CN102697040B

CN102697040B - 含金福菇草酸脱羧酶的干粉和菌粉的制备方法

Info

Publication number: CN102697040B
Application number: CN201210181783.9A
Authority: CN
Inventors: 李青山; 阮荣; 刘海峰; 宋保平; 陈先桥
Original assignee: WUHAN KANGFUDE BIO-TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: Wuhan Kangfude Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2012-06-05
Filing date: 2012-06-05
Publication date: 2015-08-26
Anticipated expiration: 2032-06-05
Also published as: CN102697040A

Abstract

本发明公开了一种含金福菇草酸脱羧酶的干粉和菌粉的制备方法，涉及人体或动物体胃肠中草酸盐的降解领域，该方法包括以下步骤：以金福菇或其同属真菌为原料，采用液体发酵方式培养菌体，调节发酵液pH值到2.0~5.0，诱导生产草酸脱羧酶，收集发酵液与菌体后进行菌体粉碎，然后进行固液分离，分别得到含金福菇草酸脱羧酶的液体部分和固体部分，再分别干燥分离获得的液体部分与固体部分，即得到含金福菇草酸脱羧酶的干粉和菌粉。本发明制备的含金福菇草酸脱羧酶的干粉和菌粉可用于食品、饮料及饲料等去草酸加工，也可作为原料制备保健品或药品，适合口服，在胃肠中能够有效降解草酸及草酸盐，能预防或治疗尿草酸过多症及草酸钙结石。

Description

含金福菇草酸脱羧酶的干粉和菌粉的制备方法

技术领域

本发明涉及人体或动物体胃肠中草酸盐的降解领域，特别是涉及一种含金福菇草酸脱羧酶的干粉和菌粉的制备方法。

背景技术

结石病每年给全球数以千万的人带来痛苦，并且导致上百亿美元的经济损失。草酸钙结石是最常见的结石，约占全部结石的75%。人体中的草酸盐主要来源于两种途径：从饮食中吸收和生理代谢产生。除极少数有原发性草酸病的病人外，正常人生理代谢产生的草酸盐一般在一定的范围内，变化不大，但从饮食中吸收的草酸盐的量却因人而异，草酸钙结石病人从饮食中吸收的草酸盐比正常人平均多 50% （参见R. Holmes 等，Urol. Res，32：311~316，2004）。体内的草酸盐主要由尿液排出体外，尿液中草酸盐排除量超出正常值即为尿草酸盐过多症，其是衡量由于尿草酸盐过量产生的尿道、膀胱及肾草酸钙结石的一个重要指标。

目前，肾结石的治疗方法包括体外冲击波破碎、微创手术或开放手术，这些方法不仅费用昂贵，还给肾脏带来创伤。结石复发率很高，对复发病人反复使用手术，会导致其肾功能衰竭。

为了预防从饮食中吸收草酸盐，病人需要终生坚持每餐服用药品或食品添加剂，因而服用的药品或食品添加剂需无副作用。柠檬酸钾是唯一经临床试验证实能抑制结石生长的预防型药物，但病人需要长年每日口服1~2克，由于服用量大，副作用强，许多人难以承受其副作用而不得不停止治疗。

人们虽然已进行一系列的努力来降低这些结石病人从食品中吸收草酸盐，下面介绍从文献中检索到的各种可能方法：

1、口服微生物，例如：多种芽孢杆菌和双歧杆菌的混合物制品，（参见申请号为00808182.4的中国专利）。该方法中的微生物制剂临床效果不明显，因为这些微生物可以不用草酸盐而生存（参见D. Goldfarb等，Clin. J. Am. Soc. Nephrol，2：745~749，2007）。

2、口服稀土金属盐，从胃肠中吸收草酸盐（参见申请号为02808557.4的中国专利）。然而，长期服用，可能有毒副作用。

3、将草酸氧化酶（参见申请号为US2006/023115的PCT申请）或草酸脱羧酶（参见申请号为US11/833082的美国专利）制成蛋白晶体，再用戊二醛交联提高其稳定性，然后将这些晶体制成口服药剂，用于降解胃肠中的草酸盐。然而，长期服用，可能有毒副作用。

4、口服一种肠道中寄生的以草酸盐为能源物质的活细菌制剂（参见申请号为US66/99469的美国专利）。该方法中的微生物制剂非常难以制备，成本极高，效果未知。

5、草酸脱羧酶的结构、反应机理及其在自然中的分布已有详细叙述（参见D.Svedruzic等，Arch. Biochem. Biophys.，433，176~192，2005），草酸脱羧酶（EC 4. 1. 1. 2）催化的化学反应式为：

HOOC~COOH → CO2 + HCOOH。

但目前所有文献报道的草酸脱羧酶只在酸性pH下有活力，因为肠道中的pH在6.0~7.5之间，属于中性pH，因此草酸脱羧酶不适合在肠道中降解草酸盐。

目前还没有找到一种在肠道中降解草酸盐的简单有效的办法。对于尿草酸盐吸收过多的人群，尤其是那些反复生长结石的病人而言，亟需一种安全、有效、无创伤且价廉的方法来降低其食入的草酸盐，以达到预防和治疗结石的目的。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述背景技术的不足，提供一种含金福菇草酸脱羧酶的干粉和菌粉的制备方法，其制备的金福菇草酸脱羧酶菌粉适合口服，与传统手术方式相比无创伤，且在胃肠中能够有效降解草酸及草酸盐，减少人体或动物体从饮食制品中吸收草酸盐，能够预防或治疗尿草酸过多症及草酸钙结石；安全、无毒副作用，可长期服用；制备简便，成本低。

本发明提供的含金福菇草酸脱羧酶的干粉和菌粉的制备方法，包括以下步骤：A、以金福菇或其同属真菌为原料，采用液体发酵方式培养菌体，然后调节发酵液pH值到2.0~5.0之间，诱导生产草酸脱羧酶，收集发酵液与菌体；B、粉碎收集的发酵液和菌体后进行固液分离，分别得到含金福菇草酸脱羧酶的液体部分和固体部分，再分别干燥分离获得的液体部分与固体部分，即得到含金福菇草酸脱羧酶的干粉和菌粉。

在上述技术方案中，步骤B中得到的含金福菇草酸脱羧酶的干粉为粗酶干粉，通过蛋白质纯化的方法进一步纯化，即制成纯酶干粉。

在上述技术方案中，步骤A中所述液体发酵的过程如下：液体培养基成分为：酵母粉，7 g/L；大豆蛋白胨，6 g/L；KH₂PO₄，2 g/L；MgSO₄·7·H₂O，0.5 g/L；CaCl₂，0.2 g/L；葡萄糖，10 g/L；蔗糖，20 g/L；在121℃对液体培养基灭菌30分钟后，培养金福菇菌丝体，培养温度为25℃，摇瓶装量为10%，转速为150~200转/分钟，或发酵罐培养，培养温度为25℃，转速为200~300转/分钟；接种量为10~30%，培养3~8天后，将发酵液pH值调到2.5~4.5，诱导草酸脱羧酶的生产，并在培养液中加入含锰的物质；诱导生产5~15天后，收集菌体与发酵液。

在上述技术方案中，步骤A中调节发酵液pH值到pH4.5~5.0、pH4.0~4.5、pH3.5~4.0、pH3.2~3.5、pH3.0~3.2、pH2.8~3.0、pH2.5~2.8或者pH2.0~2.5。

在上述技术方案中，所述含锰的物质包括MnCl₂、MnSO₄、KMnO₄和MnO₂。

在上述技术方案中，当加入的含锰的物质为MnCl₂时，加入的MnCl₂的浓度为0.001~100毫摩尔浓度。

在上述技术方案中，所述菌体和发酵液中均含有草酸脱羧酶，每克菌体含10~1000单位草酸脱羧酶，每升发酵液含50~20000单位草酸脱羧酶。

在上述技术方案中，步骤B中采用喷雾干燥法或冷冻干燥法进行干燥。

在上述技术方案中，所述喷雾干燥法的过程如下：对于发酵液，将发酵液经过膜浓缩5~20倍后，采用喷雾干燥机进行干燥，喷雾干燥机的入口温度为140~220℃，出口温度为80~105℃，其它参数根据喷雾干燥机的尺寸进行调节，酶活力的得率在80~95%；对于菌体，将菌体经过均浆机打碎后，再采用喷雾干燥机进行干燥，喷雾干燥机的入口温度为140~240℃，出口温度为80~110℃，其它参数根据喷雾干燥机的尺寸进行调节，酶活力的得率在80~95%。

在上述技术方案中，所述冷冻干燥法的过程如下：将发酵液浓缩后冻干；将菌体粉碎后冻干。

与现有技术相比，本发明的优点如下：

（1）本发明制备的金福菇（Tricholoma Lobayensc Heim）草酸脱羧酶不仅在胃的酸性环境中（pH2~6）有活力，而且在肠的广阔的中性pH环境（pH6.0~7.5）中稳定并且有高活力，对含草酸脱羧酶的食用菌金福菇（Tricholoma Lobayensc Heim）菌粉而言，草酸脱羧酶绝大多数包在微小菌粉中，受到保护而不被胃肠中蛋白酶降解，因此非常适合口服，与传统手术方式相比无创伤，且用该酶或含该酶的菌粉作为活性组分，来制备或加工的食品、饲料、食品添加剂、饲料添加剂、保健品或药品，在胃肠中能够有效降解草酸及草酸盐，减少人体或动物体从饮食制品中吸收草酸盐，能够预防或治疗尿草酸过多症及草酸钙结石。

（2）本发明的原料来自食用菌，无毒副作用，比较安全，可长期服用。

（3）本发明的制备简便，成本低，能够降低尿草酸过多症及草酸钙结石患者的开销。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。

本发明实施例提供的含金福菇草酸脱羧酶的干粉和菌粉的制备方法，包括以下步骤：

A、以金福菇（Tricholoma Lobayensc Heim）或其同属真菌等食用菌为原料，采用液体发酵方式培养大量菌体，然后调节发酵液pH值到2.0~5.0之间，进行诱导草酸脱羧酶的生产，之后收集发酵液与菌体。液体发酵的过程如下：液体培养基成分为：酵母粉，7 g/L；大豆蛋白胨，6 g/L；KH₂PO₄，2 g/L；MgSO₄·7·H₂O，0.5 g/L；CaCl₂，0.2 g/L；葡萄糖，10 g/L；蔗糖，20 g/L；在121℃对液体培养基灭菌30分钟后，培养金福菇菌丝体，培养温度为25℃，摇瓶装量为10%，转速为150~200转/分钟，或发酵罐培养，培养温度为25℃，转速为200~300转/分钟；接种量为10~30%，培养3~8天后，将发酵液pH值调到2.0~5.0，诱导草酸脱羧酶的生产，并在培养液中加入含锰的物质，例如MnCl₂、MnSO₄、KMnO₄或MnO₂，当加入的含锰的物质为MnCl₂时，加入的MnCl₂的浓度为0.001~100毫摩尔浓度。实际应用上，可调节发酵液pH值到pH4.5~5.0、pH4.0~4.5、pH3.5~4.0、pH3.2~3.5、pH3.0~3.2、pH2.8~3.0、pH2.5~2.8或者pH2.0~2.5，其中，pH3.2~3.5效果最好。诱导生产5~15天后，收集发酵液与菌体。菌体和发酵液中均含有草酸脱羧酶，每克菌体含10~1000单位草酸脱羧酶，每升发酵液含50~20000单位草酸脱羧酶。

B、粉碎收集的发酵液和菌体后进行固液分离，分别得到含金福菇草酸脱羧酶的液体部分和固体部分，再采用喷雾干燥法或冷冻干燥法分别干燥分离获得的液体部分和固体部分，即得到含金福菇草酸脱羧酶的干粉和菌粉。该含金福菇草酸脱羧酶的干粉为粗酶干粉，通过蛋白质纯化的方法进一步纯化，即制成纯酶干粉。

喷雾干燥法的过程如下：对于液体部分，先经过膜浓缩5~20倍后，采用喷雾干燥机进行干燥，喷雾干燥机的入口温度为140~220℃，出口温度为80~105℃，其它参数根据喷雾干燥机的尺寸进行调节，酶活力的得率在80~95%。对于固体部分，将其用水悬浮后，再采用喷雾干燥机进行干燥，喷雾干燥机的入口温度为140~240℃，出口温度为80~110℃，其它参数根据喷雾干燥机的尺寸进行调节，酶活力的得率在80~95%。

该液体部分与固体部分也可以用一般生物制品冷冻干燥的方法进行干燥，其干燥结果与喷雾干燥相似。冷冻干燥法的过程如下：将液体部分浓缩后冻干；将固体部分直接冻干。

下面通过8个具体实施例来说明含金福菇草酸脱羧酶的干粉和菌粉的制备方法的步骤。

实施例1、步骤如下：

A、以金福菇或其同属真菌等食用菌为原料，采用液体发酵方式培养大量菌体，液体培养基成分为：酵母粉，7 g/L；大豆蛋白胨，6 g/L；KH₂PO₄，2 g/L；MgSO₄·7·H₂O，0.5 g/L；CaCl₂，0.2 g/L；葡萄糖，10 g/L；蔗糖，20 g/L；在121℃对液体培养基灭菌30分钟后，培养金福菇菌丝体，培养温度为25℃，摇瓶装量为10%，转速为150~160转/分钟，或发酵罐培养，培养温度为25℃，转速为200~220转/分钟；接种量为10~15%，培养3~4天后，将发酵液pH值调到4.5~5.0，诱导草酸脱羧酶的生产，并在培养液中加入浓度为0.001~1 mM的MnCl₂。诱导生产5~7天后，收集发酵液与菌体。菌体和发酵液中均含有草酸脱羧酶，每克菌体含10~300单位草酸脱羧酶，每升发酵液含50~10000单位草酸脱羧酶。

B、粉碎收集的发酵液和菌体后进行固液分离，分别得到含金福菇草酸脱羧酶的液体部分和固体部分，再采用喷雾干燥法分别干燥分离获得的液体部分和固体部分，即得到含金福菇草酸脱羧酶的干粉和菌粉。该含金福菇草酸脱羧酶的干粉为粗酶干粉，通过蛋白质纯化的方法进一步纯化，即制成纯酶干粉。

喷雾干燥法的过程如下：对于液体部分，经过膜浓缩5~10倍后，采用喷雾干燥机进行干燥，喷雾干燥机的入口温度为140~160℃，出口温度为80~88℃，其它参数根据喷雾干燥机的尺寸进行调节，酶活力的得率在80~90%。对于固体部分，将其用水悬浮后，再采用喷雾干燥机进行干燥，喷雾干燥机的入口温度为140~170℃，出口温度为80~90℃，其它参数根据喷雾干燥机的尺寸进行调节，酶活力的得率在80~88%。

实施例2、步骤如下：

A、以金福菇或其同属真菌等食用菌为原料，采用液体发酵方式培养大量菌体，液体培养基成分为：酵母粉，7 g/L；大豆蛋白胨，6 g/L；KH₂PO₄，2 g/L；MgSO₄·7·H₂O，0.5 g/L；CaCl₂，0.2 g/L；葡萄糖，10 g/L；蔗糖，20 g/L；在121℃对液体培养基灭菌30分钟后，培养金福菇菌丝体，培养温度为25℃，摇瓶装量为10%，转速为165~175转/分钟，或发酵罐培养，培养温度为25℃，转速为230~250转/分钟；接种量为16~20%，培养5~6天后，将发酵液pH值调到4.0~4.5，诱导草酸脱羧酶的生产，并在培养液中加入浓度为2~30 mM的MnCl₂。诱导生产8~10天后，收集发酵液与菌体。菌体和发酵液中均含有草酸脱羧酶，每克菌体含50~500单位草酸脱羧酶，每升发酵液含100~10000单位草酸脱羧酶。

喷雾干燥法的过程如下：对于液体部分，经过膜浓缩8~16倍后，采用喷雾干燥机进行干燥，喷雾干燥机的入口温度为170~190℃，出口温度为89~95℃，其它参数根据喷雾干燥机的尺寸进行调节，酶活力的得率在85~93%。对于固体部分，将其用水悬浮后，再采用喷雾干燥机进行干燥，喷雾干燥机的入口温度为180~200℃，出口温度为85~100℃，其它参数根据喷雾干燥机的尺寸进行调节，酶活力的得率在82~92%。

实施例3、步骤如下：

A、以金福菇或其同属真菌等食用菌为原料，采用液体发酵方式培养大量菌体，液体培养基成分为：酵母粉，7 g/L；大豆蛋白胨，6 g/L；KH₂PO₄，2 g/L；MgSO₄·7·H₂O，0.5 g/L；CaCl₂，0.2 g/L；葡萄糖，10 g/L；蔗糖，20 g/L；在121℃对液体培养基灭菌30分钟后，培养金福菇菌丝体，培养温度为25℃，摇瓶装量为10%，转速为180~185转/分钟，或发酵罐培养，培养温度为25℃，转速为260~270转/分钟；接种量为21~25%，培养7~8天后，将发酵液pH值调到3.5~4.0，诱导草酸脱羧酶的生产，并在培养液中加入浓度为50~70 mM的MnCl₂。诱导生产11~12天后，收集发酵液与菌体。菌体和发酵液中均含有草酸脱羧酶，每克菌体含100~800单位草酸脱羧酶，每升发酵液含500~18000单位草酸脱羧酶。

喷雾干燥法的过程如下：对于液体部分，经过膜浓缩12~20倍后，采用喷雾干燥机进行干燥，喷雾干燥机的入口温度为200~220℃，出口温度为96~105℃，其它参数根据喷雾干燥机的尺寸进行调节，酶活力的得率在88~95%。对于固体部分，将其用水悬浮后，再采用喷雾干燥机进行干燥，喷雾干燥机的入口温度为210~240℃，出口温度为95~110℃，其它参数根据喷雾干燥机的尺寸进行调节，酶活力的得率在83~93%。

实施例4、步骤如下：

A、以金福菇或其同属真菌等食用菌为原料，采用液体发酵方式培养大量菌体，液体培养基成分为：酵母粉，7 g/L；大豆蛋白胨，6 g/L；KH₂PO₄，2 g/L；MgSO₄·7·H₂O，0.5 g/L；CaCl₂，0.2g/L；葡萄糖，10 g/L；蔗糖，20 g/L；在121℃对液体培养基灭菌30分钟后，培养金福菇菌丝体，培养温度为25℃，摇瓶装量为10%，转速为190~200转/分钟，或发酵罐培养，培养温度为25℃，转速为280~300转/分钟；接种量为26~30%，培养6~7天后，将发酵液pH值调到3.2~3.5，诱导草酸脱羧酶的生产，并在培养液中加入浓度为80~100 mM的MnCl₂。诱导生产13~15天后，收集发酵液与菌体。菌体和发酵液中均含有草酸脱羧酶，每克菌体含200~1000单位草酸脱羧酶，每升发酵液含1000~20000单位草酸脱羧酶。

B、粉碎收集的发酵液和菌体后进行固液分离，分别得到含金福菇草酸脱羧酶的液体部分和固体部分，再采用冷冻干燥法：将液体部分浓缩后冻干；将固体部分直接冻干，即得到含金福菇草酸脱羧酶的干粉和菌粉。该含金福菇草酸脱羧酶的干粉为粗酶干粉，通过蛋白质纯化的方法进一步纯化，即制成纯酶干粉。酶活力的得率在85~95%。

实施例5、除步骤A中“将发酵液pH值调到3.0~3.2，诱导草酸脱羧酶的生产，并在培养液中加入MnSO₄”与实施例4不同外，其余步骤和参数都与实施例4相同。

实施例6、除步骤A中将“发酵液pH值调到2.8~3.0，诱导草酸脱羧酶的生产，并在培养液中加入KMnO₄”与实施例4不同外，其余步骤和参数都与实施例4相同。

实施例7、除步骤A中“将发酵液pH值调到2.5~2.8，诱导草酸脱羧酶的生产，并在培养液中加入MnO₂”与实施例4不同外，其余步骤和参数都与实施例4相同。

实施例8、除步骤A中“将发酵液pH值调到2.0~2.5，诱导草酸脱羧酶的生产，并在培养液中加入MnSO₄”与实施例4不同外，其余步骤和参数都与实施例4相同。

本发明实施例中的金福菇草酸脱羧酶不仅在酸性pH条件下，即胃中有活力，而且在pH6.0~7.5之间，即肠中有高活力。草酸脱羧酶菌粉受菌的细胞组分保护而不受胃肠蛋白酶的破坏，在胃肠中稳定并具有高活性，因而十分适合于制成口服制品在胃肠中降解草酸盐。几乎所有的以植物为原材料的食品，饮料，中药制剂以及饲料均含有草酸盐，其中绿叶蔬菜，巧克力，可可，花生及花生制品，黄豆及豆制品，茶叶及含茶饮料，咖啡，各种麦类谷物等中含量很高。草酸脱羧酶可制成食品添加剂或药品与食品一起食入，在胃肠中降解饮食品中的草酸盐以降低草酸盐被肠道吸收。

本发明实施例中可以采用HPLC（High Performance Liquid Chromatography，高效液相色谱法）方法测定草酸含量（参见C. Clausen*等，International Biodeterioration & Biodegradation 62：372–375，2008），也可以通过美国Trinity Biotech的试剂盒（St. Louis， Mo.）采用比色法测定草酸含量。具体草酸脱羧酶活力测定的过程如下：将0.8ml 10mM（毫摩尔浓度）草酸盐溶液（其中含50mM柠檬酸盐缓冲液，pH值为4.5），在37˚C预热10分钟后，加入0.1ml含草酸脱羧酶的溶液或菌粉悬浮液开始反应。反应30分钟后，加入0.1ml 1N（当量浓度）盐酸使酶失活。迅速离心并取上清液，用HPLC测定残留草酸盐浓度。一个酶活力单位（U）为在此条件下，每分钟降解1个微摩尔草酸盐所需的酶量。

下面说明本发明实施例中制备的含金福菇草酸脱羧酶的干粉和菌粉的应用。

1、菌粉对草酸脱羧酶在模拟肠道环境下的保护作用

将含金福菇草酸脱羧酶的干粉和菌粉分别配制成1U/mL的溶液与悬浮液，然后与等体积的含6.4mg/mL胰蛋白酶的50 mM磷酸盐缓冲液（pH值为7.5）混合，37˚C下搅拌，在一系列的时间点取样分析残留的酶活力。含金福菇草酸脱羧酶的干粉在10分钟内失去全部活力，而含金福菇草酸脱羧酶的菌粉在1小时后，还保留了70%的活力。此结果表明了菌粉对草酸脱羧酶的保护作用。因为肠道是食物消化的重要场所，其中有大量的蛋白酶存在。因此，菌粉对草酸脱羧酶的保护作用是保证草酸脱羧酶在肠道中不被蛋白酶降解，发挥降解草酸盐作用的重要条件。

2、菌粉对草酸脱羧酶在模拟胃环境下的保护作用

将含金福菇草酸脱羧酶的干粉和菌粉分别配制成1U/mL的溶液与悬浮液，然后与等体积的含3.2mg/mL胃蛋白酶的50 mM柠檬酸缓冲液（pH值为2.5）混合，37˚C下搅拌，在一系列的时间点取样分析残留的酶活力。含金福菇草酸脱羧酶的干粉在30分钟内失去全部活力，而含金福菇草酸脱羧酶的菌粉在2小时后，还保留了90%的活力。此结果表明了菌粉对草酸脱羧酶的保护作用。因为胃是食物消化的重要场所之一，其中有大量的胃蛋白酶存在。因此，菌粉对草酸脱羧酶的保护作用是保证草酸脱羧酶在胃中不被蛋白酶降解，发挥降解草酸盐作用的重要条件。

3、草酸脱羧酶活力pH值范围

草酸脱羧酶活力pH值范围的测定与活力测定方法除使用的缓冲液及pH不同外，其它部分相同。使用的缓冲液为：50 mM 甘氨酸缓冲液，pH值为：2、2.5；50 mM 柠檬酸盐缓冲液，pH值为：3、 3.5、4、4.5、5；50 mM磷酸盐缓冲液，pH值为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。参见表1所示，金福菇的草酸脱羧酶活力pH值范围是2~8。在pH6.0~7.5之间，仍然有很高活力，与肠中的pH条件相符，适合在肠中除去食入物品中的草酸盐，这是其它传统草酸脱羧酶与草酸氧化酶都不具备的特性，它们只在酸性pH值下有活力。

表1、金福菇的草酸脱羧酶活力pH值范围

pH	2	2.5	3	4	5	5.5	6	6.5	7	7.5	8
												相对活力(%)	4	43	98	100	78	65	53	32	23	12	6

4、除去中性pH食品中的草酸盐

在1升大小的摇瓶中放入5克菠菜、20克熟牛肉、25克番茄、50克米饭、200ml水，打碎成糊状，调整pH值至7.0，加水至500ml，调温至37˚C，加入2克金福菇菌丝干菌粉（约含100个单位草酸脱羧酶）或100个单位草酸脱羧酶酶粉，摇匀，并维持在200转/分钟转速下摇动。分别在0、5、10、20、30、60、90、120、180分钟取样，立即离心，取上清液，用HPLC分析草酸盐含量，结果参见表2所示。可见，金福菇菌丝粉能迅速除去中性pH食品中的可溶草酸盐，并将其浓度控制在0.02mM或以下。

表2、用金福菇菌丝粉除去中性pH食品中的草酸盐

时间	0	5	10	20	30	60	90	120	180
										可溶草酸浓度（mM）	0.28	0.09	0.04	0.03	0.03	0.02	0.01	0.02	0.02

5、除去酸性pH食品中的草酸盐

在1升大小的摇瓶中放入5克菠菜、20克熟牛肉、25克番茄、50克米饭、200ml水，打碎成糊状，调pH至3.0，加水至500 ml，调温至37˚C，加入2克金福菇菌丝干菌粉（约含100个单位草酸脱羧酶）或100个单位草酸脱羧酶酶粉，摇匀，并维持在200转/分钟转速下摇动。在0，5，10，20， 30，60，90，120，180分钟取样，立即离心，取上清液，用HPLC分析草酸盐含量，结果参见表3所示。可见，金福菇菌丝粉能迅速除去酸性pH食品中的可溶草酸盐，并将其浓度控制在0.02mM或以下。

表3、用金福菇菌丝粉除去酸性pH食品中的草酸盐

时间	0	5	10	20	30	60	90	120	180
										可溶草酸浓度（mM）	0.48	0.11	0.05	0.04	0.04	0.01	0.01	0.02	0.02

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

Claims

1.一种含金福菇草酸脱羧酶的干粉和菌粉的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

A、以金福菇为原料，采用液体发酵方式培养菌体，液体培养基成分为：酵母粉，7g/L；大豆蛋白胨，6g/L；KH₂PO₄，2g/L；MgSO₄·7·H₂O，0.5g/L；CaCl₂，0.2g/L；葡萄糖，10g/L；蔗糖，20g/L；在121℃对液体培养基灭菌30分钟后，培养金福菇菌丝体，培养温度为25℃，摇瓶装量为10％，转速为150～200转/分钟，或发酵罐培养，培养温度为25℃，转速为200～300转/分钟；接种量为10～30％，培养3～8天后，然后调节发酵液pH值到2.0～5.0之间，诱导生产草酸脱羧酶，并在培养液中加入含锰的物质；诱导生产5～15天后，收集发酵液与菌体；

B、粉碎收集的发酵液和菌体后进行固液分离，分别得到含金福菇草酸脱羧酶的液体部分和固体部分，再分别干燥分离获得的液体部分与固体部分，即得到含金福菇草酸脱羧酶的干粉和菌粉，所述菌体和发酵液中均含有草酸脱羧酶，每克菌体含10～1000单位草酸脱羧酶，每升发酵液含50～20000单位草酸脱羧酶，金福菇草酸脱羧酶在肠中，pH值为6.0～7.5的中性环境中稳定并且有高活力。

2.如权利要求1所述的含金福菇草酸脱羧酶的干粉和菌粉的制备方法，其特征在于：步骤B中得到的含金福菇草酸脱羧酶的干粉为粗酶干粉，通过蛋白质纯化的方法进一步纯化，即制成纯酶干粉。

3.如权利要求1所述的含金福菇草酸脱羧酶的干粉和菌粉的制备方法，其特征在于：步骤A中调节发酵液pH值到pH4.5～5.0、pH4.0～4.5、pH3.5～4.0、pH3.2～3.5、pH3.0～3.2、pH2.8～3.0、pH2.5～2.8或者pH2.0～2.5。

4.如权利要求1所述的含金福菇草酸脱羧酶的干粉和菌粉的制备方法，其特征在于：所述含锰的物质选自MnCl₂、MnSO₄、KMnO₄或MnO₂。

5.如权利要求4所述的含金福菇草酸脱羧酶的干粉和菌粉的制备方法，其特征在于：当加入的含锰的物质为MnCl₂时，加入的MnCl₂的浓度为0.001～100毫摩尔浓度。

6.如权利要求1至5中任一项所述的含金福菇草酸脱羧酶的干粉和菌粉的制备方法，其特征在于：步骤B中采用喷雾干燥法或冷冻干燥法进行干燥。

7.如权利要求6所述的含金福菇草酸脱羧酶的干粉和菌粉的制备方法，其特征在于：所述喷雾干燥法的过程如下：对于液体部分，经过膜浓缩5～20倍后，采用喷雾干燥机进行干燥，喷雾干燥机的入口温度为140～220℃，出口温度为80～105℃，其它参数根据喷雾干燥机的尺寸进行调节，酶活力的得率在80～95％；对于固体部分，将其用水悬浮后，再采用喷雾干燥机进行干燥，喷雾干燥机的入口温度为140～240℃，出口温度为80～110℃，其它参数根据喷雾干燥机的尺寸进行调节，酶活力的得率在80～95％。

8.如权利要求6所述的含金福菇草酸脱羧酶的干粉和菌粉的制备方法，其特征在于：所述冷冻干燥法的过程如下：将液体部分浓缩后冻干；将固体部分直接冻干。