TWI418303B - 可去除玉米烯酮毒素之地衣芽孢桿菌及其用途 - Google Patents

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Description

可去除玉米烯酮毒素之地衣芽孢桿菌及其用途
本發明係關於一種地衣芽孢桿菌，特別是關於一種可去除玉米烯酮毒素(zearalenone,ZEN)之地衣芽孢桿菌CK1菌株(BCRC 910458)。
穀物受黴菌毒素污染為全球普遍存在的問題，其導致人類與畜禽健康受損而產生鉅額經濟損失。此些黴菌毒素包括黃麴毒素(aflatoxins)、串珠鐮孢毒素(fumonisins)、赭麴毒素(ochratoxins)、震顫真菌毒素(tremorgenic toxins)、單端孢霉烯族毒素(trichothecenes)以及玉米烯酮毒素(zearalenone,ZEN)，皆會危害動物的健康，以及因為牲畜產量降低而造成經濟上嚴重的損失。玉米烯酮毒素是一種非類固醇雌激素的黴菌毒素，係可由許多種黴菌的聚酮生成途徑(polyketide pathway)所合成，包括多種禾谷鐮孢菌例如Fusarium graminearum 、F. culmorum 、F. cerealis 、F. equiseti 、F. crookwellense 以及F. semitectum ，都是屬於在溫暖地區土壤中常見的黴菌種類，也是對穀物常見的黴菌毒素污染源。玉米烯酮毒素(ZEN)常對於農地的牲畜造成生育疾病，且偶而也會對人類造成高雌激素综合症(hyperoestrogenic syndromes)。雖然玉米烯酮毒素並未被世界衛生組織的國際腫瘤組織(IARC)分類為對人類具有致癌性(第3類群組)，但研究已證實其具有肝毒素性(hepatotoxic)、血液毒性(haematotoxic)、免疫毒性(immunotoxic)以及基因毒性(genotoxic)。
許多研究皆致力於建立前述黴菌毒素相關的檢測方法，以避免產品受到黴菌毒素污染風險。在相關領域之研究人員認為，最好的解決方法就是以生化分解的方式去除黴菌毒素，其可在溫和的條件下除去黴菌毒素，而不利用有害的化學物質或造成營養價值及美味的流失。
利用微生物進行食物或飼料的生化解毒是一種已知的技術。生化解毒可減少或除去前述食物或飼料中可能的黴菌毒素污染，且是一種高效率、專一性以及較不會影響環境的方法。此類技術應用在受黴菌污染的食物或飼料中的方式通常有兩種，第一種是黴菌毒素的生物分解。某些細菌或酵母菌的菌種，包括溶纖維丁酸菌(Butyrivibrio fibrisolvens )、粉紅粘帚菌(Gliocladium roseum )以及解毒毛孢酵母(Trichosporon mycotoxinivorans )，以及某些的瘤胃原蟲(rumen protozoa)，可將黴菌毒素分解成不具毒性或輕微毒性的產物。第二種方式是藉由結合於微生物的細胞壁單元，以抑制消化道中對於黴菌毒素的吸收，例如鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus )以及釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )。
地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis )是一種在土壤及有機物質中常見的細菌，且廣泛地應用於生產工業用酵素，例如澱粉酶或蛋白酶。在先前文獻中指出，特定種類的地衣芽孢桿菌具有極大的潛力作為人類使用或是飼料添加物的益生菌。例如在先前文獻中即指出地衣芽孢桿菌作為益生菌株時，可有效增強小鼠的免疫系統、增加體重、減少腹瀉，並可改善豬隻的飼料轉化效率(feed-conversion efficiency)。另外，已知地衣芽孢桿菌亦可抑制麴菌屬(Aspergillus )生長以及分解黃麴毒素B1(AFB1)以及赭麴毒素A(OTA)。然而，目前並未發現有任何關於地衣芽孢桿菌用於去除玉米烯酮毒素之文獻。
然而，雖然利用微生物進行食物或飼料的生化解毒是一種已知的技術，且已知地衣芽孢桿菌具有多種分解性酵素，例如具備蛋白酶以及澱粉酶活性等，但從未有人發現適合用於去除玉米烯酮毒素的地衣芽孢桿菌株。並且，使用於生化解毒的微生物，必需考慮到可能會產生腸毒素或具有溶血性等問題。
緣此，本發明之一目的即是提供一種可去除玉米烯酮毒素之地衣芽孢桿菌，其係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910458。
本發明之另一目的即是提供一種利用地衣芽孢桿菌去除玉米烯酮毒素之用途。
本發明為解決習知技術之問題所採用之技術手段係為利用一種由土壤樣本所分離出之地衣芽孢桿菌CK1菌株，經過型態學及基因特徵的鑑定，證實CK1菌株確實屬於地衣芽孢桿菌。同時評估其細胞外聚木糖酶(xylanase)、羧甲基纖維素酶(CMCase)、蛋白酶(protease)活性，以及利用CK1菌株分解玉米烯酮毒素之各種實施，證明本發明之地衣芽孢桿菌CK1菌株除了具有良好的玉米烯酮毒素解毒能力外，同時具有極高的聚木糖酶、纖維素酶以及蛋白酶活性。
本發明之CK1菌株藉由生理、生化、型態學及16S rDNA基因序列分析方法，證實CK1菌株確實為地衣芽孢桿菌。並且，CK1菌株具有良好的玉米烯酮毒素解毒能力。就目前已知相關技術領域而言，本發明的CK1菌株是第一個被揭露具有去除玉米烯酮毒素能力的地衣芽孢桿菌，具有在含有玉米烯酮毒素的穀物中分解玉米烯酮毒素的能力，且經過生化及基因檢測，證實CK1菌株不具溶血性且不會產生內毒素，適合作為食物或飼料的添加物，可幫助促進纖維素、半纖維素及蛋白質的水解，並且，利用此種生化解毒的方式，減少或除去食物或飼料中可能的微生物毒素污染，兼具高效率、專一性以及不會對環境造成影響的優點。
本發明所採用的具體實施例，將藉由以下之實施例及附呈圖式作進一步之說明。
 實施例1 地衣芽孢桿菌CK1菌株的型態學及分子鑑定 使用菌株
本發明新穎之CK1菌株係分離自土壤樣本，此樣本是取自國立台灣大學的農業試驗場，其方法係參照Petchkongkaew et al.(2008)。將樣本中篩出的單一菌落轉移至含有0.5%(w/v)的燕麥聚木糖(oat spelt xylan；Sigma-Aldrich Co.)之LB(Luria-Bertani)瓊脂盤(Difco Laboratories)，在37℃下培養24小時，利用剛果紅(Congo Red)染色法檢測其聚木糖酶活性。若產生黃色透明環表示菌株具有聚木糖酶的活性。在所有的測試菌落中，本發明的地衣芽孢桿菌株CK1顯示出最高的聚木糖酶活性，並進行更進一步的分析檢測。
在本發明中作為對照菌株的地衣芽孢桿菌株ATCC 14580菌株，係購自美國菌種保存中心(ATCC；Manassas,VA)。所有在此使用的菌株係培養於37℃下之LB培養液。瓊脂盤的製備係以瓊脂(1.5% W/V)外加入培養液中。
形態學特徵
菌落形態的觀察，係將CK1菌株接種於血液瓊脂盤(Merck,Darmstadt,Germany)，於37℃下培養24小時後觀察其菌落形態。菌體形態的觀察，係將CK1菌株培養於37℃下之LB培養液，在對數中期時收集菌體並以乙醇固定，利用Waldech et al.,(2006)之DAPI染色法(DAPI staining)染色後，以顯微鏡進行觀察。菌體另以革蘭氏染色套組(Sigma-Aldrich Co.)，依據使用說明書進行革蘭氏染色後，以顯微鏡進行菌體觀察。CK1菌株對不同碳源利用性之生化分析，係採用API 50 CHB系統(bioMerieux,Inc.)。
分子鑑定
基因體DNA係利用DNeasy Blood ＆ Tissue kit(Qiagen Inc.)，由CK1菌株中分離出。CK1菌株之16S rRNA基因序列，係利用引子對16S-27f(SEQ ID NO:1)以及16S-1492r(SEQ ID NO:2)，進行聚合酶連鎖反應(PCR)增殖放大。接著將PCR產物進行自動定序。16S rRNA基因之種源分析及比對，係採用自第54~510號位置的核苷酸序列，其包括V1至V3之高度變異區。序列比對之軟體係利用BioEdit Sequence Alignment Editor program(Hall,1999)，以及利用ClustalW(Thompson et al.,1994)之鄰接法(neighbor-joining method)建立種源樹，並以TreeView program(Page,1996)繪圖。
確定地衣芽孢桿菌CK1菌株
以前述的方法取得具有最強聚木糖酶(xylanase)活性的新穎純種CK1菌株，係寄存於中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Centre(BCRC),Hsinchu)，寄存編號為BCRC 910458，進行基礎形態學分析。參閱第1A~1C圖，第1A及1B圖分別顯示CK1菌株於相位差及螢光顯微鏡下觀察菌體形態結果，第1C圖係顯示CK1菌株在血液瓊脂盤上的菌落型態。由第1C圖可觀察到CK1菌株顯示出其菌落邊緣具有粗糙及不規則形狀，且在血液瓊脂盤上不具有溶血能力。由第1A及1B圖可觀察到CK1菌株的菌體末端為圓端之直桿狀，單一或鏈狀地分布、有運動性、且有內孢子生成。其特徵符合Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology(Claus and Berkeley,1986)所描述的Bacillus licheniformis 。
利用API 50 CHB系統之菌種鑑定套組，進行更進一步的生化分析，發現在CK1菌株以及ATCC 14580菌株之間的差距非常微小。參閱表1所示，在49種碳源中，CK1菌株以及ATCC 14580菌株可在其中的26種生長。然而，在糖類的吸收方面發現兩者具有差異點(核糖、半乳糖、乙醯葡萄糖胺、乳糖、蜜二糖)。依據API 50 CHB系統之生化特徵測試，鑑定出CK1菌株與地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis )具有99.9%之相似性。
參閱第2圖，係利用CK1菌株以及ATCC 14580菌株的16S rRNA基因(包含其V1-V3高度變異區)定序結果再以鄰接法(Neighbor-joining)建立演化樹。其顯示了CK1菌株與ATCC 14580菌株之間具有96.3%之相似性。因此，依據顯微鏡的觀察結果、型態學及生化學檢測，以及包含V1-V3高度變異區之16S rRNA基因的種源分析，CK1菌株確實屬於地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis )。
實施例2 地衣芽孢桿菌株之細胞外聚木糖酶、羧甲基纖維素酶以及蛋白酶活性
將隔夜培養的CK1菌株以及ATCC 14580菌株，以1%之接種量接種至10ml的LB培養液，並於37℃下以迴轉震盪器培養，轉速為250rpm，培養16小時。接著以5000 x g在4℃下離心20分鍾，收集上清液進行擴散法檢測及酵素活性分析。
擴散法檢測
CK1菌株以及ATCC 14580菌株的細胞外聚木糖酶、羧甲基纖維素酶以及蛋白酶活性，係利用Teather and Wood(1982)及Waldeck et al.(2006)之擴散法(radial diffusion methods)進行檢測。
參閱第3A圖，係顯示CK1菌株與ATCC 14580菌株在不同受質(聚木糖、羧甲基纖維素及脫脂牛奶)之酵素活性。當菌株具有酵素活性時，會在培養基上分解受質而形成透明環。CK1菌株與ATCC 14580菌株相較之下，在擴散法檢測中產生較大的分解區(聚木糖、羧甲基纖維素及脫脂牛奶)，顯示CK1菌株比ATCC 14580菌株可生成較多量的胞外聚木糖酶、羧甲基纖維素酶以及蛋白酶。
CK1菌株的聚木糖酶、羧甲基纖維素酶以及蛋白酶活性
聚木糖酶及羧甲基纖維素酶之活性係以偶氮聚木糖(azo-xylan)以及偶氮羧甲基纖維素(azo-CMC)(Megazyme,Wicklow,Ireland)作為受質，依據使用說明書進行檢測，條件如下：0.5ml的培養上清液加入0.5ml含有2%染劑受質的醋酸納緩衝液(pH 5.0)中，在40℃培養60分鍾後，加入2.5倍體積的沉澱緩衝液(4%三水合醋酸鈉及0.4%醋酸鋅，溶於95%乙醇溶液中)。以1000 x g離心10分鍾後，測量上清液之590nm吸光值。酵素活性的單位係以製造商所提供的標準曲線所決定。1單位的纖維酶活性定義為在量測條件下，由各個受質中每分鐘釋放1μmol的染劑。
蛋白酶的活性係依據Waldeck et al.(2006)所述，以量測CK1菌株培養上清液所釋放之染劑量而決定。將0.5ml的培養上清液加入0.5ml含有2%(w/v)偶氮酪蛋白(azo-casein)之100mM磷酸鈉溶液(pH 7.0)，在40℃培養60分鍾後，加入3ml的5%三氯醋酸鈉(TCA)溶液，並以1000 x g離心10分鍾沉澱未分解的偶氮酪蛋白，並測量上清液的440nm吸光值。酵素活性的單位係以製造商所提供的標準曲線所決定。1單位的蛋白酶活性定義為在量測條件下，由偶氮酪蛋白中每分鐘釋放1μmol的染劑。
本發明的統計分析係使用Statistical Analysis System software package version 9.1(Statistical Analysis System Institute,2002)。所有結果皆以平均值±標準差的方式呈現。學生t檢測(student’st -test)用於內組別比較，以及P值(P -value)小於0.05時被認為具有統計意義。
參閱第3B圖，為了證實擴散法檢測的結果，CK1菌株與ATCC 14580菌株發酵24小時後，鑑定各酵素之活性。圖中顯示CK1菌株之聚木糖酶、羧甲基纖維素酶以及蛋白酶的活性分別為33.84±5.55、59.09±4.10以及40.16±2.31(mU/ml)，而對照組ATCC 14580菌株之聚木糖酶、羧甲基纖維素酶以及蛋白酶的活性分別為9.70±0.85、24.12±5.76以及8.52±0.45(mU/ml)，CK1菌株與ATCC 14580菌株的這三種酵素活性相較，皆相差20(mU/ml)以上。因此，由第3B圖所得結果可知，CK1菌株比ATCC 14580菌株具有較佳的胞外聚木糖酶、羧甲基纖維素酶以及蛋白酶活性，符合擴散法檢測所得的結果。
實施例3 地衣芽孢桿菌株在玉米烯酮毒素 (zearalenone,ZEN)影響下的生長特徵
玉米烯酮毒素(Sigma-Aldrich)溶於二甲基亞碸(DMSO)，作為標準的庫存溶液。為了分析地衣芽孢桿菌株在玉米烯酮毒素影響下的生長特徵，將隔夜培養的CK1菌株以及ATCC 14580菌株，接種至含有玉米烯酮毒素(2ppm)或不含玉米烯酮毒素之10ml的LB培養液(菌元接種量為1%)，並於37℃下以迴轉震盪器培養48小時(轉速為250rpm)。在培養期間，每4小時取樣本，以標準瓊脂盤方法以及量測渾濁度(OD 600)之方法，進行細胞計數。
結果
將CK1菌株培養在37℃的LB培養液中，培養24小時後達到生長定常期(stationary phase)，其菌數為9.17±0.14log CFU ml-1 (OD600值為2.09±0.02)。ATCC 14580菌株的生長狀態與CK1菌株所觀察到的相似。在發酵期間，ATCC 14580菌株與CK1菌株的細胞計數未有明顯差異。
在含有2ppm的玉米烯酮毒素之LB培養液中，CK1菌株與ATCC 14580菌株的生長速度與在不含玉米烯酮毒素之LB培養液相同，顯示玉米烯酮毒素對於CK1菌株與ATCC 14580菌株的生長並無影響。
實施例4 在LB broth中地衣芽孢桿菌株對於玉米烯酮毒素之解毒效果
為了確認CK1菌株以及ATCC 14580菌株對於玉米烯酮毒素的解毒效果，分別將CK1菌株以及ATCC 14580菌株接種至含有玉米烯酮毒素(2ppm)之10ml的LB培養液，於37℃下以迴轉震盪器培養24小時(轉速為250rpm)。在培養期間，分別在第0、4、 8、12、24及48小時取樣，並依Silva et al.(2001)所述之方法純化並定量玉米烯酮毒素。
結果
參閱第4圖，ATCC 14580菌株(以空心圓點表示)及CK1菌株(以實心圓點表示)對於玉米烯酮毒素皆具有解毒作用。然而，和ATCC 14580菌株相比，在培養8小時後，CK1菌株明顯對於玉米烯酮毒素具有較佳的解毒作用。同時參閱第5A~5D圖，分別顯示(A)單獨存在之玉米烯酮毒素標準品以及(B~D)CK1菌株在2ppm的玉米烯酮毒素下培養0小時、24小時及48小時後的HPLC管柱層析結果。由HPLC管柱層析結果發現，在CK1菌株培養48小時後，並未觀察到有任何分解玉米烯酮毒素後的產物，係因滯留時間第2-6分鐘出現的peaks應為solvent，第12分鐘出現的peak為玉米烯酮毒素。比較第5B圖(0小時)、第5C圖(12小時)及第5D圖(24小時)，三者間僅有玉米烯酮毒素的peak變小，其它peaks的大小不變，故判斷應無其它玉米烯酮毒素的分解產物出現。
為了探討LB培養液中的玉米烯酮毒素是否被CK1菌株的細胞壁所吸附，將CK1菌株培養在含有2ppm玉米烯酮毒素之LB培養液48小時後，以5000 x g在4℃下離心20分鍾收集菌體。離心取得之菌體以10mL磷酸鈉緩衝溶液(10mM，pH 7.4)懸浮，然後以超音波破菌儀(sonicator 3000,Misoix,Farmingdale,NY,USA)進行破菌。破菌後再以12,000 x g於4℃離心10分鐘，去除上清液，取得沈澱在下方的細胞壁。將細胞壁經過甲醇萃取，並以HPLC分析玉米烯酮毒素濃度。結果顯示，在甲醇萃取的HPLC菌體細胞壁分餾中，並未發現玉米烯酮毒素，證實CK1菌株並非藉由細胞壁的吸附作用而清除培養液中的玉米烯酮毒素。
實施例5 在玉米粉中地衣芽孢桿菌株對於玉米烯酮毒素之解毒效果
為了確認CK1菌株以及ATCC 14580菌株對於玉米烯酮毒素的解毒效果，取1g含有玉米烯酮毒素的玉米粉，懸浮於99ml的蒸餾水中。於121℃滅菌15分鐘後，將CK1菌株以及ATCC 14580菌株接種至10ml的玉米粉溶液中，並於37℃下以迴轉震盪器培養36小時(轉速為250rpm)。在培養期間，分別在第0、12、24及36小時取樣，以Silva et al.(2001)所述方法純化並定量玉米烯酮毒素。
本發明中所使用的玉米係購自本地超級市場，經測試過為不含玉米烯酮毒素。受玉米烯酮毒素污染的玉米粉係依Maeteo et al.(2001)所述方法製備。
參閱第6圖，係顯示測試CK1菌株在含有玉米烯酮毒素的玉米粉中分解玉米烯酮毒素的能力。在接種測試菌株之前，玉米粉溶液(1%)中的玉米烯酮毒素的濃度為1.79±0.15ppm。如第6圖所示，ATCC 14580菌株以空心圓點表示，而CK1菌株以實心圓點表示，在培養36小時後，在玉米粉溶液的上清液中，僅殘餘1.87%的玉米烯酮毒素，殘餘的玉米烯酮毒素濃度為0.03ppm，顯示CK1菌株的確具有分解玉米烯酮毒素的解毒能力。參閱第7A~7D圖，分別顯示CK1菌株在含有玉米烯酮毒素的玉米粉溶液中培養0、12、24、36小時後的HPLC管柱層析結果。結果顯示在CK1菌株培養36小時後的HPLC管柱層析結果中，玉米烯酮毒素已顯著減少，且並未觀察到有任何分解玉米烯酮毒素後的產物。
實施例6 CK1菌株是否產生腸毒素
使用於黴菌毒素的生化解毒之微生物，不可具有產生有害毒物之現象。在大多數與Bacillus 菌種有關的食物中毒意外中，多半與仙人掌桿菌(B. cereus )有關，但亦有其他的Bacillus 菌種被確認與食物中毒有關。在Bacillus 菌種中，主要有地衣芽孢桿菌(B. licheniformis )與短小芽孢桿菌(B. pumilus )兩種，與食物源性腸胃炎(food-borne gastroenteritis)有關，且一般相信，其產生的腸毒素係類似於B. cereus 的腸毒素。目前已知B. cereus 可產生兩種不同腸毒素複合物，包括溶血素BL(hemolysin BL(Hbl))以及非溶血性腸毒素(nonhemolytic enterotoxin(Nhe))。Hbl複合物係有三種由hblA 、hblD 以及hblC 基因所編碼的蛋白質B、L1 、L2 所組成。而Nhe複合物係有三種由nheA 、nheB 以及nheC 基因所編碼的蛋白質NheA、NheB及NheC所組成。為確認CK1菌株是否會產生腸毒素，分別以免疫套組檢測腸毒素及PCR檢測腸毒素基因，並且同時以購自美國菌種保存中心(ATCC；Manassas,VA)之B. licheniformis ATCC 14580、B. cereus ATCC11778、B. cereus ATCC33019菌株作對照(以說明下面免疫套組檢測Hbl,NheA)
以免疫套組檢測腸毒素
腸毒素的檢測係使用專門用於檢測Hbl腸毒素的HblC次單元的BCET-RPLA Toxin Detection kit(Oxoid,Basingstoke,UK)，以及利用專門檢測Nhe腸毒素之NheA次單元的TECRA Bacillus Diarrheal Enterotoxin Visual Immunoassay(VIA)kit(Tecra Diagnostics,Roseville,Australia)。
以PCR檢測腸毒素基因
B. cereus 腸毒素基因的檢測，係利用Guinebretiere et al.(2002)及Ouoba et al.(2008)所述方法，以聚合酶連鎖反應(PCR)檢測腸毒素基因hbl (A 、B 、C )及nhe (A 、B 、C )是否存在。hblA 基因所使用之引子對為BCF(SEQ ID NO:3)以及BCR(SEQ ID NO:4)、hblB 基因所使用之引子對為HAF(SEQ ID NO:5)以及HBR(SEQ ID NO:6)、hblC 基因所使用之引子對為HCF(SEQ ID NO:7)以及HCR(SEQ ID NO:8)、hblD 基因所使用之引子對為HDF(SEQ ID NO:9)以及HDR(SEQ ID NO:10)、nheA 基因所使用之引子對為NH1F(SEQ ID NO:11)以及NH1R(SEQ ID NO:12)、nheB 基因所使用之引子對為NBF(SEQ ID NO:13)以及NBR(SEQ ID NO:14)、nheC 基因所使用之引子對為NCF(SEQ ID NO:15)以及NCR(SEQ ID NO:16)。
結 果
為了確認CK1菌株是否會產生腸毒素，分別利用專門檢測Hbl腸毒素的HblC次單元的套組，以及另一專門檢測Nhe腸毒素之NheA次單元的套組，針對CK1菌株進行檢測，並且同時以B. licheniformis ATCC 14580、B. cereus ATCC11778、B. cereus ATCC33019菌株作對照。結果參閱表2，無論是CK1菌株或ATCC 14580菌株皆未發現腸毒素。進一步利用Guinebretiere et al.(2002)與Ouoba et al.(2008)所述方法，以PCR檢測B. cereus 腸毒素基因hbl (A 、B 、C 及D )以及nhe (A 、B 及C )是否存在，結果再參閱表2，顯示出CK1菌株與ATCC 14580菌株兩者皆不具有B. cereus 腸毒素基因。
結論
在習知技術領域中已知，地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis )具有多種分解性酵素，例如蛋白酶以及澱粉酶。在ATCC 14580菌株的基因體中，即具有多種可分解澱粉、半纖維素、幾丁質、果膠及蛋白質的酵素之基因。在本發明中，由土壤樣本中分離出可生成聚木糖酶的CK1菌株。在擴散法檢測結果中顯示，和ATCC 14580菌株相較之下，CK1菌株具有較大的分解區域，表示CK1菌株具有相對較多量的聚木糖酶、羧甲基纖維素酶及蛋白酶。藉由生理、生化及16S rDNA基因序列分析方法，證實CK1菌株確實為地衣芽孢桿菌。此外，ATCC 14580菌株及CK1菌株皆具有去除玉米烯酮毒素的能力，相較之下，CK1菌株對於玉米烯酮毒素的解毒能力較佳。就目前已知相關技術領域而言，本發明的CK1菌株是第一個被揭露具有去除玉米烯酮毒素能力的地衣芽孢桿菌。
在前述實施例中已證實，CK1菌株可減少培養基中的玉米烯酮毒素濃度。HPLC管柱層析結果發現，在CK1菌株培養48小時後，並未觀察到有任何分解玉米烯酮毒素後的產物。更進一步地，在甲醇萃取的CK1菌體細胞壁中，HPLC管柱層析結果並未發現玉米烯酮毒素，顯示玉米烯酮毒素並未結合於CK1菌株的細胞壁。
根據上述結果，可利用本發明之地衣芽孢桿菌CK1菌株，使用於去除玉米烯酮毒素之用途，例如添加於食物或穀物中，作為食物或飼料的添加劑。
該領域熟習此技藝者應可理解，以上所述僅為本發明之其中數種實施例，並非用於限制本發明所請之範圍。在未偏離本發明之創作精神情況下，亦可將各實施例依據說明書內容進行修飾或變化，惟此種變化仍屬本發明之保護範圍。
第1A~1B圖分別顯示CK1菌株之相位差及螢光顯微鏡結果；
第1C圖係顯示CK1菌株在血液瓊脂盤上的菌落型態；
第2圖係顯示以鄰接法(Neighbor-joining)建立的演化樹；
第3A圖係顯示CK1菌株與ATCC 14580菌株在不同受質之酵素活性；
第3B圖係顯示CK1菌株與ATCC 14580菌株發酵24小時後，測定各酵素之活性；
第4圖係顯示CK1菌株與ATCC 14580菌株對於玉米烯酮毒素之解毒作用；
第5A~5D圖分別顯示CK1菌株在含有玉米烯酮毒素之LB培養液培養不同時間後的HPLC管柱層析結果；
參閱第6圖係顯示CK1菌株與ATCC 14580菌株在含有玉米烯酮毒素的玉米粉中分解玉米烯酮毒素的能力；
第7A~7D圖分別顯示CK1菌株在含有玉米烯酮毒素的玉米粉溶液中培養不同時間後的HPLC管柱層析結果。

Claims (10)

  1. 一種可去除玉米烯酮毒素之地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis )，係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910458。
  2. 如申請範圍第1項所述之可去除玉米烯酮毒素之地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis )，係具有高於原生地衣芽孢桿菌20mU/ml以上之聚木糖酶(xylanase)、羧甲基纖維素酶(CMCase)以及蛋白酶(protease)活性。
  3. 一種利用地衣芽孢桿菌去除玉米烯酮毒素之用途，其中該地衣芽孢桿菌係如申請範圍第1項所述之地衣芽孢桿菌。
  4. 如申請範圍第3項所述之用途，其中該地衣芽孢桿菌具有高於原生地衣芽孢桿菌20mU/ml以上之聚木糖酶(xylanase)、羧甲基纖維素酶(CMCase)以及蛋白酶(protease)活性。
  5. 如申請範圍第3項所述之用途，其中該地衣芽孢桿菌係添加於一食物中。
  6. 如申請範圍第3項所述之用途，其中該地衣芽孢桿菌係添加於一飼料中。
  7. 如申請範圍第3項所述之用途，其中該地衣芽孢桿菌之較佳解毒作用時間為24小時。
  8. 如申請範圍第3項所述之用途，其中該地衣芽孢桿菌之更佳解毒作用時間為36小時。
  9. 一種地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis )，係寄存於中華民國食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910458。
  10. 一種可用於製造去除玉米烯酮毒素之組合物，該組合物為包含如申請專利第9項之地衣芽孢桿菌，係為可進行聚木糖、羧甲 基纖維素及脫脂牛奶的分解及玉米烯酮毒素解毒的活性。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102406098B (zh) * 2011-08-16 2013-03-13 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种降解玉米赤霉烯酮的方法
CN103667103B (zh) * 2013-10-08 2016-01-20 暨南大学 一种分解玉米赤霉烯酮和木聚糖的枯草芽孢杆菌及其应用
CN105087444B (zh) * 2015-09-02 2018-11-23 国家粮食局科学研究院 降解玉米赤霉烯酮的解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN108251320B (zh) * 2016-12-29 2020-09-22 中粮营养健康研究院有限公司 一株地衣芽孢杆菌、含有该菌的菌剂及其应用、降解玉米赤霉烯酮的方法和试剂盒
CN111820361A (zh) * 2019-04-17 2020-10-27 海南泓缘生物科技股份有限公司 一种对喷浆玉米皮中赤霉烯酮毒素的生物降解方法
CN110172425B (zh) * 2019-05-30 2020-12-04 华中农业大学 玉米赤霉烯酮脱毒型益生菌的筛选及应用
CN110343636B (zh) * 2019-06-25 2021-01-12 新疆农业科学院微生物应用研究所（中国新疆-亚美尼亚生物工程研究开发中心） 一种斯塔普氏属菌株及其在玉米赤霉烯酮降解中的应用
CN113322197A (zh) * 2021-04-17 2021-08-31 苏州优利莱生物科技有限公司 一种降解玉米赤霉烯酮的微生物制剂及其制备方法
CN113647510A (zh) * 2021-08-09 2021-11-16 云南师范大学 一种可降解发酵饲料中霉菌毒素的酶菌复合添加剂及其应用
CN115957310B (zh) * 2022-12-28 2023-08-25 山东宝来利来生物工程股份有限公司 一种霉菌毒素解毒剂及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
劉嚞睿、蕭人瑄，地衣芽孢桿菌微生物製劑之開發與應用(第1年/全程3年)，行政院農業委員會98年度科技計畫研究報告，98年1月1日-98年12月31日 *

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