ES2285698T3

ES2285698T3 - Procedimiento para la preparacion de un pienso para cerdas.

Info

Publication number: ES2285698T3
Application number: ES94115697T
Authority: ES
Inventors: Norimasa C/O Central Research Lab. Ohnishi; Yasuhiko C/O Ajinomoto Co. Inc. Toride; Akinori C/O Techn. & Engineering Lab. Uehara; Ei-Ichi Kokue
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1993-10-05
Filing date: 1994-10-05
Publication date: 2007-11-16
Anticipated expiration: 2014-10-05
Also published as: CA2133610C; EP0646322A1; US5728398A; KR950010769A; AU683911B2; US5814333A; CN1105820A; DK0646322T3; DE69434973D1; DE69434973T2; CN1066317C; CA2133610A1; KR100313381B1; EP0646322B1; TW264374B; AU7307894A

Abstract

Procedimiento para la preparación de un pienso para cerdas que comprende un aditivo de pienso que comprende como ingrediente activo para mejorar la eficacia de la reproducción una forma reducida de ácido fólico o un derivado activo de la misma en una cantidad que proporciona un aporte de 0, 1 a 100 µg (en forma reducida de ácido fólico) por kg de peso corporal de una cerda al día, en el que dicha forma reducida de ácido fólico está en forma de células disgregadas o extracto celular de un microorganismo, en el que dicho procedimiento comprende cultivar las células en un medio al que se ha añadido ácido p-aminobenzoico, una forma oxidada de ácido fólico y/o un ácido nucleico en una cantidad comprendida entre 1 mg/l y 1 g/l y obtener dichas células disgregadas o extracto celular.

Description

Procedimiento para la preparación de un pienso para cerdas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un pienso para cerdas.

Técnica anterior

El ácido fólico es una coenzima que participa en la síntesis de aminoácidos, tales como metionina, serina y ácido glutámico y bases purínicas de ácidos nucleicos que constituyen los ADN. Se ha confirmado por reconocimientos epidemiológicos en mujeres embarazadas y en pruebas en cobayas preñadas que la demanda de ácido fólico aumenta y su concentración en el plasma sanguíneo disminuye en los cuerpos de las madres durante el embarazo [Pritchard J. A. et al., Am. J. Obst. Gynecol., vol. 104, pág. 388 (1969) y Habibzadeh H. C. et al., Br. J. Nutr., vol. 55, pág. 23 (1986)].

Se ha confirmado también en relación con los cerdos, el animal doméstico, que la cantidad de forma reducida de los ácidos fólicos en el plasma sanguíneo de cerdas disminuye durante el embarazo [Natsuhori et al., Programa final y libro de resúmenes del 10º Simposium Internacional: "Chemistry and Biology of Pteridines and Flates", pág. 196 (1993)]. Se ha demostrado también que la eficacia de la reproducción puede mejorarse administrando ácido fólico (en forma oxidada) a cerdas preñadas por inyección intramuscular [Matte J. J. et al., J. Anim. Sci., vol. 67 pág. 426 (1989) y Friendship R. M. et al., Can Vet. J., vol. 32, pág. 564 (1991)], que presenta la importancia de la administración de ácidos fólicos a cerdas preñadas (cerdas).

Sin embargo, la administración de ácido fólico a cerdas por inyección intramolecular es problemática en la práctica y es muy preferida si se expresa el efecto de mejora de la eficacia de la reproducción cuando se administra ácido fólico mediante la adición al pienso (administración oral). Se han realizado ya numerosas investigaciones sobre la mejora de la eficacia de la reproducción basadas en la administración oral. Sin embargo algunos consideran la administración eficaz [Thaler R. C. et al., J. Anim. Sci., vol. 67, pág. 3.360 (1989), Lindemann M. D. et al., J. Anim. Sci., vol. 67, pág. 459 (1989) y Lindemann M. D. et al., J. Anim. Sci., vol. 71, pág. 239 (1991)], y otros son escépticos acerca de sus efectos [Easter R. A. et al., Nutrition Reports International, vol. 28, pág. 945 (1983) y Matte J. J. et al., Livestock Production Science, vol. 33, pág. 131 (1992)]. No existe una conclusión clara sobre los efectos de la administración oral de una forma oxidada de ácido fólico.

En general, el ácido fólico se sintetiza químicamente. El ácido fólico sintetizado químicamente es de forma oxidada, y la forma oxidada del ácido fólico por sí misma no opera como coenzima. Normalmente, una vez se ha absorbido en el cuerpo, se transfiere mediante la ácido dihidrofólico deshidrogenasa en ácido 7,8-dihidrofólico, que se reduce a continuación enzimáticamente a formas reducidas de ácido fólico tales como el ácido tetrahidrofólico (THF) o el ácido 5-metiltetrahidrofólico (5MF) para expresar la función como coenzima. Por consiguiente, el efecto de la administración de ácidos fólicos puede determinarse midiendo la cantidad de THF o 5MF en el plasma sanguíneo. Sin embargo, no es una gran cantidad de ácidos fólicos de tipo inactivo la que debe administrarse a los cerdos para aumentar el índice de ácidos fólicos de tipo activo en el plasma sanguíneo mediante la administración oral de ácidos fólicos de tipo inactivo.

Con el fin de analizar los efectos de la administración de ácidos fólicos a los cerdos, el procedimiento HPLC-ECD se ha desarrollado recientemente para determinar el contenido de ácidos fólicos de tipo activo en el plasma sanguíneo mediante una cromatografía líquida de alto rendimiento utilizando un detector electroquímico, y, utilizando este procedimiento, se han llevado a cabo investigaciones sobre el grado de aparición de THF y 5MF en el plasma sanguíneo en el momento de administrar el ácido fólico (forma oxidada) a los cerdos mediante inyección intravenosa, inyección intramuscular o administración oral. Para ser más específicos, 4 cerdos criados con un peso corporal de aproximadamente 25 kg se sometieron según el procedimiento de cuadrado latino a 4 factores: inyección intravenosa (1mg/kg de peso corporal), inyección intramuscular (1 mg/kg de peso corporal), administración oral de dosificación reducida (1mg/kg de peso coporal) y administración oral de dosificación amplia (50 mg/kg de peso corporal), de ácido fólico (forma oxidada) y se llevaron a cabo pruebas. Como resultado, la concentración de THF y 5MF en el plasma sanguíneo aumentó en los casos de inyección intravenosa, inyección intramuscular y administración oral de dosificación amplia. En consecuencia, se considera que el ácido fólico administrado (una forma oxidada) fue absorbido y convertido en ácidos fólicos de tipo activo en el hígado, etc. Por otro lado, THF y 5MF no apareció en el plasma sanguíneo en los casos de administración oral de dosificación reducida. Con respecto a lo expuesto anteriormente, véase Eiichi Kokue et al., "Abstract Book of the 113^{th} Convention of Japan Veterinary Society", pág. 112 (1992). Con relación a las ratas, es conocido que la concentración de formas reducidas de ácido fólico aumenta rápidamente incluso cuando se administra una forma oxidada de ácido fólico en una dosis reducida [Tsunematu K. et al., Cong. Anom., Vol. 30, p. 113 (1990)].

A partir de lo expuesto anteriormente, se considera que los cerdos tienen la capacidad de convertir ácidos fólicos de tipo inactivo en ácidos fólicos de tipo activo, pero su capacidad de absorción de ácidos fólicos de tipo inactivo del tracto digestivo es mucho menor que el de las ratas. Asimismo, se ha descubierto que debe administrarse una cantidad extremadamente elevada de ácidos fólicos de tipo inactivo a los cerdos para aumentar el valor de los ácidos fólicos de tipo activo en el plasma sanguíneo medinate la administración oral de ácidos fólicos de tipo inactivo.

Problemas que deben ser resueltos por la invención

La presente invención se ha preparado en vista de la técnica anterior. Sus objetivos consisten en proporcionar un procedimiento para la preparación de un pienso para cerdas que sea capaz de aumentar la concentración de las formas reducidas del ácido fólico en el plasma sanguíneo y, como resultado, mejorar la eficacia de la reproducción.

Medidas tomadas para resolver los problemas

Con la finalidad de resolver los problemas anteriores, se han realizado intensas investigaciones en la presente invención. Como resultado, se ha descubierto que la concentración de formas reducidas de ácido fólico en el plasma sanguíneo de cerdas puede aumentarse añadiendo una forma reducida de ácido fólico al pienso y administrándolo por vía oral a cerdas, y han completado la presente invención basándose en este descubrimiento.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un pienso para cerdas que comprende un aditivo de pienso que comprende como ingrediente activo para mejorar la eficacia de la reproducción una forma reducida de ácido fólico o un derivado activo de la misma en una cantidad que proporciona un aporte de 0,1 a 100 \mug (en forma reducida de ácido fólico) por kg de peso corporal de una cerda al día, en el que dicha forma reducida de ácido fólico está en forma de células disgregadas o extracto celular de un microorganismo, en el que dicho procedimiento comprende cultivar las células en un medio al que se ha añadido ácido p-aminobenzoico, una forma oxidada de ácido fólico y/o un ácido nucleico en una cantidad de 1 mg/l a 1 g/l y obtener dichas células disgregadas o el extracto celular.

La invención se explicará con detalle a continuación.

Como es bien sabido, normalmente se genera una pluralidad de embriones (embriones múltiples) a través de la fertilización en el útero de las cerdas. Sin embargo, todos los embriones múltiples generados de este modo no siempre nacen de una manera segura. Naturalmente, resulta muy deseable desde el punto de vista de la gestión de la cría de cerdos que todos los embriones múltiples una vez generados puedan llegar al mundo de una manera segura. En la presente invención, la expresión "mejora en la eficacia de la cría de cerdas" significa que el índice de embriones que han nacido de una manera segura con respecto al número total de embriones generados aumenta cuando las cerdas reciben una administración oral con el aditivo de pienso según la presente invención o cuando se las alimenta con pienso según la invención, en comparación con los casos en los que no reciben dicha administración o no son alimentadas.

Las células disgregadas o el extracto celular de la invención de un microorganismo que contiene una forma reducida de ácido fólico.

Respecto a las células disgregadas o al extracto celular de un microorganismo, se han utilizado levaduras, tal como la levadura Torula, como fuente de vitaminas para piensos. Sin embargo, las vitaminas contenidas en sus células se absorben sólo escasamente ya que se utilizan habitualmente sin destrucción de las paredes celulares.

En vista de lo anterior, se han realizado intensas investigaciones y se ha descubierto que puede aumentarse la cantidad de THF y 5MF en el plasma sanguíneo de cerdas administrando por vía oral las células destruidas o el extracto celular de un microorganismo, a saber, productos preparados sometiendo a las células de un microorganismo a un tratamiento de destrucción mecánica, a un tratamiento de digestión enzimática o a autolisis a fin de preparar las formas reducidas de ácido fólico en estado fácilmente absorbible. Por consiguiente, la eficacia de la reproducción puede aumentarse administrando el producto a cerdas preñadas.

Como materia prima puede utilizarse cualquier microorganismo para producir las células disgregadas o el extracto celular, con la condición de que los productos (células destruidas mecánicamente o células destruidas enzimáticamente) tengan un alto contenido de formas reducidas de ácido fólico. Los ejemplos específicos incluyen bacterias, tales como Corynebacterium glutamicum (denominación anterior: Brevibacterium lactofermentum) (ATCC 13.869), Corynebacterium ammoniagenes (denominación anterior: Brevibacterium ammoniagenes) (ATCC 6.871), Brevibacterium flavum (ATCC 13.826), Corynebacterium glutamicum (ATCC 13.032, ATCC 13.060), Bacillus subtilis (ATCC 13.952, IFO 3.009, IFO 13.169), Lactococcus lactis subesp. cremoris (ATCC 19.257); levaduras, tales como Saccharomyces cerevisiae, (IFO 2.044, IFO 2.375), Candida utilis (denominación anterior: Torulopsis utilis) (ATCC 9.226); y hongos, tales como Aspergillus oryzae (IFO 30.104), Aspergillus niger (IFO 4.414).

Puede utilizarse cualquier medio de cultivo para cultivar estos microorganismos, con la condición de que los nutrientes asimilables a los microorganismos estén contenidos en éstos. Por ejemplo, pueden utilizarse medios ordinarios añadidos de forma apropiada con fuentes de carbono, tales como carbohidratos, como por ejemplo glucosa, sacarosa, alcoholes, tales como etanol, glicerol, ácidos orgánicos, tales como ácido acético, ácido propiónico, aceites de soja, y mezclas de éstos; nutrientes orgánicos o inorgánicos que contienen nitrógeno, tales como extracto de levadura, peptona, extracto de carne, maíz impregnada en solución, sulfato de amonio, amoníaco, nutrientes inorgánicos, tales como fosfatos, magnesio, hierro, manganeso, potasio; y vitaminas, tales como biotina y tiamina.

Para el cultivo, las condiciones habitualmente empleadas para el cultivo de estos microorganismos pueden utilizarse sin ninguna modificación. Por ejemplo, los microorganismos pueden cultivarse en un medio nutriente entre 20 y 40ºC a un pH comprendido en el intervalo entre 4,0 y 9,5 durante un periodo comprendido entre 20 horas y 5 días.

La cantidad de formas reducidas de ácido fólico producidas en las células de un microorganismo obtenido mediante el cultivo se aumenta añadiendo ácido p-aminobenzoico, una forma oxidada del ácido fólico y/o un ácido nucleico en el medio de cultivo. El ácido nucleico utilizado contiene guanosina, inosina, xantina, ácido 5'-guanílico, ácido 5'-inosínico, ácido 5'-xantílico, guanosina-5'-difosfato y guanosina-5'-trifosfato. Estos aditivos pueden añadirse en una cantidad en la que puede aumentarse la cantidad de formas reducidas de ácido fólico producidas en las células, en comparación con los casos en los que no se añaden aditivos, en una cantidad de 1 mg/litro a 1 g/litro, preferentemente de 10 a 100 mg/litro. Si la cantidad añadida es demasiado pequeña, no se alcanzará ningún efecto, mientras que si es demasiado, el crecimiento de los microorganismos puede inhibirse.

Las células obtenidas de este modo por cultivo se someten a tratamiento de disgregación o extracción después de separarse del líquido de cultivo mediante un procedimiento apropiado. Pero el cultivo puede someterse al tratamiento de disgregación o extracción directamente o tras la concentración, cuando los ingredientes del medio de cultivo pueden administrarse por vía oral a las cerdas y si no afecta al rendimiento del tratamiento de disgregación. Además, las células que deben someterse al tratamiento de disgregación o extracción pueden ser células vivas o células des-
truidas.

No existe limitación particular en el procedimiento de disgregación de las células. Por ejemplo, la destrucción puede realizarse por un procedimiento mecánico conocido hasta ahora, así como por un procedimiento que utiliza enzimas. Los procedimientos mecánicos por sí mismos pueden realizarse según los anteriores. Por ejemplo, las células de un microorganismo pueden disgregarse con perlas de vidrio utilizando "Beads Beater" (fabricado por Biospec Co.), o la disgregación de las células puede realizarse a presión, o puede realizarse utilizando un disgregador ultrasónico. Además, en el caso en que las células de un microorganismo sean disgregadas por una enzima, el procedimiento puede realizarse por sí mismo según un procedimiento anterior. Por ejemplo, una vez las células cultivadas se han sometido a un tratamiento térmico de esterilización tal como están, se añade a éstas una enzima que digiere la pared celular, para descomponer las paredes celulares de los microorganismos. Para esta descomposición, puede utilizarse cualquier enzima, con la condición de que sea capaz de digerir y disgregar las paredes celulares. Las enzimas bien conocidas tales como lisozimas, proteasas, zimoliasas, son ejemplos típicos de enzimas que poseen dicha capacidad. El tratamiento enzimático puede realizarse según condiciones conocidas.

No existe ninguna limitación concreta sobre el procedimiento de extracción de las células. Por ejemplo, la extracción puede realizarse por autolisis o calentando las células en agua caliente en un intervalo de temperatura comprendido entre 90ºC y 120ºC.

Las células destruidas preparadas de este modo o el extracto celular puede administrarse por vía oral tal cual o en una forma concentrada o seca apropiada, o en forma de mezcla añadida con los aditivos apropiados. Dado que los ácidos fólicos casi no están presentes en las paredes celulares, es posible eliminar los fragmentos restantes de las paredes celulares de las células destruidas. Es de rutina que entre las posibles formas de administración oral se incluya una en la que las células disgregadas o el extracto celular se añade a un pienso y las cerdas se alimentan con el
pienso.

Es también de rutina que las diversas formas reducidas del ácido fólico pueden utilizarse individualmente o dos o más de ellas pueden utilizarse en combinación.

Teniendo en cuenta la conveniencia de la utilización, el aditivo alimentario para las cerdas obtenido por el procedimiento según la presente invención puede distribuirse en una forma de dosificación apropiada, incluyendo concentrados, polvos secos, gránulos, con o sin adición de vehículos apropiados.

El pienso para cerdas se caracteriza porque se añade a éste el aditivo del pienso para cerdas.

No existe dificultad concreta en la producción de dicho pienso para cerdas. Puede producirse según un procedimiento conocido para la producción de piensos de formulación, excepto que el aditivo del pienso se añada a éste.

La explicación se dará a continuación en un punto que debe considerarse con respecto a la adición del aditivo del pienso para cerdas. Es la cantidad que debe añadirse. El aditivo del pienso para cerdas debe añadirse en una cantidad en la que aparezcan los efectos de la adición. Esto es, se añade en una cantidad que proporcione un aporte de 0,1 a 100 \mug (en forma reducida de ácido fólico) por kg de peso corporal de una cerda al día. Si la cantidad añadida es demasiado pequeña, no se alcanzará ningún efecto. Los efectos de la adición no aumentarán aún si se añade en una cantidad mayor del intervalo anterior y por consiguiente será inútil.

No existe ninguna dificultad concreta en el procedimiento de mejora de la eficacia de la reproducción. Todas las condiciones de la reproducción pueden estar de acuerdo con los procedimientos anteriores conocidos hasta ahora, excepto que la cantidad de una forma reducida de ácido fólico considerada es de 0,1 a 100 \mug, por kilo de peso corporal de las cerdas.

En el procedimiento de reproducción, la duración de la administración oral o la alimentación es la siguiente: Dado que la finalidad de administrar la forma reducida de ácido fólico consiste en criar con seguridad a los embriones múltiples del nacimiento generados por fertilización en el interior del útero de una cerda, tantos como sea posible, si es posible, todos ellos, la ingesta oral de la forma reducida de ácido fólico se comienza en un momento comprendido entre aproximadamente dos meses antes del apareamiento (fertilización) y justo después del apareamiento, y la ingesta se continúa hasta que se confirma que los embriones o fetos múltiples se han desarrollado hasta una etapa segura del nacimiento (por ejemplo, dos meses después del apareamiento) o hasta su nacimiento por motivos de
seguridad.

Ejemplos

La presente invención se explicará mediante ejemplos.

Ejemplo 1

(Solamente de referencia)

Efectos de la administración de Leucovorin

Se realizaron las pruebas utilizando dos lechones Gettingen de la misma camada (cerdos de 0,7 años con un peso corporal de 15 kg; uno para la prueba y otro para comparación).

Una suspensión acuosa al 0,75% de leucovorin (producido por Sigma Co.) se administró por vía oral mediante alimentación forzada (se inyectó directamente en el interior del estómago a través de un tubo fino flexible) al animal de ensayo que se había mantenido en ayunas desde el día anterior, en una cantidad de 50 g por kg de peso corporal. A título de comparación, la alimentación forzada se realizó exactamente de la misma manera, excepto que se utilizó ácido fólico (una forma oxidada; producida por Kongo Kagaku Co.) en lugar de leucovorin.

Se tomaron muestras de sangre 1, 3, 6, 9 y 24 horas después de la administración de las sustancias de ensayo y se analizaron cuantitativamente dos clases de ácidos fólicos de tipo activo, a saber el ácido tetrahidrofólico (THF) y el ácido 5-metiltetrahidrofólico (5MF) contenido en los plasmas sanguíneos de los cerdos. Como referencia, se controló también la sangre antes de la administración de las sustancias de ensayo, y se sometió la sangre al mismo análisis cuantitativo (referencia).

Los detalles de los análisis cuantitativos eran los siguientes. A 0,2 ml de una muestra de sangre tomada se añadió 0,2 ml de ácido perclórico 0,5 M y la mezcla resultante se sometió a centrifugación de 5.000 g X 2 min, para eliminar las proteínas. Cien (100) \mul del sobrenadante obtenido se sometieron a cromatografía líquida de alto rendimiento. El análisis se realizó utilizando una columna de "4,6 mm \phi \times 150 mm de fase unida a fenilo" (producida por Irica Co.). Para la fase móvil, se utilizó una mezcla de 97,5:2,5 (v/v) de tampón de acetato de potasio 20 mM (pH 3,6) y acetonitrilo, y el caudal fue de 0,8 ml/min. Para la detección, se utilizó "Electrochemical Detector Type E-502" (producido por Irica Co.), y la determinación se realizó a un voltaje aplicado de -300
mV.

Los resultados de la determinación se presentan en la Tabla 1 siguiente.

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TABLA 1

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Como se deduce de la Tabla 1, la concentración de THF en el plasma sanguíneo aumentó inmediatamente después de la administración de leucovorin, y a continuación aumentó la concentración de 5MF. El comportamiento de los dos ácidos fólicos de tipo activo en la sangre es muy comprensible ya que se ha sabido que leucovorin cambia a THF y a continuación a 5MF en el metabolismo en los organismos. El hecho de que la concentración de THF en el plama sanguíneo aumente en 1 hora indica que la absorción de leucovorin en el cuerpo procede muy suavemente. Por otra parte, en la administración oral del ácido fólico (tipo inactivo) realizada para comparación, no se observaron cambios en el valor de los ácidos fólicos en el plasma sanguíneo.

Ejemplo 2

(Solamente de referencia)

Efectos de la administración del ácido 7,8-dihidrofólico

Se realizaron las pruebas utilizando dos lechones Gettingen de la misma camada (cerdos de 2 años con un peso corporal de aproximadamente 20 kg).

Ácido 7,8-dihidrofólico (producido por Sigma Co.) en solución de ascorbato sódico al 0,2% se alimentó a la fuerza por vía oral a los animales de la prueba que se habían mantenido en ayunas durante 24 horas, en una cantidad de 1 mg o 0,2 mg por kg de peso corporal. Se tomaron muestras de sangre después de la administración y se analizaron cuantitativamente los ácidos fólicos de tipo activo contenidos en los plasmas sanguíneos de la misma manera que en el Ejemplo 1.

En la Tabla 2 siguiente se presenta el cambio de las concentraciones de THF y 5MF en los plasmas sanguíneos de los dos cerdos.

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TABLA 2

2

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Como se desprende de la Tabla 2, la administración de ácido 7,8-dihidrofólico en ambas cantidades condujo a un aumento notable de la concentración de THF, aunque la concentración de 5MF disminuyó en la misma me-
dida.

Ejemplo 3

(Solamente de referencia)

Efectos de la administración de hígado en polvo

Se repitió exactamente la prueba de la misma manera que en el Ejemplo 1, incluyendo los animales de ensayo, excepto que se alimentó a la fuerza una suspensión acuosa al 50% de polvos de hígado de cerdo en una cantidad de 5 g como polvos de hígado (que contenían formas oxidadas y formas reducidas de ácido fólico en una cantidad de 0,08 mg en total) en lugar de la suspensión acuosa de leucovorin. Se utilizan también aquí los resultados de la prueba de comparación del Ejemplo 1.

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Los resultados se muestran en la Tabla 3.

TABLA 3

3

Como se deduce de la Tabla 3, en el ensayo de los polvos de hígado, la concentración de THF aumentó rápidamente y la concentración de 5MF también aumentó. Esto se debe probablemente a que una gran cantidad de 5MF está contenida en los polvos de hígado. Por otra parte, en la comparación, tal como se menciona en el Ejemplo 1, no se observó ningún aumento en la concentración de 5MF y THF en el plasma sanguíneo. Debe entenderse que la absorción de los ácidos fólicos en el cuerpo es sumamente buena, considerando el hecho de que el contenido de ácidos fólicos en 5 g de polvos de hígado es de 0,08 g (incluyendo los ácidos fólicos de tipo inactivo) se tiene en consideración.

Ejemplo 4

(Solamente de referencia)

Preparación de las células disgregadas de microorganismos (a) Cultivo de microorganismos

En matraces de 500 ml se vertieron 50 ml en cada uno de un medio de cultivo que presenta la composición mostrada en la Tabla 4 indicada a continuación. Tras la esterilización por calentamiento, se inocularon en el medio una aguja de inoculación de platino de células de cada uno de los microorganismos mostrados en la Tabla 5, las bacterias utilizadas se cultivaron previamente en un medio de cultivo con agar-agar a 30ºC durante 24 horas y las levaduras y mohos utilizados se cultivaron previamente en un medio de agar-agar con extracto de malta a 30ºC durante 48 a 72 horas, y se cultivaron en agitación a 30ºC durante 24 a 78 horas. Tras el cultivo, se recogieron las células por centrifugación.

TABLA 4

4

TABLA 5

5

(b) Preparación de las células disgregadas de microorganismos

Los microorganismos recogidos de este modo se pusieron en suspensión en solución salina fisiológica de un volumen igual al del medio de cultivo y se sometieron a continuación a un tratamiento térmico (esterilización) a 100ºC durante 10 minutos, y se recogieron otra vez las células por centrifugación. Se pusieron en suspensión las células en un tampón de fosfato 25 mM (pH 7,0) a una concentración del 10% en peso húmedo.

Con respecto a las bacterias, se añadieron 0,1% en peso de lisozima de clara de huevo (producida por Sigma Co.) y 0,2% en peso de papaína (producida por Amano Pharmaceutical Co.) a las suspensiones preparadas de este modo de las células, y las paredes celulares se digirieron y se destruyeron manteniendo la mezcla a 37ºC durante 12 horas, para obtener un líquido de células destruidas. Con respecto a las levaduras, se añadieron 0,2% en peso de "Zymolyasa 20T", enzima que digiere la pared celular de las levaduras (producida por Seikagaku Kogyo K.K.), y las paredes celulares se digirieron y se destruyeron también manteniendo la mezcla a 37ºC durante 12 horas, para obtener un líquido de células destruidas. Con respecto a los mohos, se añadieron las suspensiones de las células en la misma cantidad (en volumen) de perlas de vidrio de 0,75 mm \phi, y la mezcla se sometió 5 veces al tratamiento de disgregación celular de 1 minuto utilizando "Beads Beater" (producido por Biospec Co.) y a continuación a decantación, para obtener un sobrenadante eliminando las perlas de vidrio.

Cada uno de los líquidos de las células disgregadas obtenido de este modo y los fluidos sobrenadantes de las bacterias, las levaduras y los mohos se secaron por liofilización para obtener polvos (uno de la forma de distribución del aditivo para la alimentación de las cerdas según la presente invención).

c) Determinación del contenido de ácidos fólicos

La cantidad de ácidos fólicos contenida por 100 g de los polvos secos obtenidos de este modo se determinó mediante bioanálisis utilizando Enterococcus hirae ATCC 8.043. Los resultados obtenidos se presentan también en la Tabla 5. En este bioanálisis, tanto los ácidos fólicos de tipo activo (formas reducidas) como los ácidos fólicos de tipo inactivo (formas oxidadas) se determinan a la vez para proporcionar su cantidad total. Sin embargo, el valor determinado de este modo puede considerarse que en su mayor parte se basa en el tipo activo ya que los ácidos fólicos contenidos en los polvos secos proceden de microorganismos.

Ejemplo 5

(Solo de referencia)

Preparación de las células de microorganismos destruidas mecánicamente

Se cultivaron de manera similar a la del Ejemplo 3, Corynebacterium glutamicum ATCC 13.869 y Corynebacterium glutamicum ATCC 13.060, y se recogieron sus células y se pusieron en suspensión en tampón fosfato 20 mM (pH 7,0) al 10% en peso, para preparar las suspensiones celulares.

Se mezclaron las suspensiones celulares con la misma cantidad de perlas de vidrio de 0,1 mm \phi y las células se disgregaron completamente repitiendo 10 veces el tratamiento de disgregación de 1 minuto utilizando "Beads Beater". A continuación, los productos resultantes se sometieron a separación centrífuga, para separar las fracciones de citoplasma en los sobrenadantes de la centrífuga y las fracciones de las paredes celulares en los residuos de la centrífuga.

Cada una de las fracciones se secó por liofilización y se determinó la cantidad de ácidos fólicos presente en 100 g de productos secos mediante bioanálisis como en el Ejemplo 4. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 6.

TABLA 6

6

De la Tabla 6 se deduce que los ácidos fólicos están presentes en las fracciones del citoplasma.

Ejemplo 6 Cultivo con adición de precursores del ácido fólico

De manera similar a la del Ejemplo 4, se prepararon productos digeridos (productos disgregados) de células por tratamiento enzimático de las células utilizando Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 o Corynebacterium glutamicum ATCC 13060.

Las células utilizadas anteriormente se obtuvieron cultivando las bacterias anteriores con la adición de 100 mg/litro de ácido p-aminobenzoico, 10 mg/litro de ácido fólico (forma oxidada) o 100 mg/litro de guanosina.

En la Tabla 7 se presenta el contenido de ácidos fólicos obtenido en 100 mg de polvos secos.

TABLA 7

7

Ejemplo 7 Efectos de la administración de las células de microorganismos disgregadas

Los efectos de la administración (1) del producto de la digestión enzimática de Corynebacterium glutamicum preparado en el Ejemplo 4, (2) del producto de digestión enzimática de Saccharomyces cerevisiae IFO 2044 preparado en el Ejemplo 4, y (3) del producto de la digestión enzimática de Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 (células cultivadas con adición de ácido p-aminobenzoico al medio) se ensayaron de manera similar a la del Ejemplo 1.

Como animales de ensayo se utilizaron 4 lechones Gettingen de la misma camada (de 1 año; peso corporal, 30 kg). Los productos de la digestión enzimática se utilizaron en una cantidad de 50 mg como producto seco, por 1 kg de peso corporal. A título de comparación, se realizó la misma prueba utilizando 50 mg de un ácido fólico de tipo inactivo (producido por Kongo Kagaku K.K.), por 1 kg de peso corporal (comparación).

Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 8 siguiente.

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TABLA 8

8

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En la tabla, las cantidades de THF y 5MF se presentan en ng/ml.

Lo que se ha indicado a continuación se puede deducir de la Tabla 8. Un aumento en el valor de THF en el plasma sanguíneo se observó en cada uno de los casos de los productos de digestión enzimática (1), (2) y (3), en comparación con los de referencia (antes de la administración). En el caso de (1) y (2), la concentración de THF aumentó rápidamente después de la administración. En el caso de (2), el ritmo de aumento en la concentración de THF fue lento en comparación con (1) y (3). Con respecto al alcance del aumento en la concentración de THF, (3) es mayor que (1) y por consiguiente es más eficaz. Un ácido fólico de tipo inactivo (comparación) no tiene efecto en el aumento de concentración de THF y 5MF en el plasma sanguíneo.

Ejemplo 8

(Solamente de referencia)

Prueba en campo

Se utilizaron 60 cerdas (40 para los ensayos y 20 para la comparación) (de 1,5 a 4 años; peso corporal, 150 a 200 kg) de la especie LW (un híbrido formado por cruce de la especie Landrace con la especie Large Yorkshire). Las células destruidas de Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 (producto seco de las células digeridas por vía enzimática) preparadas en el Ejemplo 4 y las células destruidas de la misma cepa (producto seco de la fracción del citoplasma) preparado en el Ejemplo 5 se utilizaron como productos que contenían ácido fólico de tipo activo.

A partir de los 2 meses antes del apareamiento, se alimentaron continuamente 20 cerdas con un pienso al que se añade el producto destruido que contenía ácido fólico preparado en el Ejemplo 4 en una cantidad de 300 mg por día y cerda. Tras 60 días del apareamiento, se determinó el contenido de THF y 5MF en el plasma sanguíneo como en el Ejemplo 1 (Ensayo I).

Se realizó una prueba similar en las células destruidas preparadas en el Ejemplo 5 (Prueba II). A título de comparación, se realizó una prueba similar sin añadir ninguna célula destruida (Comparación).

Los resultados se presentan en la Tabla 9. Como se deduce de la tabla, el contenido de THF y el de 5MF llegó a ser mayor cuando se administró con los productos que contenían ácido fólico (Pruebas I y II) comparadas con la Comparación.

TABLA 9

9

En cada una de las pruebas, se continuó la administración de ácidos fólicos en forma de células destruidas de un microorganismo hasta el parto.

Todas las cerdas parieron alrededor de 114 días tras el apareamiento. Los resultados de la administración fueron los siguientes: En la prueba en que se administraron células digeridas por vía enzimática (Prueba I), parieron 11,6 lechones de promedio y en la prueba en que se administró el producto seco de la fracción citoplásmica (Prueba II) parieron 11,8 lechones de promedio. Por otra parte, parieron 10,8 lechones de promedio en el caso de la comparación. Los resultados anteriores demuestran que los valores de THF y 5MF en el plasma sanguíneo de las cerdas aumentan administrando las células digeridas por vía enzimática y los productos secos de las fracciones citoplásmicas (presente invención) y por consiguiente los resultados de la reproducción pueden mejorarse.

Méritos de la invención

Según la presente invención, la concentración de ácidos fólicos de tipo activo contenida en el plasma sanguíneo de las cerdas puede aumentarse mediante administración oral de un pienso obtenido por el procedimiento de la reivindicación 1. Esto contribuiría al tratamiento de la cría del cerdo en gran medida.

Claims

1. Procedimiento para la preparación de un pienso para cerdas que comprende un aditivo de pienso que comprende como ingrediente activo para mejorar la eficacia de la reproducción una forma reducida de ácido fólico o un derivado activo de la misma en una cantidad que proporciona un aporte de 0,1 a 100 \mug (en forma reducida de ácido fólico) por kg de peso corporal de una cerda al día, en el que dicha forma reducida de ácido fólico está en forma de células disgregadas o extracto celular de un microorganismo, en el que dicho procedimiento comprende cultivar las células en un medio al que se ha añadido ácido p-aminobenzoico, una forma oxidada de ácido fólico y/o un ácido nucleico en una cantidad comprendida entre 1 mg/l y 1 g/l y obtener dichas células disgregadas o extracto celular.