肽;(ii) 根據前述項目中任一項所述的一種或多種多核苷酸;和/或(iii) 根據前述項目中任一項所述的一種或多種核酸構建體和/或表達載體。
14. 一種包含以下中的一種或多種的組合物或試劑盒:根據前述項目中任一項所述的變體、核酸構建體、表達載體、重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子和/或轉基因花粉粒、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑(例如溶解的或成顆粒的或成團粒的)、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑、益生元、中間益生元和/或它們的混合物和/或一種或多種多肽,所述一種或多種多肽與選自以下的氨基酸序列具有至少70%序列同一性(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%):SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2 、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 318、SEQ ID NO: 336、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NOs: 17-21、23-34、316-359、368-370;其中所述多肽能夠使至少一種具有所述式I的黴菌毒素解毒(例如修飾或水解):
,其中R1選自H和OH,R2選自H和CH2-CH3,R3選自H和Cl;
優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;進一步優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;最優選地,所述多肽包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個:
i’) PGFIDAHVH(SEQ ID NO: 3),優選地,所述SEQ ID NO: 3被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置87-95的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
ii’) PAEQA(SEQ ID NO: 4),優選地,所述SEQ ID NO: 4被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置116-120的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
iii’) GVCNG(SEQ ID NO: 5),優選地,所述SEQ ID NO: 5被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置197-201的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
iv’) CRAAVR(SEQ ID NO: 6),優選地,所述SEQ ID NO: 6被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置205-210的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
v’) IKFMPSGGVLSL(SEQ ID NO: 7),優選地,所述SEQ ID NO: 7被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置220-231的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
vi’) RKVAAH(SEQ ID NO: 8),優選地,所述SEQ ID NO: 8被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置257-262的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
vii’) AGVDSIEHG(SEQ ID NO: 9),優選地,所述SEQ ID NO: 9被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置275-283的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
viii’) VMPGLIDAH(SEQ ID NO: 10),優選地,所述SEQ ID NO: 10被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置51-59的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
ix’) AGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 11),優選地,所述SEQ ID NO: 11被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置96-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
x’) QTFGH(SEQ ID NO: 12),優選地,所述SEQ ID NO: 12被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置135-139的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xi’) ATGGVLS(SEQ ID NO: 13),優選地,所述SEQ ID NO: 13被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置185-191的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xii’) YVAAHAHGD(SEQ ID NO: 14),優選地,所述SEQ ID NO: 14被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置219-227的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xiii’) LTPTL(SEQ ID NO: 15),優選地,所述SEQ ID NO: 15被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置262-266的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xiv’) VMPGLID(SEQ ID NO: 360),優選地,所述SEQ ID NO: 360被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置52-58的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xv’) KGGSL(SEQ ID NO: 361),優選地,所述SEQ ID NO: 361被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置67-71的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xvi’) LLLAGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 362),優選地,所述SEQ ID NO: 362被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置93-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xvii’) QTFGHGE(SEQ ID NO: 363),優選地,所述SEQ ID NO: 363被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置135-141的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xviii’) FATGGVLSQRD(SEQ ID NO: 364),優選地,所述SEQ ID NO: 364被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置184-194的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xix’) IVNEA(SEQ ID NO: 365),優選地,所述SEQ ID NO: 365被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置209-213的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xx’) IGVDEWGL(SEQ ID NO: 366),優選地,所述SEQ ID NO: 366被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置279-286的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xxi’) GFETGL(SEQ ID NO: 367),優選地,所述SEQ ID NO: 367被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置317-322的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處。
15. 根據前述項目中任一項所述的組合物或試劑盒,其進一步包含以下中的一種或多種(例如如本文表2中所示):(i) 一種或多種其它多肽,所述一種或多種其它多肽能夠使式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素)(例如OTA、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾和/或水解)和/或結合式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素)(例如OTA、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C),優選地,所述一種或多種其它多肽屬於M20肽酶氨基酰化酶1-樣蛋白2-樣酰胺水解酶亞家族(例如M20肽酶ACY1L2酰胺水解酶亞家族,例如具有根據保守結構域數據庫(Conserved Domain Database)的標識符cd05672(例如https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cddsrv.cgi?uid=cd05672),和/或具有氨基肽酶活性(例如EC 3.4.11.10),和/或包含羧基肽酶活性(例如羧基肽酶A和/或B活性,例如分別具有EC 3.4.17.1和/或EC 3.4.17.2)和/或嗜熱菌蛋白酶活性(例如具有EC 3.4.24.27);(ii) 一種或多種其它多肽,所述一種或多種其它多肽能夠使一種或多種黴菌毒素(例如ZEN)和/或一種或多種植物和/或細菌衍生的毒素(例如單端孢黴烯黴菌毒素,諸如例如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、雪腐鐮刀菌烯醇、新茄鐮孢菌醇、trichotecin、扁蟲菌素(crotocin)、桿孢菌素(roridin) A、葡萄穗黴毒素H、二乙酰藨草鐮刀烯醇、HT-2毒素或T-2毒素;黃麴黴毒素,諸如例如黃麴黴毒素B1、B2、G1或G2;煙麴黴毒素,諸如例如煙麴黴毒素B1、B2、B3或B4;多肽黴菌毒素,諸如例如白殭菌毒素或恩鐮孢菌素;玉米赤黴烯酮;桔黴素;棒麴黴素;麥角生物鹼,諸如例如麥角胺)和/或一種或多種植物和/或細菌衍生的毒素(例如內毒素等)解毒,特別是所述一種或多種其它多肽能夠使一種或多種其它黴菌毒素和/或一種或多種植物和/或細菌衍生的毒素解毒,例如伏馬菌素酯酶(例如如WO 2016/134387 A1中公開)和/或玉米赤黴烯酮內酯酶(例如如WO 2020/025580 A1中公開)和/或ergopeptine水解酶(例如如WO 2014/056006 A1中公開);(iii) 一種或多種有機吸收劑(例如活的/失活的/凍乾的/休眠的/死的全酵母或酵母衍生的產物,諸如例如酵母細胞壁,或酵母寡糖,諸如例如甘露聚醣)和/或無機吸收劑(例如矽藻土和/或粘土礦物,諸如例如高嶺土或高嶺石,綠土,諸如例如蒙脫石、伊利石或綠泥石;特別是膨潤土);(iv) 一種或多種活的、滅活的、凍乾的和/或休眠的微生物,所述一種或多種活的、滅活的、凍乾的和/或休眠的微生物能夠使一種或多種其它黴菌毒素(例如單端孢黴烯黴菌毒素,諸如例如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、雪腐鐮刀菌烯醇、新茄鐮孢菌醇、trichotecin、扁蟲菌素(crotocin)、桿孢菌素(roridin) A、葡萄穗黴毒素H、二乙酰藨草鐮刀烯醇、HT-2毒素或T-2毒素;黃麴黴毒素,諸如例如黃麴黴毒素B1、B2、G1或G2;煙麴黴毒素,諸如例如煙麴黴毒素B1、B2、B3或B4;多肽黴菌毒素,諸如例如白殭菌毒素或恩鐮孢菌素;玉米赤黴烯酮;桔黴素;棒麴黴素;麥角生物鹼,諸如例如麥角胺)和/或一種或多種植物或細菌衍生的毒素(例如內毒素等)解毒,特別地所述微生物是以下的成員:毛孢子菌(Trichosporon)和Apriotrichum屬(例如如WO 03/053161 A1中公開)或紅蝽菌(Coriobacteriaceae)科(例如如EP 3 501 526 A1中公開);(v) 一種或多種植物產品(例如海草,優選海草粉;和/或藻類,優選藻粉;和/或薊,優選薊種子;和/或甘草屬(glycyrrhiza)植物製劑,優選甘草粉和/或甘草提取物,例如如WO 2018/121881 A1中公開);(vi) 一種或多種調味化合物(例如植物提取物,例如來自牛至、百里香、冬青、香菜、墨角蘭、薄荷、胡椒薄荷、茴芹、橙、檸檬、茴香、八角、丁香、肉桂和/或大蒜;和/或精油,諸如例如D-檸檬烯、γ-萜品烯、對-繖花烴、2-蒈烯、芳樟醇氧化物、異薄荷酮、樟腦、芳樟醇、萜品烯-4-醇、2-異丙基-1-甲氧基-4-甲基苯、L-薄荷醇、乙胺、α-萜品醇、β-石竹烯、D-香芹酮、水楊酸甲酯、α-石竹烯、乙酸薰衣草酯、氧化石竹烯、丁子香酚、百里酚和/或香芹酚);(vii) 一種或多種維生素(例如維生素A、D、E、K、C、B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9、B12;特別是維生素E)。
16. 一種用於生產食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物的方法,所述方法包括:a) 提供:
(i) 一種或多種多肽,所述一種或多種多肽與選自以下的氨基酸序列具有至少70%序列同一性(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%):SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 318、SEQ ID NO: 336、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NOs: 17-21、23-34、16-359、368-370;其中所述多肽能夠使至少一種具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解):
,其中R1選自H和OH,R2選自H和CH2-CH3,R3選自H和Cl;
優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;進一步優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;最優選地,所述多肽包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個:
i’) PGFIDAHVH(SEQ ID NO: 3),優選地,所述SEQ ID NO: 3被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置87-95的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
ii’) PAEQA(SEQ ID NO: 4),優選地,所述SEQ ID NO: 4被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置116-120的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
iii’) GVCNG(SEQ ID NO: 5),優選地,所述SEQ ID NO: 5被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置197-201的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
iv’) CRAAVR(SEQ ID NO: 6),優選地,所述SEQ ID NO: 6被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置205-210的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
v’) IKFMPSGGVLSL(SEQ ID NO: 7),優選地,所述SEQ ID NO: 7被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置220-231的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
vi’) RKVAAH(SEQ ID NO: 8),優選地,所述SEQ ID NO: 8被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置257-262的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
vii’) AGVDSIEHG(SEQ ID NO: 9),優選地,所述SEQ ID NO: 9被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置275-283的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
viii’) VMPGLIDAH(SEQ ID NO: 10),優選地,所述SEQ ID NO: 10被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置51-59的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
ix’) AGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 11),優選地,所述SEQ ID NO: 11被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置96-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
x’) QTFGH(SEQ ID NO: 12),優選地,所述SEQ ID NO: 12被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置135-139的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xi’) ATGGVLS(SEQ ID NO: 13),優選地,所述SEQ ID NO: 13被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置185-191的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xii’) YVAAHAHGD(SEQ ID NO: 14),優選地,所述SEQ ID NO: 14被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置219-227的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xiii’) LTPTL(SEQ ID NO: 15),優選地,所述SEQ ID NO: 15被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置262-266的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xiv’) VMPGLID(SEQ ID NO: 360),優選地,所述SEQ ID NO: 360被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置52-58的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xv’) KGGSL(SEQ ID NO: 361),優選地,所述SEQ ID NO: 361被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置67-71的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xvi’) LLLAGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 362),優選地,所述SEQ ID NO: 362被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置93-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xvii’) QTFGHGE(SEQ ID NO: 363),優選地,所述SEQ ID NO: 363被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置135-141的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xviii’) FATGGVLSQRD(SEQ ID NO: 364),優選地,所述SEQ ID NO: 364被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置184-194的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xix’) IVNEA(SEQ ID NO: 365),優選地,所述SEQ ID NO: 365被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置209-213的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xx’) IGVDEWGL(SEQ ID NO: 366),優選地,所述SEQ ID NO: 366被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置279-286的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xxi’) GFETGL(SEQ ID NO: 367),優選地,所述SEQ ID NO: 367被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置317-322的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處,
(ii) 根據前述項目中任一項所述的變體;
(iii) 根據前述項目中任一項所述的一種或多種多核苷酸;
(iv) 根據前述項目中任一項所述的一種或多種核酸構建體和/或表達載體;和/或
(v) 根據前述項目中任一項所述的一種或多種重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子和/或轉基因花粉粒;優選地,所述一種或多種多肽是一種或多種重組和/或分離多肽;
(b) 將(a)應用於適用於生產食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑(例如溶解的或成顆粒的或成團粒的)、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物的營養源或材料。
17. 根據項目16所述的方法,其中將(a)應用於(b)至在適用於生產食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑(例如溶解的或成顆粒的或成團粒的)、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物的營養源或材料中至少5mU/kg(例如至少10mU/kg、至少50mU/kg、至少0.1U/kg、至少0.2U/kg、至少0.29U/kg、至少0.5U/kg、至少1U/kg、至少2U/kg、至少2.5U/kg、至少2.62U/kg)的酶活性濃度。
18. 一種通過根據前述項目中任一項所述的方法生產的食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑(例如溶解的或成顆粒的或成團粒的)、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物。
19. 根據前述項目中任一項所述的變體、多核苷酸、核酸構建體、表達載體、重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子、轉基因花粉粒、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑(例如溶解的或成顆粒的或成團粒的)、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元或它們的混合物、組合物或試劑盒和/或一種或多種多肽,所述一種或多種多肽與選自以下的氨基酸序列具有至少70%序列同一性(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%):SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 318、SEQ ID NO: 336、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NOs: 17-21、23-34、16-359、368-370;其中所述多肽能夠使至少一種具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解):
,其中R1選自H和OH,R2選自H和CH2-CH3,R3選自H和Cl;
優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;進一步優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;最優選地,所述多肽包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個:
i’) PGFIDAHVH(SEQ ID NO: 3),優選地,所述SEQ ID NO: 3被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置87-95的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
ii’) PAEQA(SEQ ID NO: 4),優選地,所述SEQ ID NO: 4被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置116-120的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
iii’) GVCNG(SEQ ID NO: 5),優選地,所述SEQ ID NO: 5被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置197-201的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
iv’) CRAAVR(SEQ ID NO: 6),優選地,所述SEQ ID NO: 6被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置205-210的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
v’) IKFMPSGGVLSL(SEQ ID NO: 7),優選地,所述SEQ ID NO: 7被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置220-231的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
vi’) RKVAAH(SEQ ID NO: 8),優選地,所述SEQ ID NO: 8被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置257-262的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
vii’) AGVDSIEHG(SEQ ID NO: 9),優選地,所述SEQ ID NO: 9被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置275-283的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
viii’) VMPGLIDAH(SEQ ID NO: 10),優選地,所述SEQ ID NO: 10被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置51-59的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
ix’) AGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 11),優選地,所述SEQ ID NO: 11被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置96-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
x’) QTFGH(SEQ ID NO: 12),優選地,所述SEQ ID NO: 12被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置135-139的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xi’) ATGGVLS(SEQ ID NO: 13),優選地,所述SEQ ID NO: 13被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置185-191的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xii’) YVAAHAHGD(SEQ ID NO: 14),優選地,所述SEQ ID NO: 14被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置219-227的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xiii’) LTPTL(SEQ ID NO: 15),優選地,所述SEQ ID NO: 15被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置262-266的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xiv’) VMPGLID(SEQ ID NO: 360),優選地,所述SEQ ID NO: 360被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置52-58的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xv’) KGGSL(SEQ ID NO: 361),優選地,所述SEQ ID NO: 361被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置67-71的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xvi’) LLLAGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 362),優選地,所述SEQ ID NO: 362被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置93-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xvii’) QTFGHGE(SEQ ID NO: 363),優選地,所述SEQ ID NO: 363被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置135-141的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xviii’) FATGGVLSQRD(SEQ ID NO: 364),優選地,所述SEQ ID NO: 364被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置184-194的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xix’) IVNEA(SEQ ID NO: 365),優選地,所述SEQ ID NO: 365被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置209-213的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xx’) IGVDEWGL(SEQ ID NO: 366),優選地,所述SEQ ID NO: 366被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置279-286的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xxi’) GFETGL(SEQ ID NO: 367),優選地,所述SEQ ID NO: 367被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置317-322的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處,
其用於用作藥物(例如用於獸醫用途)和/或用於疾病的治療和/或預防。
20. 根據前述項目中任一項所述的變體、多核苷酸、核酸構建體、表達載體、重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子、轉基因花粉粒、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑(例如溶解的或成顆粒的或成團粒的)、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元或它們的混合物、組合物或試劑盒和/或一種或多種多肽,所述一種或多種多肽與選自以下的氨基酸序列具有至少70%序列同一性(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%):SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 318、SEQ ID NO: 336、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NOs: 17-21、23-34、16-359、368-370;其中所述多肽能夠使至少一種具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解):
,其中R1選自H和OH,R2選自H和CH2-CH3,R3選自H和Cl;
優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;進一步優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;最優選地,所述多肽包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個:
i’) PGFIDAHVH(SEQ ID NO: 3),優選地,所述SEQ ID NO: 3被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置87-95的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
ii’) PAEQA(SEQ ID NO: 4),優選地,所述SEQ ID NO: 4被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置116-120的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
iii’) GVCNG(SEQ ID NO: 5),優選地,所述SEQ ID NO: 5被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置197-201的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
iv’) CRAAVR(SEQ ID NO: 6),優選地,所述SEQ ID NO: 6被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置205-210的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
v’) IKFMPSGGVLSL(SEQ ID NO: 7),優選地,所述SEQ ID NO: 7被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置220-231的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
vi’) RKVAAH(SEQ ID NO: 8),優選地,所述SEQ ID NO: 8被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置257-262的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
vii’) AGVDSIEHG(SEQ ID NO: 9),優選地,所述SEQ ID NO: 9被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置275-283的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
viii’) VMPGLIDAH(SEQ ID NO: 10),優選地,所述SEQ ID NO: 10被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置51-59的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
ix’) AGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 11),優選地,所述SEQ ID NO: 11被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置96-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
x’) QTFGH(SEQ ID NO: 12),優選地,所述SEQ ID NO: 12被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置135-139的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xi’) ATGGVLS(SEQ ID NO: 13),優選地,所述SEQ ID NO: 13被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置185-191的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xii’) YVAAHAHGD(SEQ ID NO: 14),優選地,所述SEQ ID NO: 14被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置219-227的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xiii’) LTPTL(SEQ ID NO: 15),優選地,所述SEQ ID NO: 15被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置262-266的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xiv’) VMPGLID(SEQ ID NO: 360),優選地,所述SEQ ID NO: 360被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置52-58的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xv’) KGGSL(SEQ ID NO: 361),優選地,所述SEQ ID NO: 361被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置67-71的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xvi’) LLLAGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 362),優選地,所述SEQ ID NO: 362被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置93-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xvii’) QTFGHGE(SEQ ID NO: 363),優選地,所述SEQ ID NO: 363被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置135-141的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xviii’) FATGGVLSQRD(SEQ ID NO: 364),優選地,所述SEQ ID NO: 364被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置184-194的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xix’) IVNEA(SEQ ID NO: 365),優選地,所述SEQ ID NO: 365被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置209-213的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xx’) IGVDEWGL(SEQ ID NO: 366),優選地,所述SEQ ID NO: 366被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置279-286的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xxi’) GFETGL(SEQ ID NO: 367),優選地,所述SEQ ID NO: 367被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置317-322的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處,
其用於以下方法中的一種或多種中:
i) 用於治療、改善、預防和/或診斷黴菌毒素中毒、優選OTA黴菌毒素中毒的方法;
ii) 用於監測黴菌毒素中毒的發展和/或評估黴菌毒素中毒預防和/或治療、優選OTA黴菌毒素中毒預防和/或治療的功效的方法;
iii) 用於使具有式I的黴菌毒素解毒和/或改變毒性的方法;
iv) 生產以下中的一種或多種的方法:食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑(例如溶解的或成顆粒的或成團粒的)、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元;藥物、獸醫、診斷、解毒、監測和/或篩選組合物或試劑盒;
v) 根據前述項目中任一項所述的方法;
vi) 根據(i)-(v)的任何組合;
vii) (i)-(vi)中任一項的方法,其中所述方法是體外、離體、體內和/或製造方法。
21. 根據前述項目中任一項所述的變體、多核苷酸、核酸構建體、表達載體、重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子、轉基因花粉粒、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑(例如溶解的或成顆粒的或成團粒的)、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元或它們的混合物、組合物或試劑盒中的一種或多種和/或一種或多種多肽,所述一種或多種多肽與選自以下的氨基酸序列具有至少70%序列同一性(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%):SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 318、SEQ ID NO: 336、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NOs: 17-21、23-34、16-359、368-370;其中所述多肽能夠使至少一種具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解):
,其中R1選自H和OH,R2選自H和CH2-CH3,R3選自H和Cl;優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;進一步優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;最優選地,所述多肽包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個:
i’) PGFIDAHVH(SEQ ID NO: 3),優選地,所述SEQ ID NO: 3被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置87-95的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
ii’) PAEQA(SEQ ID NO: 4),優選地,所述SEQ ID NO: 4被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置116-120的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
iii’) GVCNG(SEQ ID NO: 5),優選地,所述SEQ ID NO: 5被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置197-201的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
iv’) CRAAVR(SEQ ID NO: 6),優選地,所述SEQ ID NO: 6被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置205-210的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
v’) IKFMPSGGVLSL(SEQ ID NO: 7),優選地,所述SEQ ID NO: 7被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置220-231的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
vi’) RKVAAH(SEQ ID NO: 8),優選地,所述SEQ ID NO: 8被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置257-262的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
vii’) AGVDSIEHG(SEQ ID NO: 9),優選地,所述SEQ ID NO: 9被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置275-283的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處;
viii’) VMPGLIDAH(SEQ ID NO: 10),優選地,所述SEQ ID NO: 10被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置51-59的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
ix’) AGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 11),優選地,所述SEQ ID NO: 11被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置96-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
x’) QTFGH(SEQ ID NO: 12),優選地,所述SEQ ID NO: 12被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置135-139的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xi’) ATGGVLS(SEQ ID NO: 13),優選地,所述SEQ ID NO: 13被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置185-191的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xii’) YVAAHAHGD(SEQ ID NO: 14),優選地,所述SEQ ID NO: 14被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置219-227的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xiii’) LTPTL(SEQ ID NO: 15),優選地,所述SEQ ID NO: 15被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置262-266的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處;
xiv’) VMPGLID(SEQ ID NO: 360),優選地,所述SEQ ID NO: 360被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置52-58的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xv’) KGGSL(SEQ ID NO: 361),優選地,所述SEQ ID NO: 361被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置67-71的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xvi’) LLLAGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 362),優選地,所述SEQ ID NO: 362被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置93-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xvii’) QTFGHGE(SEQ ID NO: 363),優選地,所述SEQ ID NO: 363被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置135-141的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xviii’) FATGGVLSQRD(SEQ ID NO: 364),優選地,所述SEQ ID NO: 364被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置184-194的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xix’) IVNEA(SEQ ID NO: 365),優選地,所述SEQ ID NO: 365被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置209-213的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xx’) IGVDEWGL(SEQ ID NO: 366),優選地,所述SEQ ID NO: 366被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置279-286的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處;
xxi’) GFETGL(SEQ ID NO: 367),優選地,所述SEQ ID NO: 367被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置317-322的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處,
用於以下中的一項或多項或在以下中的一項或多項中的用途:
i) 黴菌毒素中毒、優選OTA黴菌毒素中毒的治療、改善、預防和/或診斷;
ii) 監測黴菌毒素中毒的發展和/或評估黴菌毒素中毒預防和/或治療、優選OTA黴菌毒素中毒預防和/或治療的功效;
iii) 使具有式I的黴菌毒素解毒和/或改變毒性;
iv) 生產以下中的一種或多種:食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑(例如溶解的或成顆粒的或成團粒的)、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元;藥物、獸醫、診斷、解毒、監測和/或篩選組合物或試劑盒;
v) 根據前述項目中任一項所述的方法;
vi) 根據(i)-(v)的任何組合;
vii) (i)-(vi)中任一項的用途,其中所述用途是體外、離體、體內用途和/或製造方法中的用途。
22. 根據前述項目中任一項所述的方法、用途、變體、多肽、多核苷酸、核酸構建體、表達載體、重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子、轉基因花粉粒、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑(例如溶解的或成顆粒的或成團粒的)、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元或它們的混合物、組合物或試劑盒,其中所述SEQ ID NO為SEQ ID NO: 318。
23. 根據前述項目中任一項所述的方法、用途、變體、多肽、多核苷酸、核酸構建體、表達載體、重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子、轉基因花粉粒、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑(例如溶解的或成顆粒的或成團粒的)、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元或它們的混合物、組合物或試劑盒,其中所述SEQ ID NO為SEQ ID NO: 1。
24. 根據前述項目中任一項所述的方法、用途、變體、多肽、多核苷酸、核酸構建體、表達載體、重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子、轉基因花粉粒、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑(例如溶解的或成顆粒的或成團粒的)、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元或它們的混合物、組合物或試劑盒,其中所述SEQ ID NO為SEQ ID NO: 2。
25. 根據前述項目中任一項所述的方法、用途、變體、多肽、多核苷酸、核酸構建體、表達載體、重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子、轉基因花粉粒、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑(例如溶解的或成顆粒的或成團粒的)、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元或它們的混合物、組合物或試劑盒,其中所述SEQ ID NO為SEQ ID NO: 22。
26. 根據前述項目中任一項所述的方法、用途、變體、多肽、多核苷酸、核酸構建體、表達載體、重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子、轉基因花粉粒、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑(例如溶解的或成顆粒的或成團粒的)、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元或它們的混合物、組合物或試劑盒,其中所述SEQ ID NO為SEQ ID NO: 336。
27. 根據前述項目中任一項所述的方法、用途、變體、多肽、多核苷酸、核酸構建體、表達載體、重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子、轉基因花粉粒、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑(例如溶解的或成顆粒的或成團粒的)、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元或它們的混合物、組合物或試劑盒,其中所述SEQ ID NO為SEQ ID NO: 348。
28. 根據前述項目中任一項所述的方法、用途、變體、多肽、多核苷酸、核酸構建體、表達載體、重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子、轉基因花粉粒、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑(例如溶解的或成顆粒的或成團粒的)、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元或它們的混合物、組合物或試劑盒,其中例如與參照酶/多肽(例如如本文表6-18中任一個中所定義的)相比,在根據前述項目中任一項所述的方法、用途、變體、多肽、多核苷酸、核酸構建體、表達載體、重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子、轉基因花粉粒、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑(例如溶解的或成顆粒的或成團粒的)、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元或它們的混合物、組合物或試劑盒的製粒前和/或製粒後,相應的OTA解毒活性和/或熱穩定性和/或OTA降解能力得到改進。
29. 根據前述項目中任一項所述的方法、用途、變體、多肽、多核苷酸、核酸構建體、表達載體、重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子、轉基因花粉粒、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑(例如溶解的或成顆粒的或成團粒的)、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元或它們的混合物、組合物或試劑盒,使用SEQ ID NO: 318的編號。
通過以下實施例進一步闡述了本發明,然而本發明不限於所述實施例或受所述實施例的任何具體實施方案的限制。
本發明的實施例
本領域技術人員將容易地理解,本發明非常適於實現所述目的並獲得所述結果和優點,以及其中固有的那些。此外,對於本領域技術人員來說顯而易見的是,在不背離本發明的範圍和精神的情況下,可以對本文所公開的發明進行各種替換和修改。本文所述的組合物、方法、程序、處理、分子和具體化合物目前代表了示例性的某些實施方案,並且不旨在作為對本發明範圍的限制。本領域技術人員可以想到其中的變化和其它用途,這些變化和用途包含在由權利要求的範圍限定的本發明的精神內。本說明書中對先前公開的文獻的列舉或討論不應必然地被認為是承認該文獻是現有技術的一部分或是公知常識。本發明在此已經被廣泛和一般地描述。落入一般性公開的範圍內的較窄種類和亞屬分組中的每一個也形成本發明的一部分。這包括本發明的一般性描述,附帶條件或負面限制從該屬中除去任何主題,而不管所去除的材料是否在本文中具體敘述。本文所引用的所有文獻,包括專利申請和科學出版物,均以引用方式併入本文用於所有目的。其它實施例在以下權利要求書內。另外,在本發明的特徵或方面以馬庫什組的形式描述的情況下,本領域技術人員將認識到本發明也因此以馬庫什組的任何單獨成員或成員的亞組的形式描述。
實施例1:序列分析
使用如本領域技術人員已知的常見氨基酸序列比對工具,例如使用默認設置的ClustalO工具,或例如使用默認設置的Needleman-Wunsch算法例如如國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)提供的(“Needleman-Wunsch Global Align Proteins Sequences”),進行序列比對。
在下文的表3、4、5、6和7中,分別示出了序列與SEQ ID NO: 1、2、22、336和348的示例性計算的序列同一性。本領域技術人員知道如何確定任何其它氨基酸序列之間的序列同一性。當N端氨基酸未被算法截掉而是在全局比對(例如通過使用Needleman-Wunsch算法)中考慮時,所計算的與SEQ ID NO: 1的同一性較低,例如當SEQ ID NO: 316的N端氨基酸未被截掉時,SEQ ID NO: 316與SEQ ID NO: 1為78%相同。
表3:與SEQ ID NO: 1的序列同一性。
SEQ ID NO: | % | SEQ ID NO: | % | SEQ ID NO: | % | SEQ ID NO: | % |
16 | 83.01 | 106 | 99.76 | 149 | 99.76 | 175 | 99.28 |
17 | 92.55 | 107 | 99.76 | 150 | 99.52 | 176 | 99.28 |
18 | 91.55 | 108 | 99.76 | 151 | 99.52 | 177 | 99.28 |
19 | 94.71 | 109 | 99.76 | 152 | 99.52 | 178 | 99.28 |
20 | 96.39 | 110 | 99.76 | 153 | 99.52 | 179 | 99.28 |
21 | 95.67 | 111 | 99.76 | 154 | 99.52 | 180 | 99.76 |
48 | 99.76 | 126 | 99.52 | 155 | 99.52 | 181 | 99.76 |
49 | 99.76 | 127 | 99.52 | 156 | 99.52 | 182 | 99.76 |
51 | 99,76 | 128 | 99.52 | 157 | 99.52 | 183 | 99.76 |
72 | 99.76 | 129 | 99.52 | 158 | 99.52 | 184 | 99.76 |
83 | 99.76 | 133 | 99.76 | 159 | 99.52 | 186 | 99.76 |
87 | 99.76 | 134 | 99.76 | 160 | 99.52 | 306 | 99.52 |
88 | 99.76 | 135 | 99.52 | 161 | 99.52 | 307 | 99.52 |
89 | 99.76 | 136 | 99.76 | 162 | 99.52 | 308 | 99.52 |
90 | 99.76 | 137 | 99.76 | 163 | 99.52 | 309 | 99.52 |
91 | 99.76 | 138 | 99.76 | 164 | 99.28 | 310 | 99.52 |
92 | 99.76 | 139 | 99.76 | 165 | 99.28 | 311 | 99.52 |
93 | 99.76 | 140 | 99.76 | 166 | 99.28 | 312 | 99.52 |
95 | 99.76 | 141 | 99.76 | 167 | 99.28 | 313 | 99.52 |
96 | 99.76 | 142 | 99.76 | 168 | 99.28 | 314 | 99.52 |
100 | 99.76 | 143 | 99.76 | 169 | 99.28 | 315 | 99.52 |
101 | 99.76 | 144 | 99.76 | 170 | 99.28 | 316 | 81.97 |
102 | 99.76 | 145 | 99.76 | 171 | 99.28 | 368 | 95.91 |
103 | 99.76 | 146 | 99.76 | 172 | 99.28 | 369 | 91.53 |
104 | 99.76 | 147 | 99.76 | 173 | 99.28 | 370 | 83.67 |
105 | 99.76 | 148 | 99.76 | 174 | 99.28 |
表4:與SEQ ID NO: 2的序列同一性。
SEQ ID NO: | % | SEQ ID NO: | % |
22 | 63.39 | 35 | 99.75 |
23 | 62.90 | 36 | 99.75 |
24 | 63.30 | 37 | 99.75 |
25 | 62.90 | 38 | 99.75 |
26 | 62.16 | 39 | 99.75 |
27 | 61.08 | 40 | 99.75 |
28 | 63.05 | 41 | 99.75 |
29 | 63.30 | 42 | 99.75 |
30 | 62.81 | 43 | 99.75 |
31 | 62.56 | 44 | 99.75 |
32 | 63.79 | 45 | 99.75 |
33 | 63.05 | 46 | 99.75 |
34 | 63.55 | 47 | 98.04 |
表5:與SEQ ID NO: 22的序列同一性。
SEQ ID NO: | % | SEQ ID NO: | % |
23 | 99.51 | 29 | 73.22 |
24 | 73.04 | 30 | 72.55 |
25 | 74.45 | 31 | 72.30 |
26 | 76.83 | 32 | 72.79 |
27 | 71.15 | 33 | 72.79 |
28 | 72.44 | 34 | 73.28 |
表6:與SEQ ID NO: 336的序列同一性。
SEQ ID NO: | % | SEQ ID NO: | % |
338 | 98 | 343 | 93 |
339 | 98 | 344 | 93 |
340 | 98 | 345 | 90 |
341 | 95 | 346 | 90 |
342 | 95 | 347 | 90 |
表7:與SEQ ID NO: 348的序列同一性。
SEQ ID NO: | % | SEQ ID NO: | % |
350 | 98 | 355 | 93 |
351 | 98 | 356 | 93 |
352 | 98 | 357 | 90 |
353 | 95 | 358 | 90 |
354 | 95 | 359 | 90 |
為了將酶指定到EC編號,通過使用蛋白質結構建模的標準建模算法,例如SWISS-MODELL(https://swissmodel.expasy.org/interactive;Waterhouse等人,Nucleic Acids Res. 46, W296-W303),使用酶的氨基酸序列進行同源性建模。這種算法提供基於輸入序列的模型化結構,並且將基於輸入序列的模型化結構提供給先前公開的酶結構,例如RCSB蛋白質數據庫(PDB;https://www.rcsb.org/)中的。在本發明的序列的情況下,具有如RCSB PDB記錄中所描述結構(具有PDB ID:2QS8)的酶被鑑定為匹配酶結構。這種酶的活性被描述為Xaa-Pro二肽酶,其可以被發現具有EC編號3.4.13.9,例如在Expasy的ENZYME數據庫(https://enzyme.expasy.org/)中。因此,根據本發明的酶具有EC 3.4.13.9的酶活性。
實施例2:克隆和重組生產
由商業供應商TWIST Bioscience (https://www.twistbioscience.com/)或GenScript (https://www.genscript.com/)合成編碼多肽序列SEQ ID NOs: 1-2、16-359、368-370中任一個的基因,其中密碼子經優化用於在大腸桿菌(Escherichia coli)中表達。最初設計所選擇的基因以進一步編碼C端融合到多肽序列中任一個的六組氨酸標籤,以便於之後純化。隨後的多肽生產和酶表徵也用不帶標籤的酶進行,產生基本上相同的結果。
使用本領域已知的在大腸桿菌中表達的常用工具將基因克隆到表達載體中。特別地,使用具有lac操縱子的T7啟動子系統(Dubendorf和Studier Studier 1991, J. Mol. Biol. 219, 45-59)來調節基因表達。用所述表達載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)菌株。使用卡那黴素抗性標記以允許在含有50μg/mL卡那黴素的瓊脂平板上選擇轉化體。
為了生產重組蛋白,將單個轉化體菌落在terrific肉湯(TB)培養基(含有12g/L胰蛋白腖,24g/L酵母提取物,5g/L甘油,50mg/L卡那黴素)中於37℃下振盪培養過夜,以產生預培養物。培養後,將1mL該預培養物加入到50mL新鮮TB培養基中,並如前繼續培養,直到OD600達到0.5-0.8。隨後,加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至400μM的終濃度以啟動基因表達。根據需要(例如深孔板、搖瓶、生物反應器)應用常見生物技術方法學調整培養規模。通過在26-28℃下振盪進一步培養18-20小時進行基因表達。然後,通過離心收穫細胞。棄去上清液,將細胞沉澱重懸於50mM Tris-HCl緩衝液,pH 7.5,然後在冰上使用超聲處理系統(QSonica)破碎細胞。通過離心(18 min,21,130×g,4℃)澄清粗裂解物。用Bio-Rad 12% mini-PROTEAN TGX無染色預製凝膠,通過SDS-PAGE(Laemmli 1970, Nature 227, 680-685)驗證裂解物的可溶級分中重組目標酶的存在。適用於在其它大腸桿菌菌株、其它細菌生產宿主(例如芽孢桿菌(Bacillus sp.)例如枯草芽孢桿菌(B. subtilis)或澱粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens),棒狀桿菌(Corynebacterium sp.)例如穀氨酸棒桿菌(C. glutamicum)、假單胞菌(Pseudomonas sp.)等)以及其它真核宿主(例如CHO細胞,酵母例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)等,其它真菌宿主例如麴黴屬菌株(Aspergillus spp.)、木黴屬菌株(Trichoderma spp.)等)中實現重組蛋白生產的替代策略描述於現有技術中並且是技術人員熟知的。
為了通過親和層析進一步純化和分離帶六組氨酸標籤的重組酶,使用His GraviTrap TALON柱(GE Healthcare)或His MultiTrap高性能預包裝一次性96孔板(Cytiva)。為此,將澄清的裂解物上樣到柱上,然後用含有10mM咪唑、300mM NaCl的洗滌緩衝液洗滌,以除去非目標多肽。用含有150mM咪唑、300mM NaCl的洗脫緩衝液洗脫結合到柱上的重組目標蛋白。通過用50mM Tris-HCl緩衝液pH 7.5洗滌除去洗脫液中含有的咪唑,並使用VivaSpin 6離心柱(Sartorius)濃縮伴隨的酶。使用軟件GelAnalyzer(例如2010a版)或LabChip XII HT Touch (PerkinElmer)的默認軟件通過SDS-PAGE再次分析純化和濃縮的酶,以驗證製備物的純度並通過與已知濃度的牛血清白蛋白(BSA)標準品比較來估計蛋白質濃度。
在分析所產生的目標多肽時,當表達編碼具有SEQ ID NO: 318的氨基酸序列的多肽的基因時,可以發現兩個種類(species)。第一種(SEQ ID NO: 1)缺少SEQ ID NO: 318的N端氨基酸1-24,第二種(SEQ ID NO: 317)缺少SEQ ID NO: 318的N端氨基酸1-21。類似地,這種經加工種類可以在與SEQ ID NO: 318的多肽密切相關的多肽中發現,例如SEQ ID NOs: 16-21、48-316的多肽。使用共同序列比對,可以確定SEQ ID NO: 318的酶的同源變體的經加工種類。例如,SEQ ID NOs: 326和327的多肽是SEQ ID NO: 17的多肽的經加工種類,SEQ ID NO: 328和329的多肽是SEQ ID NO: 18的多肽的經加工種類,SEQ ID NOs: 330和331的多肽是SEQ ID NO: 19的多肽的經加工種類,SEQ ID NOs: 332和333的多肽是SEQ ID NO: 20的多肽的經加工種類, SEQ ID NOs: 334和335的多肽是SEQ ID NO: 21的多肽的經加工種類。進一步地,SEQ ID NOs: 336和348的多肽分別是SEQ ID NOs: 337和349的多肽的成熟、經加工種類。此外,通過應用分子生物學的常用方法,可以用備選多肽替換N端氨基酸,所述備選多肽也可被表達宿主切割,例如lamB、ompA、phoA、torT、dsbA、pac、pelB的前導肽(分別為SEQ ID NOs:319-325)中的任一種,從而也允許活性酶變體的生產。
實施例3:比活性的測定
為了測定例如如上文實施例2中所描述生產的重組目標多肽的以單位/升(U/L)計的比活性,進行赭麴黴毒素A(OTA)解毒活性測定。一個單位定義為當使用0.495μM的起始OTA濃度時,在1分鐘內降解1μmol或OTA所需的酶量。
以200μL的反應混合物終體積設置OTA解毒活性測定,該反應混合物含有在100mM磷酸鈉緩衝液中的重組酶製備物(優選地稀釋為產生1-10mU/L的體積活性(volumetric activity))和200ng/mL OTA。
在pH 6.0和pH 7.5測定比活性。一旦反應混合物的所有組分都被混合,就通過跟踪在ex/em 390nm/450nm下熒光減少,在熒光分光光度計(BioTek Synergy H1 MFD多模式微板讀數器)上於37℃下跟踪OTA降解。對於在pH 6.0和pH 7.5進行的工作,使用100mM磷酸鈉緩衝液。
為了計算比活性,使用記錄的熒光減少曲線的初始線性部分。除了上文描述的基於熒光的方法,還通過使用如Delafioria等人2020, Toxins 12, 258描述的HPLC-MS方法測定OTA降解,基本上證實了基於熒光的結果。如本文中所描述表達編碼所示SEQ ID NOs中任一個的基因,在表8中示例性地示出所獲得的多肽製備物的比活性。類似地,使用赫麴黴毒素B、C或TA作為底物,可以見到酶活性。
表8:在pH 6.0或pH 7.5以U/g计的OTA解毒比活性。
SEQ ID NO: | pH 6.0 | pH 7.5 | SEQ ID NO: | pH 6.0 | pH 7.5 |
1 | 99.00 | 191.89 | 20 | 49.73 | 100.52 |
2 | 0.61 | 0.73 | 21 | 20.53 | 30.87 |
17 | 11.65 | 28.44 | 22 | 0.66 | 0.79 |
18 | 39.30 | 147.14 | 368 | 3.70 | 15.10 |
19 | 8.72 | 10.91 | 369 | 122.50 | 159.80 |
作為比較,發現具有如NCBI GenBank數據庫記錄CAK41945.1中所列氨基酸序列的來自黑麴黴(Aspergillus niger)的酶在pH 6.0和pH 7.5分別具有0.80U/g和2.78U/g的OTA解毒比活性。
發現編碼具有如下文所示SEQ ID NOs中所示的所選氨基酸置換的多肽的基因的表達產生如表7中示例性示出的SEQ ID NO: 2的酶的其它活性酶變體。所表達的具有SEQ ID NO: 318的氨基酸序列的酶的其它酶變體包含下列突變中的任一種:H30Q,H30N,H30D,S97A,S97L,N103E,N103S,N103H,F109W,N111E,N111Q,N111S,N111T,M112L,M112V,M112F,M112Y,Y122K,Y126F,T130D,T130Q,T130N,T144G,T144S,T144K,I184A,I184L,I184M,I184Y,I184W,K188N,K188Q,L229V,L229M,S230V,S230A,S230N,Q242A,Q242G,K258W,K258F,S284A,S284V,S284N,E287N,E287H,I308G,I308L,H310S,H310T,V311M,K314N,T317W,T317F,F318W,F318I,A330S,A330T,V355M,G391K,或其組合,使用SEQ ID NO: 318的編號。例如,SEQ ID NO: 318的酶的特定變體具有以下突變組合中的任一種:I308V/V355L;F318Y/V355L;S97V/A171P/I184V/S284T/I308V/V355L;S143E/T144A/A171P/I308V/G354A/V355L;H30E/H50N/S97V/G98V/N103D/W104Y/Q119H/T130E/G142A/T144R/Y170F/A171P/I184V/H187N/K188R/M223C/S230T/E239Q/S284T/I308V/V311I/L333I/H339E/A353S/V355L/G356P;I308V/F318Y/V355L;I184V/I308V/V355L;I184V/I308V/F318Y/V355L;H30E/A36C/H50N/L85C/S97V/G98V/S100D/N103Q/W104Y/Y105R/G106P/D107R/F108A/F109Y/D110K/N111D/M112W/M113Q/Q119H/Y122R/Y126W/T130E/G142A/S143E/T144R/Y170F/A171P/G176S/A179C/Q181M/P183S/I184V/H187N/K188R/A192V/V198T/M223C/G226S/V228A/L229I/S230T/L231F/D233N/V235A/E239Q/Q242P/H253E/K258Y/H264Q/D278R/S284T/E287Q/Y300C/A307G/I308V/A309C/H310E/V311A/E313A/K314Q/T317C/F318Y/I322M/A329G/A330M/H332S/L333M/H339E/A353S/G354A/V355L/G356P/A357P/H358N/N361Q/L389C/G391R;H30E/V32I/A36C/A37G/H50N/D76D/A83S/L85C/S97V/G98V/S100D/N103Q/W104Y/Y105R/G106P/D107R/F108A/F109Y/D110K/N111D/M112W/M113Q/A117G/Q119H/Y122R/Y126W/T130E/V141L/G142A/S143E/T144R/V147I/Y170F/A171P/G176S/A179C/Q181M/P183S/I184V/H187N/K188R/A192V/V198T/E203D/M223C/G226S/V228A/L229I/S230T/L231F/D233N/V235A/E239Q/Q242P/D243E/I249V/H253E/K258Y/H264Q/D278R/S284T/E287Q/Y300C/A307G/I308V/A309C/H310E/V311A/E313A/K314Q/T317C/F318Y/I322M/A329G/A330M/H332S/L333M/H339E/A353S/G354A/V355L/G356P/A357P/H358N/S360T/N361Q/L389C/G391R/L425V;H30E/V32I/A36C/A37G/H50N/D76D/A83S/L85C/S97V/G98V/S100D/N103Q/A117G/Q119H/Y122R/Y126W/T130E/V141L/G142A/S143E/T144R/V147I/Y170F/A171P/G176S/A179C/Q181M/P183S/I184V/H187N/K188R/A192V/V198T/E203D/M223C/G226S/V228A/L229I/S230T/L231F/D233N/V235A/E239Q/Q242P/D243E/I249V/H253E/K258Y/H264Q/D278R/S284T/E287Q/Y300C/A307G/I308V/A309C/H310E/V311A/E313A/K314Q/T317C/F318Y/I322M/A329G/A330M/H332S/L333M/H339E/A353S/G354A/V355L/G356P/A357P/H358N/S360T/N361Q/L389C/G391R/L425V;Y170F/A171P/G176S/A179C/Q181M/P183S/I184V/H187N/K188R/A192V/V198T/M223C/G226S/V228A/L229I/S230T/L231F/D233N/V235A/E239Q/Q242P/H253E/K258Y/H264Q/D278R/S284T/E287Q/Y300C/A307G/I308V/A309C/H310E/V311A/E313A/K314Q/T317C/F318Y/I322M/A329G/A330M/H332S/L333M;或Y170F/A171P/G176S/A179C/Q181M/P183S/I184V/H187N/K188R/A192V/V198T/M223C/G226S/V228A/L229I/S230T/L231F/D233N/V235A/E239Q/Q242P,使用SEQ ID NO: 318的編號。發現具有突變組合I308V/V355L(使用SEQ ID NO: 318的編號)的SEQ ID NO: 318的酶的變體在pH 7.5和pH 6分别顯示SEQ ID NO: 318的未突變酶的活性的189%和209%。發現具有突變組合F318Y/V355L的SEQ ID NO: 318的酶的變體在pH 7.5和pH 6分別顯示SEQ ID NO: 318的未突變酶的活性的138%和197%。值得注意的是,具有H30E/V32I/A36C/A37G/H50N/D76D/A83S/L85C/S97V/G98V/S100D/N103Q/W104Y/Y105R/G106P/D107R/F108A/F109Y/D110K/N111D/M112W/M113Q/A117G/Q119H/Y122R/Y126W/T130E/V141L/G142A/S143E/T144R/V147I/Y170F/A171P/G176S/A179C/Q181M/P183S/I184V/H187N/K188R/A192V/V198T/E203D/M223C/G226S/V228A/L229I/S230T/L231F/D233N/V235A/E239Q/Q242P/D243E/I249V/H253E/K258Y/H264Q/D278R/S284T/E287Q/Y300C/A307G/I308V/A309C/H310E/V311A/E313A/K314Q/T317C/F318Y/I322M/A329G/A330M/H332S/L333M/H339E/A353S/G354A/V355L/G356P/A357P/H358N/S360T/N361Q/L389C/G391R/L425V;H30E/V32I/A36C/A37G/H50N/D76D/A83S/L85C/S97V/G98V/S100D/N103Q/A117G/Q119H/Y122R/Y126W/T130E/V141L/G142A/S143E/T144R/V147I/Y170F/A171P/G176S/A179C/Q181M/P183S/I184V/H187N/K188R/A192V/V198T/E203D/M223C/G226S/V228A/L229I/S230T/L231F/D233N/V235A/E239Q/Q242P/D243E/I249V/H253E/K258Y/H264Q/D278R/S284T/E287Q/Y300C/A307G/I308V/A309C/H310E/V311A/E313A/K314Q/T317C/F318Y/I322M/A329G/A330M/H332S/L333M/H339E/A353S/G354A/V355L/G356P/A357P/H358N/S360T/N361Q/L389C/G391R/L425V;Y170F/A171P/G176S/A179C/Q181M/P183S/I184V/H187N/K188R/A192V/V198T/M223C/G226S/V228A/L229I/S230T/L231F/D233N/V235A/E239Q/Q242P/H253E/K258Y/H264Q/D278R/S284T/E287Q/Y300C/A307G/I308V/A309C/H310E/V311A/E313A/K314Q/T317C/F318Y/I322M/A329G/A330M/H332S/L333M;或Y170F/A171P/G176S/A179C/Q181M/P183S/I184V/H187N/K188R/A192V/V198T/M223C/G226S/V228A/L229I/S230T/L231F/D233N/V235A/E239Q/Q242P(使用SEQ ID NO: 318的編號)的突變組合中的任一種的SEQ ID NO: 318的酶的變體在使用如國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)提供的使用默認設置的Needleman-Wunsch算法(“Needleman-Wunsch Global Align Protein Sequences”)的全局序列比對(即不省略N和/或C端氨基酸)中與SEQ ID NO: 1的氨基酸序列分別为75%、80%、85%或90%相同。
包含若干氨基酸置换的SEQ ID NO: 318的酶的其它示例性變體在下文表9中示出。
表9:包含所示置換的SEQ ID NO: 318的酶的變體
SEQ ID NO: | 置換 | SEQ ID NO: | 置換 | SEQ ID NO: | 置換 | SEQ ID NO: | 置換 |
48 | F109A | 116 | Q99D | 184 | A330M | 252 | N361E |
49 | T144A | 117 | F108Y | 185 | A330V | 253 | N361Q |
50 | A171P | 118 | M113Q | 186 | L333I | 254 | D110K/K188D |
51 | A171G | 119 | Y122R | 187 | L333M | 255 | D110K/K188E |
52 | P183G | 120 | Y126W | 188 | L333V | 256 | H187N/K188R |
53 | P183S | 121 | F109Y | 189 | G354L | 257 | S284D/A329S |
54 | V228A | 122 | Q242P | 190 | G354S | 258 | S284D/A329T |
55 | L229V | 123 | I315P | 191 | G354T | 259 | H310D/E313A |
56 | L229M | 124 | T317Y | 192 | G354V | 260 | H310E/E313A |
57 | A307S | 125 | F318Y | 193 | G356A | 261 | G98S |
58 | A307G | 126 | H253E/D278R | 194 | G356F | 262 | G98V |
59 | I308V | 127 | K258Y/G391R | 195 | G356P | 263 | Y105N |
60 | V311T | 128 | A36C/L85C | 196 | G356V | 264 | Y105R |
61 | V355T | 129 | S100C/T317C | 197 | G356Y | 265 | G106P |
62 | V235P | 130 | A179C/M223C | 198 | W104F | 266 | D107R |
63 | E239Q | 131 | Y300C/L389C | 199 | W104L | 267 | D107Y |
64 | S143E | 132 | A309C/A330C | 200 | W104P | 268 | M112F |
65 | N361W | 133 | A307V | 201 | W104Y | 269 | M112K |
66 | V311A | 134 | N111D | 202 | I322L | 270 | M113D |
67 | V355A | 135 | Y300C/L389C | 203 | I322M | 271 | M113R |
68 | A357P | 136 | S97D | 204 | I322Q | 272 | Q119E |
69 | Q181M | 137 | S97N | 205 | I322S | 273 | Q119H |
70 | Q181L | 138 | S97P | 206 | H30E | 274 | Q119K |
71 | H264Q | 139 | S97T | 207 | H30K | 275 | Q119M |
72 | M223C | 140 | S97V | 208 | H30P | 276 | G176S |
73 | M223A | 141 | G142A | 209 | H30R | 277 | A192L |
74 | A171L | 142 | G142P | 210 | H50D | 278 | A192M |
75 | H178Q | 143 | T144D | 211 | H50N | 279 | A192V |
76 | H178L | 144 | T144E | 212 | H50P | 280 | V198T |
77 | A307G/V311A | 145 | T144P | 213 | S100D | 281 | L231F |
78 | A307G/V311T | 146 | T144R | 214 | N103D | 282 | V235A |
79 | A307G/V355T | 147 | A179P | 215 | N103L | 283 | V235D |
80 | A307G/V355A | 148 | A179S | 216 | N103Q | 284 | V235F |
81 | V228L | 149 | A179T | 217 | T130E | 285 | V235L |
82 | V228I | 150 | A171P/I184V | 218 | H187D | 286 | L231E/V321T |
83 | L229I | 151 | A171P/I308A | 219 | H187E | 287 | L229I/I308A |
84 | H264N | 152 | A171P/I308V | 220 | H187G | 288 | I308A/A329V |
85 | H264L | 153 | A171P/F318Y | 221 | H187P | 289 | I308A/G356F |
86 | A307T | 154 | A171P/G354A | 222 | K188D | 290 | I308A/G356P |
87 | I308A | 155 | I184V/I308A | 223 | K188E | 291 | I308A/G356Y |
88 | V311L | 156 | I184V/I308V | 224 | K188R | 292 | L229I/I308V |
89 | V311I | 157 | I184V/F318Y | 225 | G226A | 293 | I308V/A329V |
90 | G354A | 158 | I184V/G354A | 226 | G226P | 294 | I308V/G356F |
91 | F318L | 159 | I308A/F318Y | 227 | G226S | 295 | I308V/G356P |
92 | F318M | 160 | I308V/F318Y | 228 | S230D | 296 | I308V/G356Y |
93 | A329G | 161 | I308A/G354A | 229 | S230P | 297 | G354A/G356V |
94 | A329V | 162 | I308V/G354A | 230 | S230T | 298 | G354A/G356Y |
95 | V355L | 163 | F318Y/G354A | 231 | D233N | 299 | H310D/V355L |
96 | V355I | 164 | A171P/I184V/I308A | 232 | D233Q | 300 | H310E/V355L |
97 | F108V | 165 | A171P/I184V/I308V | 233 | D233S | 301 | V311A/V355L |
98 | F108L | 166 | A171P/I184V/F318Y | 234 | H253A | 302 | G354P/V355L |
99 | F109V | 167 | A171P/I184V/G354A | 235 | H253N | 303 | V355L/G356P |
100 | F109L | 168 | A171P/I308A/F318Y | 236 | S284D | 304 | I184V/A192L |
101 | M112I | 169 | A171P/I308V/F318Y | 237 | S284H | 305 | I184V/A192M |
102 | M112W | 170 | A171P/I308A/G354A | 238 | S284T | 306 | I308A/A330L |
103 | I184V | 171 | A171P/I308V/G354A | 239 | H310D | 307 | I308A/A330M |
104 | I184F | 172 | A171P/F318Y/G354A | 240 | H310E | 308 | I308A/A330V |
105 | H187Q | 173 | I184V/I308A/F318Y | 241 | H332E | 309 | I308A/L333I |
106 | H187N | 174 | I184V/I308V/F318Y | 242 | H332R | 310 | I308A/L333M |
107 | H310Q | 175 | I184V/I308A/G354A | 243 | H332S | 311 | I308V/A330L |
108 | H310N | 176 | I184V/I308V/G354A | 244 | H339E | 312 | I308V/A330M |
109 | K314Q | 177 | I184V/F318Y/G354A | 245 | H339K | 313 | I308V/A330V |
110 | K314E | 178 | I308A/F318Y/G354A | 246 | H339N | 314 | I308V/L333I |
111 | H332Q | 179 | I308V/F318Y/G354A | 247 | H339S | 315 | I308V/L333M |
112 | H332V | 180 | Y170E | 248 | A353S | 316 | H30E/A36C/H50N/L85C/S97V/ G98V/S100D/N103Q/W104Y/ Y105R/G106P/D107R/F108A/ F109Y/D110K/N111D/M112W/ M113Q/Q119H/Y122R/Y126W/ T130E/G142A/S143E/T144R/ Y170F/A171P/G176S/A179C/ Q181M/P183S/I184V/H187N/ K188R/A192V/V198T/M223C/ G226S/V228A/L229I/S230T/ L231F/D233N/V235A/E239Q/ Q242P/H253E/K258Y/H264Q/ D278R/S284T/E287Q/Y300C/ A307G/I308V/A309C/H310E/ V311A/E313A/K314Q/T317C/ F318Y/I322M/A329G/A330M/ H332S/L333M/H339E/A353S/ G354A/V355L/G356P/A357P/ H358N/N361Q/L389C/G391R |
113 | E287Q | 181 | Y170F | 249 | H358A | ||
114 | H358Q | 182 | Y170R | 250 | H358K | ||
115 | H358Y | 183 | A330L | 251 | H358N |
包含若干氨基酸置換的SEQ ID NO: 2的酶的其它示例性變體在下文表10中示出。
表10:包含所示置換的SEQ ID NO: 2的酶的變體
SEQ ID NO: | 置換 | SEQ ID NO: | 置換 |
35 | I065G | 42 | F318V |
36 | I065A | 43 | P132A |
37 | E106G | 44 | I272V |
38 | E106S | 45 | Y275F |
39 | I268A | 46 | Y275H |
40 | Q269I | 47 | I065A/E106G/I268A/Q269I/Y275V/F318V/P132A/I272V |
41 | Y275V |
此外並且特別地,產生了具有以下突變組合中的任一種的SEQ ID NO: 2的酶變體:I065A/E106G/I272V/Y275V/F318V;I065A/E106G/Y275V/F318V;I065A/Y275V/F318V;R7K/I18L/D26N/I33V/T34S/A40V/K41R/V44I/N45D/L60I/L62I/T63S/I65A/R66K/D77E/L84I/S87S/E106G/I110L/A115G/I116L/N117Q/E118D/I120L/I126V/P132A/A140G/L142I/L146I/G157S/D164E/V173I/A178S/V183I/E192Q/E197D/T202S/E204D/R231K/R239K/I268A/Q269I/I272V/Y275V/V296L/I300L/K301R/R304K/V308I/L311I/A312T/F318V/D323E/S343T/A355S/S356A/L359I/L361I/T363S/I365L/A372G/I374L/V375I/L376I/N378D/N384D/I385V/D387E/I388V/A389S/R390K/V391I/I395L/V400L/N405D/L408I;或V44I/N45D/L60I/L62I/T63S/I65A/R66K/D77E/L84I/S87S/E106G/I110L/A115G/I116L/N117Q/E118D/I120L/I126V/P132A/A140G/L142I/L146I/G157S/D164E/V173I/A178S/V183I/E192Q/E197D/T202S/E204D/R231K/R239K/I268A/Q269I/I272V/Y275V/V296L/I300L/K301R/R304K/V308I/L311I/A312T/F318V/D323E/S343T/A355S/S356A/L359I/L361I/T363S/I365L/A372G/I374L/V375I/L376I/N378D/N384D/I385V/D387E(使用SEQ ID NO: 2的編號),其中所述變體與SEQ ID NO: 2的酶分別為98.8%、99.0%、99.3%、81.4%或85.0%相同。
此外,本發明人還產生了具有以下突變組合中的任一種的SEQ ID NO: 22的酶的變體:V5I/D38E/N40D/L66I/I74L/A83T/K131R/S153T/D176E/R195K/S202T/A208V/S245T/S261T/T267S/K274R/E305D/L335V/L360I/D379N;或Q2A/Y3F/V5I/I7L/V12I/T14N/S27N/S32T/D38E/N40D/L51F/L66I/G69A/I74L/K78R/A83T/L84I/E91D/E106D/K113A/R114K/N117K/K125R/I126V/A129G/K131R/F142L/S143T/S153T/G162A/D176E/S178T/D179E/I183L/R195K/D197E/S202T/F203Y/R207K/A208V/I209L/A216V/E235D/A236G/S245T/K248Q/E249D/D250E/L256I/I260L/S261T/L262I/T267S/I271V/K274R/E294D/N295Q/L296I/L300V/R301K/E305D/G313A/T320S/I327L/G328A/L335V/S344T/A357S/L360I/L362I/L366I/I367L/D372E/I375L/V377I/D379N/N385D/V389I/Q398D/L401I/D405E/G406A(使用SEQ ID NO: 22的編號),其中所述變體與SEQ ID NO: 22的酶分別為95.15%或80.10%相同。
表11:與SEQ ID NO: 2的酶相比,以%计的OTA解毒比活性。
SEQ ID NO: | pH 6.0 | pH 7.5 | SEQ ID NO: | pH 6.0 | pH 7.5 |
35 | 56.00 | 136.00 | 42 | 131.00 | 595.00 |
36 | 117.00 | 309.00 | 43 | 46.00 | 19.00 |
37 | 42.00 | 187.00 | 44 | 84.00 | 84.00 |
38 | 11.00 | 53.00 | 45 | 168.00 | 138.00 |
39 | 8.00 | 15.00 | 46 | 82.00 | 66.00 |
40 | 15.00 | 61.00 | 47 | 85.00 | 267.00 |
41 | 272.00 | 1551.00 |
發現編碼如下文表12中所示SEQ ID NOs中所示的具有所選擇氨基酸置換的多肽的基因的表達產生如表12中示例性所示的SEQ ID NO: 318的酶的另外的活性酶變體。
表12:與SEQ ID NO: 1的酶相比,以%計的OTA解毒比活性。
SEQ ID NO: | pH 6.0 | pH 7.5 | SEQ ID NO: | pH 6.0 | pH 7.5 | SEQ ID NO: | pH 6.0 | pH 7.5 | SEQ ID NO: | pH 6.0 | pH 7.5 |
48 | 54 | 102 | 124 | 87 | 78 | 189 | 82 | 22 | 252 | 32 | 13 |
49 | 76 | 179 | 125 | 58 | 94 | 190 | 122 | 85 | 253 | 93 | 87 |
50 | 81 | 257 | 126 | 63 | 75 | 191 | 21 | 28 | 254 | 32 | 15 |
51 | 46 | 140 | 127 | 78 | 82 | 192 | 69 | 30 | 256 | 116 | 101 |
52 | 16 | 44 | 128 | 67 | 73 | 193 | 81 | 85 | 257 | 34 | 15 |
53 | 64 | 100 | 129 | 51 | 83 | 194 | 78 | 52 | 258 | 29 | 25 |
54 | 33 | 40 | 133 | 23 | 27 | 195 | 148 | 100 | 259 | 56 | 54 |
55 | 27 | 54 | 134 | 41 | 52 | 196 | 48 | 58 | 260 | 83 | 81 |
56 | 32 | 87 | 135 | 68 | 70 | 197 | 59 | 29 | 261 | 78 | 95 |
57 | 15 | 16 | 136 | 64 | 48 | 198 | 111 | 84 | 262 | 116 | 106 |
58 | 6 | 8 | 137 | 86 | 93 | 199 | 9 | 34 | 263 | 19 | 11 |
59 | 69 | 333 | 138 | 46 | 29 | 200 | 18 | 25 | 264 | 46 | 44 |
60 | 23 | 61 | 139 | 141 | 88 | 201 | 134 | 121 | 265 | 20 | 11 |
61 | 15 | 34 | 140 | 118 | 120 | 202 | 59 | 47 | 266 | 11 | 22 |
62 | 35 | 26 | 141 | 138 | 123 | 203 | 100 | 70 | 268 | 25 | 39 |
63 | 43 | 112 | 142 | 34 | 8 | 204 | 41 | 24 | 271 | 6 | 23 |
64 | 36 | 146 | 143 | 86 | 84 | 205 | 52 | 24 | 272 | 121 | 86 |
65 | 4 | 10 | 144 | 78 | 95 | 206 | 168 | 112 | 273 | 134 | 76 |
66 | 15 | 15 | 145 | 101 | 90 | 207 | 87 | 72 | 274 | 100 | 100 |
67 | 51 | 28 | 146 | 172 | 112 | 208 | 135 | 108 | 275 | 71 | 85 |
68 | 70 | 67 | 148 | 40 | 19 | 209 | 143 | 88 | 276 | 13 | 30 |
69 | 102 | 75 | 149 | 30 | 13 | 210 | 93 | 102 | 277 | 6 | 14 |
70 | 80 | 77 | 150 | 89 | 62 | 211 | 121 | 111 | 278 | 32 | 19 |
71 | 32 | 17 | 151 | 75 | 86 | 212 | 46 | 17 | 279 | 23 | 36 |
72 | 34 | 46 | 152 | 65 | 74 | 213 | 76 | 39 | 280 | 70 | 50 |
73 | 20 | 23 | 153 | 72 | 77 | 214 | 123 | 108 | 281 | 90 | 50 |
77 | 5 | 3 | 154 | 38 | 38 | 215 | 27 | 20 | 282 | 77 | 41 |
80 | 7 | 3 | 155 | 116 | 124 | 216 | 147 | 115 | 283 | 29 | 23 |
83 | 63 | 90 | 156 | 144 | 109 | 217 | 153 | 139 | 284 | 48 | 23 |
84 | 3 | 5 | 157 | 78 | 63 | 218 | 104 | 101 | 285 | 28 | 21 |
85 | 5 | 3 | 158 | 157 | 92 | 219 | 87 | 88 | 286 | 39 | 17 |
86 | 4 | 9 | 159 | 84 | 93 | 220 | 85 | 83 | 287 | 151 | 105 |
87 | 65 | 166 | 160 | 78 | 84 | 222 | 8 | 20 | 288 | 29 | 31 |
88 | 66 | 91 | 161 | 132 | 110 | 223 | 14 | 16 | 289 | 66 | 106 |
89 | 43 | 107 | 162 | 191 | 124 | 224 | 169 | 132 | 290 | 160 | 122 |
90 | 99 | 162 | 163 | 145 | 112 | 225 | 24 | 27 | 291 | 77 | 79 |
91 | 49 | 73 | 164 | 29 | 63 | 226 | 19 | 22 | 292 | 77 | 81 |
92 | 37 | 52 | 165 | 46 | 71 | 227 | 47 | 36 | 293 | 16 | 18 |
93 | 20 | 17 | 166 | 72 | 68 | 228 | 23 | 19 | 294 | 31 | 42 |
95 | 108 | 178 | 167 | 54 | 73 | 229 | 21 | 15 | 295 | 95 | 110 |
96 | 42 | 33 | 168 | 41 | 62 | 230 | 141 | 127 | 296 | 42 | 38 |
99 | 52 | 58 | 169 | 50 | 45 | 231 | 20 | 22 | 297 | 182 | 106 |
100 | 43 | 28 | 170 | 49 | 32 | 233 | 11 | 17 | 298 | 15 | 17 |
101 | 82 | 89 | 171 | 69 | 37 | 234 | 23 | 13 | 299 | 156 | 95 |
102 | 50 | 89 | 172 | 62 | 70 | 235 | 56 | 38 | 300 | 152 | 103 |
103 | 101 | 124 | 173 | 27 | 53 | 236 | 19 | 15 | 301 | 55 | 43 |
104 | 102 | 71 | 174 | 45 | 59 | 237 | 49 | 26 | 302 | 26 | 23 |
105 | 81 | 120 | 175 | 121 | 108 | 238 | 151 | 97 | 303 | 167 | 110 |
106 | 88 | 126 | 176 | 112 | 95 | 239 | 73 | 76 | 304 | 25 | 24 |
107 | 54 | 92 | 177 | 94 | 90 | 240 | 86 | 101 | 305 | 36 | 46 |
108 | 61 | 96 | 178 | 85 | 88 | 241 | 18 | 55 | 306 | 114 | 74 |
109 | 74 | 107 | 179 | 49 | 66 | 242 | 41 | 54 | 307 | 138 | 84 |
110 | 33 | 48 | 180 | 91 | 83 | 243 | 37 | 77 | 308 | 171 | 117 |
111 | 8 | 52 | 181 | 138 | 112 | 244 | 127 | 93 | 309 | 106 | 48 |
113 | 31 | 95 | 182 | 98 | 91 | 245 | 62 | 59 | 310 | 78 | 91 |
117 | 40 | 80 | 183 | 58 | 55 | 246 | 113 | 89 | 311 | 89 | 48 |
118 | 26 | 22 | 184 | 103 | 76 | 247 | 80 | 100 | 312 | 81 | 64 |
119 | 107 | 101 | 185 | 32 | 18 | 248 | 131 | 91 | 313 | 84 | 54 |
120 | 85 | 90 | 186 | 142 | 115 | 249 | 21 | 26 | 314 | 71 | 33 |
121 | 84 | 78 | 187 | 51 | 58 | 250 | 17 | 21 | 315 | 38 | 56 |
122 | 59 | 80 | 188 | 84 | 52 | 251 | 53 | 33 | 316 | 62 | 61 |
另外,發現具有SEQ ID NO: 336的氨基酸序列的酶和SEQ ID NO: 337的多肽的其它變體在pH 7.5和pH 6.0分別具有大約40U/g和22U/g的OTA解毒比活性。包含若干氨基酸置換的SEQ ID NO: 337的酶的示例性變體在下文表13中示出,使用SEQ ID NO: 337的編號並包含類似於SEQ ID NO: 337的酶的N端信號肽。
表13:包含所示置換的SEQ ID NO: 337的酶的變體
SEQ ID NO: | 置換 | SEQ ID NO: | 置換 |
338 | S148V/S194E/S195A/A222P/V235I/ G359V/Y369F/M384L/V406L | 343 | R83E/P103N/S148V/S149V/K154D/W155Y/ Q170H/T181E/G193A/S195R/Y221F/A222P/ V235I/Q238N/R239K/M274C/L280I/S281T/ E290Q/T335S/G359V/Y369F/V372I/S381V/ M384I/R390E/A404S/V406L/E407P |
339 | A222P/V235I/L280I/Y369F/A380V/ S381V/M384I/G405A/E407P | 344 | P103N/A115R/S148V/W155Y/Q170H/H176Y/ T181E/G193A/S195R/Y221F/A222P/V235I/ Q238N/R239K/M274C/L280I/S281T/E290Q/ E294D/T335S/G359V/Y369F/V372I/S381V/ M384I/R390E/A404S/V406L/E407P |
340 | A222P/V235I/L280I/G359V/Y369F/ A380V/S381L/G405A/E407F | 345 | R83E/A89C/P103N/L136C/S148V/S149V/ K154Q/W155Y/Y156R/E157P/D158R/W159A/ Y160F/K161D/S162D/M163W/V164Q/Q170H/ Y173R/Y177W/T181E/G193A/S194E/S195R/ Y221F/A222P/G227S/A230C/Q232M/P234S/ V235I/Q238N/R239K/A243V/V249T/M274C/ G277S/V279A/L280I/S281T/L282F/D284N |
341 | R83E/P103N/S148V/S149V/K154D/ W155Y/Q170H/T181E/G193A/S195R/ Y221F/A222P/V235I/Q238N/R239K/ M274C/S281T/E290Q/T335S/G359V/ V372I | 346 | V249T/M274C/G277S/V279A/L280I/S281T/ L282F/D284N/V286A/E290Q/Q293P/H304E/ K309Y/H315Q/D329R/T335S/Q338E/Y351C/ A358G/G359V/Y360C/W361E/V362A/L364A/ K365Q/T368C/Y369F/I373M/A380G/S381M/ Q383S/M384L/R390E/A404S/G405A/V406L/ E407P/P408A/H409N/N412Q/L440C/G442R |
342 | W155Y/Q170H/T181E/G193A/S195R/ Y221F/A222P/V235I/Q238N/R239K/ M274C/S281T/E290Q/T335S/G359V/ V372I/M384I/R390E/A404S/V406L/ E407P | 347 | P103N/L136C/S148V/S149V/K154Q/W155Y/ Y156R/E157P/D158R/W159A/Y160F/K161D/ S162D/M163W/V164Q/Q170H/Y173R/Y177W/ S194E/Y221F/P234S/R238K/A243V/V249T/ M274C/G277S/V279A/L280I/S281T/L282F/ D284N/H304E/K309Y/H315Q/D329R/T335S/ Q338E/Y351C/A358G/M384L/L440C/G442R |
另外,發現具有SEQ ID NO: 348的氨基酸序列的酶和SEQ ID NO: 349的多肽的其它變體在pH 7.5和pH 6.0分別具有大約32U/g和19U/g的OTA解毒比活性。包含若干氨基酸置換的SEQ ID NO: 349的酶的示例性變體在下文表14中示出,使用SEQ ID NO: 349的編號並包含類似於SEQ ID NO: 349的酶的N端信號肽。
表14:包含所示置換的SEQ ID NO: 349的酶的變體
SEQ ID NO: | 置換 | SEQ ID NO: | 置換 |
350 | S96V/G97E/A143S/A170P/F183I/ G307V/Y317F/M332L/V354L | 355 | E32R/N52P/S96V/G97V/N102D/W103Y/Q118H/ T129E/G141A/A143R/Y169F/A170P/F183I/D186N/ R187K/M222C/L228I/S229T/E238Q/T283S/G307V/ Y317F/A320I/A329V/M332I/R338E/A352S/V354L/ E355P |
351 | A170P/F183I/L228I/Y317F/A328V/ A329V/M332I/G353A/E355P | 356 | N52P/I63R/S96V/W103Y/Q118H/R124Y/T129E/ G141A/A143R/Y169F/A170P/F183I/D186N/R187K/ M222C/L228I/S229T/E238Q/D242E/T283S/G307V/ Y317F/A320I/A329V/M332I/R338E/A352S/V354L/ E355P |
352 | A170P/F183I/L228I/G307V/Y317F/ A328V/A329L/G353A/E355F | 357 | E32R/A38C/N52P/L84C/S96V/G97V/N102Q/ W103Y/Y104R/K105P/D106R/F107A/R108F/ D109K/R110D/M111W/L112Q/Q118H/Y121R/ N125W/T129E/G141A/S142E/A143R/Y169F/ A170P/G175S/G178C/G180M/P182S/F183I/ D186N/R187K/D191V/V197T/M222C/G225S/ V227A/L228I/S229T/L230F/D232N |
353 | E32R/N52P/S96V/G97V/N102D/ W103Y/Q118H/T129E/G141A/A143R/ Y169F/A170P/F183I/D186N/R187K/ M222C/S229T/E238Q/T283S/G307V/ A320I | 358 | V197T/M222C/G225S/V227A/L228I/S229T/L230F/ D232N/V234A/E238Q/Q241P/H252E/K257Y/ H263Q/D277R/T283S/T286E/Y299C/A306G/ G307V/E308C/W309E/V310A/M312A/K313Q/ N316C/Y317F/V321M/A328G/A329M/Q331S/ M332L/R338E/A352S/G353A/V354L/E355P/ P356A/H357N/N360Q/L388C/G390R |
354 | W103Y/Q118H/T129E/G141A/A143R/ Y169F/A170P/F183I/D186N/R187K/ M222C/S229T/E238Q/T283S/G307V/ A320I/M332I/R338E/A352S/V354L/ E355P | 359 | N52P/L84C/S96V/G97V/N102Q/W103Y/Y104R/ K105P/D106R/F107A/R108F/D109K/R110D/ M111W/L112Q/Q118H/Y121R/N125W/S142E/ Y169F/P182S/D186K/D191V/V197T/M222C/ G225S/V227A/L228I/S229T/L230F/D232N/ H252E/K257Y/H263Q/D277R/T283S/T286E/ Y299C/A306G/M332L/L388C/G390R |
實施例4:穩定性的測定
根據熱穩定性測定了穩定性。儘管如此,本領域技術人員知道對高溫(例如超過30℃)的穩定性通常與對其它非標準條件的穩定性相關,例如對酸性或鹼性pH(例如分別低於pH 6.5或高於pH 7.5)、對高鹽濃度、有機溶劑或乾燥的穩定性。
為了測定所產生的酶的動力學穩定性,進行熱穩定性測定。為此,將純化的蛋白質樣品在20mM Tris-HCl緩衝液pH 7.5中稀釋至0.1mg/mL的蛋白質濃度,並且將等分試樣在熱循環儀中在45、55、65、75、80、85、90、95或99℃下溫育10分鐘。在此溫育之後,將等分試樣儲存在4℃下直至進一步分析。在整個溫育過程中,將參比等分試樣儲存在4℃下。隨後,用實施例3中所描述的測定來測定所有等分試樣的殘留OTA解毒活性。相對於參比等分試樣計算殘留酶活性。相對於參比等分試樣測定在溫育後喪失50%初始活性的溫度範圍(T50)。結果示於表15中。
表15:維持50%初始活性的溫度
SEQ ID NO: | T50 | SEQ ID NO: | T50 | SEQ ID NO: | T50 |
1 | 65-75 | 38 | >99 | 61 | 66-68 |
2 | >95 | 39 | >99 | 62 | 63-64 |
17 | 65-75 | 40 | >99 | 63 | 72-74 |
18 | 81-83 | 41 | 99 | 64 | 63-64 |
19 | 65 | 42 | >99 | 65 | 23102 |
20 | <45 | 43 | >99 | 66 | 65.3-66.9 |
21 | 65-75 | 44 | >99 | 67 | <63.2 |
22 | >95 | 45 | >99 | 68 | 70.7-72.6 |
23 | >95 | 46 | >99 | 69 | <63.2 |
24 | >95 | 47 | >99 | 70 | <63.2 |
25 | >95 | 48 | <63.2 | 71 | 70.7-72.6 |
26 | >95 | 49 | 68-70 | 72 | 74.4-77.0 |
27 | >95 | 50 | 64 | 73 | 74.4-77.0 |
28 | >95 | 51 | 68-70 | 74 | <63.2 |
29 | >95 | 52 | <63.2 | 75 | 74.4-77.0 |
30 | >95 | 53 | <63.2 | 77 | 65.3-66.9 |
31 | >95 | 54 | <63.2 | 78 | 68.8-70.7 |
32 | >95 | 55 | 64-66 | 79 | 70.7-72.6 |
33 | >95 | 56 | 66-68 | 80 | 64.0-65.3 |
34 | >95 | 57 | 68-70 | 368 | 68 |
35 | 99 | 58 | 72 | 369 | 68 |
36 | 99 | 59 | 68-70 | ||
37 | >99 | 60 | 66-68 |
此外,發現具有SEQ ID NO: 336的氨基酸序列的酶和SEQ ID NO: 337的多肽的其它變體具有90-95℃的T50。類似地,發現具有SEQ ID NO: 348的氨基酸序列的酶和SEQ ID NO: 349的多肽的其它變體具有85-90℃的T50。
作為比較,發現具有如NCBI GenBank數據庫記錄CAK41945.1中所列氨基酸序列的來自黑麴黴的酶具有70-80℃的T50。
為了相互比較所選擇的酶的溫度行為和熱穩定性,將酶在pH 6.0、65℃下溫育10 min。將溫育後剩餘的酶活性與溫育後SEQ ID NO: 1的酶的剩餘活性進行比較,後者設為100%,參見表16。
表16:酶活性比較。
SEQ ID NO: | % | SEQ ID NO: | % | SEQ ID NO: | % | SEQ ID NO: | % |
83 | 19 | 154 | 32 | 202 | 25 | 261 | 60 |
84 | 58 | 155 | 35 | 203 | 10 | 262 | 40 |
85 | 95 | 156 | 34 | 206 | 42 | 268 | 28 |
87 | 53 | 157 | 73 | 207 | 37 | 272 | 41 |
88 | 33 | 158 | 9 | 208 | 35 | 273 | 34 |
89 | 71 | 159 | 30 | 209 | 31 | 274 | 32 |
91 | 16 | 160 | 30 | 210 | 39 | 275 | 25 |
95 | 38 | 162 | 7 | 211 | 34 | 280 | 31 |
96 | 39 | 163 | 17 | 213 | 25 | 281 | 13 |
103 | 36 | 164 | 15 | 214 | 59 | 282 | 28 |
105 | 15 | 165 | 33 | 216 | 14 | 284 | 13 |
106 | 27 | 166 | 37 | 217 | 36 | 285 | 63 |
107 | 21 | 167 | 26 | 218 | 28 | 286 | 33 |
108 | 27 | 168 | 48 | 219 | 38 | 287 | 28 |
111 | 35 | 169 | 30 | 220 | 22 | 288 | 90 |
113 | 62 | 173 | 53 | 224 | 40 | 289 | 63 |
119 | 45 | 174 | 54 | 225 | 84 | 290 | 53 |
120 | 23 | 175 | 13 | 227 | 24 | 291 | 34 |
121 | 40 | 177 | 20 | 230 | 32 | 292 | 21 |
122 | 40 | 179 | 17 | 231 | 75 | 294 | 36 |
124 | 42 | 180 | 28 | 232 | 25 | 295 | 41 |
125 | 100 | 181 | 47 | 234 | 50 | 296 | 43 |
127 | 64 | 182 | 38 | 235 | 56 | 297 | 32 |
128 | 84 | 183 | 75 | 237 | 14 | 299 | 27 |
136 | 36 | 184 | 46 | 238 | 24 | 300 | 31 |
137 | 48 | 186 | 42 | 239 | 30 | 301 | 35 |
138 | 27 | 187 | 36 | 240 | 44 | 303 | 56 |
139 | 40 | 188 | 45 | 241 | 73 | 304 | 63 |
140 | 34 | 189 | 19 | 242 | 11 | 305 | 35 |
141 | 55 | 190 | 15 | 243 | 41 | 306 | 36 |
143 | 21 | 192 | 41 | 244 | 33 | 307 | 35 |
144 | 28 | 193 | 42 | 245 | 37 | 308 | 39 |
145 | 47 | 194 | 45 | 246 | 27 | 309 | 28 |
146 | 45 | 195 | 38 | 247 | 53 | 310 | 39 |
148 | 35 | 196 | 57 | 248 | 38 | 311 | 30 |
150 | 22 | 197 | 29 | 253 | 22 | 312 | 17 |
151 | 30 | 198 | 55 | 256 | 36 | 313 | 20 |
152 | 38 | 200 | 88 | 259 | 41 | 315 | 29 |
153 | 34 | 201 | 54 | 260 | 27 | 316 | 25 |
實施例5:制粒試驗
為了驗證本文稱為添加劑的酶例如用於飼料或食品的適用性,進行了製粒試驗。作為一個例子,將1.15U或0.06U的具有SEQ ID NO: 1或2的氨基酸序列中任一個的酶中任一種與1kg的粉狀飼料均勻混合,並進行標準飼料製粒過程,其中在五個單獨的飼料製粒批次中,將空調的溫度設定為75、80、85、90或95℃。通過計算重懸團粒(pellet)中摻入的OTA降解成OTα的百分比,估計製粒過程對酶的穩定性的影響。應用以下方案分析了經處理的粉料(mash):將50μL 10ppm OTA摻入1g乾燥樣品中,然後通過加入4.95mL RO-w水(37℃)開始測定。將懸浮液在50mL管中在頂置式振盪器(overhead shaker)中37℃下溫育60 min。通過加入1mL 6M磷酸終止反應,然後在室溫下在旋轉振盪器中再溫育10 min。隨後,將30μL 13C標記的OTA / 13C標記的OTα(各自1ppm)內標加入到每個樣品中並混合。加入30mL乙酸乙酯,然後在頂置式振盪器上以80rpm振盪60 min。離心(10 min,3214rcf)後,將8mL的上層有機相轉移到新的50mL管中。加入4 mL 0.1M NaHCO3(pH 8.2)。在頂置式振盪器上以80rpm振盪1 min後,將樣品再次離心(10 min,3214rcf),然後將3mL下層水相轉移至新的15mL管。加入70μL 85%磷酸和1.5mL乙酸乙酯,並在頂置式振盪器上以80rpm振盪1 min。離心(10 min,3214rcf)後,將50μL上層有機相加入矽烷化HPLC小瓶中的50μL乙腈中並充分混合。通過如Dellafiora等人(2020, Toxins 12, 258)所描述的HPLC MS/MS方法測定OTA和OTα含量,以測定OTA降解形成OTα的百分比。表17示例性地示出了在未經處理的粉狀飼料樣品(空白)中以及在用所示酶中任一種處理飼料樣品時在所示溫度中任一個下製粒後,剩餘的OTA和形成的OTα的量。結論是,製粒期間的熱處理不影響酶將OTA降解成OTα的能力。
表14:在所示溫度下制粒前和制粒後的OTA降解能力
樣品 | OTA % | OTα % | 樣品 | OTA % | OTα % |
粉料空白 | 100 | 0 | Mash blank | 100 | 0 |
粉料 + SEQ ID NO: 2_制粒前 | 20 | 80 | 粉料+ SEQ ID NO: 1_制粒前 | 1 | 99 |
粉料+ SEQ ID NO: 2_團粒_75 °C | 16 | 84 | 粉料+ SEQ ID NO: 1_團粒_75 °C | 1 | 99 |
粉料+ SEQ ID NO: 2_團粒_80 °C | 12 | 88 | 粉料+ SEQ ID NO: 1_團粒_80 °C | 1 | 99 |
粉料+ SEQ ID NO: 2_團粒_85 °C | 16 | 84 | 粉料+ SEQ ID NO: 1_團粒_85 °C | 1 | 99 |
粉料+ SEQ ID NO: 2_團粒_90 °C | 12 | 88 | 粉料+ SEQ ID NO: 1_團粒_90 °C | 1 | 99 |
粉料+ SEQ ID NO: 2_團粒_95 °C | 13 | 87 | 粉料+ SEQ ID NO: 1_團粒_95 °C | 1 | 99 |
實施例6:試餵試驗
為了進一步研究本文稱為添加劑的酶例如用於飼料或食品的應用,在豬中進行飼餵試驗。示例性地,通過應用本領域技術人員已知的方法在生物反應器中培養大腸桿菌轉化體,產生了具有SEQ ID NO: 1或2的氨基酸序列中任一個的酶中任一種。將細胞培養液(cell broth)勻漿並離心。將上清液濃縮,通過凍乾乾燥並通過研磨配製成粉末。測定了由此獲得的凍乾粉末的酶活性,並將粉末與飼料混合用於如以下所描述的飼餵試驗。
基於以下實驗飲食設置研究了十三個仔豬組:1) 基礎飼料;2) 基礎飼料+50ppb OTA;3) 基礎飼料+50ppb OTA+2.62U SEQ ID NO: 1的酶/kg飼料;4) 基礎飼料+50ppb OTA+0.29U SEQ ID NO: 2的酶/kg飼料;5) 基礎飼料+500ppb OTA;6) 基礎飼料+500ppb OTA+2.62U SEQ ID NO: 1的酶/kg飼料;7) 500ppb OTA+0.29U SEQ ID NO: 2的酶/kg飼料。基礎飼料本身不含任何可檢測量的OTA。
每個試驗組由四隻重約7-8 kg的仔豬組成,它們剛斷奶,並在餵以如上文所描述的實驗飲食之前適應固體飲食。飼餵試驗的持續時間(即飼餵實驗飲食的實際天數)為十四天。每個試驗組共同消耗約15kg飼料。在整個飼養試驗中沒有仔豬發生任何意外疾病。在第0天、剛好在開始實驗飲食之前和第14天收集尿液和血液樣品。
從血漿和尿液樣品中提取OTA,用於隨後的HPLC-MS分析。將200μL樣品與800μL提取溶液(含有99%乙酸乙酯和1%磷酸(85%))充分混合,然後在19000×g離心5 min進行相分離。用50μL乙腈稀釋50μL上層相,然後進行HPLC-MS分析。使用如Dellafiora等人(2020, Toxins 12, 258)所描述的HPLC-M方法測定在試驗期間食用實驗食物時所取樣品中OTA濃度的變化。使用如上文所示的飲食設置編號,結果示於表18中。值得注意的是,僅當重組酶是飲食設置的一部分時,才觀察到血漿和尿兩者中OTA濃度的降低,證明了本發明的酶在食品/飼料中用於OTA解毒的適用性。
表18:第0天和第14天血漿和血液樣品中OTA濃度(以ppb計),以及OTA減少(以%計)。
飲食設置# | 血將樣品 | 尿樣品 | ||||
第0天 | 第14天 | % OTA减少 | 第0天 | 第14天 | % OTA减少 | |
1 | 0 | 0 | n/a | 0 | 0 | n/a |
2 | 0 | 41±4 | n/a | 0 | 2 | n/a |
3 | 0 | 19±2 | 54 | 0 | 0 | 100 |
4 | 0 | 11±3 | 73 | 0 | 0 | 100 |
5 | 0 | 414±72 | n/a | 0 | 20±2 | n/a |
6 | 0 | 168±41 | 59 | 0 | 7±1 | 65 |
7 | 0 | 107±31 | 74 | 0 | 4 | 80 |
圖1:赭麴黴毒素A水解為苯丙氨酸和赭麴黴毒素α的示例性方案(Dellafiora等人,Toxins 2020, 12, 258)。
TW202328441A_111132273_SEQL.xml
Claims (16)
- 一種用於使具有式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解)的方法(例如體外、離體、體內或製造方法): ,其中R1選自H和OH,R2選自H和CH2-CH3,R3選自H和Cl;所述方法包括: (a) 提供: (i) 一種或多種多肽,所述一種或多種多肽與選自以下的氨基酸序列具有至少70%序列同一性(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%):SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 318、SEQ ID NO: 336、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NOs: 16-359、368-370;其中所述一種或多種多肽能夠使至少一種具有所述式I的黴菌毒素解毒(例如修飾或水解);優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;進一步優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;最優選地,所述一種或多種多肽包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個: i’) PGFIDAHVH(SEQ ID NO: 3),優選地,所述SEQ ID NO: 3被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置87-95的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; ii’) PAEQA(SEQ ID NO: 4),優選地,所述SEQ ID NO: 4被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置116-120的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; iii’) GVCNG(SEQ ID NO: 5),優選地,所述SEQ ID NO: 5被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置197-201的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; iv’) CRAAVR(SEQ ID NO: 6),優選地,所述SEQ ID NO: 6被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置205-210的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; v’) IKFMPSGGVLSL(SEQ ID NO: 7),優選地,所述SEQ ID NO: 7被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置220-231的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; vi’) RKVAAH(SEQ ID NO: 8),優選地,所述SEQ ID NO: 8被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置257-262的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; vii’) AGVDSIEHG(SEQ ID NO: 9),優選地,所述SEQ ID NO: 9被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置275-283的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; viii’) VMPGLIDAH(SEQ ID NO: 10),優選地,所述SEQ ID NO: 10被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置51-59的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; ix’) AGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 11),優選地,所述SEQ ID NO: 11被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置96-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; x’) QTFGH(SEQ ID NO: 12),優選地,所述SEQ ID NO: 12被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置135-139的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xi’) ATGGVLS(SEQ ID NO: 13),優選地,所述SEQ ID NO: 13被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置185-191的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xii’) YVAAHAHGD(SEQ ID NO: 14),優選地,所述SEQ ID NO: 14被包含在對應於SEQ ID NO: 2或22的位置219-227的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2或22的編號)處; xiii’) LTPTL(SEQ ID NO: 15),優選地,所述SEQ ID NO: 15被包含在對應於SEQ ID NO: 2或22的位置262-266的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2或22的編號)處; xiv’) VMPGLID(SEQ ID NO: 360),優選地,所述SEQ ID NO: 360被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置52-58的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xv’) KGGSL(SEQ ID NO: 361),優選地,所述SEQ ID NO: 361被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置67-71的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xvi’) LLLAGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 362),優選地,所述SEQ ID NO: 362被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置93-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xvii’) QTFGHGE(SEQ ID NO: 363),優選地,所述SEQ ID NO: 363被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置135-141的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xviii’) FATGGVLSQRD(SEQ ID NO: 364),優選地,所述SEQ ID NO: 364被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置184-194的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xix’) IVNEA(SEQ ID NO: 365),優選地,所述SEQ ID NO: 365被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置209-213的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xx’) IGVDEWGL(SEQ ID NO: 366),優選地,所述SEQ ID NO: 366被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置279-286的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xxi’) GFETGL(SEQ ID NO: 367),優選地,所述SEQ ID NO: 367被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置317-322的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; ii) 親本多肽的一種或多種變體,其中所述變體在對應於所述親本多肽的位置的一個或多個位置處包含改變(例如置換、缺失和/或插入),其中所述變體與選自以下的親本氨基酸序列具有至少70%(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)但小於100%序列同一性:SEQ ID NOs: 1、2、16-21、22、23-34、317-318、326-335、336-337、348-349、368-370;其中所述變體能夠使至少一種具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解);優選地,所述變體具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;進一步優選地,所述變體具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;最優選地,所述變體包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個:根據(i)的(i’)-(xxi’);進一步最優選地,所述親本多肽選自以下:SEQ ID NOs: 1、2、16-21、22、23-34、317-318、326-335、336-337、348-349、368-370; (iii) 編碼和/或能夠表達根據(i)-(ii)的一種或多種多肽和/或一種或多種變體的一種或多種多核苷酸、核酸構建體和/或表達載體; (iv) 包含(i)、(ii)和/或(iii)的一種或多種重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子和/或轉基因花粉粒;和/或 (v) 包含(i)、(ii)、(iii)和/或(iv)的食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物; (b) 將(a)應用於所述具有式I的黴菌毒素。
- 一種食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物,其包含以下中的一種或多種: (i) 一種或多種多肽,所述一種或多種多肽與選自以下的氨基酸序列具有至少70%序列同一性(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%):SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 318、SEQ ID NO: 336、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NOs: 16-359、368-370;其中所述多肽能夠使至少一種具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解): 其中R1選自H和OH,R2選自H和CH2-CH3,R3選自H和Cl;優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;進一步優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;最優選地,所述多肽包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個: i’) PGFIDAHVH(SEQ ID NO: 3),優選地,所述SEQ ID NO: 3被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置87-95的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; ii’) PAEQA(SEQ ID NO: 4),優選地,所述SEQ ID NO: 4被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置116-120的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; iii’) GVCNG(SEQ ID NO: 5),優選地,所述SEQ ID NO: 5被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置197-201的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; iv’) CRAAVR(SEQ ID NO: 6),優選地,所述SEQ ID NO: 6被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置205-210的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; v’) IKFMPSGGVLSL(SEQ ID NO: 7),優選地,所述SEQ ID NO: 7被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置220-231的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; vi’) RKVAAH(SEQ ID NO: 8),優選地,所述SEQ ID NO: 8被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置257-262的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; vii’) AGVDSIEHG(SEQ ID NO: 9),優選地,所述SEQ ID NO: 9被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置275-283的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; viii’) VMPGLIDAH(SEQ ID NO: 10),優選地,所述SEQ ID NO: 10被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置51-59的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; ix’) AGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 11),優選地,所述SEQ ID NO: 11被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置96-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; x’) QTFGH(SEQ ID NO: 12),優選地,所述SEQ ID NO: 12被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置135-139的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xi’) ATGGVLS(SEQ ID NO: 13),優選地,所述SEQ ID NO: 13被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置185-191的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xii’) YVAAHAHGD(SEQ ID NO: 14),優選地,所述SEQ ID NO: 14被包含在對應於SEQ ID NO: 2或22的位置219-227的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2或22的編號)處; xiii’) LTPTL(SEQ ID NO: 15),優選地,所述SEQ ID NO: 15被包含在對應於SEQ ID NO: 2或22的位置262-266的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2或22的編號)處; xiv’) VMPGLID(SEQ ID NO: 360),優選地,所述SEQ ID NO: 360被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置52-58的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xv’) KGGSL(SEQ ID NO: 361),優選地,所述SEQ ID NO: 361被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置67-71的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xvi’) LLLAGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 362),優選地,所述SEQ ID NO: 362被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置93-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xvii’) QTFGHGE(SEQ ID NO: 363),優選地,所述SEQ ID NO: 363被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置135-141的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xviii’) FATGGVLSQRD(SEQ ID NO: 364),優選地,所述SEQ ID NO: 364被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置184-194的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xix’) IVNEA(SEQ ID NO: 365),優選地,所述SEQ ID NO: 365被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置209-213的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xx’) IGVDEWGL(SEQ ID NO: 366),優選地,所述SEQ ID NO: 366被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置279-286的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xxi’) GFETGL(SEQ ID NO: 367),優選地,所述SEQ ID NO: 367被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置317-322的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; ii) 親本多肽的一種或多種變體,其中所述變體在對應於所述親本多肽的位置的一個或多個位置處包含改變(例如置換、缺失和/或插入),其中所述變體與選自以下的親本氨基酸序列具有至少70%(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)但小於100%序列同一性:SEQ ID NOs: 1、2、16-21、22、23-34、317-318、326-335、336-337、348-349、368-370;其中所述變體能夠使至少一種具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解);優選地,所述變體具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;進一步優選地,所述變體具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;最優選地,所述變體包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個:根據(i)的(i’)-(xxi’); (iii) 編碼和/或能夠表達根據(i)-(ii)的一種或多種多肽和/或一種或多種變體的一種或多種多核苷酸、核酸構建體和/或表達載體;和/或 (iv) 包含(i)、(ii)和/或(iii)的一種或多種重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子和/或轉基因花粉粒。
- 一種親本多肽的變體,所述變體能夠使至少一種具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解): ,其中R1選自H和OH,R2選自H和CH2-CH3,R3選自H和Cl;其中所述變體在對應於所述親本多肽的位置的一個或多個位置處包含改變(例如置換、缺失和/或插入),其中所述變體與選自以下的親本氨基酸序列具有至少70%(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)但小於100%序列同一性:SEQ ID NOs 1、2、16-21、22、23-34、317-318、326-335、336-337、348-349、368-370;優選地,所述變體具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;進一步優選地,所述變體具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;最優選地,所述變體包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個: i’) PGFIDAHVH(SEQ ID NO: 3),優選地,所述SEQ ID NO: 3被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置87-95的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; ii’) PAEQA(SEQ ID NO: 4),優選地,所述SEQ ID NO: 4被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置116-120的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; iii’) GVCNG(SEQ ID NO: 5),優選地,所述SEQ ID NO: 5被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置197-201的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; iv’) CRAAVR(SEQ ID NO: 6),優選地,所述SEQ ID NO: 6被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置205-210的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; v’) IKFMPSGGVLSL(SEQ ID NO: 7),優選地,所述SEQ ID NO: 7被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置220-231的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; vi’) RKVAAH(SEQ ID NO: 8),優選地,所述SEQ ID NO: 8被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置257-262的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; vii’) AGVDSIEHG(SEQ ID NO: 9),優選地,所述SEQ ID NO: 9被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置275-283的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; viii’) VMPGLIDAH(SEQ ID NO: 10),優選地,所述SEQ ID NO: 10被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置51-59的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; ix’) AGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 11),優選地,所述SEQ ID NO: 11被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置96-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; x’) QTFGH(SEQ ID NO: 12),優選地,所述SEQ ID NO: 12被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置135-139的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xi’) ATGGVLS(SEQ ID NO: 13),優選地,所述SEQ ID NO: 13被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置185-191的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xii’) YVAAHAHGD(SEQ ID NO: 14),優選地,所述SEQ ID NO: 14被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置219-227的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xiii’) LTPTL(SEQ ID NO: 15),優選地,所述SEQ ID NO: 15被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置262-266的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xiv’) VMPGLID(SEQ ID NO: 360),優選地,所述SEQ ID NO: 360被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置52-58的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xv’) KGGSL(SEQ ID NO: 361),優選地,所述SEQ ID NO: 361被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置67-71的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xvi’) LLLAGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 362),優選地,所述SEQ ID NO: 362被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置93-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xvii’) QTFGHGE(SEQ ID NO: 363),優選地,所述SEQ ID NO: 363被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置135-141的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xviii’) FATGGVLSQRD(SEQ ID NO: 364),優選地,所述SEQ ID NO: 364被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置184-194的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xix’) IVNEA(SEQ ID NO: 365),優選地,所述SEQ ID NO: 365被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置209-213的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xx’) IGVDEWGL(SEQ ID NO: 366),優選地,所述SEQ ID NO: 366被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置279-286的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xxi’) GFETGL(SEQ ID NO: 367),優選地,所述SEQ ID NO: 367被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置317-322的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處。
- 根據前述權利要求中任一項所述的方法、變體、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物,其中所述多肽和/或變體具有以下中的一個或多個: i) 所述肽酶活性為Xaa-Pro二肽酶EC 3.4.13.9; ii) 所述多肽和/或變體具有TIM桶結構,所述TIM桶結構包含沿多肽主鏈交替的8個α-螺旋和8個平行β-鏈,其中優選地,所述TIM桶還包含磷酸結合位點; iii) 所述多肽和/或變體在pH7.5具有至少2.9U/g的比活性; iv) 所述多肽和/或變體在pH6.0具有至少0.9U/g的比活性; v) 所述多肽和/或變體具有大於80℃(例如大於85℃)的T50值; vi) 所述多肽選自以下:SEQ ID NOs 1、2、16-21、22、23-34、317-318、326-335、336-337、348-349、368-370;和/或 vii) 所述變體選自以下:SEQ ID NOs: 35-316、319-325、338-347、350-359。
- 根據前述請求項中任一項所述的方法、變體、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物,其中所述變體在對應於SEQ ID NO: 2的位置65、106、132、268、269、272、275和/或318的一個或多個位置處包含改變(例如置換、缺失和/或插入),優選地,使用SEQ ID NO: 2的編號。
- 根據請求項5所述的方法、變體、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物,其中所述變體包含以下置換或置換組合中的一個或多個:I65G,I65A,E106G,E106S,P132A,I268A,Q269I,I272V,Y275V;F318V;I272V;Y275F;Y275H;和/或F318V,或其等價氨基酸置換。
- 根據前述請求項中任一項所述的方法、變體、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物,其中所述變體在對應於SEQ ID NO: 1或318的位置30、36、50、85、97、98、99、100、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、119、122、126、130、142、143、144、170、171、176、178、179、181、183、184、187、188、192、198、223、226、228、229、230、231、233、235、239、242、253、264、284、287、307、308、310、311、314、315、317、318、322、329、330、332、333、339、353、354、355、356、357、358或361的一個或多個位置處包含改變(例如置換、缺失和/或插入),優選地,使用SEQ ID NO: 1或318的編號,進一步優選地,使用SEQ ID NO: 318的編號。
- 根據請求項7所述的方法、變體、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物,其中所述變體包含以下置換或置換組合中的一個或多個:Y300C+L389C;I308V;A171P;T144A;V355L;I308A;G354A;S143E;M223C;A171G;H187N;I184V;H187Q;E239Q;V311I;K314Q;F109A;Y122R;F318Y;A36C+L85C;A375P;M223C;M223A;H264Q;A307G;H178Q;A307G+V355T;T144A;A171P;A171G;M223C;V228A;L229V;L229M;A307S;A307G;I308V;V311T;V355T;V311A;V355A;H264Q;M223C;M223A;A171L;A171G;H178Q;H178L;A307G+V311A;A307G+V311T;A307G+V355T;A307G+A355A;H178S;V228L;V228I;L229I;H264N;H264L;A307V;A307T;I308A;V311L;V311I;G354A;S97D;S97N;S97P;S97T;S97V;G142A;G142P;T144D;T144E;T144P;T144R;A179P;A179S;A179T;A171P+I184V;A171P+I308A;A171P+I308V;A171P+F318Y;A171P+G354A;I184V+I308A;I184V+I308V;I184V+F318Y;I184V+G354A;I308A+F318Y;I308V+F318Y;I308A+G354A;I308V+G354A;F318Y+G354A;A171P+I184V+I308A;A171P+I184V+I308V;A171P+I184V+F318Y;A171P+I184V+G354A;A171P+I308A+F318Y;A171P+I308V+F318Y;A171P+I308A+G354A;A171P+I308V+G354A;A171P+F318Y+G354A;I184V+I308A+F318Y ;I184V+I308V+F318Y;I184V+I308A+G354A;I184V+I308V+G354A;I184V+F318Y+G354A;I308A+F318Y+G354A;I308V+F318Y+G354A;Q181M;Q181L;F318L;F318M;A329G;A329V;V355L;V355I;Y170E;Y170F;Y170R;A330L;A330M;A330V;L333I;L333M;L333V;G354L;G354S;G354T;G354V;G356A;G356F;G356P;G356V;G356Y;F109A;P183G;P183S;F108V;F108L;F109V;F109L;M112I;M112W;I184V;I184F;W104F;W104L;W104P;W104Y;I322L;I322M;I322Q;I322S;H187Q;H187N;H310Q;H310N;K314Q;K314E;H332Q;H332V;E287Q;H358Q;H358Y;Q99D;H30E;H30K;H30P;H30R;H50D;H50N;H50P;S100D;N103D;N103L;N103Q;T130E;H187D;H187E;H187G;H187P;K188D;K188E;K188R;G226A;G226P;G226S;S230D;S230P;S230T;D233N;D233Q;D233S;H253A;H253N;S284D;S284H;S284T;H310D;H310E;H332E;H332R;H332S;H339E;H339K;H339N;H339S;A353S;H358A;H358K;H358N;N361E;N361Q;D110K+K188D;D110K+K188E;H187N+K188R;S284D+A329S;S284D+A329T;H310D+E313A;H310E+E313A;V235P;E239Q;A357P;F108Y;N111D;M113Q;Y122R;Y126W;F109Y;Q242P;I315P;T317Y;F318Y;G98S;G98V;Y105N;Y105R;G106P;D107R;D107Y;M112F;M112K;M113D;M113R;Q119E;Q119H;Q119K;Q119M;G176S;A192L;A192M;A 192V;V198T;L231F;V235A;V235D;V235F;V235L;L231E+V321T;L229I+I308A;I308A+A329V;I308A+G356F;I308A+G356P;I308A+G356Y;L229I+I308V;I308V+A329V;I308V+G356F;I308V+G356P;I308V+G356Y;G354A+G356V;G354A+G356Y;H310D+V355L;H310E+V355L;V311A+V355L;G354P+V355L;V355L+G356P;I184V+A192L;I184V+A192M;S143E;N361W;I308A+A330L;I308A+A330M;I308A+A330V;I308A+L333I;I308A+L333M;I308V+A330L;I308V+A330M;I308V+A330V;I308V+L333I;I308V+L333M;I308V+V355L;F318Y+V355L;H253E+D278R;K258Y+G391R;A36C+L85C;S100C+T317C;A179C+M223C;Y300C+L389C;A309C+A330C或其等價氨基酸置換。
- 一種編碼和/或能夠表達根據前述請求項中任一項所述的一種或多種變體和/或多肽的多核苷酸、核酸構建體或表達載體。
- 包含以下中的一種或多種的重組宿主細胞(例如分離的重組宿主細胞)、孢子、轉基因植物、轉基因種子或轉基因花粉粒:(i) 根據前述請求項中任一項所述的一種或多種變體和/或多肽;(ii) 根據前述請求項中任一項所述的一種或多種多核苷酸;和/或(iii) 根據前述請求項中任一項所述的一種或多種核酸構建體和/或表達載體。
- 一種包含以下中的一種或多種的組合物或試劑盒:根據前述請求項中任一項所述的變體、核酸構建體、表達載體、重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子和/或轉基因花粉粒、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑、益生元、中間益生元和/或它們的混合物和/或一種或多種多肽,所述一種或多種多肽與選自以下的氨基酸序列具有至少70%序列同一性(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%):SEQ ID NOs: 1、2、16-21、22、23-34、317-318、326-335、336-337、348-349、368-370、35-316、319-325、338-347、350-359;其中所述多肽能夠使至少一種具有所述式I的黴菌毒素解毒(例如修飾或水解): ,其中R1選自H和OH,R2選自H和CH2-CH3,R3選自H和Cl;優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;進一步優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;最優選地,所述多肽包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個: i’) PGFIDAHVH(SEQ ID NO: 3),優選地,所述SEQ ID NO: 3被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置87-95的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; ii’) PAEQA(SEQ ID NO: 4),優選地,所述SEQ ID NO: 4被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置116-120的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; iii’) GVCNG(SEQ ID NO: 5),優選地,所述SEQ ID NO: 5被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置197-201的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; iv’) CRAAVR(SEQ ID NO: 6),優選地,所述SEQ ID NO: 6被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置205-210的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; v’) IKFMPSGGVLSL(SEQ ID NO: 7),優選地,所述SEQ ID NO: 7被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置220-231的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; vi’) RKVAAH(SEQ ID NO: 8),優選地,所述SEQ ID NO: 8被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置257-262的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; vii’) AGVDSIEHG(SEQ ID NO: 9),優選地,所述SEQ ID NO: 9被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置275-283的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; viii’) VMPGLIDAH(SEQ ID NO: 10),優選地,所述SEQ ID NO: 10被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置51-59的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; ix’) AGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 11),優選地,所述SEQ ID NO: 11被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置96-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; x’) QTFGH(SEQ ID NO: 12),優選地,所述SEQ ID NO: 12被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置135-139的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xi’) ATGGVLS(SEQ ID NO: 13),優選地,所述SEQ ID NO: 13被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置185-191的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xii’) YVAAHAHGD(SEQ ID NO: 14),優選地,所述SEQ ID NO: 14被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置219-227的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xiii’) LTPTL(SEQ ID NO: 15),優選地,所述SEQ ID NO: 15被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置262-266的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xiv’) VMPGLID(SEQ ID NO: 360),優選地,所述SEQ ID NO: 360被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置52-58的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xv’) KGGSL(SEQ ID NO: 361),優選地,所述SEQ ID NO: 361被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置67-71的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xvi’) LLLAGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 362),優選地,所述SEQ ID NO: 362被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置93-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xvii’) QTFGHGE(SEQ ID NO: 363),優選地,所述SEQ ID NO: 363被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置135-141的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xviii’) FATGGVLSQRD(SEQ ID NO: 364),優選地,所述SEQ ID NO: 364被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置184-194的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xix’) IVNEA(SEQ ID NO: 365),優選地,所述SEQ ID NO: 365被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置209-213的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xx’) IGVDEWGL(SEQ ID NO: 366),優選地,所述SEQ ID NO: 366被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置279-286的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xxi’) GFETGL(SEQ ID NO: 367),優選地,所述SEQ ID NO: 367被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置317-322的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處。
- 一種用於生產食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物的方法,所述方法包括:a) 提供: (i) 一種或多種多肽,所述一種或多種多肽與選自以下的氨基酸序列具有至少70%序列同一性(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%):SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 318、SEQ ID NO: 336、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NOs: 16-359、368-370;其中所述多肽能夠使至少一種具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解): ,其中R1選自H和OH,R2選自H和CH2-CH3,R3選自H和Cl;優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;進一步優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;最優選地,所述多肽包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個: i’) PGFIDAHVH(SEQ ID NO: 3),優選地,所述SEQ ID NO: 3被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置87-95的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; ii’) PAEQA(SEQ ID NO: 4),優選地,所述SEQ ID NO: 4被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置116-120的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; iii’) GVCNG(SEQ ID NO: 5),優選地,所述SEQ ID NO: 5被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置197-201的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; iv’) CRAAVR(SEQ ID NO: 6),優選地,所述SEQ ID NO: 6被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置205-210的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; v’) IKFMPSGGVLSL(SEQ ID NO: 7),優選地,所述SEQ ID NO: 7被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置220-231的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; vi’) RKVAAH(SEQ ID NO: 8),優選地,所述SEQ ID NO: 8被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置257-262的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; vii’) AGVDSIEHG(SEQ ID NO: 9),優選地,所述SEQ ID NO: 9被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置275-283的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; viii’) VMPGLIDAH(SEQ ID NO: 10),優選地,所述SEQ ID NO: 10被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置51-59的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; ix’) AGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 11),優選地,所述SEQ ID NO: 11被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置96-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; x’) QTFGH(SEQ ID NO: 12),優選地,所述SEQ ID NO: 12被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置135-139的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xi’) ATGGVLS(SEQ ID NO: 13),優選地,所述SEQ ID NO: 13被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置185-191的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xii’) YVAAHAHGD(SEQ ID NO: 14),優選地,所述SEQ ID NO: 14被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置219-227的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xiii’) LTPTL(SEQ ID NO: 15),優選地,所述SEQ ID NO: 15被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置262-266的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xiv’) VMPGLID(SEQ ID NO: 360),優選地,所述SEQ ID NO: 360被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置52-58的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xv’) KGGSL(SEQ ID NO: 361),優選地,所述SEQ ID NO: 361被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置67-71的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xvi’) LLLAGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 362),優選地,所述SEQ ID NO: 362被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置93-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xvii’) QTFGHGE(SEQ ID NO: 363),優選地,所述SEQ ID NO: 363被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置135-141的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xviii’) FATGGVLSQRD(SEQ ID NO: 364),優選地,所述SEQ ID NO: 364被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置184-194的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xix’) IVNEA(SEQ ID NO: 365),優選地,所述SEQ ID NO: 365被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置209-213的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xx’) IGVDEWGL(SEQ ID NO: 366),優選地,所述SEQ ID NO: 366被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置279-286的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xxi’) GFETGL(SEQ ID NO: 367),優選地,所述SEQ ID NO: 367被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置317-322的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處, (ii) 根據前述請求項中任一項所述的變體; (iii) 根據前述請求項中任一項所述的一種或多種多核苷酸; (iv) 根據前述請求項中任一項所述的一種或多種核酸構建體和/或表達載體;和/或 (v) 根據前述請求項中任一項所述的一種或多種重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子和/或轉基因花粉粒;優選地,所述一種或多種多肽是一種或多種重組和/或分離多肽; (b) 將(a)應用於適用於生產食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物的營養源或材料。
- 一種通過根據前述請求項中任一項所述的方法生產的食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元和/或它們的混合物。
- 根據前述請求項中任一項所述的變體、多核苷酸、核酸構建體、表達載體、重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子、轉基因花粉粒、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元或它們的混合物、組合物或試劑盒和/或一種或多種多肽,所述一種或多種多肽與選自以下的氨基酸序列具有至少70%序列同一性(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%):SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 318、SEQ ID NO: 336、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NOs: 16-359、368-370;其中所述多肽能夠使至少一種具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解): ,其中R1選自H和OH,R2選自H和CH2-CH3,R3選自H和Cl;優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;進一步優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;最優選地,所述多肽包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個: i’) PGFIDAHVH(SEQ ID NO: 3),優選地,所述SEQ ID NO: 3被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置87-95的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; ii’) PAEQA(SEQ ID NO: 4),優選地,所述SEQ ID NO: 4被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置116-120的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; iii’) GVCNG(SEQ ID NO: 5),優選地,所述SEQ ID NO: 5被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置197-201的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; iv’) CRAAVR(SEQ ID NO: 6),優選地,所述SEQ ID NO: 6被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置205-210的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; v’) IKFMPSGGVLSL(SEQ ID NO: 7),優選地,所述SEQ ID NO: 7被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置220-231的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; vi’) RKVAAH(SEQ ID NO: 8),優選地,所述SEQ ID NO: 8被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置257-262的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; vii’) AGVDSIEHG(SEQ ID NO: 9),優選地,所述SEQ ID NO: 9被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置275-283的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; viii’) VMPGLIDAH(SEQ ID NO: 10),優選地,所述SEQ ID NO: 10被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置51-59的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; ix’) AGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 11),優選地,所述SEQ ID NO: 11被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置96-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; x’) QTFGH(SEQ ID NO: 12),優選地,所述SEQ ID NO: 12被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置135-139的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xi’) ATGGVLS(SEQ ID NO: 13),優選地,所述SEQ ID NO: 13被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置185-191的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xii’) YVAAHAHGD(SEQ ID NO: 14),優選地,所述SEQ ID NO: 14被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置219-227的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xiii’) LTPTL(SEQ ID NO: 15),優選地,所述SEQ ID NO: 15被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置262-266的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xiv’) VMPGLID(SEQ ID NO: 360),優選地,所述SEQ ID NO: 360被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置52-58的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xv’) KGGSL(SEQ ID NO: 361),優選地,所述SEQ ID NO: 361被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置67-71的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xvi’) LLLAGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 362),優選地,所述SEQ ID NO: 362被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置93-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xvii’) QTFGHGE(SEQ ID NO: 363),優選地,所述SEQ ID NO: 363被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置135-141的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xviii’) FATGGVLSQRD(SEQ ID NO: 364),優選地,所述SEQ ID NO: 364被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置184-194的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xix’) IVNEA(SEQ ID NO: 365),優選地,所述SEQ ID NO: 365被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置209-213的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xx’) IGVDEWGL(SEQ ID NO: 366),優選地,所述SEQ ID NO: 366被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置279-286的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xxi’) GFETGL(SEQ ID NO: 367),優選地,所述SEQ ID NO: 367被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置317-322的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處, 其用於用作藥物(例如用於獸醫用途)和/或用於疾病的治療和/或預防。
- 根據前述請求項中任一項所述的變體、多核苷酸、核酸構建體、表達載體、重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子、轉基因花粉粒、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元或它們的混合物、組合物或試劑盒和/或一種或多種多肽,所述一種或多種多肽與選自以下的氨基酸序列具有至少70%序列同一性(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%):SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 318、SEQ ID NO: 336、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NOs: 16-359、368-370;其中所述多肽能夠使至少一種具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解): 其中R1選自H和OH,R2選自H和CH2-CH3,R3選自H和Cl;優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;進一步優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;最優選地,所述多肽包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個: i’) PGFIDAHVH(SEQ ID NO: 3),優選地,所述SEQ ID NO: 3被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置87-95的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; ii’) PAEQA(SEQ ID NO: 4),優選地,所述SEQ ID NO: 4被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置116-120的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; iii’) GVCNG(SEQ ID NO: 5),優選地,所述SEQ ID NO: 5被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置197-201的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; iv’) CRAAVR(SEQ ID NO: 6),優選地,所述SEQ ID NO: 6被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置205-210的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; v’) IKFMPSGGVLSL(SEQ ID NO: 7),優選地,所述SEQ ID NO: 7被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置220-231的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; vi’) RKVAAH(SEQ ID NO: 8),優選地,所述SEQ ID NO: 8被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置257-262的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; vii’) AGVDSIEHG(SEQ ID NO: 9),優選地,所述SEQ ID NO: 9被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置275-283的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; viii’) VMPGLIDAH(SEQ ID NO: 10),優選地,所述SEQ ID NO: 10被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置51-59的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; ix’) AGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 11),優選地,所述SEQ ID NO: 11被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置96-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; x’) QTFGH(SEQ ID NO: 12),優選地,所述SEQ ID NO: 12被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置135-139的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xi’) ATGGVLS(SEQ ID NO: 13),優選地,所述SEQ ID NO: 13被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置185-191的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xii’) YVAAHAHGD(SEQ ID NO: 14),優選地,所述SEQ ID NO: 14被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置219-227的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xiii’) LTPTL(SEQ ID NO: 15),優選地,所述SEQ ID NO: 15被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置262-266的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xiv’) VMPGLID(SEQ ID NO: 360),優選地,所述SEQ ID NO: 360被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置52-58的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xv’) KGGSL(SEQ ID NO: 361),優選地,所述SEQ ID NO: 361被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置67-71的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xvi’) LLLAGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 362),優選地,所述SEQ ID NO: 362被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置93-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xvii’) QTFGHGE(SEQ ID NO: 363),優選地,所述SEQ ID NO: 363被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置135-141的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xviii’) FATGGVLSQRD(SEQ ID NO: 364),優選地,所述SEQ ID NO: 364被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置184-194的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xix’) IVNEA(SEQ ID NO: 365),優選地,所述SEQ ID NO: 365被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置209-213的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xx’) IGVDEWGL(SEQ ID NO: 366),優選地,所述SEQ ID NO: 366被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置279-286的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xxi’) GFETGL(SEQ ID NO: 367),優選地,所述SEQ ID NO: 367被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置317-322的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處, 其用於以下方法中的一種或多種中: i) 用於治療、改善、預防和/或診斷黴菌毒素中毒、優選OTA黴菌毒素中毒的方法; ii) 用於監測黴菌毒素中毒的發展和/或評估黴菌毒素中毒預防和/或治療、優選OTA黴菌毒素中毒預防和/或治療的功效的方法; iii) 用於使具有式I的黴菌毒素解毒和/或改變毒性的方法; iv) 生產以下中的一種或多種的方法:食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元;藥物、獸醫、診斷、解毒、監測和/或篩選組合物或試劑盒; v) 根據前述請求項中任一項所述的方法; vi) 根據(i)-(v)的任何組合; vii) (i)-(vi)中任一項的方法,其中所述方法是體外、離體、體內和/或製造方法。
- 根據前述請求項中任一項所述的變體、多核苷酸、核酸構建體、表達載體、重組宿主細胞、孢子、轉基因植物、轉基因種子、轉基因花粉粒、食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元或它們的混合物、組合物或試劑盒中的一種或多種和/或一種或多種多肽,所述一種或多種多肽與選自以下的氨基酸序列具有至少70%序列同一性(例如至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%):SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 318、SEQ ID NO: 336、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NOs: 16-359、368-370;其中所述多肽能夠使至少一種具有所述式I的黴菌毒素(例如赭麴黴毒素A、赭麴黴毒素B和/或赭麴黴毒素C)解毒(例如修飾或水解): 其中R1選自H和OH,R2選自H和CH2-CH3,R3選自H和Cl;優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.X,其中X選自以下:9、4、5、7、12、17、18、19、20、21、22、23;進一步優選地,所述多肽具有肽酶活性,所述肽酶活性具有EC 3.4.13.9;最優選地,所述多肽包含以下氨基酸序列(例如保守基序)中的一個或多個: i’) PGFIDAHVH(SEQ ID NO: 3),優選地,所述SEQ ID NO: 3被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置87-95的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; ii’) PAEQA(SEQ ID NO: 4),優選地,所述SEQ ID NO: 4被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置116-120的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; iii’) GVCNG(SEQ ID NO: 5),優選地,所述SEQ ID NO: 5被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置197-201的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; iv’) CRAAVR(SEQ ID NO: 6),優選地,所述SEQ ID NO: 6被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置205-210的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; v’) IKFMPSGGVLSL(SEQ ID NO: 7),優選地,所述SEQ ID NO: 7被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置220-231的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; vi’) RKVAAH(SEQ ID NO: 8),優選地,所述SEQ ID NO: 8被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置257-262的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; vii’) AGVDSIEHG(SEQ ID NO: 9),優選地,所述SEQ ID NO: 9被包含在對應於SEQ ID NO: 1的位置275-283的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 1的編號)處; viii’) VMPGLIDAH(SEQ ID NO: 10),優選地,所述SEQ ID NO: 10被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置51-59的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; ix’) AGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 11),優選地,所述SEQ ID NO: 11被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置96-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; x’) QTFGH(SEQ ID NO: 12),優選地,所述SEQ ID NO: 12被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置135-139的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xi’) ATGGVLS(SEQ ID NO: 13),優選地,所述SEQ ID NO: 13被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置185-191的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xii’) YVAAHAHGD(SEQ ID NO: 14),優選地,所述SEQ ID NO: 14被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置219-227的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xiii’) LTPTL(SEQ ID NO: 15),優選地,所述SEQ ID NO: 15被包含在對應於SEQ ID NO: 2的位置262-266的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 2的編號)處; xiv’) VMPGLID(SEQ ID NO: 360),優選地,所述SEQ ID NO: 360被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置52-58的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xv’) KGGSL(SEQ ID NO: 361),優選地,所述SEQ ID NO: 361被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置67-71的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xvi’) LLLAGFTTVRDCG(SEQ ID NO: 362),優選地,所述SEQ ID NO: 362被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置93-105的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xvii’) QTFGHGE(SEQ ID NO: 363),優選地,所述SEQ ID NO: 363被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置135-141的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xviii’) FATGGVLSQRD(SEQ ID NO: 364),優選地,所述SEQ ID NO: 364被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置184-194的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xix’) IVNEA(SEQ ID NO: 365),優選地,所述SEQ ID NO: 365被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置209-213的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xx’) IGVDEWGL(SEQ ID NO: 366),優選地,所述SEQ ID NO: 366被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置279-286的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處; xxi’) GFETGL(SEQ ID NO: 367),優選地,所述SEQ ID NO: 367被包含在對應於SEQ ID NO: 22的位置317-322的氨基酸位置(例如使用SEQ ID NO: 22的編號)處, 用於以下中的一項或多項或在以下中的一項或多項中的用途: i) 黴菌毒素中毒、優選OTA黴菌毒素中毒的治療、改善、預防和/或診斷; ii) 監測黴菌毒素中毒的發展和/或評估黴菌毒素中毒預防和/或治療、優選OTA黴菌毒素中毒預防和/或治療的功效; iii) 使具有式I的黴菌毒素解毒和/或改變毒性; iv) 生產以下中的一種或多種:食物、中間食物;草料、中間草料;飼料、中間飼料;添加劑(例如食物、草料或飼料添加劑)、中間添加劑(例如食物、草料或飼料中間添加劑);解毒劑、中間解毒劑;營養補充劑、中間營養補充劑;益生元、中間益生元;藥物、獸醫、診斷、解毒、監測和/或篩選組合物或試劑盒; v) 根據前述請求項中任一項所述的方法; vi) 根據(i)-(v)的任何組合; vii) (i)-(vi)中任一項的用途,其中所述用途是體外、離體、體內用途和/或製造方法中的用途。
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