BRPI0612635B1 - Composition associating at least two phytases for phytic acid hydrolysis, use of a composition, phytic acid hydrolysis (mio-inositol 1, 2, 3, 4, 5, 6-hexach phosphate) process in inorganic monophosates, low phosphorylation inositals and in free mio-inositol, and kit or set for animal feeding - Google Patents

Abstract

composição associando pelo menos duas fitases para a hidrólise do ácido fítico, utilização de uma composição, processo de hidrólise de ácido fítico (mio-inositol 1, 2, 3, 4, 5, 6-hexaquis fosfato) em monofosfatos inorgânicos, em mio-inositóis de grau de fosforilação inferior e em mio-inositol livre, e, kit ou conjunto para a alimentação de animais. composições e processos associando, pelo menos, duas fitases para a hidrólise do ácido fítico (mio-inositol hexaquis fosfato) em monofosfatos inorgânicos, em mio-inositóis de grau de fosforilação inferior e em mio-inositol livre. estas composições e processos apresentam em particular um interesse para a alimentação animal.

Description

'•COMPOSIÇÃO ASSOCIANDO PELO MENOS DUAS FITASES PARa a HIDRÓLISE DO ÁCIDO FÍTICO, UTILIZAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO, PROCESSO DE HIDRÓLISE DE ÁCIDO FÍTICO (MIO-INOSITOL 1,2,3,4,5,6-HEXAQUIS FOSFATO) EM MONOFOSFATOS INORGÂNICOS, EM MIO-INOSITÓIS DE GRAU DE FOSFORILAÇÃO INFERIOR E EM MIO-INOSITOL LIVRE, E, KIT OU CONJUNTO PARA A ALIMENTAÇÃO DE ANIMAIS" A invenção refere-se ao efeito sinergístico da associação de fitases sobre a hidrólise de ácido fítico.

Os sais do ácido fítico (mio-inositol hexaquis fosfato) ou fitatos (mio-inositol-hexaquis di-hidrogenofosfato) são a forma principal de armazenamento do fósforo nos cereais, as plantas leguminosas e oleaginosas. Eles constituem assim a fonte principal de fósforo nos alimentos para animais à base de plantas, componentes principais dos regimes dos animais monogástricos (aves e suínos). No entanto, a biodisponibilidade deste fósforo nos alimentos é limitada para estes animais. Com efeito, eles não possuem as enzimas intestinais degradando os fitatos em quantidade suficiente para permitir a hidrólise dos fitatos e fornecer, assim, as quantidades de fosfato inorgânico que são necessárias para os mesmos. Por outro lado, o ácido fítico é um fator anti-nutricional, que forma complexos com as proteínas e os íons (Fe , Ca , Zn , Mg ) e diminuir, portanto, a disponibilidade destes elementos.

As rações alimentícias das aves e dos suínos devem ser portanto suplementadas com fosfato inorgânico enquanto o fósforo dos fitatos é excretado e contribui para a eutrofização das águas de superfície nas zonas de criação intensiva dos animais monogástricos.

As fitases (mio-inositol hexaquis fosfato 3- e 6- fosfo-hidrolases EC 3.1.3.8 e 3.1.3.26) fazem parte da família das histidinas fosfatases acidas. As fitases são as hexaquisfosfohidrolases que hidrolisam as ligações fosfo-ésteres presentes no ácido fítico ou o fitato. Assim elas catalisam a hidrólise do mio-inositol hexaquisfosfato (ácido fítico, InsP5) em monofosfatos inorgânicos e em mio-inositóis fosfato de grau de fosforilação inferior (lnsP5 à InSPj) e em mio-inositol livre em alguns casos.

Existem duas sub-classes de fítases, diferenciadas apenas pela pó da primeira fosfato hidrólise. As 3-fitases (EC 3.13.8) hidrolisam o fosfato em posição 3 e as 6-fitases (EC 3.1.3.26) hidrolisam o fosfato em posição 6.

Estas enzimas usadas como aditivo em alimentação animal, permitindo, de um lado, aumentar a disponibilidade do fósforo fítico, por outro lado melhorar a digestibilidade dos alimentos. Além disso, a liberação de fosfato fítico diminuir consideravelmente os custos devido à suplementação em fosfato, assim como a poluição provocada por um excesso de fosfatos excretados.

As fítases são produzidas por uma grande variedade de organismos: plantas, animais e sobretudo microorganismos. Estas fítases possuem características bioquímicas muitos diferentes particularmente sua atividade em função do pH e sua estabilidade em temperatura. Além disso, estas enzimas presentes diferenças em nível: (a) de sua eficácia em hidrolisar a totalidade dos fosfatos, (b) de sua estéreo-especificidade, (c) de sua afinidade frente aos inositóis fosfatos.

Dentre os microorganismos produtores de fítases, cita-se notadamente: os cogumelos dos gêneros Aspergillus, PéniciUium, Mucor e Rhizopus, as bactérias: Pseudomonas sp., Klebsiella sp., Escherichia coli, Enterobacter sp., Bacillus subtilis e leveduras: Saccharomyces cerevisiae, Candiáa tropicalis, Torulopsis candida, Debaryomyces castellii, Debaryomyces occidentalis (sinônimo Schwanniomyces castellii), Kluyveromyces fragilis.

Numerosas fítases de microorganismos já foram estudadas e usadas em diversas aplicações agro-industriais. A eficácia destas enzimas nos alimentos e durante a digestão do animal depende de sua capacidade de manter seu potencial quaisquer que sejam as diferentes condições encontradas durante as etapas de preparação do alimento, assim como no trato digestivo. A preparação dos alimentos necessita de enzimas termo-resístentes enquanto que os valores de pH variam por exemplo de 5.02, 2.75, 6.28, 6.63, e 5.98 quando da passagem nos diversos compartimentos do papo, estômago, duodeno, jejuno, íleo das aves. A maior parte das fítases descritas atualmente só hidrolisam parcialmente o ácido fítico e alguns com cínéticas muito lentas. Assim, numerosas fítases só hidrolisam 5 ligações fosfato do ácido fítico, seja 83% do fósforo em potencial.

Atualmente, dentre as leveduras, somente a fítase da levedura Schwanniomyces occidenalis foi descrita como sendo capaz de hidrolisar todas as ligações fosfato do fitato (EP 0 699762 e Segueilha L., Lambrechts C, Boze H., Moulin G., Galzy P., (1992) Purification and properties of a fítase from Schwanniomyces casteUiii, J. Ferm. Bioeng., 74, 7-11).

Em condições experimentais, não se obtém, no entanto, uma hidrólise completa do fitato ou do ácido fítico.

Para obter uma hidrólise mais eficaz do ácido fítico, foi assim proposto combinar diferentes fítases. W098/30681 descreve a combinação de fítases tendo diferentes estéreo-especificidades e notadamente a combinação de 3-fitase e de 6-fitase. Este documento descreve em particular a combinação de uma 6-fitase de Peniophora lycii e X de uma 3-fitase de Aspergillus niger (fítase Novo™). US 6,183,740 descreve igualmente a combinação de fítases de diferentes estéreo-especificidades, assim como a combinação com outros ácidos fosfatases.

Uma hidrólise completa do ácido fítico em fosfato e em inositol não é observada no entanto. O problema que se propõe resolver a presente invenção consiste em melhorar a velocidade e a eficácia da hídrólise do ácido fítico a fim de obter uma hídrólise completa do ácido fítico nas diversas aplicações agro-industriais.

Este problema é resolvido pelas composições e os processos da presente invenção em que se associam pelo menos duas fitases específicas. De modo vantajoso, as composições da presente invenção permitem uma hídrólise completa de todos os grupamentos fosfato do ácido fítico graças ao efeito sinérgico observado. Com vantagem, as composições da presente invenção são ativas em um patamar de pH grande adaptado às aplicações agro-industriais das fitases e notadamente às aplicações no domínio da alimentação animal. Uma outra vantagem da presente invenção é que as fitases usadas são termoestáveis.

Descrição das seqüências SEQID No. 1: Fítase de Schwanniomyces casteün. SEQ ID No. 2: Fitase de Debaryomyces castellii. SEQ ID No. 3: Fitase de Aspergillus niger. SEQ ID No. 4: Fitase de Pénicíllium funiculosum. SEQ ID No. 5: Fitase de Peniophora lycii. SEQ ID No. 6: seqüência codificando para a fitase de trigo SEQ ID No. 7: Fitase de trigo (Triticum aestivum).

Descrição da invenção A invenção tem por objeto uma composição associando pelo menos duas fitases para a hídrólise do ácido fítico (mio-inositol 1,2,3,4,5,6-hexaquis fosfato) compreendendo: - uma primeira fitase apresentando pelo menos 80% de identidade com a fitase da SEQ ID No. 1 ou apresentando pelo menos 80% de identidade com a fitase da SEQ ID No. 2; - uma segunda fitase apresentando pelo menos 80% de identidade com a fitase da SEQID No. 3.

Preferivelmente, a primeira fitase é uma 3-fitase catalisando a hidrólise de seis ligações fosfato do ácido fítico.

Preferivelmente, a primeira fitase tem uma temperatura ótima compreendida entre 55°C e 80°C e um pH ótimo compreendido entre pH 3.5 e pH5.

Em uma forma de realização preferida, a primeira fitase é uma fitase da levedura Schwanniomyces castellii ou uma fitase da levedura Debaryomyces castellii.

Em uma outra forma de realização preferida, a primeira fitase é a fitase da SEQ ID No. 1 ou a fitase da SEQ ID No. 2.

Preferivelmente, a segunda fitase é uma 3-fitase catalisando a hidrólise de pelo menos cinco ligações fosfato do ácido fítico.

Preferivelmente, a segunda fitase tem uma temperatura ótima compreendida entre 50°C e 60°C e um pH ótimo compreendido entre pH 2 e pH6.

Em uma forma de realização preferida, a segunda fitase é uma fitase de Aspergillus niger.

Em uma outra forma de realização preferida, a segunda fitase é a fitase da SEQ ID No. 3.

Preferivelmente, as composições de acordo com a invenção consistem em um aditivo nutricional para animais ou em um alimento para animais. A invenção tem igualmente por objeto a utilização de uma composição de acordo com a invenção para a fabricação de um aditivo nutricional para animais ou um alimento para animais. A invenção tem também por objeto a utilização de uma composição de acordo com a invenção para aumentar a disponibilidade do fósforo fítico e melhorar a digestibilidade dos alimentos para animais. A presente invenção refere-se também a um processo de hidrólise do ácido fítico (mio-inositol 1,2,3,4,5,6-hexaquis fosfato) em monofosfatos inorgânicos, em mio-inositois de grau de fosforilação inferior e em mio-inositol livre compreendendo as etapas seguintes: - dispõe-se de uma primeira fítase apresentando pelo menos 80% de identidade com a fítase da SEQID No. 1 ou apresentando pelo menos 80% de identidade com a fítase da SEQ ID No. 2; - dispõe-se de uma segunda fítase apresentando pelo menos 80% de identidade com a fítase da SEQ ID No. 3; - coloca-se simultaneamente em contato o ácido fítico com a primeira fítase e a segunda fítase.

Preferivelmente, a primeira fítase é uma 3-fitase catalisando a hidrólise de seis ligações fosfato do ácido fítico.

Preferivelmente, a primeira fítase tem uma temperatura ótima compreendida entre 55°C e 80°C e um pH ótimo compreendido entre pH 3.5 e pH5.

Em uma forma de realização preferida, a primeira fítase é uma fítase da levedura Schwanniomyces castellii ou uma fítase da levedura Debaryomyces castellii.

Em uma forma de realização particularmente vantajosa, a primeira fítase é a fítase da SEQ ID No. 1 ou a fítase da SEQ ID No. 2.

Preferivelmente, a segunda fítase é uma 3-fitase catalisando a hidrólise de pelo menos cinco ligações de fosfato do ácido fítico.

Preferivelmente, a segunda fítase tem uma temperatura ótima compreendida entre 50°C e 60°C e um pH ótimo compreendido entre pH 2 e pH6.

Em uma forma de realização vantajosa, a segunda fítase é uma fítase de Aspergillus niger.

Em uma forma de realização particularmente vantajosa, a segunda fitase é a fitase da SEQID No. 3. A invenção tem também por objeto um kit ou estojo para a alimentação dos animais compreendendo: a fitase de Schwanniomyces casteUii da SEQ ID No. 1 ou a fitase de Debaryomyces casteUii da SEQ ID No. 2; a fitase de Aspergillus niger da SEQ ID No. 3.

As composições de acordo com a invenção associam uma primeira fitase apresentando pelo menos 80% de identidade com a fitase da SEQ ID No. 1 ou apresentando pelo menos 80% de identidade com a fitase da SEQ ID No. 2; e uma segunda fitase apresentando pelo menos 80% de identidade com a fitase da SEQ ID No. 3.

De modo surpreendente, esta associação específica de fitases permite obter um efeito sinergístico sobre a hidrólise do ácido fítico. AS composições de acordo com a presente invenção catalisam assim uma hidrólise rápida e total do ácido fítico em uma grande gama de pH.

Entende-se por fitase, as mio-inositol hexaquis fosfato fosfo-hidrolases (EC 3.1.3.8 e 3.1.3.26). Estas enzimas catalisam a hidrólise de mio-inositol 1,2,3,4,5,6-hexaquis fosfato (ácido fítico, InsP6) em monofosfatos inorgânicos e em mio-inositóis fosfato de grau inferior (InsP5 a InsP [) e em mio-inositol livre para algumas fitases.

As composições de acordo com a invenção compreendem uma primeira fitase apresentando pelo menos 80% de identidade com a fitase da SEQ ID No. 1 ou apresentando pelo menos 80% de identidade com a fitase da SEQ ID No. 2. A fitase da SEQ ID No. 1 é uma fitase da levedura Schwanniomyces casteUii enquanto que a fitase da SEQ ID No. 2 é uma fitase da levedura Debaryomyces casteUii.

Estas fitases tem propriedades catalíticas muito próximas e são portanto interpermutáveis nas associações de fitases de acordo com a invenção.

Preferivelmente, a primeira fitase apresenta pelo menos 80%, 90%, 95%, 98% e preferivelmente pelo menos 99% de aminoácidos idênticos com a fitase da SEQ ID No. 1 ou apresenta pelo menos 80%, 90%, 95%, 98% e preferivelmente pelo menos 99% de aminoácidos idênticos com a fitase da SEQ ID No. 2. preferivelmente Preferivelmente, a primeira fitase tem as mesmas propriedade e notadamente as mesmas propriedades catalíticas que as fitases da SEQ ID No. 1 e da SEQ ID No. 2. Preferivelmente, a primeira fitase é isolada de outras cepas de Schwanniomyces castellii, de Debaryomyces castellii ou de outras leveduras. Altemativamente, a primeira fitase pode ser obtida por técnicas de metagênese dirigida, por exemplo.

Por aminoácidos idênticos, entende-se os aminoácidos invariantes entre duas seqüências. A primeira fitase pode apresentar uma deleção, uma adição ou uma substituição de pelo menos um aminoácido em relação às fitases da SEQ ID No. 1 ou da SEQ ID No. 2.

As fitases da SEQ ID No. 1 e da SEQ ID No. 2 tem propriedades catalíticas comuns. De acordo com a invenção, a primeira fitase empregada nas composições e os processos de acordo com a invenção apresenta um grau de identidade com a fitase da SEQ ID No. 1 ou da SEQ ID No. 2 e conserva estas propriedades catalíticas comuns.

Preferivelmente, a primeira fitase tem uma atividade de 3-fitase. Preferivelmente, a primeira fitase catalisa a hidrólise das seis ligações fosfato do ácido fítico.

As 3-fitases (EC 3.1.3.8) hidrolisam em primeiro lugar o fosfato em posição 3.

Uma fitase capaz de hidrolisar todas as ligações fosfato do ácido Meo (posições 1, 2, 3, 4, 5, 6) catalisa a hidrólise do mio-inositol 1,2,3,4,5,6-hexaquis fosfato (ácido fítico, lnsPQ em monofosfatos inorgânicos e em mio-inositol livre.

Numerosas fitases só hidrolisam 5 ligações fosfato do ácido Meo seja 83% do fósforo potencial. Estas enzimas hidrolisam o ácido Meo em mio-inositol monofosfato, mas não em mio-inositol livre.

Por "atividade da fitase", entende-se a atividade enzimática da fitase. Esta atividade é expressa em unidades internacionais (U. I) por miligrama de proteína. Uma U. I. de atividade enzimática é a camada catalítica de transformar um micromol de substrato por unidade de tempo, a um pH e a uma temperatura dados.

Preferivelmente, a primeira fitase tem uma temperatura ótima compreendida entre 55°C e 80°C e um pH ótimo compreendido entre pH 3.5 e pH 5. Em uma forma de realização preferida, a primeira fitase é uma fitase da levedura Schwanniomyces castellii ou uma fitase da levedura Debaryomyces castellii.

Em uma outra forma de realização particularmente vantajosa, a primeira fitase é a fitase da SEQID No. 1 ou a fitase da SEQID No. 2.

As composições de acordo com a invenção compreendem pelo menos uma segunda fitase apresentando pelo menos 80% de identidade com a fitase da SEQ ID No. 3. A fitase da SEQ ID No. 3 é uma fitase do cogumelo filamentoso Aspergillus niger.

Preferivelmente, a segunda fitase apresenta pelo menos 80%, 90%, 95%, 98% e preferivelmente pelo menos 99% de aminoácidos idênticos com a fitase da SEQ ID No. 3.

Preferivelmente, a segunda fitase conserva as propriedades e notadamente as propriedades catalíticas da fitase da SEQ ID No. 3.

Preferivelmente, esta fitase é isolada de outras cepas de Aspergillm niger ou de outros cogumelos filamentosos. Alternativamente, esta fitase pode ser obtida pelas técnicas de metagênese dirigida, por exemplo.

Por "aminoácidos idênticos", entende-se os aminoácidos invariantes entre duas seqüências. A segunda fitase pode apresentar uma deleção,.uma adição ou uma substituição de pelo menos um aminoácido em relação a fitase da SEQID No. 3.

De acordo com a invenção, a segunda fitase empregada nas composições e os processo de acordo com a invenção apresenta portanto um grau de identidade com a fitase da SEQ ID No. 3 e conserva as propriedades catalíticas desta última Preferivelmente, a segunda fitase é uma 3-fitase catalisando a hidrólise de pelo menos cinco ligações fosfato do ácido fítico.

Preferivelmente, a segunda fitase tem uma temperatura ótima compreendida entre 50°C e 60°C e um pH ótimo compreendido entre pH 2 e pH 6. Ainda mais preferivelmente, a segunda fitase tem um primeiro pH ótimo entre pH 2.5 e 3.5 e um segundo pH ótimo entre pH 4.5 e 5.5.

Em uma forma de realização preferida, a segunda fitase é uma fitase de Aspergillus niger.

Em uma forma de realização vantajosa, a segunda fitase é a fitase da SEQ ID No. 3. A atividade enzimática de uma fitase varia notadamente em função do pH. As fitases tem assim gamas (ou patamares) de pH nas quais sua atividade enzimática é mais elevada ou ótima. Por gama entende-se um patamar ou um intervalo de pH dado. Duas fitases tem atividades enzimáticas nas gamas de pH complementares quando estas fitases tem uma atividade nas gamas de pH diferentes. Preferivelmente, estas gamas se sobrepõem parcialmente. Tipicamente, as fitases tem uma atividade enzimática mais elevada em pH ácido. Duas fitases tendo gamas de pH complementares tem assim por exemplo uma atividade enzimática máxima entre pH 2 e pH 4, para a primeira fitase e uma atividade enzimática máxima entre pH 4 e pH 6 para a segunda fitase. Nas composições e os processos da presente invenção, a primeira e a segunda fitase tem preferivelmente gamas de pH ou pHs ótimos complementares. As composições e os métodos de acordo com a invenção permitem assim uma hidrólise do ácido fítico em uma gama de pH grande.

Os métodos de medida e de identificação do grau de identidade entre os polipeptídeos são bem conhecidos na arte. Pode-se empregar, por exemplo, Vetor NTi 9.1.0, programa de alinhamento AlignX (Clustal W algorithm) (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com). Preferivelmente, usam-se os parâmetros por défaut.

As fitases das composições e processos de acordo com a invenção são isoladas ou purificadas de seu ambiente natural. As fitases podem ser preparadas por meio de diferentes processos, estes processos são notadamente a purificação a partir de fontes naturais como as células expressando naturalmente as fitases, a produção de fitases recombinantes por células hospedeiras apropriadas e sua purificação posterior, a produção por síntese química ou por fim uma combinação de diferentes abordagens. Estes diferentes processos de produção são bem conhecidos dos versados. Assim, as fitases empregadas nas composições e os processos da presente invenção pedem ser isoladas a partir de Schwanniomyces castellii, de Debaryomyces castellii ou de Aspergillus niger. Em uma outra forma de realização, as s fitases da presente invenção são isoladas a partir de organismos hospedeiros recombinantes.

Preferivelmente, as composições de acordo com a invenção consistem em um aditivo nutricional para animais ou em um alimento para animais. A invenção tem igualmente por objeto a utilização de uma composição de acordo com a invenção para a fabricação de um aditivo nutricional para animais ou de um alimento para animais. A presente invenção refere-se portanto igualmente aos aditivos alimentares suprindo uma atividade fitase. A obtenção deste tipo de atividade enzimática permite melhorar a digestibilidade de um alimento e melhorar seu valor nutricional.

Entende-se, por "aditivo nutricional" uma substância adicionada intencionalmente a um alimento, geralmente m quantidades pequenas para melhorar suas características nutricionais ou sua digestibilidade. Os aditivos nutricionais para animais podem conter, por exemplo, vitaminas, saís minerais, aminoácidos e enzimas. A presente invenção também refere-se aos alimentos para animais. Estes alimentos se apresentam comumente sob a forma de farinhas ou granulados em que são incorporados os aditivos de acordo com a invenção. Entende-se por 'alimento" qualquer um que possa servir à nutrição dos animais. Para a criação intensiva de animais, os alimentos para animais compreendem comumente uma base nutricional e aditivos nutricionais. Entende-se por 'base nutricional" o que constitui o essencial da ração alimentar de um animal, constituído a título de exemplo por uma mistura de cereais, proteínas e materiais graxos de origem animal ou vegetal.

As bases nutricionais para animais são adaptadas à alimentação destes animais e são bem conhecidas na arte. Comumente, estas bases nutricionais compreendem, por exemplo, milho, farinha, ervilhas e soja. Estas bases nutricionais podem já conter aditivos nutricionais como vitaminas, sais minerais e aminoácidos.

Em uma forma de realização preferida, a invenção refere-se aos alimentos para animais monogástricos e notadamente as aves e os suínos. As aves compreendem notadamente aves poedeiras, as aves para produção de carne, os perus e os patos. As suínos compreendem notadamente os suínos de engorda e de abate, assim com os leitões. A invenção também tem por objeto a utilização de uma composição de acordo com a invenção para aumentar a disponibilidade do fósforo fítico e melhorar a digestibilidade dos alimentos para animais.

As composições e os processos de acordo com a invenção associam uma primeira fitase capaz de hidrolisar todas as ligações fosfato do ácido fítico selecionadas dentre as fitases de Schwanniomyces castellii e as fítases de Debaryomyces castellii e uma segunda fitase capaz de hidrolisar pelo menos cinco ligações fosfatos do ácido fítico e tendo uma atividade enzimática na gama de pH complementar à gama de pH da primeira fitase. Figuras Figura 1 - comparação de cinéticas de hidrólise de ácido fítico em diferentes pH para as 6 fitases sozinhas ou associadas duas a duas. Os resultados são expressados em% de fosfatos teóricos liberados.

Figura 2 - Porcentagem de hidrólise de ácido fítico para diferentes fítases após 120 min de reação. (A) fitases sozinhas, (B) fitases associadas. Os traços em pontilhados correspondem à hidrólise de 5 ligações fosfato.

Figura 3 - Comparação das velocidades iniciais de hidrólise de ácido fítico (pmol. ΜΓ1 .min"1) para e/ou fitases com pH diferentes. (A) fitases sozinhas, (B) fitases associadas. As velocidades são calculadas durante os 10 primeiros minutos de reação.

Exemplos Materiais e métodos 1. Origens das fitases "Aspergillus niger Natuphos (AN): lote R2503 ou lote: 057NPHO2 Wim van Hartingsveldt, Cora M. J. van Zeijl, G. Marian Harteveld, Robin J. Gouka, Marjon E. G. Suykerbuyk, Ruud G. M. Luiten, Peter A. van Paridon, Gérard C. M. Selten, Annemarie E. Veenstra, Robert F. M. van Gorcom and Cees A. M. J. J van den Hondel; Cloning, characterization and overexpression of the fitase-encoding gene (phyA) of Aspergillus niger. Gene, 127, (1) 87-94 (1993) - Peniophora lycii (PL): lote 172NHS02 Lassen.S.F., Breinholt.J., Ostergaard.P.R., Brugger,R.,Bischoff,A., Wyss.M. and Fuglsang.C.C; Expression, gene cloning, and characterization of five novel fitases from four basídiomycete ítingi: Peniophora lycii, Agrocybe pediades, a Ceriporia sp., and Trametes pubescens. Appl. Environ. Microbiol. 67 (10), 4701-4707 (2001) - Pénicillium funiculosum (PF): Godo Al346 lote 1301 WO 03054199 - Trigo (B): referência Sigma P 1259. WO 0183763 - Schwanniomyces castellii (SC): produzido em Candida boidinii lote 10059 CN 25 EP 0931837 - Debaryomyces castellii cepa CBS 2923 (DC). 2. Método enzimátíco A atividade fitasíca é medida seguindo a liberação de fosfato inorgânico durante o tempo. A atividade é medida em presença de 8 mM fitato de sódio (Sigma) dissolvido em um tampão acetato de sódio pH 5.5, 200 mM à 37°C (5 volumes). A reação é iniciada por adição de extrato enzimático (1 volume). A reação é parada por acidulação do meio por ácido tricloroacético 20% (1 volume de meio de reação + 1 volume de ácido). A quantidade de fosfato liberada é determinada após diferente tempos de incubação.

Uma unidade enzimática (U) é definida como a quantidade de enzima que libera um pmol de fosfato inorgânico em um minuto. 3. Condição de hidrólise dos fítatos com diferentes pHs A hidrólise é realizada a 40°C em 10 ml de tampão acetato 250 mM para os pH 4 a 6,5 ou tampão glicina 200 mM a pH 3, contendo: 0,340 mM de fitato de sódio, 0,04 ou 0,08 U/mL de fitase. As retiradas são realizadas em tempos diferentes durante 120 min. A reação é parada por adição de ácido tricloroacético.

Os fosfatos são dosados diretamente sem diluição. 4. Dosagem dos fosfatos A quantidade de fosfato liberada é revelada por colorimetria. A solução de revelação, preparada extemporaneamente, contém sulfato de ferro (380 mM, 1 volume) e heptamolibdato de amônio (12 mM, 4 volumes). A medida da absorbância, a 700 nm, é feita após 30 min de revelação em temperatura ambiente (1 volume de meio de reação + 1 volume de solução de revelação), com a ajuda de um espectrofotômetro UV / visível (Beckman DU 530).

Um reta de escalonagem é previamente estabelecida com di-hídrogenofosfato de potássio.

RESULTADOS 1. Fitases testadas As fitases testadas se distinguem de acordo com diferentes critérios (1) características bioquímicas (pH ótimo, estéreo-especificidade: 3, 4 ou 6 fitases), (2) número de ligações fosfatos hidrolisadas.

Todas estas fitases tem um pH ótimo de hidrólise próximo de 5, no entanto as fitases de AN e PL tem um segundo pH ótimo a 2,5. Três hidrolisam totalmente os fosfatos (SC, DC, Trigo). A posição hidrolisada em primeiro é seja a posição 3 (AN, PL, DC), seja a posição 6 (PL), seja a posição 4 (trigo) (tabela 1) Tabela 1 - Comparação de características bioquímicas das fitases (1) Ullah, A. H. J e Sethumadhavan, K., (2003) PhyA gene product of Aspergillus flcuum and Peniophora lycii produces dissimilar fitases. Biochemical and Biophysical Research Communications 303:463-468 (2) WO 03054199 Filed Jun 13 2003 Bohlmann, R., Moussu, F, Nore, O, Pierrard, I, Saunier, D., Testeniere, O., New polynucleotide encoding fungai fitase, useful as feed additíve to improve fosfato assimilation, also new strain of Pénicillium. (3) Nakano, T., Joh, T., Narita, K., Hayakawa, T. (2000) The pathway of defosforylation of mio-Inositol Hexaquisphosphate by Fitases from Wheat Bran of Tricicum aestivum L. cv Nourini/61. Biosci. Biotechnol. Biochem., 64:995-1003 (4) Segueilha, L., Lambrechts, C, Boze, H., Moulin, G. and Galzy, P. (1992) Purification and Properties of the Fitase from Schwanniomyces castellii. J. Ferment. Bíoeng.. 74(1): 7-11. 2. Comparação da eficácia de hidrólise de ácido fítico por 6 fitases em diversos pHs O estudo é realizado em presença de 0,340 mM de fitase. A quantidade de enzima suprida corresponde a 0,08 U/mL de fitase, medida nas condições padrão a pH 5,5. Os valores de pH testados são de 3,4, 5,5, 6, 6,5. A reação é seguida durante 120 min. As retiradas são efetuadas com o tempo, a reação é parada por acidificação, os fosfatos são dosados por colorimetria. A comparação de diversas fitases é feita em função de eficácia de hidrólise, ísto é, porcentagem de fosfato liberado por relação à porcentagem teórica. Os resultados são apresentados na figura 1 A. A partir da literatura, 4 fitases (PF, SC, DC, B) são capazes de hidrolisar totalmente o ácido fítico em inositol e fosfato; 2 fitases (AN e PL) só hidrolisam 5 ligações seja 83% do fósforo em potencial.

Nas condições testadas a pH 3 e pH 4, 4 fitases (SC, PF] DC e PL) hidrolisam 80% pelo menos do ácido fítico. A fitase de trigo é pouco ativa nos pH 3 e 4. Para os valores de pH superiores a pH 5,5, nenhuma fitase hidrolisa mais do que 70% do ácido fítico. As fitases PF e DC são pouco ativas a pH 6,5. A fitase AN é a menos sensível às variações de pH, no entanto ela só libera 60 à 70% dos fosfatos seja valores 10 à 20% inferiores aos esperados. (Fig 2A). A comparação das velocidades iniciais de liberação dos fosfatos mostra uma grande heterogeneidade entre as fitases (figura 3A). A fitase de melhor desempenho a pH ácido é a de Schwanniomyces castellii enquanto que a de A. niger tem o melhor desempenho nos valores de pH superiores a 5,5. A fitase de tribo é a menos eficaz, quaisquer que sejam as condições testadas. 3. Influência do pH sobre a velocidade de liberação de fosfato em presença de fitases associadas A fim de melhorar a eficácia de hidrólise de ácido fítico, várias associações de duas fitases são testadas. Cada fitase é suprida a 0,04 U/ml, seja um valor total de 0,08 U/ml no tubo de reação. A fitase DC, hidrolisando 6 ligações fosfato, é sistematicamente testada em associação com outras fitases, hidrolisando 5 ou 6 ligações fosfato. Duas outras associações são igualmente usadas para comparar de um lado uma outra associação de fitase podendo liberar 6 e 5 fosfatos (SC/ΑΝ), por outro lado duas fitases PL/AN, tendo características bioquímicas muito próximas (figura 1B).

Uma análise global permite mostrar que a associação de 2 fitases favorece a maior parte do tempo a eficácia de hidrólise do ácido fítico. Enquanto que nas mesmas condições, nenhuma fitase não hidrolisa totalmente o ácido fítico, para 2 misturas (DC/AN e SC/AN), 100% à 85% das ligações fosfato são hidrolisadas qualquer que seja o pH. Para a associação DC/PL observa-se igualmente um ganho de cerca de 20% nos pHs ácidos. As associações PL/AN, DC/PF e DC/SC oferecem pouca melhora (Fig. 2B). A comparação das velocidades iniciais de hidrólise, mostra que existe um forte efeito sinergístico para a associação SC/AN e para a associação DC/AN em relação às fitases sozinhas e em relação às outras associações de fitases. As diferenças de velocidade de hidrólise ligadas ao pH são minimizadas quando da associação. As outras associações são menos eficazes, o efeito sinergístico só é visível para alguns pH, por exemplo, para DC/PL em pH 3 e 4 (Fig. 3). O efeito sinergístico parece ser devido em grande parte à capacidade das fitases de hidrolisar a totalidade dos fosfatos. Além disso, as melhores associações se referem às fitases tendo pH ótimo de atividade complementar (2,5-4,5). É necessário no entanto notar que se tem pouco efeito sinergístico para as fitases de menor desempenho em termos de eficácia de hidrólise como as de trigo e de Pénicillium funiculosum. 4. Influência das concentrações e da proporção de fitases sobre a eficácia de hidrólise do ácido fítico Os requerentes compararam a influência da quantidade de fitase (efeitos dose) e da proporção da mistura de fitases sobre a hidrólise do ácido fítico. Três associações são usadas DC/AN, DC/PL e AN/PL, e 2 concentrações (0,04 e 0,08 U/mL) em fitases são testadas (tabelas 2 e 3). Tabela 2: Comparação da porcentagem de hidrólise de ácido fítico para as diferentes associações, testadas em duas concentrações finais 0,04 e 0,08 U/ml. As três primeiras colunas dão valores para as três fitases sozinhas na concentração de 0,08 U/ml.

Os valores entre parênteses representam a relação entre os valores obtidos com 0,04 U/ml e as em presença de 0,08 U/ml.

As porcentagens de hidrólise quando do estudo em mistura ^concentração global 0,08 U/ml) são superiores ás determinadas com enzima sozinhas (0,08 U/ml) e próximas de 100% para as misturas AN/DC e PL/DC e a em uma gama de pH variando de 3 a 6. A mistura AN/PL não aumenta de modo significante a porcentagem de hidrólise observada com cada fitase tomada em separado. A redução por um fator 2 da quantidade global suprida (0,04 U/ml) não induz uma diminuição em 2 dos fosfatos liberados. Em alguns casos, AN/DC e PL/DC à pH 4 e pH 5,5, e AN/PL pH 4 à 6, as porcentagens de hidrólise são equivalentes às observadas em presença de 0,08U/ml (Tabela 3).

Tabela 3 - Comparação das velocidades iniciais de hidrólise (pmol/ ml/ min) do ácido fítico para as diferentes associações, testadas nas duas concentrações finais 0,04 e 0,08 U/ml.

As três primeiras colunas dão valores para as três fitases sozinhas na concentração 0,08 U/ml.

Os valores entre parêntese representam a relação entre as velocidades obtidas com 0,04 U/ml e as em presença de 0,08 U/ml. A associação de fitase permite portanto diminuir a quantidade de fitase no meio de reação por um fator dois mantendo uma eficácia de hidrólise idêntica e a em uma gama de pH estendida. Se nota um efeito nítido da dose sobre a liberação de fosfato.

Por outro lado, as velocidades iniciais de hidrólise do ácido fítico são pelo menos duas vezes mais baixas em presença de 0,04 U/mL de fitase que em presença de 0,08 U/mL (tabela 3). Estes resultados apoiam a hipótese de que a sinergia entre as fítases permite essencialmente a hidrólise total dos fosfatos presentes. A proporção de cada fitase no meio de reação não parece ter muita influência sobre a eficácia de hidrólise (tabela 4). Em todos os casos, um aumento da quantidade de fosfato liberado é observado, com uma leve vantagem para uma associação a 50% de cada fitase, principalmente para os pHs superiores a 5,5.

Tabela 4- Comparação da porcentagem de hidrólise de ácido fítico em função da proporção de cada fitase na mistura. A quantidade global permanece em todos os casos de 0,08 U/ml.

Nas condições de experiência, nenhum fitase hidrolisa totalmente o ácido fítico em inositol e fosfatos, apesar de que 4 dentre elas sejam capazes de liberar todos os fosfatos de acordo com a literatura. Quanto fitases, SC, PF, DC, PL hidrolisam 80% das ligações fosfato nos valores de pH 3 e 4. Duas misturas DC/AN e SC/ΑΝ hidrolisam de 80% à 100% das ligações fosfato em todos os pHs testados. A associação de fitase de tipo, 3-fitase (AN, DC, PF), 4- fitase (B) ou 6-fitase (PL) entre si não ocasiona melhora notável. A complementação e a sinergia entre fitases parece depender de 3 critérios próprios de cada fitase; (1) de seu perfil de atividade em função do pH, (2) de sua camada em hidrolisar a totalidade ou não dos fosfatos. A utilização de tais associações em nutrição animal podería permitir diminuir as quantidades de fitases usadas em pelo menos 20% e portanto diminuir os custos. O teor em fosfato de origem fítica no alimento seria igualmente aumentado, melhorado o valor alimentício e permitiría assim diminuir o suprimento de fosfato inorgânico. A poluição provocada pelos dejetos de fosfato não disponível seria assim diminuída.

REIVINDICAÇÕES

Claims (14)

1. Composição associando pelo menos duas fitases para a hidrólise do ácido fítico (mio-inositol 1,2,3,4,5,6- hexuquis fosfato), caracterizada pelo fato de que compreende: a) uma primeira fitase da SEQ ID NO: 1 ou da SEQ ID NO: 2 que é uma 3-fitase catalisando a hidrólise de seis ligações fosfato do ácido fítico; b) uma segunda fitase da SEQ ID NO: 3 que é uma 3-fitase catalisando a hidrólise de pelo menos cinco ligações fosfato do ácido fítico,

2. Composição, dc acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a primeira fitase tem uma temperatura ótima compreendida entre 55"C e 80"C e um pH ótimo compreendido entre pH 3,5 e pH 5.

3. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a primeira fitase é uma fitase da levedura Schwanniomyces custeUii ou uma fitase da levedura Deba ryomyces caste i!ii.

4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a segunda fitase tem uma temperatura ótima compreendida entre 50"C e ó(fC e um pH ótimo compreendido entre pH 2 e pH 6.

5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a segunda fitase é uma fitase de Aspergiíius niger.

6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações l a 5, caracterizada pelo fato de que consiste em um aditivo nutricional para animais ou em um alimento para animais,

7. Utilização dc uma composição, tal como dcfmída em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de ser para a fabricação de um aditivo nutricional para animais ou um alimento para animais.

8. Utilização de uma composição, tal como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de ser para aumentar a disponibilidade do fósforo fítico.

9. Processo de hidrólise de ácido fítico (mio-inositol 1,2,3,4,5,6-hexaquis fosfato) em monofosfatos inorgânicos, em mio-inositóis de grau de fosforilação inferior e em mio-inositol livre, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) uma primeira fitase da SEQ ID NO: 1 ou da SEQ ID NO: 2 que é uma 3-fitase catalisando a hidrólise de seis ligações fosfato do ácido fítico; b) uma segunda fitase da SEQ ID NO: 3 que é uma 3-fitase catalisando a hidrólise de pelo menos cinco ligações fosfato do ácido fítico, c) coloca-se simultaneamente em contato o ácido fítico com a primeira fitase e a segunda fitase.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a primeira fitase tem uma temperatura ótima compreendida entre 55°C e 80°C e um pH ótimo compreendido entre pH 3,5 e pH 5.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que a primeira fitase é uma fitase da levedura Schwanniomyces castellii ou uma fitase da levedura Debaryomyces castellii.

12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que a segunda fitase tem uma temperatura ótima compreendida entre 50°C e 60°C e um pH ótimo compreendido entre pH 2 e pH 6.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que a segunda fitase é uma fitase de Aspergillus niger.

14. Kit ou conjunto para a alimentação de animais, caracterizado pelo fato de que compreende: a) a fitase de Schwanniomyces castellii da SEQ ID NO: 1 ou a fitase de Debaryomyces castellii da SEQ ID NO: 2;b) a fitase de Aspergillus niger da SEQ ID NO: 3.