JP2009500028A - フィチン酸の加水分解におけるフィターゼの併用の相乗効果 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 なし
Description
配列番号1:シャウンニオマイセス・カステリ(Schwanniomyces castellii)フィターゼ
配列番号2:デバリオマイセス・カステリ(Debaryomyces castellii)フィターゼ
配列番号3:アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)フィターゼ
配列番号4:ペニシリウム・フニクロサム(Penicillium funiculosum)フィターゼ
配列番号5:ペニオフォラ・リシイ(Peniophora lycii)フィターゼ
配列番号6:コムギフィターゼをコードする配列
配列番号7:コムギ(Triticum aestivum)フィターゼ。
配列番号1のフィターゼと少なくとも80%の同一性を示すか、または配列番号2のフィターゼと少なくとも80%の同一性を示す第1のフィターゼと;
配列番号3のフィターゼと少なくとも80%の同一性を示す第2のフィターゼ
を含んでなる組成物である。
配列番号1のフィターゼと少なくとも80%の同一性を示すか、または配列番号2のフィターゼと少なくとも80%の同一性を示す第1のフィターゼを提供する工程と;
配列番号3のフィターゼと少なくとも80%の同一性を示す第2のフィターゼを提供する工程と;
フィチン酸を、前記第1のフィターゼおよび前記第2のフィターゼと同時に接触させる工程
を含んでなる方法にも関する。
配列番号1のシャウンニオマイセス・カステリフィターゼまたは配列番号2のデバリオマイセス・カステリフィターゼ;
配列番号3のアスペルギルス・ニガーフィターゼ
を含んでなる動物を飼育するためのキットまたはアセンブリー(assembly)でもある。
有益な実施形態において、前記第2のフィターゼは配列番号3のフィターゼである。
図1:単独または対で併用した6のフィターゼについての、種々のpHにおけるフィチン酸の加水分解の動態の比較。結果は、放出された理論的なリン酸塩の%として表される。
1.フィターゼ起源
アスペルギルス・ニガー Natuphos (AN): バッチR2503またはバッチ057NPHO2
Wim van Hartingsveldt, Cora M. J. van Zeijl, G. Marian Harteveld, Robin J. Gouka, Marjon E.G. Suykerbuyk, Ruud G. M. Luiten, Peter A. van Paridon, Gerard C. M. Selten, Annemarie E. Veenstra, Robert F. M. van Gorcom and Cees A. M. J. van den Hondel; Cloning, characterization and overexpression of the phytase-encoding gene (phyA) of Aspergillus niger. Gene, 127, (1) 87-94 (1993)
ペニオフォラ・リシイ (PL): バッチ 172NHSO2
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ペニシリウム・フニクロサム (PF): Godo A1346 バッチ 1301
WO 03054199
コムギ (B): Sigma reference P1259.
WO 0183763
シャウンニオマイセス・カステリ (SC): カンジダ・ボイジニイ(Candida boidinii)バッチ10059 CN 25において産生
EP 0931837
デバリオマイセス・カステリ株 CBS 2923 (DC)。
フィターゼ活性は、一定時間に渡って無機リン酸塩の放出を追うことにより測定される。
加水分解は、40℃で、0.340mMのフィチン酸ナトリウム、0.04または0.08U/mlのフィターゼを含有する、10mlの250mMアセテート緩衝液, pH4〜6.5、200mMグリシン緩衝液, pH3において行われる。試料は、120分間の種々の時間で取る。反応は、トリクロロ酢酸の添加により停止する。
リン酸塩は、希釈せずに直接的に分析される。
放出されるリン酸塩の量は、比色により可視化される。可視化溶液は、即席で調製され、硫酸鉄(380 mM, 1容積)およびヘプタモリブデン酸アンモニウム(12 mM, 4容積)を含む。UV/可視分光光度計(ベックマン DU 530)を用いて、外界温度で30分間可視化した後(反応媒質 1容積+可視化溶液 1容積)、700nmで吸収を測定する。
検量線は、リン酸二水素カリウムを用いて予め作成する。
1.フィターゼ試験
試験されるフィターゼは、種々の基準によると相互に異なる:(1)生物化学的な特徴(至適pH、立体特異性:3、4、または6フィターゼ)、(2)加水分解されるリン酸結合の数。
(2) 2003年6月13日に出願されたWO 03054199 Bohlmann, R., Moussu, F., Nore, O., Pierrard, J., Saunier, D., Testeniere, O., New polynucleotide encoding fungal phytase, useful as feed additive to improve phosphate assimilation, also new strain of Penicillium.
(3) Nakano, T., Joh, T., Narita, K., Hayakawa, T. (2000) The pathway of dephosphorylation of myo-Inositol Hexakisphosphate by Phytases from Wheat Bran of Tricicum aestivum L. cv Nourin#61. Biosci. Biotechnol. Biochem., 64:995-1003
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試験は、0.340mMのフィテートの存在下で行われる。導入される酵素の量は0.08U/mlのフィターゼに対応し、pH5.5における標準的な条件下で測定される。試験されるpH値は、3、4、5.5、6、6.5である。反応は、120分間観察する。試料を一定時間採取した後、酸性化により反応を停止させ、比色によりリン酸塩を分析する。
フィチン酸加水分解の効率を改善するために、2つのフィターゼのいくつかの組み合わせが試験される。各フィターゼは、0.04U/ml、すなわち全体量0.08U/mlで反応チューブに導入される。6のリン酸結合を加水分解するDCフィターゼは、5または6のリン酸結合を加水分解する他のフィターゼと組み合わせて、系統的に試験される。2つの他の組み合わせが比較のために使用され、第1に、6および5のリン酸塩を放出することができるフィターゼの他の組み合わせ(SC/AN)、第2に、非常によく似た生化学的な性質を有する2つのフィターゼPL/ANである(図1B)。
我々は、フィチン酸加水分解におけるフィターゼの量(用量効果)およびフィターゼの混合物の比率の影響を比較した。DC/AN、DC/PL、およびAN/PLの3つの組み合わせが使用され、2つのフィターゼ濃度(0.04および0.08U/ml)について試験された(表2および3)。
Claims (22)
- フィチン酸(ミオイノシトール 1,2,3,4,5,6-六リン酸)の加水分解のための少なくとも2のフィターゼを組み合わせた組成物であって、
a)配列番号1のフィターゼと少なくとも80%の同一性を示すか、または配列番号2のフィターゼと少なくとも80%の同一性を示す第1のフィターゼと;
b)配列番号3のフィターゼと少なくとも80%の同一性を示す第2のフィターゼ
を含んでなることを特徴とする組成物。 - 前記第1のフィターゼは、フィチン酸の6のリン酸結合の加水分解を触媒する3-フィターゼであることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記第1のフィターゼは、55℃〜80℃の至適温度およびpH3.5〜pH5の至適pHを有することを特徴とする、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記第1のフィターゼは、酵母シャウンニオマイセス・カステリのフィターゼまたは酵母デバリオマイセス・カステリのフィターゼであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第1のフィターゼは、配列番号1のフィターゼまたは配列番号2のフィターゼであることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第2のフィターゼは、フィチン酸の少なくとも5のリン酸結合の加水分解を触媒する3-フィターゼであることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第2のフィターゼは、50℃〜60℃の至適温度およびpH2〜pH6の至適pHを有することを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第2のフィターゼはアスペルギルス・ニガーフィターゼであることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第2のフィターゼは配列番号3のフィターゼであることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組成物。
- 動物のための栄養添加物または動物の飼料からなることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の組成物。
- 動物のための栄養添加物または動物の飼料の製造のための、請求項1〜9のいずれか1項に記載の組成物の使用。
- フィチン酸のリンの利用能を増大させ、動物の飼料の消化性を改善するための、請求項1〜10のいずれか1項に記載の組成物の使用。
- フィチン酸(ミオイノシトール 1,2,3,4,5,6-六リン酸)を、無機一リン酸塩、より低いリン酸化度であるミオイノシトール、および遊離のミオイノシトールに加水分解する方法であって、
a)配列番号1のフィターゼと少なくとも80%の同一性を示すか、または配列番号2のフィターゼと少なくとも80%の同一性を示す第1のフィターゼを提供する工程と;
b)配列番号3のフィターゼと少なくとも80%の同一性を示す第2のフィターゼを提供する工程と;
c)フィチン酸を、前記第1のフィターゼおよび前記第2のフィターゼと同時に接触させる工程
を含んでなることを特徴とする方法。 - 前記第1のフィターゼは、フィチン酸の6のリン酸結合の加水分解を触媒する3-フィターゼであることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- 前記第1のフィターゼは、55℃〜80℃の至適温度およびpH3.5〜pH5の至適pHを有することを特徴とする、請求項13または14に記載の方法。
- 前記第1のフィターゼは、酵母シャウンニオマイセス・カステリのフィターゼまたは酵母デバリオマイセス・カステリのフィターゼであることを特徴とする、請求項13〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のフィターゼは、配列番号1のフィターゼまたは配列番号2のフィターゼであることを特徴とする、請求項13〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2のフィターゼは、フィチン酸の少なくとも5のリン酸結合の加水分解を触媒する3-フィターゼであることを特徴とする、請求項13〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2のフィターゼは、50℃〜60℃の至適温度およびpH2〜pH6の至適pHを有することを特徴とする、請求項13〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2のフィターゼはアスペルギルス・ニガーフィターゼであることを特徴とする、請求項13〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2のフィターゼは配列番号3のフィターゼであることを特徴とする、請求項13〜20のいずれか1項に記載の方法。
- a)配列番号1のシャウンニオマイセス・カステリフィターゼまたは配列番号2のデバリオマイセス・カステリフィターゼ;
b)配列番号3のアスペルギルス・ニガーフィターゼ
を含んでなることを特徴とする、動物を飼育するためのキットまたはアセンブリー。
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