KR101306774B1

KR101306774B1 - 피트산 가수분해에 대한 피타제 조합의 상승 작용 효과

Info

Publication number: KR101306774B1
Application number: KR1020087003104A
Authority: KR
Inventors: 엘렌느 보즈; 귀 물렝
Original assignee: 아디쎄오 프랑스 에스에이에스
Priority date: 2005-07-08
Filing date: 2006-07-07
Publication date: 2013-09-11
Also published as: CN101258239B; US20100278965A1; JP4955675B2; ES2343334T3; BRPI0612635B1; JP2009500028A; SI1910531T1; PL1910531T3; DE602006013829D1; TWI410496B; CA2614359A1; RU2407791C2; UA92352C2; FR2888249A1; RU2008101939A; ZA200800451B; US8541036B2; DK1910531T3; MY145654A; ATE465249T1

Abstract

본 발명은 피트산(미오-이노시톨 헥사키스포스페이트)를 무기 모노인산, 저인산화도의 미오-이노시톨, 및 자유 미오-이노시톨로 가수분해하기 위해 두 개 이상의 피타제를 조합한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 이러한 조성물 및 방법은 특히 동물 급식에 유용하다.

피타제, 피트산 가수분해, 조합, 상승작용 효과, 동물 사료, 동물용 영양 첨가제

Description

피트산 가수분해에 대한 피타제 조합의 상승 작용 효과{Synergistic effect of the combination of phytases on hydrolysis of phytic acid}

본 발명은 피트산 가수분해에 대한 피타제들의 조합의 상승 작용 효과에 관한 것이다.

피트산염(미오-이노시톨 헥사키스포스페이트) 또는 피테이트(미오-이노시톨 헥사키스 디하이드로겐포스페이트)는 곡류, 콩과 식물 및 오일 함유 식물에서 인(phosphorus)의 주된 저장형태이다. 이들은 식물-기초 동물 사료에서 인의 주된 공급원을 구성하며, 단위 동물(monogastric animal; 가금 및 돼지) 식사의 주된 구성요소이다. 그러나 이들 동물에 있어서 사료내 이 인의 생체 이용율은 제한적인데, 이들 동물들은 피트산염을 가수분해하여 이들이 필요로 하는 무기 인산을 공급하기에 충분한 피트산염 가수분해 장내 효소를 갖고 있지 못하기 때문이다. 또한 피트산은 항영양 인자(antinutritional factor)로서 단백질 및 이온(Fe³ ⁺, Ca² ⁺, Zn²⁺, Mg² ⁺)과 복합체를 형성하여 이들의 생체 이용율을 감소시킨다.

따라서, 가금 및 돼지의 사료에는 무기 인산염을 보충해주어야 하며, 피트산염으로부터의 인은 배설되어, 단위 동물을 광범위하게 육성하는 지역의 지표수를 부영양화시킨다.

피타제(미오-이노시톨 헥사키스포스페이트 3- 및 6-포스포하이드로라제 EC 3.1.3.8 및 3.1.3.26)는 히스티딘산 포스파타제의 패밀리중 일부분이다. 피타제는 피트산 또는 피트산염내의 포스포에스테르 결합을 가수분해하는 헥사키스포스포하이드로라제이다. 따라서, 이들 효소들은 미오-이노시톨 헥사키스포스페이트(피트산, InsP₆)의 무기 모노인산, 낮은 정도로 인산화된(저인산화도) 인산 미오-이노시톨(InsP₅ 내지InsP₁), 및 어떤 경우에는 자유 미오-이노시톨로의 가수분해를 촉매한다.

제일 먼저 가수분해되는 인산의 위치에 의해 구분되는 두 클래스의 피타제가 존재한다. 3-피타제(EC 3.1.3.8)은 3-위치의 인산을 가수분해하고, 6-피타제(EC 3.1.3.26)는 6-위치의 인산을 가수분해한다.

동물 사료에 첨가제로 사용되는 이러한 효소들은 첫째 피트산 인(phytic phosphorous)의 생체이용율을 증가시키며, 두번째로 사료의 소화성을 개선시킨다. 또한 피트산 인의 방출은 인산 보충에 따른 경비를 상당한 정도로 경감시키며, 배설된 과량의 인산염으로 인해 유발되는 오염을 경감시킨다.

피타제는 식물, 동물 및, 특히 미생물 등 다양한 유기체에 의해 제조된다. 이들 피타제들은 매우 상이한 생화학적 특성, 특히 pH 함수로서의 활성 및 온도 안 정성을 갖는다. 또한 이들 효소들은 (a) 모든 인산염을 가수분해시킬 수 있는지 여부, (b) 입체 특이성 및 (c) 인산 이노시톨에 대한 친화성에 있어서 상이한 특성을 나타낸다.

피타제 생성 미생물 중 특히 아스퍼질러스(Aspergillus)속, 페니실리움(Penicillium)속, 뮤코(Mucor)속 및 리조푸스(Rhizopus)속의 진균을 들 수 있으며, 박테리아로서 슈도모나스(Pseudomonas sp.), 클레브시엘라(Klebsiella sp.), 대장균(Escherichia coli), 엔테로박터(Enterobacter sp.), 바실러스 서브스틸리스(Bacillus subtilis)를 들 수 있고, 효모로서 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 토룰롭시스 칸디다(Torulopsis candida), 데바리오마이세스 카스텔리(Debaryomyces castellii), 데바리오마이세스 오시덴탈리스(Debaryomyces occidentalis; 동종 이명; 쉬반니오마이세스 카스텔리(Schwanniomyces castellii) ), 클루이베로마이세스 프라질리스(Kluyveromyces fragilis) 등을 들 수 있다.

수많은 미생물 피타제들이 연구된 바 있으며, 다양한 농업 산업부분에서 응용되었다. 이들 효소들의 사료내 그리고 동물 소화에 있어서의 효율성은 사료 제조 단계에서, 소화관에서 마주치게 되는 다양한 조건에 관계없이 그 효과를 유지할 수 있는 능력에 의존한다. 사료 제제는 예를 들면 가금의 소낭(crop), 위, 십이지장, 공장, 및 회장 부분을 통과하는 동안의 pH 5.02, 2.75, 6.28, 6.63 및 5.98의 다양한 범위의 pH에서 열안정적인 효소를 필요로 한다.

지금까지 보고된 대부분의 피타제는 단지 부분적으로 피트산을 가수분해하 며, 어떤 경우 매우 느린 키네틱(kinetic)으로 가수분해한다. 따라서, 많은 피타제들이 피트산의 오직 5 인산기, 즉 잠재적인 인의 83%만을 가수분해한다.

지금까지, 효모 중에서, 단지 효모 쉬반니오마이세스 오시덴탈리스 만이 피트산염의 모든 인산기를 가수분해시키는 것으로 보고되었다(EP 0 699 762 및 Segueilha L., Lambrechts C, Boze H., Moulin G., Galzy P., (1992) Purification and properties of a phytase from Schwanniomyces castelliii, J. Ferm. Bioeng., 74, 7-11).

그러나 실험 조건하에서, 피트산염 또는 피트산의 완전한 가수분해는 수득된 바 없다.

보다 효과적인 피트산 가수분해를 얻기 위하여 다양한 피타제를 결합하는 것이 제안되었다.

WO 98/30681은 다양한 입체특이성을 갖는 피타제 조합, 특히 3-피타제와 6-피타제의 조합을 개시하였다. 이 문헌은 특히 페니포라 리시 ( Peniophora lycii ) 6-피타제와 아스퍼질러스 나이거 ( Aspergillus niger ) 3-피타제(피타제 Novo^TM)의 조합을 개시하였다.

US 6,183,740호 역시 다양한 특이성의 피타제들의 조합 및 다른 산 포스파타제와의 조합을 개시하였다.

그러나, 피트산이 인산 및 이노시톨로 완전히 가수분해되는 것은 관찰되지 않았다.

본 발명은 다양한 농업 산업분야에서의 응용에 있어 피트산의 완전한 가수분해를 달성하기 위하여 피트산의 가수분해 속도 및 효율성을 개선하기 위함이다.

이러한 과제는 최소한 두개의 특이적 피타제를 조합하는 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 해결된다. 유용하게도, 본 발명의 조성물은 상승 작용 효과에 의해 피트산의 모든 인산기를 완전히 가수분해시킨다. 또한 본 발명의 조성물은 피타제의 농업에서의 응용, 특히 동물 영양 부분에서의 응용에 적합하게 광범위한 범위의 pH 에서 활성을 나타낸다. 본 발명의 다른 이점은 본 발명에서 사용되는 피타제가 열안정성이라는 것이다.

서열에 대한 설명

서열번호 1: 쉬반니오마이세스 카스텔리(Schwanniomyces castellii) 피타제.

서열번호 2: 데바리오마이세스 카스텔리(Debaryomyces castellii) 피타제.

서열번호 3: 아스퍼질러스 나이거 ( Aspergillus niger ) 피타제.

서열번호 4: 페니실리움 푸니쿨로섬 ( Penicillium funiculosum ) 피타제.

서열번호 5: 페니포라 리시 ( Peniophora lycii ) 피타제.

서열번호 6: 밀 피타제(wheat phytase) 코딩 서열.

서열번호 7: 밀(Triticum aestivum) 피타제.

발명에 대한 설명

본 발명은 피트산(미오-이노시톨 1,2,3,4,5,6-헥사키스포스페이트)의 가수분해를 위한 두 개 이상의 피타제를 조합한 조성물로서,

a) 서열번호: 1의 피타제 또는 서열번호: 2의 피타제와 80% 이상의 동일성을 나타내는 제1 피타제;

b) 서열번호: 3의 피타제와 80% 이상의 동일성을 나타내는 제2 피타제;를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 제1 피타제는 피트산의 6개 인산 결합의 가수분해를 촉매하는 3-피타제이다.

바람직하게, 상기 제1 피타제는 55℃ 내지 80℃의 적정 온도 및 pH 3.5 내지 5의 적정 pH를 가진다.

바람직한 일 실시형태에서, 상기 제1 피타제는 효모 쉬반니오마이세스 카스텔리(Schwanniomyces castellii) 피타제 또는 효모 데바리오마이세스 카스텔리(Debaryomyces castellii) 피타제이다.

또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 제1 피타제는 서열번호: 1의 피타제 또는 서열번호: 2의 피타제이다.

바람직하게, 상기 제2 피타제는 피트산의 최소한 5개 인산 결합의 가수분해를 촉매하는 3-피타제이다.

바람직하게, 상기 제2 피타제는 50℃ 내지 60℃의 적정 온도 및 pH 2 내지 6의 적정 pH를 갖는다.

바람직한 일 실시형태에서, 상기 제2 피타제는 아스퍼질러스 나이거( Aspergillus niger ) 피타제이다.

다른 바람직한 실시형태에서, 상기 제2 피타제는 서열번호: 3의 피타제이다.

바람직하게 본 발명에 따른 조성물은 동물용 영양 첨가제 또는 동물 사료를 구성한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 조성물을 동물용 영양 첨가제 또는 동물 사료의 제조에 사용하는 방법(용도)에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 조성물을 피트산 인(phytic phosphorus)의 생체이용율 및 동물 사료의 소화성을 개선시키기 위해 사용하는 방법(용도)에 관한 것이다.

본 발명은 또한 피트산(미오-이노시톨 1,2,3,4,5,6-헥사키스포스페이트)을 무기 모노인산, 저인산화도의 미오-이노시톨 및 자유 미노이노시톨로 가수분해시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은

- 서열번호: 1의 피타제 또는 서열번호: 2의 피타제와 80% 이상의 동일성을 나타내는 제1 피타제를 공급하는 단계;

- 서열번호: 3의 피타제와 80% 이상의 동일성을 나타내는 제2 피타제를 공급하는 단계; 및

- 피트산을 동시에 상기 제1 피타제 및 제2 피타제에 접촉시키는 단계;를 포함한다.

바람직하게, 상기 제1 피타제는 55℃ 내지 80℃의 적정 온도, pH 3.5 내지 5의 적정 pH를 갖는다.

바람직한 일 실시형태에서, 상기 제1 피타제는 효모 쉬반니오마이세스 카스텔리(Schwanniomyces castellii)의 피타제 또는 효모 데바리오마이세스 카스텔리(Debaryomyces castellii)의 피타제이다.

더욱 바람직한 실시형태에서, 상기 제1 피타제는 서열번호: 1의 피타제 또는 서열번호: 2의 피타제이다.

바람직하게, 상기 제2 피타제는 50℃ 내지 60℃의 적정온도, pH 2 내지 6의 적정 pH를 갖는다.

더욱 바람직한 실시형태에서, 상기 제2 피타제는 서열번호: 3의 피타제이다.

본 발명은 또한 동물 급식용 키트 또는 어셈블리를 제공하며, 이는

- 서열번호: 1의 쉬반니오마이세스 카스텔리(Schwanniomyces castellii) 피타제 또는 서열번호: 2의 데바리오마이세스 카스텔리(Debaryomyces castellii) 피타제;

- 서열번호: 3의 아스퍼질러스 나이거 ( Aspergillus niger ) 피타제를 포함한다.

본 발명에 따른 조성물은 서열번호: 1의 피타제와 80% 이상의 동일성 또는 서열번호: 2의 피타제와 80% 이상의 동일성을 나타내는 제1 피타제; 및 서열번호: 3의 피타제와 80% 이상의 동일성을 나타내는 제2 피타제를 조합한 것이다.

놀랍게도, 이러한 피타제들의 특징적인 조합에 의해 피트산의 가수분해에 있어 상승 작용 효과(synergic effect)를 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 광범위한 pH 범위에서 피트산이 신속하고 완전한 가수분해되도록 촉매한다.

본 발명에서 "피타제"는 미오-이노시톨 헥사키스포스페이트 포스포하이드로라제 (EC 3.1.3.8 및 3.1.3.26)를 지칭한다. 이들 효소는 미오-이노시톨 1,2,3,4,5,6-헥사키스포스페이트(피트산, InsP₆)을 무기 모노인산(inorganic monophosphate), 저인산화도 인산 미오-이노시톨(InsP₅ 내지InsP₁), 및 어떤 피타제에 대해서는 자유 미오-이노시톨(free myo-inositol)로 가수분해되는 것을 촉매한다.

본 발명에 따른 조성물은 서열번호: 1의 피타제 또는 서열번호: 2의 피타제와 80% 이상의 동일성을 나타내는 제1 피타제를 포함한다.

상기 서열번호: 1의 피타제는 효모 쉬반니오마이세스 카스텔리(Schwanniomyces castellii)의 피타제이고, 서열번호: 2의 피타제는 효모 데바리오마이세스 카스텔리(Debaryomyces castellii)의 피타제이다.

이들 피타제들은 매우 유사한 촉매 성질을 가지며 따라서 본 발명에 따른 피타제 조합에 있어 상호 호환적이다.

바람직하게, 상기 제1 피타제는 서열번호: 1의 피타제와 최소한 80%, 90%, 95%, 98%, 및 바람직하게는 최소한 99%의 동일한 아미노산을 나타내며, 서열번호: 2의 피타제와 최소한 80%, 90%, 95%, 98%, 및 바람직하게는 최소한 99%의 동일한 아미노산을 나타낸다.

바람직하게, 상기 제1 피타제는 서열번호: 1의 피타제 및 서열번호: 2의 피타제와 동일한 성질, 특히 동일한 촉매 성질을 갖는다. 바람직하게 상기 제1 피타제는 쉬반니오마이세스 카스텔리 또는 데바리오마이세스 카스텔리의 다른 균주 또는 다른 효모에서 분리된다. 또는, 제1 피타제는 예를 들어 지정부위 돌연변이(site-directed mutagenesis) 기술에 의해 수득될 수 있다.

본 발명에서 "동일한 아미노산들"이란 두 서열 간에 변경되지 않는 아미노산들을 의미한다. 제1 피타제는 서열번호: 1 또는 서열번호: 2의 피타제와 비교시 최소한 하나의 아미노산이 결실, 부가 또는 치환된 것이다.

서열번호: 1 또는 서열번호: 2의 피타제는 공통의 촉매 성질을 갖는다. 본 발명에 따른 조성물 및 방법에 사용되는 제1 피타제는 서열번호: 1 또는 서열번호: 2의 피타제와 동일성을 나타내며, 공통의 촉매 성질을 보유한다.

바람직하게, 상기 제1 피타제는 3-피타제 활성을 갖는다. 바람직하게 상기 제1 피타제는 피트산의 6개의 인산결합의 가수분해를 촉매한다.

3-피타제(EC 3.1.3.8)은 제일 먼저 3-위치의 인산을 가수분해한다.

피트산의 모든 인산 결합(1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 및 6-위치)을 가수분해할 수 있는 피타제는 미오-이노시톨 1,2,3,4,5,6-헥사키스포스페이트(피트산, InsP₆)을 무기 모노인산 및 자유 미오-이노시톨로의 가수분해를 촉매한다.

많은 피타제는 피트산의 오직 5개의 인산결합, 즉 잠재적인 인의 83% 만을 가수분해한다. 이들 효소들은 피트산을 미오-이노시톨인산으로 가수분해하나, 자유 미오-이노시톨로는 가수분해시킬 수 없다.

본 발명에서 "피타제 활성"은 피타제의 효소 활성을 지칭한다. 이 활성은 단백질 밀리그램 당 국제 단위(I.U)로 표시된다. 1 I.U 효소 활성은 주어진 pH 및 온도에서, 단위 시간당 1 마이크로몰의 기질을 전환시키는 촉매 능력을 말한다.

바람직하게, 제1 피타제는 55℃ 내지 80℃의 적정 온도 및 pH 3.5 내지 5의 적정 pH를 가진다.

바람직한 일 실시형태에서, 상기 제1 피타제는 효모 쉬반니오마이세스 카스텔리(Schwanniomyces castellii)의 피타제 또는 효모 데바리오마이세스 카스텔 리(Debaryomyces castellii)의 피타제이다.

본 발명에 따른 조성물은 서열번호: 3의 피타제와 80% 이상의 동일성을 나타내는 최소한 하나의 제2 피타제를 포함한다.

서열번호: 3의 피타제는 사상균 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)의 피타제이다.

바람직하게, 상기 제2 피타제는 서열번호: 3의 피타제와 최소한 80%, 90%, 95%, 98%, 및 바람직하게는 최소한 99%의 동일한 아미노산을 나타낸다.

바람직하게 제2 피타제는 서열번호: 3의 피타제와 동일한 성질, 특히 동일한 촉매 성질을 갖는다. 바람직하게 이 피타제는 아스퍼질러스 나이거의 다른 균주 또는 다른 사상균에서 분리된다. 또는, 이 피타제는 예를 들어 지정부위 돌연변이(site-directed mutagenesis) 기술에 의해 수득될 수 있다.

본 발명에서 "동일한 아미노산들"이란 두 서열 간에 변경되지 않는 아미노산을 의미한다. 제2 피타제는 서열번호: 3의 피타제와 비교시 최소한 하나의 아미노산이 결실, 부가 또는 치환된 것이다.

본 발명에 따른 조성물 및 방법에 사용되는 제2 피타제는 서열번호: 3의 피타제와 동일성을 나타내며, 이의 촉매 성질을 보유한다.

바람직하게, 상기 제2 피타제는 피트산의 최소한 5개의 인산 결합의 가수분해를 촉매하는 3-피타제이다.

바람직하게, 상기 제2 피타제는 50℃ 내지 60℃의 적정 온도 및 pH 2 내지 6의 적정 pH를 갖는다. 보다 바람직하게, 제2 피타제는 pH 2.5 내지 3.5의 제1 적정 pH 및 pH 4.5 내지 5.5의 제2 적정 pH 를 갖는다.

유용한 실시형태에서, 상기 제2 피타제는 서열번호: 3의 피타제이다.

피타제의 효소 활성은 특히 pH의 함수로 변화된다. 따라서 피타제는 그 효소 활성이 높거나 적정한 pH 범위(또는 구간)을 갖는다. 상기 "범위"란 주어진 pH 구간 또는 간격을 의미한다. 두개의 피타제가 상이한 pH 범위에서 활성을 가질 때, 이들 피타제는 상보적(complementary) pH 범위에서 효소 활성을 갖는다. 바람직하게 이들 구간은 중첩되거나 부분적으로 겹친다. 통상 피타제는 산성 pH에서 더 높은 효소 활성을 갖는다. 따라서, 상보적 pH 범위를 갖는 두개의 피타제는 예를 들면 제1 피타제는 pH 2 내지 4에서 최대 효소 활성을 갖고, 제2 피타제는 pH 4 내지 6 에서 최대 효소 활성을 갖는다. 본 발명의 조성물 및 방법에서, 제1 및 제2 피타제는 바람직하게는 상보적 pH 범위 또는 상보적 적정 pH를 갖는다. 본 발명에 따른 조성물 및 방법은 따라서 광범위한 pH 범위에서 피트산의 가수분해가 가능하다.

폴리펩티드간 동일성의 정도를 측정하고 동정하는 방법은 본 기술분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어 정렬 프로그램 AlignX (Clustal W algorithm)인 Vector NTi　9.1.0(Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com)를 사용할 수 있다. 바람직하게 디폴트 파라미터가 사용된다.

본 발명에 따른 조성물 및 방법의 피타제는 천연 환경으로부터 분리 또는 정제된다. 상기 피타제는 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 상기 제조 방법으로는 특히 천연적으로 이들 피타제를 발현하는 세포와 같은 천연 공급원에서의 정제, 적합한 숙주 세포에 의한 재조합 피타제의 제조 및 이들의 후속 정제, 화학적 합성에 의한 제조 또는, 최종적으로 이들 다양한 접근의 조합이다. 이러한 다양한 제조 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 따라서 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용되는 피타제는 쉬반 니오마이세스 카스텔리, 데바리오마이세스 카스텔리 또는 아스퍼질러스 나이거에서 분리할 수 있다. 다른 실시 형태에서 본 발명의 피타제는 본 발명에 따른 피타제를 발현하는 재조합 숙주 유기체에서 분리할 수 있다.

바람직하게 본 발명에 따른 조성물은 동물용 영양 첨가제 또는 동물용 사료를 구성한다.

따라서, 본 발명은 피타제 활성을 공급하는 사료 첨가제에 관한 것이다. 이러한 형태의 효소 활성의 공급에 의해 사료의 소화성 및 그 영양학적 가치를 개선시킬 수 있다.

본 발명에서, "영양 첨가제"는 사료(feed)의 소화성 또는 영양학적 특성을 개선하기 위하여, 의도적으로 사료에 소량으로 첨가하는 물질을 지칭한다. 동물을 위한 영양 첨가제는 예를 들면, 비타민, 미네랄염, 아미노산 및 효소 등을 포함한다.

본 발명은 또한 동물 사료에 관한 것이다. 이들 사료는 통상 본 발명에 따른 첨가제가 포함되어 있는 식사, 또는 과립의 형태이다. 본 발명에서 "사료"는 동물을 위해 음식으로 제공되는 모든 것을 의미한다. 동물 번식 증강용(intensive rearing of animal)으로 사용하기 위해서, 동물 사료는 보통 영양 기초사료 및 영양 첨가제를 포함한다. 본 발명에서 "영양 기초 사료"는 동물 사료의 대부분을 구성하는 것들을 의미하며, 예로서 곡류, 단백질, 및 동물 및/또는 식물 기원의 지방 혼합물로 이루어져 있다.

동물용 영양 기초사료는 이들 동물의 식사에 적합하며 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 보통 이들 영양 기초 사료는 예를 들면, 옥수수, 밀, 완두콩 및 콩 등을 포함한다. 이들 영양 기초사료는 의도되는 다양한 동물 종의 필요를 충족시킨다. 이러한 동물 기초사료는 이미 비타민, 미네랄염 및 아미노산과 같은 영양 첨가제들을 포함한 것일 수 있다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명은 단위(monogastric) 동물용, 특히 가금 및 돼지용 사료에 관한 것이다. 가금은 특히 암탉, 식육(meat)용 닭, 칠면조 및 오리를 포함한다. 돼지는 특히 육성 비육기의 돼지나 새끼돼지를 포함한다.

본 발명에 따른 조성물 및 방법은 쉬반니오마이세스 카스텔리 피타제 및 데바리오마이세스 카스텔리 피타제에서 선택되는, 피트산의 모든 인산 결합을 가수분해할 수 있는 제1 피타제와 상기 제1 피타제의 pH 범위와 상보적인 pH 범위에서 효소 활성을 가지며, 피트산의 최소한 5개의 인산 결합을 가수분해할 수 있는 제2 피타제를 조합한 것이다.

도 1A 및 도 1B는 각각 단독 또는 쌍으로 조합한 6개의 피타제에 대해 다양한 pH에서 피트산의 가수분해 키네틱을 비교하여 도시한 것으로서, 그 결과는 방출 된 이론적 인산의 %로 표시되었다.

도 2A 및 도 2B는 반응 후 120분 동안의 다양한 피타제에 의한 피트산 가수분해 퍼센트를 도시한 것으로, 도 2A는 피타제 단독, 도 2B는 피타제 조합을 나타낸 것이며, 점선은 5 인산 결합의 가수분해에 해당한다.

도 3A 및 도 3B는 다양한 pH에서 6개의 피타제에 대해 피트산 가수분해의 초기 속도(μmol.ml-1.min-1)을 비교한 것으로, 도 3A는 피타제 단독, 도 3B는 피타제 조합을 나타낸 것이며, 이들 속도는 반응 처음 10분 동안에 산출된다.

물질 및 방법

1. 피타제 기원

- "아스퍼질러스 나이거 나토푸스(Aspergillus niger Natuphos; AN):

배치 R2503 또는 배치 057NPHO2,

Wim van Hartingsveldt, Cora M. J. van Zeijl, G. Marian Harteveld, Robin J. Gouka, Marjon E. G. Suykerbuyk, Ruud G. M. Luiten, Peter A. van Paridon, Gerard C. M. Selten, Annemarie E. Veenstra, Robert F. M. van Gorcom and Cees A. M. J. J van den Hondel; Cloning, characterization and overexpression of ihe phytase-encoding gene (phyA) of Aspergillus niger. Gene, 127, (1) 87-94 (1993).

- 페니포라 리시(Peniophora lycii; PL):

배치 172NHSO2,

Lassen.S.F., Breinholt.J., Ostergaard.P.R., Brugger,R.,Bischoff,A., Wyss.M. and Fuglsang.C.C; Expression, gene cloning, and characterization of five novel phytases from four basidiomycete fungi: Peniophora lycii, Agrocybe pediades, a Ceriporia sp., and Trametes pubescens. Appl. Environ. Microbiol. 67 (10), 4701-4707 (2001).

- 페니실리움 푸니쿨로섬(Penicillium funiculosum; PF):

Godo A1346 배치1301, WO 03054199.

- 밀(B) :

시그마 참조번호 P 1259, WO 0183763.

- 쉬반니오마이세스 카스텔리(Schwanniomyces castellii; SC):

칸디디 보이디니(Candida boidinii) 배치 10059 CN 25에서 생산, EP 0931837

- 데바리오마이세스 카스텔리(Debaryomyces castellii) 균주 CBS 2923 (DC).

2. 효소적 방법

시간에 따른 무기 인산의 방출을 추적하여 피타제 활성을 측정하였다.

상기 활성은 200 mM 소듐 아세테이트 버퍼, pH 5.5에 용해된 8 mM의 피트산소듐(시그마)의 존재하에(5 용적), 37℃에서 측정하였다. 효소 추출물(1 용적)을 가하여 반응을 촉발시켰다. 20% 트리클로로아세트산(1 용적의 반응 매질+1 용적의 산)으로 매질를 산성화하여 반응을 중지하였다. 인큐베이션 시간을 다양하게 한 후, 방출된 인산 량을 측정하였다.

1 효소 단위(U)는 1분 내 무기 인산 1 μM을 방출시키는 효소량으로 정의된다.

3. 다양한 pH 에서 피트산염의 가수분해를 위한 조건

가수분해는 0.340 mM 피트산소듐, 0.04 또는 0.08 U/mL의 피타제를 함유하는 pH 4 내지 6.5의 250 mM 아세테이트 버퍼 또는 pH 3의 200 mM 글리신 버퍼 10 ml에서 40℃에서 수행되었다. 120분간 다양한 시간대에 샘플을 채취하였다. 트리클로로아세트산을 가하여 반응을 중지시켰다. 인산은 희석없이 바로 분석되었다.

4. 인산 분석

방출된 인산 량은 비색계로 가시화되었다. 가시화 용액은 즉시 조재하며, 황산 철(380 mM, 1 용적) 및 헵타몰리브산암모늄(12 mM, 4 용적)을 함유하였다. 주위 온도에서 30분간 가시화한 후, UV/visible 분광분석기(Beckman DU 530)를 사용하여 700nm에서 흡광도를 측정하였다(반응 매질 1 용적+ 가시화 용액 1 용적).

미리 포타슘디하이드로겐포스페이트를 사용하여 검정 곡선(calibration line)을 수립하였다.

결과

1. 테스트된 피타제

테스트된 피타제는 다양한 기준에 따라 서로 상이하다: (1) 생화학적 특성(적정 pH, 입체특이성: 3, 4, 또는 6 피타제), (2) 가수분해되는 인산 결합의 수.

이 모든 피타제는 5에 가까운 적정 가수분해 pH를 가진다; 그러나, AN과 PL 피타제는 pH 2.5에서 제2 적정 pH를 갖는다. 세 피타제는 모든 인산을 완전히 가수분해 시켰다(SC, DC, 밀). 제일 먼저 가수분해된 위치는 3-위치(AN, PL, DC) 또는 6-위치(PL) 또는 4-위치(밀)이었다(표 1 참조).

[표 1]

피타제의 생화학적 특성 비교

기원	Km(μM)	적정 pH	적정 온도(℃)	가수분해된 인산 결합의 수	입체 특이성 (인산결합의 가수분해 순서)
아스퍼질러스 나이거 ⁽¹⁾	40/27	2.5-5.5	55/58	5	3/4/5/6/1
페니포라리시 ⁽¹⁾	33	2.5-5.5	58	5	6/3(pH 5.5) 3.6(pH 3 및 5.5)
페니실리움 푸니쿨로섬 ⁽²⁾	550	4-5	50	5 또는 6	3/4
밀 ⁽³⁾	22	5-7	55	6	4/3/5/6/1/2
쉬반니오마이 세스 카스텔리 ⁽⁴⁾	38	4.4	77	6	?
데바리오마에세스 카스텔리	236	4-4.5	60	6	3/4/5/6/1-2

(1)Ullah, A. H. J and Sethumadhavan, K., (2003) PhyA gene product of Aspergillus flcuum and Peniophora lycii produces dissimilar phytases. Biochemical and Biophysical Research Communications 303 : 463-468.

(2) 2003년 6월 13일 출원된 WO 03054199, Bohlmann, R., Moussu, F., Nore, O., Pierrard, J., Saunier, D., Testeniere, O., New polynucleotide encoding fungal phytase, useful as feed additive to improve phosphate assimilation, also new strain of Penicillium.

(3) Nakano, T., Joh, T., Narita, K., Hayakawa, T. (2000) The pathway of dephosphorylation of myo-Inositol Hexakisphosphate by Phytases from Wheat Bran of Tricicum aestivum L. cv Nourin#61. Biosci. Biotechnol. Biochem., 64:995-1003.

(4) Segueilha, L., Lambrechts, C, Boze, H., Moulin, G. 및 Galzy, P. (1992) Purification and Properties of the Phytase from Schwanniomyces casteliii. J. Ferment. Bioeng. 74(1): 7-11.

2. 다양한 pH 에서 6 피타제에 의한 피트산 가수분해의 효과 비교

본 연구는 0.340 mM의 피트산염의 존재하에서 수행되었다. 도입된 효소양은 pH 5.5 표준 조건하에서 측정된 0.08 U/mL의 피타제에 해당한다. 테스트된 pH 값은 3, 4, 5.5, 6, 6.5이었다. 상기 반응은 120분간 추적되었다. 샘플을 시간에 따라 채취하고, 산성화에 의해 반응을 중지시키고, 인산은 비색계로 측정하였다.

다양한 피타제는 그 가수분해 효율의 함수로, 즉 이론적 퍼센트에 대한 방출 인산 퍼센트에 의해 비교되었다. 그 결과를 도 1A에 도시하였다.

문헌에 따르면, 4 피타제(PF, SC, DC, B)는 피트산을 이노시톨 및 인산으로 완전히 가수분해시킬 수 있고; 2 피타제(AN 및 PL)은 오직 5 결합, 즉 잠재적 인의 83%를 가수분해시킨다.

pH 3 및 pH 4의 시험 조건하에서, 4 피타제 (SC, PF, DC 및 PL)은 피트산의 최소한 80%를 가수분해하였다. 밀 피타제는 pH 3 및 pH 4에서 활성이 매우 낮았다. pH 5.5 이상의 pH 값에서는, 어떤 피타제도 피트산의 70% 이상을 가수분해하지 않았다. PF 및 DC 피타제는 pH 6.5에서 활성이 매우 낮았다. AN 피타제가 pH 변화에 가장 덜 민감하였다; 그러나 이 피타제는 인산의 단지 60 내지 70%만을 방출하였고, 즉 이값은 기대했던 것보다 10 내지 20% 더 낮은 값이었다(도 2A 참조).

인산 방출의 초기 속도를 비교한 결과, 피타제간에 매우 큰 이종성을 나타내었다(도 3A 참조). 산성 pH에서 가장 효과적인 피타제는 쉬반니오마이세스 카스텔리이었으며, A. 나이거는 5.5 이상의 pH 값에서 가장 효과적이었다. 밀 피타제는 테스트된 조건을 불문하고 가장 효과가 낮았다.

3. 조합 피타제의 존재하 인산 방출 속도에 대한 pH 의 영향

피트산 가수분해 효율을 개선하기 위하여, 두 피타제의 몇가지 조합을 테스트하였다. 각 피타제는 0.04 U/ml로 즉 반응 튜브내 전체 0.08 U/ml 도입하였다. 6 인산 결합을 가수분해하는 DC 피타제는 5 또는 6 인산결합을 가수분해하는 다른 피타제와 조합하여 체계적으로 테스트하였다. 두 다른 조합, 먼저 6 및 5 인산을 방출할 수 있는 다른 조합(SC/AN) 및 두번째로 매우 유사한 생화학적 특성을 갖는 두 피타제, PL/AN 조합이 비교에 사용되었다(도 1B).

전체적인 분석 결과 2 피타제의 조합은 대부분 피트산 가수분해의 효율을 증진하는 것으로 나타냈다. 그러나 동일 조건하에서, 어떤 피타제도 피트산을 완전히 가수분해하지 않았고, 2 혼합물(DC/AN 및 SC/AN)은 어떤 pH에서든 인산결합의 100% 내지 85%를 가수분해하였다. DC/PL 조합은 산성 pH들에서 약 20%의 활성 증가가 관찰되었다. PL/AN, DC/PF 및 DC/SC 조합은 거의 효율이 개선되지 않았다(도 2B).

초기 가수분해 속도 비교 결과, SC/AN 조합 및 DC/AN 조합은 피타제 단독 및 다른 피타제 조합에 비교하여 강한 상승 작용 효과가 존재함을 확인할 수 있었다. 가수분해 속도에서 pH-관련 상이성은 조합이 사용되는 경우 최소화된다. 다른 조합은 덜 효율적이었으며, 상승 효과도 특정 pH 범위에서만, 예를 들면 DC/PL의 경우 pH 및 4에서만 관찰되었다(도 3).

이러한 상승 효과는 대부분 모든 인산을 가수분해하는 피타제 능력에 기인된 것으로 보였다. 또한 가장 좋은 결합은 활성에 관해 상보적 적정 pH(2.5-4.5)를 갖는 피타제들과 관련되었다. 그러나 밀 피타제 및 페니실리움 푸니쿨로섬 피타제와 같이 가수분해 효율에 있어서 가장 효율이 낮은 피타제의 경우, 상승 효과도 거의 없었음이 주목되었다.

4. 피트산 가수분해 효율에 대한 피타제의 농도 및 비율의 영향

피트산 가수분해에 대해 피타제 량(용량 효과) 및 피타제 혼합물의 비율이 미치는 영향을 비교하였다. 세 조합, DC/AN, DC/PL 및 AN/PL이 사용되었으며, 2 피타제 농도(0.04 및 0.08 U/mL)이 테스트되었다(표 2 및 3).

[표 2]

다양한 조합에 대하여 두 최종 농도, 0.04 및 0.08 U/ml에서 테스트된 피트산 가수분해 퍼센트 비교. 처음 세 칼럼은 세 피타제를 단독으로 농도 0.08 U/ml에서 얻은 값이다.

	AN (0.08U)	DC (0.08U)	PL (0.08U)	AN/DC (0.08U)	AN/DC (0.04U)	PL/DC (0.08U)	PL/DC (0.04U)	AN/PL (0.08U)	AN/PL (0.04U)
pH 3	66	82	80	92	67 (73%)	94	70 (74%)	79	56 (72%)
pH 4	69	85	83	95	96 (101%)	100	93 (94%)	86	76 (89%)
pH 5.5	55	63	67	92	81 (87%)	85	71 (84%)	70	66 (94%)
pH 6	72	42	64	94	78 (83%)	85	47 (56%)	74	67 (90%)
pH 6.5	63	6	34	75	42 (56%)	35	10 (30%)	61	52 (86%)

괄호내 값은 농도 0.08 U/ml에서 얻은 값에 대한 농도 0.04 U/ml에서 얻은 값의 비율을 나타낸 것이다.

효소 혼합물(전체 농도 0.08 U/ml)로 시행한 가수분해 퍼센트는 효소 단독(0.08 U/ml)으로 시행한 가수분해 퍼센트보다 더 높았으며, AN/DC 및 PL/DC 혼합물의 경우 pH 3 내지 6에서 거의 100% 가까운 값을 나타내었다. AN/PL 혼합물의 경우 각 피타제 각각에 대해 수득된 값에 비해 가수분해 퍼센트가 실질적으로 증가하지 않았다. 전체량을 2배로 감소시킨 경우(0.04 U/ml), 방출된 인산 양의 1/2 감소를 유도하지 않았다. 어떤 경우, AN/DC 및 PL/DC은 pH 4 및 pH 5.5에서, 그리고 AN/PL은 pH 4 내지 6에서 0.08 U/ml 존재하 측정된 값과 동등한 가수분해 퍼센트를 나타내었다(표 3).

[표 3]

다양한 조합에 대하여 두 최종 농도 0.04 및 0.08 U/ml에서 테스트된 피트산 가수분해의 초기 속도 비교. 처음 세 칼럼은 세 피타제를 단독으로 농도 0.08 U/ml에서 얻은 값이다.

	AN (0.08U)	DC (0.08U)	PL (0.08U)	AN/DC (0.08U)	AN/DC (0.04U)	PL/DC (0.08U)	PL/DC (0.04U)	AN/PL (0.08U)	AN/PL (0.04U)
pH 3	2.04	1.78	2.52	4.00	1.70 (42%)	3.88	1.45 (37%)	2.18	1.60 (73%)
pH 4	4.98	3.96	5.36	6.49	2.85 (44%)	8.61	3.33 (39%)	4.29	2.73 (63%)
pH 5.5	7.76	1.56	4.00	7.26	1.86 (26%)	3.79	0.85 (22%)	4.56	2.82 (62%)
pH 6	7.91	0.39	2.87	7.53	1.04 (14%)	2.10	0.04 (2%)	3.96	2.60 (66%)
pH 6.5	5.09	0.00	0.85	3.71	0.26 (7%)	0.22	0.00 (0%)	1.89	0.74 (39%)

괄호내 값은 농도 0.08 U/ml에서 얻은 속도에 대한 농도 0.04 U/ml에서 얻은 속도의 비율을 나타낸 것이다.

따라서, 피타제 조합에 의해 광범위한 pH 범위에서 동일한 가수분해 효율을 유지하면서, 반응 매질내 피타제 양을 2배 감소시킬 수 있었다. 이는 인산 방출에 있어서 명백한 용량 효과를 보여준다.

한편, 피트산 가수분해의 초기 속도는 피타제가 0.04 U/ml의 농도로 존재하는 경우, 0.08 U/ml의 농도로 존재하는 것에 비하여 최소한 두배 더 낮다(표 3). 이러한 결과는 피타제간의 상승 작용 효과에 의해 존재하는 인산의 완전한 가수분해가 이루어진다는 가설을 지지한다.

반응 매질내 각 피타제 비율은 가수분해 효율에 그다지 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다(표 4). 모든 경우에서, 방출된 인산양의 증가가 관찰되었으며, 주로 5.5 이상의 pH에서는 각 피타제 50%를 포함하는 조합이 약간 더 유리한 것으로 관찰되었다.

[표 4]

혼합물 내 각 피타제 비율에 따른 피트산 가수분해 퍼센트 비교. 모든 경우, 전체양은 0.08 U/ml로 존재한다.

피타제 비율	AN	DC	AN/DC (1/1)	AN/DC (1/2)	AN/DC (2/1)
pH 3	66	82	92	90	88
pH 4	69	85	95	93	93
pH 5.5	55	63	92	79	79
pH 6	72	42	94	87	86
pH 6.5	63	6	75	52	64

문헌에는, 실험에 사용된 피타제 중 4개는 모든 인산을 방출할 수 있는 것으로 기재되어 있으나, 실험 조건하에서 어떤 피타제도 피트산을 이노시톨 및 인산으로 완전히 가수분해하지 않았다. 4 피타제, SC, PF, DC 및 PL은 pH 3 및 4에서 인산 결합의 80%를 가수분해하였다. 두 혼합물, DC/AN 및 SC/AN은 테스트된 모든 pH에서 인산 결합의 80% 내지 100%를 가수분행하였다.

3-피타제(AN, DC, PF), 4-피타제 (B) 또는 6-phytase (PL)의 서로 간의 조합은 어떠한 주목할 만한 개선도 나타나지 않았다.

피타제간의 보완 및 상승작용 효과는 각 피타제에 특이적인 2 기준에 의존하는 것으로 보인다: (1) pH 함수로서의 활성 프로파일, (2) 모든 인산을 가수분해할 수 있는지 여부.

동물 영양에서 이러한 조합의 사용은 사용되는 피타제양을 최소한 20% 경감시킬 수 있으며, 따라서 제조 경비를 감소시킬 수 있다. 사료내 피트산 기원의 인산 함량 또한 증가하여, 사료 가치를 개선하고, 따라서 무기 인산의 투여를 줄일 수 있다. 따라서 사용되지 않은 인산에 의해 유발되는 오염도 감소시킬 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> ADISSEO FRANCE S.A.S. <120> SYNERGISTIC EFFECT OF THE COMBINATION OF PHYTASES ON HYDROLYSIS OF PHYTIC ACID <130> IP20081063 <150> FR05.07335 <151> 2005-07-08 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 461 <212> PRT <213> Schwanniomyces castellii (Debaryomyces occidentalis) <400> 1 Met Val Ser Ile Ser Lys Leu Ile Asn Asn Gly Leu Leu Leu Ala Gly 1 5 10 15 Gln Ser Val Tyr Gln Asp Leu Ala Thr Pro Gln Gln Ser Ser Val Glu 20 25 30 Gln Tyr Asn Ile Ile Arg Phe Leu Gly Gly Ser Gly Pro Tyr Ile Gln 35 40 45 Arg Ser Gly Tyr Gly Ile Ser Thr Asp Ile Pro Asp Gln Cys Thr Ile 50 55 60 Lys Gln Val Gln Leu Met Ser Arg His Gly Glu Arg Tyr Pro Ser Lys 65 70 75 80 Asn Ser Gly Lys Lys Leu Lys Thr Ile Tyr Gly Lys Leu Lys Ser Tyr 85 90 95 Asn Gly Thr Phe Thr Gly Ser Leu Ala Phe Leu Asn Asp Tyr Glu Tyr 100 105 110 Phe Val Pro Asp Asp Ser Leu Tyr Glu Lys Glu Thr Ser Ala Leu Asn 115 120 125 Ser Gln Gly Leu Phe Ala Gly Thr Thr Asp Ala Leu Arg His Gly Ala 130 135 140 Ala Phe Arg Ala Lys Tyr Gly Ser Leu Tyr Lys Gln Asn Ser Thr Leu 145 150 155 160 Pro Val Phe Thr Ser Asn Ser Asn Arg Val Tyr Gln Thr Ser Glu Tyr 165 170 175 Phe Ala Arg Gly Phe Leu Gly Asp Glu Phe Ser Asp Ala Thr Val His 180 185 190 Phe Ala Ile Ile Asp Glu Asp Pro Lys Met Gly Val Asn Ser Leu Thr 195 200 205 Pro Arg Ala Ala Cys Asp Asn Tyr Asn Glu Asp Val Asn Asp Gly Ile 210 215 220 Val Asn Gln Tyr Ser Thr Asp Tyr Leu Asp Glu Ala Leu Lys Arg Phe 225 230 235 240 Gln Ser Ser Asn Pro Gly Leu Asn Leu Thr Ser Glu Asp Val Tyr Gln 245 250 255 Leu Phe Ala Tyr Cys Ala Tyr Glu Thr Asn Val Lys Gly Ala Ser Pro 260 265 270 Phe Cys Asp Leu Phe Thr Asn Glu Glu Tyr Ile Gln Tyr Ser Tyr Ser 275 280 285 Val Asp Leu Ser Asn Tyr Tyr Ser His Gly Ala Gly His Asn Leu Thr 290 295 300 Lys Thr Ile Gly Ser Thr Leu Leu Asn Ala Ser Leu Thr Leu Leu Lys 305 310 315 320 Asp Gly Thr Asn Asp Asn Lys Ile Trp Leu Ser Phe Ser His Asp Thr 325 330 335 Asp Leu Glu Ile Phe His Ser Ala Leu Gly Ile Val Glu Pro Ala Glu 340 345 350 Asp Leu Pro Val Asp Tyr Ile Pro Phe Pro Ser Pro Tyr Ile His Ser 355 360 365 Gln Ile Val Pro Gln Gly Ala Arg Ile Tyr Thr Glu Lys Tyr Ser Cys 370 375 380 Gly Asn Glu Thr Tyr Val Arg Tyr Ile Leu Asn Asp Ala Val Val Pro 385 390 395 400 Ile Pro Lys Cys Ser Ser Gly Pro Gly Phe Ser Cys Glu Leu Ser Lys 405 410 415 Phe Glu Glu Tyr Ile Asn Lys Arg Leu Arg Asp Val Asp Phe Val Glu 420 425 430 Gln Cys Asp Leu Lys Asp Ala Pro Thr Glu Val Thr Phe Tyr Trp Asp 435 440 445 Tyr Thr Ser Val Asn Tyr Ser Ala Ser Leu Ile Asn Gly 450 455 460 <210> 2 <211> 461 <212> PRT <213> Debaryomyces castellii <400> 2 Met Val Ser Val Ser Lys Leu Ile Asn Asn Gly Leu Leu Leu Val Gly 1 5 10 15 Gln Gly Ala Tyr Gln Asp Leu Ala Ser Pro Gln Gln Ala Ser Val Glu 20 25 30 Gln Tyr Asn Ile Ile Arg Phe Leu Gly Gly Ala Ala Pro Tyr Ile Gln 35 40 45 Asn Lys Gly Phe Gly Ile Ser Thr Asp Ile Pro Asp Gln Cys Thr Leu 50 55 60 Glu Gln Val Gln Leu Phe Ser Arg His Gly Glu Arg Tyr Pro Ser Thr 65 70 75 80 Gly Ser Gly Lys Lys Tyr Lys Ala Val Tyr Glu Lys Leu Met Ser Tyr 85 90 95 Asn Gly Thr Phe Lys Gly Glu Leu Ala Phe Leu Asn Asp Asp Tyr Glu 100 105 110 Tyr Phe Val Pro Asp Ser Val Tyr Leu Glu Lys Glu Thr Ser Pro Lys 115 120 125 Asn Ser Asp Ser Ile Tyr Ala Gly Thr Thr Asp Ala Met Lys His Gly 130 135 140 Ile Ala Phe Arg Thr Lys Tyr Gly Glu Leu Phe Asp Thr Asn Asp Thr 145 150 155 160 Leu Pro Val Phe Thr Ser Asn Ser Gly Arg Val Tyr Gln Thr Ser Gln 165 170 175 Tyr Phe Ala Arg Gly Phe Met Gly Asp Asp Phe Ser Asn Asp Thr Val 180 185 190 Lys Thr Asn Ile Ile Ser Glu Asp Ala Asp Met Gly Ala Asn Ser Leu 195 200 205 Thr Pro Arg Asp Gly Cys Phe Asn Tyr Asn Glu Asn Ala Asn Thr Ala 210 215 220 Ile Val Asp Glu Tyr Thr Thr Glu Tyr Leu Thr Lys Ala Leu Asn Arg 225 230 235 240 Phe Lys Ala Ser Asn Pro Gly Leu Asn Ile Thr Glu Asp Asp Val Ser 245 250 255 Asn Leu Phe Gly Tyr Cys Ala Tyr Glu Leu Asn Val Lys Gly Ala Ser 260 265 270 Pro Met Cys Asp Ile Phe Thr Asn Glu Glu Phe Ile Gln Tyr Ser Tyr 275 280 285 Ser Val Asp Leu Asp Asp Tyr Tyr Ser Asn Ser Ala Gly Asn Asn Met 290 295 300 Thr Arg Val Ile Gly Ser Thr Leu Leu Asn Ala Ser Leu Glu Leu Leu 305 310 315 320 Asn His Asp Lys Asn Glu Asn Lys Ile Trp Leu Ser Phe Thr His Asp 325 330 335 Thr Asp Ile Glu Ile Phe His Ser Ala Ile Gly Ile Leu Ile Pro Asp 340 345 350 Glu Asp Leu Pro Val Asp Tyr Thr Pro Phe Pro Ser Pro Tyr Ser His 355 360 365 Val Gly Ile Thr Pro Gln Gly Ala Arg Thr Ile Ile Glu Lys Tyr Ala 370 375 380 Cys Gly Asn Glu Ser Tyr Val Arg Tyr Val Ile Asn Asp Ala Val Ile 385 390 395 400 Pro Ile Lys Lys Cys Ser Ser Gly Pro Gly Phe Ser Cys Asn Leu Asn 405 410 415 Asp Tyr Asn Asp Tyr Val Ala Glu Arg Val Ala Gly Thr Asn Tyr Val 420 425 430 Glu Gln Cys Gly Asn Asn Asn Ala Ser Ala Val Thr Phe Tyr Trp Asp 435 440 445 Tyr Glu Thr Thr Asn Tyr Thr Ala Ser Leu Ile Asn Ser 450 455 460 <210> 3 <211> 467 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 3 Met Gly Val Ser Ala Val Leu Leu Pro Leu Tyr Leu Leu Ser Gly Val 1 5 10 15 Thr Ser Gly Leu Ala Val Pro Ala Ser Arg Asn Gln Ser Ser Cys Asp 20 25 30 Thr Val Asp Gln Gly Tyr Gln Cys Phe Ser Glu Thr Ser His Leu Trp 35 40 45 Gly Gln Tyr Ala Pro Phe Phe Ser Leu Ala Asn Glu Ser Val Ile Ser 50 55 60 Pro Glu Val Pro Ala Gly Cys Arg Val Thr Phe Ala Gln Val Leu Ser 65 70 75 80 Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro Thr Asp Ser Lys Gly Lys Lys Tyr Ser 85 90 95 Ala Leu Ile Glu Glu Ile Gln Gln Asn Ala Thr Thr Phe Asp Gly Lys 100 105 110 Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr Asn Tyr Ser Leu Gly Ala Asp Asp Leu 115 120 125 Thr Pro Phe Gly Glu Gln Glu Leu Val Asn Ser Gly Ile Lys Phe Tyr 130 135 140 Gln Arg Tyr Glu Ser Leu Thr Arg Asn Ile Val Pro Phe Ile Arg Ser 145 150 155 160 Ser Gly Ser Ser Arg Val Ile Ala Ser Gly Lys Lys Phe Ile Glu Gly 165 170 175 Phe Gln Ser Thr Lys Leu Lys Asp Pro Arg Ala Gln Pro Gly Gln Ser 180 185 190 Ser Pro Lys Ile Asp Val Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Ser Asn Asn 195 200 205 Thr Leu Asp Pro Gly Thr Cys Thr Val Phe Glu Asp Ser Glu Leu Ala 210 215 220 Asp Thr Val Glu Ala Asn Phe Thr Ala Thr Phe Val Pro Ser Ile Arg 225 230 235 240 Gln Arg Leu Glu Asn Asp Leu Ser Gly Val Thr Leu Thr Asp Thr Glu 245 250 255 Val Thr Tyr Leu Met Asp Met Cys Ser Phe Asp Thr Ile Ser Thr Ser 260 265 270 Thr Val Asp Thr Lys Leu Ser Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Asp 275 280 285 Glu Trp Ile Asn Tyr Asp Tyr Leu Gln Ser Leu Lys Lys Tyr Tyr Gly 290 295 300 His Gly Ala Gly Asn Pro Leu Gly Pro Thr Gln Gly Val Gly Tyr Ala 305 310 315 320 Asn Glu Leu Ile Ala Arg Leu Thr His Ser Pro Val His Asp Asp Thr 325 330 335 Ser Ser Asn His Thr Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn 340 345 350 Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Asn Gly Ile Ile Ser Ile 355 360 365 Leu Phe Ala Leu Gly Leu Tyr Asn Gly Thr Lys Pro Leu Ser Thr Thr 370 375 380 Thr Val Glu Asn Ile Thr Gln Thr Asp Gly Phe Ser Ser Ala Trp Thr 385 390 395 400 Val Pro Phe Ala Ser Arg Leu Tyr Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ala 405 410 415 Glu Gln Glu Pro Leu Val Arg Val Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro 420 425 430 Leu His Gly Cys Pro Val Asp Ala Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Ser 435 440 445 Phe Val Arg Gly Leu Ser Phe Ala Arg Ser Gly Gly Asp Trp Ala Glu 450 455 460 Cys Phe Ala 465 <210> 4 <211> 540 <212> PRT <213> Penicillium funiculosum <400> 4 Met Leu Lys Leu Tyr Val Ala Ala Cys Leu Val Val Ala Gly Val Ser 1 5 10 15 Ile Pro Thr Asp Pro Thr Val Thr Gln Val Pro Asp Tyr Phe Gln Thr 20 25 30 Ser Tyr Gly Pro Tyr Ala Gly Ala Thr Lys Ala Gly Gly Ala Pro Phe 35 40 45 Leu Ala Gln Thr Asn Pro Ile Tyr Ser Gln Pro Thr Tyr Val Ala Asn 50 55 60 Thr Pro Leu Val Thr Thr Leu Pro Ile Ser Gly Glu Pro His Asp Gly 65 70 75 80 Asn Ile Phe Gly Trp Met Gly Thr Leu Ser Pro Tyr Gln Pro Ser Pro 85 90 95 Asp Gly Phe Gly Val Asp Glu Tyr Pro Leu Pro Pro Gly Ala Asn Ile 100 105 110 Thr Gln Ile His Met Val His Arg His Gly Ser Arg Tyr Pro Thr Ser 115 120 125 Asn Ser Ala Ile Ser Asp Trp Ala Lys Lys Ile Met Gln Tyr Arg Ser 130 135 140 Asn Gly Thr Val Phe Ser Gly Glu Leu Glu Phe Leu Asn Ala Trp Asn 145 150 155 160 Tyr Gln Leu Gly Gln Ala Glu Leu Thr Ala Arg Gly Arg Gln Glu Leu 165 170 175 Phe Asp Ser Gly Ile Leu His Trp Phe Asn Tyr Gly Lys Leu Tyr Asp 180 185 190 Pro Ala Ser Lys Ile Ile Ala Arg Thr Thr Thr Met Val Arg Met Leu 195 200 205 Gln Ser Ala Glu Asn Phe Leu Asn Gly Phe Phe Gly Pro Asn Trp Thr 210 215 220 Asn Asn Ala Thr Leu Glu Val Ile Ile Glu Ser Thr Gly Phe Asn Asn 225 230 235 240 Ser Leu Ala Gly Asn Asp Met Cys Arg Asn Ala Lys Asn Thr Ser Gly 245 250 255 Gly Asp Ala Val Asn Glu Trp Thr Ala Leu Tyr Leu Gln Lys Ala Thr 260 265 270 Asn Arg Phe Arg Ser Glu Ile Ser Gly Ser Leu Asn Trp Thr Val Asp 275 280 285 Asp Thr Tyr Asn Ala Gln Ser Met Cys Pro Tyr Glu Thr Val Ala Leu 290 295 300 Gly Tyr Ser Pro Phe Cys Thr Leu Phe Ser Trp Glu Glu Trp Gln Gly 305 310 315 320 Phe Gln Tyr Val Asn Asp Leu Asn Leu Tyr Gly Asn Tyr Gly Met Gly 325 330 335 Ser Pro Val Gly Arg Ala Ile Gly Leu Gly Phe Val Glu Glu Leu Ile 340 345 350 Ala Arg Leu Gln Gly Gln Ile Pro Asn Pro Pro Glu Asp Ser Ile Gly 355 360 365 Phe Asn Gln Ser Leu Asp Asp Ser Ala Ala Thr Phe Pro Leu Asn Gln 370 375 380 Thr Ile Tyr Phe Asp Phe Ser His Asp Asn Glu Met Phe Ser Met Leu 385 390 395 400 Thr Ala Leu Gly Leu Thr Gln Phe Gly Asp Tyr Leu Ser Pro Thr Lys 405 410 415 Pro Ser Ala Asp Arg Ser Leu Ile Gly Ser His Ile Val Pro Phe Ser 420 425 430 Ala Thr Phe Val Phe Glu Ile Ile Lys Ala Pro Gly Leu Val Arg Glu 435 440 445 Asn Arg Ser Lys Tyr Cys Gly Glu Ser Val Tyr Glu Asn Thr Ser Glu 450 455 460 Glu Thr Thr Tyr Ile His Leu Val Ile Asn Gln Arg Thr Val Pro Leu 465 470 475 480 Gly Gln Ser Ile Ser Ala Cys Gly Gln Arg Asp Asp Gly Trp Cys Glu 485 490 495 Ile Ser Ala Phe Ile Gln Ala Gln Lys Glu Asn Ile Val Lys Ala Asn 500 505 510 Tyr Glu Glu Ser Cys Phe Gly Asn Trp Ser Ile Pro Ala Tyr Gly Glu 515 520 525 Ile Arg Asp Gly Ala Ile Pro Lys Asn Ala Thr Ser 530 535 540 <210> 5 <211> 439 <212> PRT <213> Peniophora lycii <400> 5 Met Val Ser Ser Ala Phe Ala Pro Ser Ile Leu Leu Ser Leu Met Ser 1 5 10 15 Ser Leu Ala Leu Ser Thr Gln Phe Ser Phe Val Ala Ala Gln Leu Pro 20 25 30 Ile Pro Ala Gln Asn Thr Ser Asn Trp Gly Pro Tyr Asp Pro Phe Phe 35 40 45 Pro Val Glu Pro Tyr Ala Ala Pro Pro Glu Gly Cys Thr Val Thr Gln 50 55 60 Val Asn Leu Ile Gln Arg His Gly Ala Arg Trp Pro Thr Ser Gly Ala 65 70 75 80 Arg Ser Arg Gln Val Ala Ala Val Ala Lys Ile Gln Met Ala Arg Pro 85 90 95 Phe Thr Asp Pro Lys Tyr Glu Phe Leu Asn Asp Phe Val Tyr Lys Phe 100 105 110 Gly Val Ala Asp Leu Leu Pro Phe Gly Ala Asn Gln Ser His Gln Thr 115 120 125 Gly Thr Asp Met Tyr Thr Arg Tyr Ser Thr Leu Phe Glu Gly Gly Asp 130 135 140 Val Pro Phe Val Arg Ala Ala Gly Asp Gln Arg Val Val Asp Ser Ser 145 150 155 160 Thr Asn Trp Thr Ala Gly Phe Gly Asp Ala Ser Gly Glu Thr Val Leu 165 170 175 Pro Thr Leu Gln Val Val Leu Gln Glu Glu Gly Asn Cys Thr Leu Cys 180 185 190 Asn Asn Met Cys Pro Asn Glu Val Asp Gly Asp Glu Ser Thr Thr Trp 195 200 205 Leu Gly Val Phe Ala Pro Asn Ile Thr Ala Arg Leu Asn Ala Ala Ala 210 215 220 Pro Ser Ala Asn Leu Ser Asp Ser Asp Ala Leu Thr Leu Met Asp Met 225 230 235 240 Cys Pro Phe Asp Thr Leu Ser Ser Gly Asn Ala Ser Pro Phe Cys Asp 245 250 255 Leu Phe Thr Ala Glu Glu Tyr Val Ser Tyr Glu Tyr Tyr Tyr Asp Leu 260 265 270 Asp Lys Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Gly Asn Ala Leu Gly Pro Val Gln 275 280 285 Gly Val Gly Tyr Val Asn Glu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Gly Gln Ala 290 295 300 Val Arg Asp Glu Thr Gln Thr Asn Arg Thr Leu Asp Ser Asp Pro Ala 305 310 315 320 Thr Phe Pro Leu Asn Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Asn 325 330 335 Thr Met Val Pro Ile Phe Ala Ala Leu Gly Leu Phe Asn Ala Thr Ala 340 345 350 Leu Asp Pro Leu Lys Pro Asp Glu Asn Arg Leu Trp Val Asp Ser Lys 355 360 365 Leu Val Pro Phe Ser Gly His Met Thr Val Glu Lys Leu Ala Cys Ser 370 375 380 Gly Lys Glu Ala Val Arg Val Leu Val Asn Asp Ala Val Gln Pro Leu 385 390 395 400 Glu Phe Cys Gly Gly Val Asp Gly Val Cys Glu Leu Ser Ala Phe Val 405 410 415 Glu Ser Gln Thr Tyr Ala Arg Glu Asn Gly Gln Gly Asp Phe Ala Lys 420 425 430 Cys Gly Phe Val Pro Ser Glu 435 <210> 6 <211> 1623 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> CDS <222> (1)..(1623) <400> 6 atg tgg atg tgg agg ggg tcg ctg ccg ctg ctt ctg ctc gcc gcg gcg 48 Met Trp Met Trp Arg Gly Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala 1 5 10 15 gtg gcg gcg gcg gct gag ccg gcg tcg acg ctg gag gga ccg tcg cgg 96 Val Ala Ala Ala Ala Glu Pro Ala Ser Thr Leu Glu Gly Pro Ser Arg 20 25 30 ccg gtg acg gtg ccg ctg cgg gaa gac agg ggc cac gcg gtg gac ctg 144 Pro Val Thr Val Pro Leu Arg Glu Asp Arg Gly His Ala Val Asp Leu 35 40 45 ccg gac acg gac ccc cgg gtg cag cgc cgg gtc aca ggc tgg gct ccc 192 Pro Asp Thr Asp Pro Arg Val Gln Arg Arg Val Thr Gly Trp Ala Pro 50 55 60 gag cag atc gcc gtc gcg ctc tcc gcc gct ccc acc tcc gcc tgg gtc 240 Glu Gln Ile Ala Val Ala Leu Ser Ala Ala Pro Thr Ser Ala Trp Val 65 70 75 80 tcc tgg atc aca ggg gat ttc cag atg ggc ggc gcc gtc aag ccg ctg 288 Ser Trp Ile Thr Gly Asp Phe Gln Met Gly Gly Ala Val Lys Pro Leu 85 90 95 gac ccc ggc acg gtc ggc agc gtc gtg cgc tac ggc ctc gcc gcc gat 336 Asp Pro Gly Thr Val Gly Ser Val Val Arg Tyr Gly Leu Ala Ala Asp 100 105 110 tct ttg gtc cgc gag gcc acc ggc gac gcg ctc gtg tac agc cag ctc 384 Ser Leu Val Arg Glu Ala Thr Gly Asp Ala Leu Val Tyr Ser Gln Leu 115 120 125 tac ccc ttc gag ggc ctc cag aac tac acc tcc ggc atc atc cac cac 432 Tyr Pro Phe Glu Gly Leu Gln Asn Tyr Thr Ser Gly Ile Ile His His 130 135 140 gtc cgc ctc caa ggg ctt gag cct ggg acg aag tac tac tac cag tgc 480 Val Arg Leu Gln Gly Leu Glu Pro Gly Thr Lys Tyr Tyr Tyr Gln Cys 145 150 155 160 ggc gac ccg gcc atc ccg ggg gcg atg agc gcc gtc cac gcg ttc cgg 528 Gly Asp Pro Ala Ile Pro Gly Ala Met Ser Ala Val His Ala Phe Arg 165 170 175 acg atg ccg gcg gtc ggg ccg cgg agc tac ccg ggg agg atc gcc gtg 576 Thr Met Pro Ala Val Gly Pro Arg Ser Tyr Pro Gly Arg Ile Ala Val 180 185 190 gtg ggg gac ctc ggg ctc acg tac aac acc acc tcg acc gtg gac cac 624 Val Gly Asp Leu Gly Leu Thr Tyr Asn Thr Thr Ser Thr Val Asp His 195 200 205 atg gcg agc aac cgg ccg gac ctg gtc ctc ctc gtc ggc gac gtg tgc 672 Met Ala Ser Asn Arg Pro Asp Leu Val Leu Leu Val Gly Asp Val Cys 210 215 220 tac gcc aac atg tac ctc acc aac ggc acc gga gcg gac tgc tac tcg 720 Tyr Ala Asn Met Tyr Leu Thr Asn Gly Thr Gly Ala Asp Cys Tyr Ser 225 230 235 240 tgc gcg ttc ggc aag tcg acg ccc atc cac gag acg tac cag ccg cgc 768 Cys Ala Phe Gly Lys Ser Thr Pro Ile His Glu Thr Tyr Gln Pro Arg 245 250 255 tgg gac tac tgg gga agg tac atg gag gcg gtg acg tcg ggg acg ccg 816 Trp Asp Tyr Trp Gly Arg Tyr Met Glu Ala Val Thr Ser Gly Thr Pro 260 265 270 atg atg gtg gtg gaa ggg aac cat gag ata gag gag cag atc ggg aac 864 Met Met Val Val Glu Gly Asn His Glu Ile Glu Glu Gln Ile Gly Asn 275 280 285 aag acg ttc gcg gcc tac cgc tcc cgg ttc gcg ttc ccg tcg acg gag 912 Lys Thr Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Phe Ala Phe Pro Ser Thr Glu 290 295 300 agc ggg tcc ttc tcc ccc ttc tac tac tcg ttc gac gcc ggc ggg atc 960 Ser Gly Ser Phe Ser Pro Phe Tyr Tyr Ser Phe Asp Ala Gly Gly Ile 305 310 315 320 cat ttc ctc atg ctc ggc gcc tac gcc gac tac ggc agg tca ggg gag 1008 His Phe Leu Met Leu Gly Ala Tyr Ala Asp Tyr Gly Arg Ser Gly Glu 325 330 335 cag tac aga tgg ctg gag aag gac ctg gcg aag gtg gac agg tcg gtg 1056 Gln Tyr Arg Trp Leu Glu Lys Asp Leu Ala Lys Val Asp Arg Ser Val 340 345 350 acg ccg tgg ctg gtc gcc ggc tgg cac gcg cca tgg tac acc acc tac 1104 Thr Pro Trp Leu Val Ala Gly Trp His Ala Pro Trp Tyr Thr Thr Tyr 355 360 365 aag gct cac tac agg gag gtg gag tgc atg aga gtg gcc atg gag gag 1152 Lys Ala His Tyr Arg Glu Val Glu Cys Met Arg Val Ala Met Glu Glu 370 375 380 ctg ctc tac tcc cac ggc ctc gac atc gcc ttc acc ggc cat gtg cac 1200 Leu Leu Tyr Ser His Gly Leu Asp Ile Ala Phe Thr Gly His Val His 385 390 395 400 gcg tat gag cgc tcc aac cgg gtg ttc aac tac acg ctg gac ccg tgc 1248 Ala Tyr Glu Arg Ser Asn Arg Val Phe Asn Tyr Thr Leu Asp Pro Cys 405 410 415 ggc gcc gtg cac atc tcg gtg ggc gac ggc ggg aac cgc gag aag atg 1296 Gly Ala Val His Ile Ser Val Gly Asp Gly Gly Asn Arg Glu Lys Met 420 425 430 gcc acc acc cac gcc gac gag cca ggg cac tgc ccg gac ccg cgg ccc 1344 Ala Thr Thr His Ala Asp Glu Pro Gly His Cys Pro Asp Pro Arg Pro 435 440 445 aag ccc aac gcc ttc atc ggc ggc ttc tgc gcc ttt aac ttc acg tcc 1392 Lys Pro Asn Ala Phe Ile Gly Gly Phe Cys Ala Phe Asn Phe Thr Ser 450 455 460 ggc ccg gcc gcc ggc agg ttc tgc tgg gac cgg cag ccg gac tac agc 1440 Gly Pro Ala Ala Gly Arg Phe Cys Trp Asp Arg Gln Pro Asp Tyr Ser 465 470 475 480 gcc tac cgg gag agc agc ttc ggc cac ggc atc ctc gag gtg aag aac 1488 Ala Tyr Arg Glu Ser Ser Phe Gly His Gly Ile Leu Glu Val Lys Asn 485 490 495 gag acg cac gct ctg tgg aga tgg cac agg aac cag gac atg tac ggg 1536 Glu Thr His Ala Leu Trp Arg Trp His Arg Asn Gln Asp Met Tyr Gly 500 505 510 agc gcc gga gat gag att tac att gtc cgg gag ccg cac agg tgc ttg 1584 Ser Ala Gly Asp Glu Ile Tyr Ile Val Arg Glu Pro His Arg Cys Leu 515 520 525 cac aaa cac aac tgg acc agg ccc gca cac ggt ccg taa 1623 His Lys His Asn Trp Thr Arg Pro Ala His Gly Pro 530 535 540 <210> 7 <211> 540 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 7 Met Trp Met Trp Arg Gly Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala 1 5 10 15 Val Ala Ala Ala Ala Glu Pro Ala Ser Thr Leu Glu Gly Pro Ser Arg 20 25 30 Pro Val Thr Val Pro Leu Arg Glu Asp Arg Gly His Ala Val Asp Leu 35 40 45 Pro Asp Thr Asp Pro Arg Val Gln Arg Arg Val Thr Gly Trp Ala Pro 50 55 60 Glu Gln Ile Ala Val Ala Leu Ser Ala Ala Pro Thr Ser Ala Trp Val 65 70 75 80 Ser Trp Ile Thr Gly Asp Phe Gln Met Gly Gly Ala Val Lys Pro Leu 85 90 95 Asp Pro Gly Thr Val Gly Ser Val Val Arg Tyr Gly Leu Ala Ala Asp 100 105 110 Ser Leu Val Arg Glu Ala Thr Gly Asp Ala Leu Val Tyr Ser Gln Leu 115 120 125 Tyr Pro Phe Glu Gly Leu Gln Asn Tyr Thr Ser Gly Ile Ile His His 130 135 140 Val Arg Leu Gln Gly Leu Glu Pro Gly Thr Lys Tyr Tyr Tyr Gln Cys 145 150 155 160 Gly Asp Pro Ala Ile Pro Gly Ala Met Ser Ala Val His Ala Phe Arg 165 170 175 Thr Met Pro Ala Val Gly Pro Arg Ser Tyr Pro Gly Arg Ile Ala Val 180 185 190 Val Gly Asp Leu Gly Leu Thr Tyr Asn Thr Thr Ser Thr Val Asp His 195 200 205 Met Ala Ser Asn Arg Pro Asp Leu Val Leu Leu Val Gly Asp Val Cys 210 215 220 Tyr Ala Asn Met Tyr Leu Thr Asn Gly Thr Gly Ala Asp Cys Tyr Ser 225 230 235 240 Cys Ala Phe Gly Lys Ser Thr Pro Ile His Glu Thr Tyr Gln Pro Arg 245 250 255 Trp Asp Tyr Trp Gly Arg Tyr Met Glu Ala Val Thr Ser Gly Thr Pro 260 265 270 Met Met Val Val Glu Gly Asn His Glu Ile Glu Glu Gln Ile Gly Asn 275 280 285 Lys Thr Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Phe Ala Phe Pro Ser Thr Glu 290 295 300 Ser Gly Ser Phe Ser Pro Phe Tyr Tyr Ser Phe Asp Ala Gly Gly Ile 305 310 315 320 His Phe Leu Met Leu Gly Ala Tyr Ala Asp Tyr Gly Arg Ser Gly Glu 325 330 335 Gln Tyr Arg Trp Leu Glu Lys Asp Leu Ala Lys Val Asp Arg Ser Val 340 345 350 Thr Pro Trp Leu Val Ala Gly Trp His Ala Pro Trp Tyr Thr Thr Tyr 355 360 365 Lys Ala His Tyr Arg Glu Val Glu Cys Met Arg Val Ala Met Glu Glu 370 375 380 Leu Leu Tyr Ser His Gly Leu Asp Ile Ala Phe Thr Gly His Val His 385 390 395 400 Ala Tyr Glu Arg Ser Asn Arg Val Phe Asn Tyr Thr Leu Asp Pro Cys 405 410 415 Gly Ala Val His Ile Ser Val Gly Asp Gly Gly Asn Arg Glu Lys Met 420 425 430 Ala Thr Thr His Ala Asp Glu Pro Gly His Cys Pro Asp Pro Arg Pro 435 440 445 Lys Pro Asn Ala Phe Ile Gly Gly Phe Cys Ala Phe Asn Phe Thr Ser 450 455 460 Gly Pro Ala Ala Gly Arg Phe Cys Trp Asp Arg Gln Pro Asp Tyr Ser 465 470 475 480 Ala Tyr Arg Glu Ser Ser Phe Gly His Gly Ile Leu Glu Val Lys Asn 485 490 495 Glu Thr His Ala Leu Trp Arg Trp His Arg Asn Gln Asp Met Tyr Gly 500 505 510 Ser Ala Gly Asp Glu Ile Tyr Ile Val Arg Glu Pro His Arg Cys Leu 515 520 525 His Lys His Asn Trp Thr Arg Pro Ala His Gly Pro 530 535 540

Claims

피트산(미오-이노시톨 1,2,3,4,5,6-헥사키스포스페이트)의 가수분해를 위한 두 개 이상의 피타제를 조합한 조성물로서,

a) 서열번호: 1 또는 서열번호: 2의 제1 피타제;

b) 서열번호: 3의 제2 피타제;를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,

제1 피타제는 피트산의 6개 인산 결합의 가수분해를 촉매하는 3-피타제인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,

상기 제1 피타제는 55℃ 내지 80℃의 적정 온도, 3.5 내지 5의 적정 pH를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,

상기 제1 피타제가 효모 쉬반니오마이세스 카스텔리(Schwanniomyces castellii) 피타제 또는 효모 데바리오마이세스 카스텔리(Debaryomyces castellii) 피타제인 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제1항에 있어서,

상기 제2 피타제는 피트산의 최소한 5개 인산 결합의 가수분해를 촉매하는 3-피타제인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,

상기 제2 피타제는 50℃ 내지 60℃의 적정 온도, 2 내지 6의 적정 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,

상기 제2 피타제는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 피타제인 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제1항에 있어서,

동물용 영양 첨가제 또는 동물 사료를 구성하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 동물용 영양 첨가제 또는 동물 사료의 제조에 사용하는 방법.
제1항 내지 제4항, 제6항 내지 제8항 및 제10항 중 어느 한 항의 조성물을 피트산 인의 생체이용율 및 동물 사료의 소화성을 개선하기 위해 사용하는 방법.
a) 서열번호: 1 또는 서열번호: 2의 제1 피타제를 공급하는 단계;

b) 서열번호: 3의 제2 피타제를 공급하는 단계; 및

c) 피트산을 동시에 상기 제1 피타제 및 제2 피타제에 접촉시키는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는,

피트산(미오-이노시톨 1,2,3,4,5,6-헥사키스포스페이트)을 무기 모노인산, 저인산화도의 미오-이노시톨 및 자유 미오-이노시톨로 가수분해시키는 방법.
제13항에 있어서,

상기 제1 피타제는 피트산의 6개 인산 결합의 가수분해를 촉매하는 3-피타제인 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서,

상기 제1 피타제는 55℃ 내지 80℃의 적정 온도, 3.5 내지 5의 적정 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서,

상기 제1 피타제가 효모 쉬반니오마이세스 카스텔리(Schwanniomyces castellii) 피타제 또는 효모 데바리오마이세스 카스텔리(Debaryomyces castellii) 피타제인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제13항에 있어서,

상기 제2 피타제는 피트산의 최소한 5개 인산 결합의 가수분해를 촉매하는 3-피타제인 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서,

상기 제2 피타제는 50℃ 내지 60℃의 적정 온도, 2 내지 6의 적정 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서,

상기 제2 피타제는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 피타제인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
a) 서열번호: 1의 쉬반니오마이세스 카스텔리(Schwanniomyces castellii) 피타제 또는 서열번호: 2의 데바리오마이세스 카스텔리(Debaryomyces castellii) 피타제;

b) 서열번호: 3의 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 피타제를 포함하는 것을 특징으로 하는 동물 급식용 키트.