DE69434973T2

DE69434973T2 - Verfahren zur Herstellung eines Futters für Mutterschweine

Info

Publication number: DE69434973T2
Application number: DE69434973T
Authority: DE
Inventors: Norimasa Kawasaki-ku Kawasaki-shi Ohnishi; Yasuhiko Toride; Akinori Kawasaki-ku Kawasaki-shi Uehara; Ei-ichi Kokubunji-shi Kokue
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1993-10-05
Filing date: 1994-10-05
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2014-10-06
Also published as: EP0646322B1; AU7307894A; ES2285698T3; KR950010769A; CA2133610A1; AU683911B2; KR100313381B1; US5728398A; DE69434973D1; CN1105820A; DK0646322T3; EP0646322A1; CA2133610C; CN1066317C; TW264374B; US5814333A

Description

[Gebiet der Erfindung]
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Futters für Mutterschweine.
[Stand der Technik]
Folsäure ist ein Coenzym, das an der Synthese von Aminosäuren, wie Methionin, Serin und Glutaminsäure, und Purinbasen von Nucleinsäuren, die Bestandteile der DNA sind, beteiligt sind. Es wurde durch epidemiologische Untersuchungen an schwangeren Frauen und Untersuchungen an tragenden Meerschweinchen gefunden, daß während der Schwangerschaft der Bedarf an Folsäure steigt und ihre Konzentration im Blutplasma abnimmt [Pritchard J. A. et al., Am. J. Obst. Gynecol., Vol. 104, p. 388 (1969) und Habibzadeh H. C. et al., Br. J. Nutr., Vol. 55, p.23 (1986)].
Es wurde für Hausschweine auch bestätigt, daß die Menge der reduzierten Form von Folsäuren im Blutplasma von Mutterschweinen während der Trächtigkeit abnimmt [Natsuhori et al., Final Program and Abstracts Book of the 10th International Symposium: "Chemistry and Biology of Pteridines and Flates," S.196 (1993)]. Es wurde auch bewiesen, daß die Züchtungseffizienz durch Verabreichung von Folsäure (einer oxidierten Form) an trächtige Schweine mittels intramuskulärer Injektion verbessert werden kann [Matte J. J. et al., J. Anim. Sci., Vol. 67 S. 426 (1989) und Friendship R. M. et al., Can Vet. J., Vol. 32, S.564 (1991)], was die Bedeutung der Verabreichung von Folsäuren an trächtige Schweine (Mutterschweine) zeigt.
Die Verabreichung der Folsäure an Mutterschweine durch intramuskuläre Injektion ist in praktischer Hinsicht jedoch problematisch, und es ist stark bevorzugt, wenn die Wirkung der Verbesserung der Züchtungseffizienz auftritt, wenn die Folsäure durch Zugabe zu dem Futtermittel verabreicht wird (orale Verabreichung). Es ist bereits eine Reihe von Untersuchungen zur Verbesserung der Züchtungseffizienz auf der Grundlage einer oralen Verabreichung durchgeführt worden. Dabei beurteilen einige Untersuchungen die Verabreichung als effektiv [Thaler R. C. et al., J. Anim. Sci., Vol. 67, S. 3,360 (1989), Lindemann M. D. et al., J. Anim. Sci., Vol. 67, S. 459 (1989) and Lindemann M. D. et al., J. Anim. Sci., Vol. 71, S. 239 (1991)], während andere bezüglich der Wirkungen skeptisch sind [Easter R. A. et al., Nutrition Reports International, Vol. 28, S. 945 (1983) und Matte J. J. et al., Livestock Production Science, Vol. 33, S. 131 (1992)]. Es gibt somit hinsichtlich der Wirkungen der oralen Verabreichung einer oxidierten Form von Folsäure keine klare Schlußfolgerung.
Im allgemeinen wird Folsäure chemisch synthetisiert. Chemisch synthetisierte Folsäure liegt in oxidierter Form vor, und die oxidierte Form von Folsäure funktioniert als solche nicht als Coenzym. Üblicherweise wird sie nach der Absorption in den Körper durch Dihydrofolsäuredehydrogenase in 7,8-Dihydrofolsäure überführt, die dann enzymatisch in die reduzierten Formen von Folsäure, wie Tetrahydrofolsäure (THF) oder 5-Methyl-tetrahydrofolsäure (5MF) reduziert wird und dann als Coenzym dienen kann. Deshalb kann die Wirkung der Verabreichung von Folsäuren durch die Messung der Menge an THF oder 5MF im Blutplasma bestimmt werden. Es ist jedoch nicht möglich, die reduzierten Formen von Folsäure allein auf selektive Weise durch vorherige Bestimmung festzustellen, da diese auf einem Radioligand-Verfahren beruht und es somit nicht möglich ist, genaue Werte der reduzierten Formen von im Blutplasma enthaltener Folsäure zu erhalten. In der vorliegenden Beschreibung können die reduzierten Formen von Folsäure als "Folsäuren vom aktiven Typ" bezeichnet werden, da sie physiologische Aktivitäten haben, und die oxidierten Formen von Folsäure können als "Folsäuren vom inaktiven Typ" bezeichnet werden, da sie keine physiologischen Aktivitäten haben.
Zum Zwecke der Analyse der Wirkungen der Verabreichung von Folsäuren an Schweine wurde das HPLC-ECD-Verfahren entwickelt, um den Gehalt an Folsäuren vom aktiven Typ im Blutplasma durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie unter Einsatz eines elektrochemischen Detektors zu bestimmen, und durch den Einsatz dieses Verfahrens wurden Untersuchungen bezüglich des Grades des Auftretens von THF und 5MF im Blutplasma zu dem Zeitpunkt durchgeführt, wenn Folsäure (eine oxidierte Form) an Schweine durch intravenöse Injektion, intramuskuläre Injektion oder orale Verabreichung verabreicht wird. Genauer gesagt wurden vier erwachsene Schweine mit einem Körpergewicht von etwa 25 kg gemäß dem Verfahren nach dem lateinischen Quadrat 4 Faktoren unterworfen: intravenöse Injektion (1 mg/kg Körpergewicht), intramuskuläre Injektion (1 mg/kg Körpergewicht), niedrig dosierte orale Verabreichung (1 mg/kg Körpergewicht) und hoch dosierte orale Verabreichung (50 mg/kg Körpergewicht) von Folsäure (einer oxidierten Form), und die Untersuchungen wurden durchgeführt. Als Ergebnis stieg die Konzentration von THF und 5MF im Blutplasma im Fall der intravenösen Injektion, intramuskulären Injektion und hoch dosierten oralen Verabreichung. Dementsprechend wird angenommen, daß die verabreichte Folsäure (eine oxidierte Form) absorbiert wurde und in der Leber und dergleichen in die Folsäuren vom aktiven Typ umgewandelt wurden. Andererseits traten THF und 5MF im Blutplasma im Fall der niedrig dosierten oralen Verabreichung nicht auf. Vgl. dazu Eiichi Kokue et al., "Abstract Book of the 113th Convention of Japan Veterinary Society," S. 112 (1992). In Bezug auf Ratten ist bekannt, daß die Konzentration von reduzierten Formen von Folsäure rasch steigt, selbst wenn eine oxidierte Form von Folsäure in niedriger Dosierung verabreicht wird [Tsunematsu K. et al., Cong. Anom., Vol. 30, S. 113 (1990)9.
Es wird deshalb angenommen, dass Schweine die Fähigkeit besitzen, Folsäuren vom inaktiven Typ in Folsäuren vom aktiven Typ umzuwandeln, deren Fähigkeit zur Absorption von Folsäuren vom inaktiven Typ aus dem Verdauungstrakt ist jedoch wesentlich geringer als diejenige von Ratten. Es wurde auch gefunden, daß eine extrem große Menge an Folsäuren vom inaktiven Typ an Schweine verabreicht werden muß, um den Wert der Folsäure vom aktiven Typ im Blutplasma durch orale Verabreichung von Folsäuren vom inaktiven Typ zu erhöhen.
[Durch die Erfindung zu lösende Aufgaben]
Die vorliegende Erfindung ist im Hinblick auf den vorstehend beschriebenen Stand der Technik gemacht worden. Ihre Ziele sind die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines Futters für Mutterschweine, welches in der Lage ist, die Konzentration von reduzierten Formen von Folsäure in Blutplasma zu erhöhen und somit die Aufzuchteffizienz zu verbessern.
[Mittel zum Lösen der Aufgaben]
Um die vorstehend beschriebenen Aufgaben zu lösen, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung eingehende Untersuchungen durchgeführt. Als Ergebnis haben sie gefunden, dass die Konzentration von reduzierten Formen von Folsäure im Blutplasma von Schweinen durch Zugeben einer reduzierten Form von Folsäure zu Futter und Verabreichung dieses Futters an Mutterschweine erhöht werden kann, und haben auf der Grundlage dieser Ergebnisse die vorliegende Erfindung gemacht.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Futters für Mutterschweine, das einen Futterzusatz enthält, der als aktiven Bestandteil zum Verbessern der Aufzuchteffizienz eine reduzierte Form von Folsäure oder ein aktives Derivat davon in einer Menge enthält, die eine Aufnahme von 0,1 bis 100 μg (als reduzierte Form von Folsäure) pro kg des Körpergewichts eines Mutterschweins pro Tag ergibt, wobei die reduzierte Form von Folsäure in der Form von zerstörten Zellen oder eines Zellextrakts eines Mikroorganismus ist, wobei das Verfahren das Kultivieren der Zellen in einem Medium, das mit p-Aminobenzoesäure, einer oxidierten Form von Folsäure und/oder einer Nucleinsäure in einer Menge von 1 mg/l bis 1 g/l versetzt ist, und das Erhalten der zerstörten Zellen oder des Zellextrakts umfaßt.
Die Erfindung wird im folgenden eingehend beschrieben.
Es ist bekannt, daß eine Vielzahl von Embryos (multiple Embryos) üblicherweise durch Befruchtung im Uterus von Schweinen erzeugt werden. Alle diese multiplen Embryos werden jedoch nicht immer sicher zur Welt gebracht. Natürlich ist es im Hinblick auf die Schweinezucht sehr wünschenswert, dass alle diese multiplen Embryos, sobald sie gebildet sind, sicher zur Welt gebracht werden können. In der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "Aufzuchteffizienz von Mutterschweinen wird verbessert", daß die Rate der sicher ausgetragenen Embryos zu der Gesamtzahl der erzeugten Embryos, wenn den Schweinen der erfindungsgemäße Futterzusatz oral verabreicht wird oder wenn sie mit dem erfindungsgemäßen Futter gefüttert werden, im Vergleich zu Fällen erhöht wird, bei denen die Verabreichung oder die Fütterung nicht auf diese Weise stattfindet.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "reduzierte Form von Folsäure" aufgebrochene Zellen oder Zellextrakte eines Mikroorganismus, der eine reduzierte Form von Folsäure enthält.
Bezüglich der aufgebrochenen Zellen oder der Zellextrakte eines Mikroorganismus sind Vitaminquelle für das Futter Hefen, wie Torulahefe, verwendet worden. Die in ihren Zellen enthaltenen Vitamine werden jedoch nur schwach absorbiert, da sie ohne Aufbrechen der Zellwände üblicherweise eingesetzt werden.
Deshalb haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung eingehende Untersuchungen durchgeführt und gefunden, daß die Menge von THF und 5MF im Blutplasma von Schweinen durch orales Verabreichen von aufgebrochenen Zellen oder Zellextrakten eines Mikroorganismus erhöht werden kann, nämlich durch Produkte, die durch mechanische Aufbruchbehandlung von Zellen eines Mikroorganismus, durch enzymatische Verdauungsbehandlung oder durch Autolyse hergestellt werden, so daß die reduzierten Formen von Folsäure in einen leicht absorbierbaren Zustand überführt werden. Dementsprechend kann die Aufzuchteffizienz durch Verabreichung des Produkts an trächtige Schweine verbessert werden.
Ein beliebiger Mikroorganismus kann als Ausgangsmaterial für die Herstellung von aufgebrochenen Zellen oder Zellextrakten verwendet werden, mit der Maßgabe, daß die Produkte (mechanisch aufgebrochene Zellen oder enzymatisch aufgebrochene Zellen) einen hohen Gehalt an reduzierten Formen von Folsäure aufweisen. Spezifische Beispiele umfassen Bakterien, wie Corynebacterium glutamicum (früherer Name: Brevibacterium lactofermentum) (ATCC 13,869, etc.), Corynebacterium ammoniagenes (früherer Name: Brevibacterium ammoniagenes) (ATCC 6,871, etc.), Brevibacterium flavum (ATCC 13,826, etc.), Corynebacterium glutamicum (ATCC 13,032, ATCC 13,060, etc.), Bacillus subtilis (ATCC 13,952, IFO 3,009, IFO 13,169, etc.), Lactococcus lactis subsp. cremoris (ATCC 19,257, etc.); Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae, (IFO 2,044, IFO 2,375, etc.), Candida utilis (früherer Name: Torulopsis utilis) (ATCC 9,226, etc.); und Pilze, wie Aspergillus oryzae (IFO 30,104, etc.), Aspergillus niger (IFO 4,414, etc.).
Für die Kultivierung dieser Mikroorganismen können beliebige Kultivierungsmedien eingesetzt werden, mit der Maßgabe, daß die Nährstoffe, die von den Mikroorganismen assimiliert werden können, darin enthalten sind. Beispielsweise können übliche Medien eingesetzt werden, die mit Kohlenstoffquellen, wie Kohlenhydraten, wie Glucose, Saccharose, Alkoholen, wie Ethanol, Glycerin, organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Sojabohnenölen und Gemischen davon; mit Stickstoff enthaltenden organischen oder anorganischen Nährstoffen, wie Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellflüssigkeit, Ammoniumsulfat, Ammoniumsulfat, Ammoniak, anorganischen Nährstoffen, wie Phosphaten, Magnesium, Eisen, Mangan, Kalium; und Vitaminen, wie Biotip, Thiamin, versetzt sind.
Für die Kultivierung können üblicherweise für die Kultivierung dieser Mikroorganismen verwendete Bedingungen ohne jegliche Modifikation eingesetzt werden. Beispielsweise können die Mikroorganismen in einem Nährstoffmedium bei 20 bis 40°C bei einem pH-Wert im Bereich von 4,0 bis 9,5 über einen Zeitraum von 20 Stunden bis 5 Tagen kultiviert werden.
Die Menge der reduzierten Formen von Folsäure, die in den Zellen eines Mikroorganismus, der durch Kultivierung erhalten wird, produziert wird, wird durch Zugeben von p-Aminobenzoesäure, einer oxidierten Form der Folsäure, und/oder einer Nucleinsäure in das Kulturmedium erhöht. Die eingesetzte Nucleinsäure enthält Guanosin, Inosin, Xanthin, 5'-Guanilsäure, 5'-Inosinsäure, 5'-Xanthylsäure, Guanosin-5'-diphophat und Guanosin-5'-triphosphat. Diese Additive können in einer Menge zugegeben werden, die es ermöglicht, daß die Menge der reduzierten Formen von in der Zelle hergestellten Folsäure im Vergleich zu Fällen erhöht werden kann, bei denen die Additive nicht zugegeben werden, wobei die zugegebene Menge mg/Liter bis 1 g/Liter, vorzugsweise 10 bis 100 mg/Liter ist. Wenn die zugegebene Menge zu gering ist, wird keine Wirkung erzielt, wohingegen, wenn sie zu groß ist, das Wachstum des Mikroorganismus inhibiert werden kann.
Die durch Kultivierung so erhaltenen Zellen werden einer Aufbrechbehandlung oder Extraktionsbehandlung nach ihrer Abtren nung von der Kulturflüssigkeit durch ein geeignetes Verfahren unterworfen. Die Kultur kann jedoch der Aufbrechbehandlung oder Extraktionsbehandlung unmittelbar oder nach der Konzentration unterworfen werden, wenn die Bestandteile des Kulturmediums an die Schweine oral verabreicht werden können und sie die Leistungsfähigkeit der Aufbrechbehandlung nicht beeinträchtigen. Außerdem können die Zellen, die einer Aufbrechbehandlung oder Extraktionsbehandlung unterworfen werden sollen, lebende oder getötete Zellen sein.
Hinsichtlich des Verfahrens zum Aufbrechen der Zellen gibt es keine besondere Einschränkung. Beispielsweise kann das Aufbrechen durch bekannte mechanische Verfahren sowie durch ein Verfahren unter Verwendung von Enzymen durchgeführt werden. Mechanische Verfahren an sich können wie herkömmlich durchgeführt werden. Beispielsweise können die Zellen eines Mikroorganismus mit Glasperlen unter Einsatz eines "Beads Beater" (hergestellt von Biospec Co.) aufgebrochen werden, oder das Aufbrechen der Zellen kann unter Druck oder unter Einsatz eines Ultraschallgerätes durchgeführt werden. Wenn die Zellen eines Mikroorganismus durch ein Enzym aufgebrochen werden, kann das Verfahren an sich auch wie herkömmlich durchgeführt werden. Beispielsweise wird, nachdem die kultivierten Zellen als solche einer Hitzesterilisationsbehandlung unterworfen worden sind, ein Zellwandverdauungsenzym zugegeben, um die Zellwände des Mikroorganismus zu zersetzen. Für diese Zersetzung kann jedes Enzym eingesetzt werden, mit der Maßgabe, daß es Zellwände verdauen und aufbrechen kann. Bekannte Enzyme, wie Lysozyme, Proteasen, Zymolyasen, sind typische Beispiele für Enzyme mit einer solchen Fähigkeit. Die enzymatische Behandlung kann unter bekannten Bedingungen durchgeführt werden.
Auch hinsichtlich des Verfahrens zum Extrahieren der Zellen gibt es keine besondere Einschränkung. Beispielsweise kann das Verfahren durch Autolyse oder durch Erhitzen der Zellen in heißem Wasser bei einer Temperatur im Bereich von 90 bis 120°C durchgeführt werden.
Die so hergestellten aufgebrochenen Zellen oder Zellextrakte können entweder als solche oder in geeigneter konzentrierter oder getrockneter Form oder in der Form eines mit geeigneten Additiven versetzten Gemisches oral verabreicht werden. Da die meisten Folsäuren nicht in den Zellwänden vorhanden sind, ist es möglich, die verbleibenden Fragmente der Zellwände von den aufgebrochenen Zellen zu entfernen. Es ist selbstverständlich, daß unter den möglichen Formen der oralen Verabreichung auch diejenige umfaßt ist, bei der die aufgebrochenen Zellen oder die Zellextrakte zu einem Futtermittel gegeben werden und dieses Futter dann an die Schweine verfüttert wird.
Es ist ebenfalls selbstverständlich, daß die verschiedenen reduzierten Formen von Folsäure einzeln eingesetzt werden können oder daß zwei oder mehr davon in Kombination eingesetzt werden können.
Im Hinblick auf die Bequemlichkeit bei der Verwendung können Futterzusatzstoffe für Mutterschweine, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden, in einer geeigneten Dosierungsform, einschließlich als Konzentrate, getrocknete Pulver, Granulate, mit oder ohne Zugabe geeigneter Träger, verteilt werden.
Das Futter für die Schweine ist dadurch gekennzeichnet, daß der Futtermittelzusatz für Schweine zugegeben wird.
Hinsichtlich der Produktion eines solchen Futters für Mutterschweine gibt es keine besonderen Schwierigkeiten. Es kann nach herkömmlichen Verfahren zur Produktion von Futtermittelformulierungen hergestellt werden, mit der Ausnahme, daß der Futtermittelzusatzstoff zugegeben wird.
Im folgenden wird ein Punkt beschrieben, der im Hinblick auf die Zugabe des Futtermittelzusatzstoffes für Mutterschweine beachtet werden muß. Es geht um die zuzugebende Menge. Der Futtermittelzusatzstoff für Schweine soll in einer Menge zugegeben werden, bei der die Wirkungen der Zugabe auftreten. D.h., es wird in einer Menge zugegeben, die zu einer Aufnahme von 0,1 bis 100 μg (als reduzierte Form von Folsäure) pro kg Körpergewicht eines Schweins pro Tag führt. Wenn diese Menge zu gering ist, wird keine Wirkung erzielt. Die Wirkungen der Zugabe werden jedoch nicht erhöht, selbst wenn das Futtermittel in einer Menge über den genannten Bereich zugegeben wird, so daß diese Zugabe nutzlos ist.
Hinsichtlich des Verfahrens zum Verbessern der Aufzuchteffizienz gibt es keine besondere Schwierigkeit. Alle Bedingungen der Aufzucht können wie bei herkömmlichen Verfahren sein, außer daß die aufgenommene Menge einer reduzierten Form vom Folsäure 0,1 bis 100 μg pro kg Körpergewicht der Schweine ist.
In dem Aufzuchtverfahren ist die Dauer der oralen Verabreichung oder des Fütterns wie folgt: Da der Zweck der Verabreichung der reduzierten Form von Folsäure ist, multiple Embryos, die bei der Befruchtung in der Gebärmutter des Schweins erzeugt werden, in so hoher Anzahl wie möglich, wenn möglich alle, sicher zur Welt zu bringen, wird die orale Aufnahme der reduzierten Form von Folsäure zu einem Zeitpunkt zwischen etwa 2 Monaten vor dem Paaren (Befruchtung) und kurz nach dem Paaren begonnen, und die Aufnahme wird fortgesetzt, bis bestätigt wird, daß die multiplen Embryos oder Föten gewachsen sind (beispielsweise zwei Monate nach dem Paaren) oder aus Sicherheitsgründen bis zu ihrer Geburt.
[BEISPIELE]
Die vorliegende Erfindung wird anhand der Beispiele erklärt.
Beispiel 1 (Referenzbeispiel) (Wirkungen der Verabreichung von Leucovorin)
Die Untersuchungen wurden unter Verwendung von zwei Gettingen-Minischweinen desselben Wurfs durchgeführt (0,7 Jahre alte Schweine mit einem Körpergewicht von 15 kg; eines für die Untersuchung und eines als Vergleich).
Eine 0,75%ige Wassersuspension von Leucovorin (hergestellt von Sigma Co.) wurde oral zwangsgefüttert (direkt in das Innere des Magens über eine feine flexible Sonde eingespritzt), wobei das Versuchstier seit dem Vortag nichts zu fressen bekommen hatte, wobei Leucovorin in einer Menge von 50 mg pro kg Körpergewicht verabreicht wurde. Zum Vergleich wurde die Zwangsfütterung auf genau dieselbe Weise durchgeführt, außer daß Folsäure (eine oxidierte Form; hergestellt von Kongo Kagaku Co.) anstelle von Leucovorin eingesetzt wurde.
Blutproben wurden 1, 3, 6, 9 und 24 Stunden nach der Verabreichung der Testsubstanzen gewonnen, und zwei Arten von Folsäuren vom aktiven Typ, nämlich Tetrahydrofolsäure (THF und 5- Methyltetrahydrofolsäure (5MF), die in dem Blutplasma der Schweine enthalten waren, wurden quantitativ analysiert. Als Kontrolle wurde Blut auch unmittelbar vor der Verabreichung der Testsubstanzen gewonnen, und das Blut wurde derselben quantitativen Analyse unterworfen (Kontrolle).
Details der quantitativen Analyse sind im folgenden angegeben. Zu 0,2 ml einer gewonnenen Blutprobe wurden 0,2 ml 0,5 m Perchlorsäure gegeben und das erhaltene Gemisch wurde einer Zentrifugation bei 5000 g × 2 min. unterworfen, um Proteine zu entfernen. 100 μl des erhaltenen Überstandes wurden einer Hochleistungsflüssigchromatographie unterworfen. Die Analyse wurde unter Einsatz einer Säule von "phenylgebundener Phase 4,6 mm ϕ × 150 mm" (hergestellt von Irica Co.) durchgeführt. Für die mobile Phase wurde ein Gemisch von 97,5:2,5 (Vol./Vol.) eines 20 mM Kaliumacetatpuffers (pH 3,6) und Acetonitril eingesetzt, und die Fließgeschwindigkeit war 0,8 ml/min. Für den Nachweis wurde ein "Electrochemical Detector Type E-502" (hergestellt von Irica Co.) eingesetzt, und die Bestimmung wurde bei einer angelegten Spannung von –300 mV durchgeführt.

Die Ergebnisse der Bestimmung sind in der folgenden Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1

abgelaufene Zeit (h)	Test		Vergleich
abgelaufene Zeit (h)	THF (*)	5MF (*)	THF (*)	5MF (*)
0 (Kontrolle)	8,2	6,0	14,6	7,6
1	51,5	12,1	14,6	4,5
3	52,1	20,6	12,0	10,5
6	55,7	27,6	12,3	7,1
9	49,2	31,0	12,4	7,9
24	30,2	20,6	8,0	6,3

*: Einheit: ng/ml

Tabelle 1 zeigt, daß die Konzentration von THF im Blutplasma unmittelbar nach der Verabreichung von Leucovorin stieg und daß dann die Konzentration von 5 MF anstieg. Das Verhalten der zwei Folsäuren vom aktiven Typ im Blut ist verständlich, da bekannt war, daß in dem Metabolismus der Organismen Leucovorin in THF und dann in 5MF umgewandelt wird. Die Tatsache, daß die Konzentration von THF im Blutplasma innerhalb einer Stunde anstieg, zeigt, daß die Absorption von Leucovorin in dem Körper ziemlich glatt verläuft. Andererseits wurden bei der oralen Verabreichung von Folsäure (inaktiver Typ), die zum Vergleich durchgeführt wurde, keine Veränderungen des Wertes der Folsäuren in Blutplasma beobachtet.
Beispiel 2 (Referenzbeispiel) (Wirkungen der Verabreichung von 7,8-Dihydrofolsäure)
Die Untersuchungen wurden unter Verwendung von zwei Gettingen-Minischweinen desselben Wurfs durchgeführt (2 Jahre alte Schweine mit einem Körpergewicht von etwa 20 kg).
7,8-Dihydrofolsäure (hergestellt von Sigma Co.) in 0,2% Natriumascorbatlösung wurde an die Versuchstiere, die 24 Stunden ohne Futter gehalten worden waren, in einer Menge von 1 mg oder 0,2 mg pro kg Körpergewicht oral zwangsverfüttert. Blutproben wurden nach der Verabreichung gewonnen, und die in den Blutplasmen enthaltenen Folsäuren vom aktiven Typ wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 quantitativ analysiert.

Die Veränderung der Konzentrationen von THF und 5MF in den Blutplasmen der zwei Schweine ist in der folgenden Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2

abgelaufene Zeit (h)	1 mg/kg		0,2 mg/kg
abgelaufene Zeit (h)	THF (*)	5MF (*)	THF (*)	5MF (*)
0 (Kontrolle)	6,75	4,44	7,22	4,74
1	17,52	4,45	14,51	5,01
3	20,94	2,47	15,09	1,94
6	14,51	1,89	15,32	1,42
9	12,49	1,88	17,46	1,88
24	6,49	2,39	14,39	3,37

*: Einheit: ng/ml

Tabelle 2 zeigt, daß die Verabreichung von 7,8-Dihydrofolsäure in beiden Mengen zu einer merklichen Erhöhung der THF-Konzentration führt, obwohl die 5MF-Konzentration in einem gewissen Maß abnimmt.
Beispiel 3 (Referenzbeispiel) (Wirkungen der Verabreichung von Leberpulver)
Der Test wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 einschließlich bezüglich der Versuchstiere, wiederholt, außer daß eine 50%ige Wassersuspension von Schweineleberpulver in einer Menge von 5 g als Leberpulver (welches oxidierte Formen und reduzierte Formen von Folsäure in einer Menge von insgesamt 0,08 mg enthielt) anstelle der Wassersuspension von Leucovorin zwangsverfüttert wurde. Die Ergebnisse der Vergleichsuntersuchung in Beispiel 1 werden hier ebenfalls verwendet.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3

abgelaufene Zeit (h)	Test		Vergleich
abgelaufene Zeit (h)	THF (*)	5MF (*)	THF (*)	5MF (*)
0 (Kontrolle)	11,9	5,5	14,6	7,6
1	24,5	28,3	14,6	4,5
3	26,4	22,7	12,0	10,5
6	24,4	14,8	12,3	7,1
9	24,6	13,3	12,4	7,9
24	14,8	11,8	8,0	6,3

*: Einheit: ng/ml

Tabelle 3 zeigt, daß in dem Versuch mit Leberpulver die Konzentration von THF rasch anstieg und die Konzentration von 5 MF ebenfalls anstieg. Dies liegt vermutlich daran, daß eine große Menge 5 MF in Leberpulver enthalten ist. Andererseits wurde im Vergleich dazu, wie in Beispiel 1 erwähnt, keine Erhöhung der Konzentration von 5 MF und THF im Blutplasma beobachtet. Es wird angenommen, daß die Absorption von Folsäuren in den Körper extrem gut ist, wobei die Tatsache beachtet werden muß, daß der Gehalt an Folsäuren in 5 g Leberpulver 0,08 g (einschließlich der Folsäuren vom inaktiven Typ) ist.
Beispiel 4 (Referenzbeispiel) (Präparation von aufgebrochenen Zellen von Mikroorganismen)
(a) Kultivierung von Mikroorganismen

In 500 ml Kolben wurden jeweils 50 ml eines Kulturmediums mit der in Tabelle 4 angegebenen Zusammensetzung gegossen. Nach der Hitzesterilisierung wurde eine Platinöse mit Zellen jedes der in Tabelle 5 angegebenen Mikroorganismen, wobei die verwendeten Bakterien vorher auf einem Bouillin-Agarmedium bei 30°C während 24 Stunden kultiviert worden waren, und die eingesetzten Hefen und Pilze wurden vorher auf einem Malzextrakt-Agarmedium bei 30°C während 48 bis 72 Stunden kultiviert worden waren, in das Medium eingeimpft und 24 bis 78 Stunden bei 30°C unter Schütteln kultiviert. Nach der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugation gewonnen. Tabelle 4

Bestandteile	Konzentration
Glucose	2,0 g/dl
Hefeextrakt	1,0 g/dl
Polypepton	1,0 g/dl
(NH₄)₂SO₄	0,5 g/dl
K₂HPO₄	0,3 g/dl
KH₂PO₄	0,1 g/dl
MgSO₄·7H₂O	0,05 g/dl
FeSO₄·7H₂O	0,001 g/dl
MnSO₄·4H₂O	0,001 g/dl
pH 7,0

Tabelle 5

	Mikroorganismen	Gehalt der Folsäuren (mg/100 g)
	Mikroorganismen	Vor dem Aufbrechen	Nach dem Aufbrechen
Bakterien	Corynebacterium glutamicum ATCC 13869	2,0	12,0
	Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6871	1,3	8,9
	Brevibacterium flavum ATCC 13826	2,8	14,2
	Corynebacterium glutamicum ATCC 13032	1,5	10,8
	Corynebacterium glutamicum ATCC 13060	3,5	9,0
	Corynebacterium glutamicum ATCC 13952	1,6	5,6
	Bacillus subtilis IFO 3009	0,9	4,7
	Bacillus subtilis IFO 13169	2,8	8,3
	Lactococcus lactis sub sp. cremoris ATCC 19257	2,1	7,8
Hefen	Saccharomyces cerevisiae IFO 2044	0,3	3,8
	Saccharomyces cerevisiae IFO 2375	0,7	4,0
	Candida utilis ATCC 9226	0,1	2,9
Pilze	Aspergillus oryzae IFO 30104	1,1	5,8
Pilze	Aspergillus niger IFO 4414	1,6	7,6

(b) Präparation von aufgebrochenen Zellen der Mikroorganismen
Die so gewonnenen Mikroorganismen wurden in einer physiologischen Kochsalzlösung eines äquimolaren Volumens zu dem Kulturmedium suspendiert und dann einer Hitzebehandlung (Sterilisation) während 10 Minuten bei 100°C unterworfen, und die Zellen wurden erneut durch Zentrifugation gewonnen. Die Zellen wurden in einem 25 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) bei einer Konzentration von 10% (Naßgewicht) suspendiert.
Bezüglich der Bakterien wurden 0,1 Gew.-% Eiweißlysozym (hergestellt von Sigma Co.) und 0,2 Gew.-% Papain (hergestellt von Amano Pharmaceutical Co.) zu den so präparierten Zellsuspensionen gegeben, und die Zellwände wurden durch Halten des Gemisches bei 37°C während 12 Stunden verdaut und aufgebrochen, wobei eine Flüssigkeit aus aufgebrochenen Zellen erhalten wurde. Bezüglich der Hefen wurden 0,2 Gew.-% "Zymolyase 20T", ein Hefezellwandverdauungsenzym (hergestellt von Seikagaku Kogyo K.K.), zugegeben, und die Zellwände wurden ebenfalls durch Halten des Gemisches bei 37°C während 12 Stunden verdaut und aufgebrochen, wobei eine Flüssigkeit aufgebrochener Zellen erhalten wurde. Bezüglich der Pilze wurden die Zellsuspensionen mit derselben Menge (bezogen auf das Volumen) Glasperlen eines Durchmessers von 0,75 mm versetzt, und das Gemisch wurde 5 mal der 1-minütigen Zellaufbrechbehandlung unter Verwendung des "Beads Beater" (hergestellt von Biospec Co.) unterworfen, und dann wurde das Gemisch dekantiert, um durch Entfernen der Glasperlen einen Überstand zu erhalten.
Jede der so erhaltenen Flüssigkeiten aufgebrochener Zellen und Überstandsflüssigkeiten der Bakterien, Hefen und Pilze wurde durch Gefriertrocknen getrocknet, wobei Pulver erhalten wurden (eine der Verteilungsformen des Zusatzstoffes für das erfindungsgemäße Futtermittel für Schweine).
(c) Bestimmung des Gehalts an Folsäuren
Die Menge der pro 100 g der so erhaltenen getrockneten Pulver enthaltenden Folsäuren wurde mittels Bioassay unter Verwendung von Enterococcus hirae ATCC 8043 bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 angegeben. In diesem Bioassay werden sowohl die Folsäuren vom aktiven Typ (reduzierte Formen) als auch die Folsäuren vom inaktiven Typ (oxidierte Formen) Der so bestimmte Wert kann jedoch hauptsächlich auf den aktiven Typ zurückgeführt werden, da die in den getrockneten Pulvern enthaltenen Folsäuren von Mikroorganismen abgeleitet sind.
Beispiel 5 (Referenzbeispiel) (Präparation von mechanisch aufgebrochenen Zellen von Mikroorganismen)
Auf ähnliche Weise wie in Beispiel 3 wurden Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 und Corynebacterium glutamicum ATCC 1306 kultiviert, und deren Zellen wurden gewonnen und in 20 mm Phosphatpuffer (pH 7,0) in einer Menge von 10 Gew.-% unter Bildung von Zellsuspensionen suspendiert.
Die Zellsuspensionen wurden mit derselben Glasperlen eines Durchmessers von 0,1 mm gemischt und die Zellen wurden durch 10-maliges Wiederholen der 1-minütigen Aufbrechbehandlung unter Verwendung des "Beads Beater" vollständig aufgebrochen. Danach wurden die erhaltenen Produkte einer Zentrifugationsabtrennung unterworfen, um Zytoplasmafraktionen in Zentrifugenüberstände und die Zellwandfraktionen in Zentrifugenrückstände aufzutrennen.
Jede der Fraktionen wurde durch Gefriertrocknen getrocknet, und die Menge der in 100 g der getrockneten Produkte enthaltenen Folsäuren wurde mit einem Bioassay wie in Beispiel 4 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 angegeben. Tabelle 6

Bakterien Gehalt an Folsäuren (mg/100 g)

Zytoplasmafraktion Zellwandfraktion

Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 13,6 0,006

Corynebacterium glutamicum ATCC 13060 11,2 0,008
Aus Tabelle 6 geht hervor, daß Folsäuren in den Zytoplasmafraktionen enthalten sind.
Beispiel 6 (Kultivieren unter Zugabe von Folsäurevorläufern)
Auf ähnliche Weise wie in Beispiel 4 wurden verdaute Produkte (aufgebrochene Produkte) von Zellen durch enzymatische Behandlung der Zellen unter Verwendung von Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 oder Corynebacterium glutamicum ATCC 13060 hergestellt.
Die vorstehend verwendeten Zellen wurden durch Kultivieren der vorstehend genannten Bakterien unter Zugabe von 100 mg/Liter p-Aminobenzoesäure, 10 mg/Liter Folsäure (einer oxidierten Form) oder 100 mg/Liter Guanosin erhalten.
Der Gehalt an Folsäuren, die in 100 g der getrockneten Pulver enthalten sind, ist in Tabelle 7 gezeigt.
Beispiel 7 (Wirkungen der Verabreichung von aufgebrochenen Zellen der Mikroorganismen)
Die Wirkungen der Verabreichung (1) des in Beispiel 4 erhaltenen enzymatischen Verdauungsprodukts von Corynebacterium glutamicum, (2) des in Beispiel 4 hergestellten enzymatischen Verdauungsprodukts von Saccharomyces cerevisiae IFO 2044 und des Verdauungsprodukts von Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 (Zellen, die durch Zugeben von p-Aminobenzoesäure zu dem Medium kultiviert wurden), wurden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 untersucht.
Als Versuchstiere wurden 4 Gettingen-Minischweine desselben Wurfs eingesetzt (1 Jahr alt; Körpergewicht 30 kg). Die enzymatischen Verdauungsprodukte wurden in einer Menge von 50 mg als Trockenprodukt pro 1 kg Körpergewicht eingesetzt. Zum Vergleich wurde derselbe Versuch unter Verwendung von 50 mg einer Folsäure vom inaktiven Typ (hergestellt von Kongo Kagalu K.K.) pro 1 kg Körpergewicht durchgeführt (Vergleich).
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 8 angegeben.
Aus der Tabelle 8 geht folgendes hervor. Eine Erhöhung des Wertes von THF im Blutplasma wurde in jedem der Fälle des enzymatischen Verdauungsprodukts (1), (2) und (3) im Vergleich mit solchen der Kontrolle (vor der Verabreichung) beobachtet. Im Fall von (1) und (2) stieg die Konzentration von THF nach der Verabreichung rasch an. Im Fall von (2) war die Geschwindigkeit des Anstiegs der THF-Konzentration im Vergleich zu (1) und (3) gering. Bezüglich des Ausmaßes des Anstiegs der THF-Konzentration ist (3) höher als (1) und somit wirksamer. Eine Folsäure vom inaktiven Typ (Vergleich) hat auf den Anstieg der Konzentration von THF und 5MF im Blutplasma keine Auswirkung.
Beispiel 8 (Referenzbeispiel) (Feldversuch)
Es wurden 60 (40 für den Versuch und 20 zum Vergleich) Schweine (1,5 bis 4 Jahre alt; 150 bis 200 kg Körpergewicht) der LW-Spezies (eine Hybridart, die durch Kreuzzüchtung von Landrace-Arten mit Large Yorkshire-Arten erhalten wurden) verwendet. Die aufgebrochenen Zellen von Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 (getrocknetes Produkt der enzymatisch verdauten Zellen), hergestellt in Beispiel 4, und die in Beispiel 5 hergestellten aufgebrochenen Zellen desselben Stammes (getrocknetes Produkt der Zytoplasmafraktion) wurden als Folsäure vom aktiven Typ enthaltende Produkte eingesetzt.
Beginnend zwei Monate vor dem Paaren wurden 20 Schweine kontinuierlich mit einem Futtermittel, das mit dem in Beispiel 4 hergestellten Folsäure enthaltenden aufgebrochenen Produkt versetzt war, in einer Menge von 300 mg pro Tag pro Schwein gefüttert. 60 Tage nach dem Paaren wurde der Gehalt an THF und 5MF im Blutplasma wie in Beispiel 1 bestimmt (Test I).
Ein ähnlicher Test wurde für die in Beispiel 5 hergestellten aufgebrochenen Zellen durchgeführt (Test II). Zum Vergleich wurde ein ähnlicher Test ohne Zugabe von aufgebrochenen Zellen durchgeführt (Vergleich).
Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt. Aus der Tabelle geht hervor, daß der Gehalt an THF und 5MF ansteigt, wenn im Vergleich zu dem Vergleichsversuch eine Verabreichung mit den Folsäure enthaltenden Produkten (Versuch I und Versuch II) durchgeführt wird.
In jedem dieser Versuche wurde die Verabreichung der Folsäuren in der Form von aufgebrochenen Zellen eines Mikroorganismus bis zum Werfen fortgesetzt.
Alle diese Schweine warfen etwa 114 Tage nach der Paarung. Die Ergebnisse bezüglich des Wurfs waren wie folgt: in dem Versuch, bei dem enzymatisch verdaute Zellen verabreicht wurden (Versuch I), wurden im Mittel 11,6 Ferkel geworfen, und in dem Versuch, bei dem das getrocknete Produkt einer zytoplasmatischen Fraktion verabreicht wurde (Versuch II), wurden im Mittel 11,8 Ferkel geworfen. Andererseits wurden im Mittel 10,8 Ferkel im Vergleichsversuch geworfen. Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß die Werte von THF und 5MF im Blutplasma von Schweinen durch die Verabreichung von enzymatisch verdauten Zellen und die getrockneten Produkte von zytoplasmatischen Fraktionen ansteigen (vorliegende Erfindung) und daß somit die Ergebnisse bei der Züchtung verbessert werden können.
[Vorteile der vorliegenden Erfindung]
Erfindungsgemäß kann die Konzentration von Folsäuren vom aktiven Typ, die im Blutplasma von Schweinen enthalten sind, durch orale Verabreichung eines Futtermittels, das durch das Verfahren gemäß Anspruch 1 erhalten wird, erhöht werden. Dies unterstützt in einem hohen Ausmaß die Schweinezucht.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Futters für Mutterschweine, das einen Futterzusatz enthält, der als aktiven Bestandteil zum Verbessern der Aufzuchteffizienz eine reduzierte Form von Folsäure oder ein aktives Derivat davon in einer Menge enthält, die eine Aufnahme von 0,1 bis 100 μg (als reduzierte Form von Folsäure) pro kg des Körpergewichts eines Mutterschweins pro Tag ergibt, wobei die reduzierte Form von Folsäure in der Form von zerstörten Zellen oder eines Zellextrakts eines Mikroorganismus ist, wobei das Verfahren das Kultivieren der Zellen in einem Medium, das mit p-Aminobenzoesäure, einer oxidierten Form von Folsäure und/oder einer Nucleinsäure in einer Menge von 1 mg/l bis 1 g/l versetzt ist, und das Erhalten der zerstörten Zellen oder des Zellextrakts umfaßt.